M a s a r y k o v a u n i v e r z i t a. P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a. Ústav experimentální biologie

Transkript

1 M a s a r y k o v a u n i v e r z i t a P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů Cirkadiánní rytmy živočichů D i p l o m o v á p r á c e Vedoucí diplomové práce: RNDr. Martin Vácha, Ph.D. Brno 2008 Bc. Silvie Červenková

2 Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala zcela samostatně za použití uvedené literatury. V Brně Podpis 2

3 Poděkování Chtěla bych poděkovat RNDr. Martinu Váchovi, Ph.D. za cenné připomínky a rady, odborné vedení a ochotnou pomoc při vypracovávání mé diplomové práce. A také hlavně mým rodičům, kteří stáli při mně a ve studiu mě podporují. 3

4 Vzdělání má hořké kořínky, ale sladké ovoce. Aristoteles 4

5 Shrnutí Tato diplomová práce poskytuje základní informace o cirkadiánních rytmech živočichů, které umožňují organismům předem se připravit na očekávané změny prostředí a také na tyto změny reagovat. Úvod je zaměřen na vlastnosti cirkadiánních rytmů, jejich synchronizaci s denní periodou vlastností prostředí a s podmínkami této synchronizace. V dalších kapitolách jsou podrobněji rozebrány fyziologické a molekulární principy cirkadiánních rytmů. Druhá část práce zahrnuje experimentální část, která se zaměřuje na analýzu pohybové aktivity švába amerického (Periplaneta americana) v průběhu 24 hodin. Summary This thesis presents basic information about circadian rhythms of animals, which helps susceptible organisms to prepare in advance for expected environment changes and also to respond to these changes. The introduction is focused on characteristics of circadian rhythms, their entrainment to daily period of environmental features and conditions of entrainment. In following chapters, particular physiological and molecular principles of circadian rhythms are analyzed. Second part of the thesis includes an experimental part, which is focused on analyses of locomotive activity of cockroach (Periplaneta americana) in the course of 24 hours. 5

6 Obsah 1. ÚVOD 7 2. LITERÁRNÍ ČÁST Rytmičnost dějů Vlastnosti cirkadiánních rytmů Synchronizace cirkadiánních rytmů s denní periodicitou prostředí Podmínky synchronizace Hodinové geny Hlavní (centrální) hodiny a periferní hodiny Umístění hlavních hodin mozku Neurony cirkadiánního řízení v mozku Accesory medulla (ame) Úloha sítnice a retinohypothalamického traktu savců Melatonin Molekulární základ cirkadiánních rytmů Hodinové geny u octomilky a myši Zpětnovazebná smyčka u octomilky a myši Cirkadiánní rytmy u octomilky Zpětnovazebná smyčka tvorby per-proteinu Nastavování biologických hodin per-proteinu EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Cíl experimentu Úvod experimentální části Materiál a metody experimentální části Výsledky a diskuse experimentální části ZÁVĚR LITERÁRNÍ ČÁSTI ZÁVĚR EXPERIMENTÁLNÍ ČÁSTI SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM SEKUNDÁRNĚ CITOVANÉ LITERATURY INTERNETOVÉ ZDROJE 52 6

7 1. Úvod Prostředí na Zemi, v němž se život vyvíjel, nebylo nikdy neměnné. Všechny živé organismy jsou od počátku vystaveny fluktuacím (kolísání, vlnění) vnějších podmínek majícím různou periodicitu. Zevní prostředí všech živých organismů prodělává pravidelné periodické změny, které jsou vyvolány otáčením Země kolem osy (jednou za 24 hodin) a kolem Slunce (za jeden rok). Jako forma adaptace na tyto časové změny vznikly během fyziologického vývoje biologické rytmy (biorytmy), které se projevují pravidelným střídáním fyziologických dějů u většiny rostlin a živočichů. Tyto rytmy jsou endogenně řízené a představují fyziologickou adaptaci významně zvyšující životaschopnost druhu. Ať už jde o střídání dne a noci nebo ročních období, vnitřní rytmus umožňuje živočichovi předvídat změnu podmínek bez ohledu na jejich náhodné krátkodobé výkyvy a nastavit optimální reakci organismu. Nejvýraznější změna v prostředí, která je výsledkem pravidelného obíhání Země kolem své centrální osy a výsledné střídání mezi dnem a nocí dává vznik cirkadiánnímu rytmu (24 hodinový rytmus, circa - okolo, dies - den). V tomto rytmu mozek upravuje různé hladiny hormonů v těle i funkci některých orgánů tak, aby byly optimálně připraveny k práci v aktuální denní době. Z fyziologických příkladů lze uvést přípravu těla ke spánku (ospalost večer), kolísání tělesné teploty a tlaku během dne a další děje. Z hormonálních příkladů je to třeba kolísání hladiny adrenalinu, nebo kortizolu, který bývá někdy označován jako stresový hormon. Ten mívá po ránu produkci 10-20x vyšší než v noci, aby připravil tělo na stres během dne. Nejdůležitějším hormonem, který je světlem ovlivňován je melatonin, od jehož hladiny se odvíjí vlastní chod cirkadiánních rytmů. Jako běžně dostupný důkaz existence cirkadiánních rytmů můžeme brát jejich rozladění, které pociťujeme při cestách do jiných časových pásem, nebo při pouhé změně času ze zimního na letní a naopak. 7

8 2. Literární část 2.1 Rytmičnost dějů Rytmický děj můžeme znázornit sinusoidální vlnou. Rytmicita je všudypřítomný znak přírody. Rytmy lze nalézt od unicelulárních ke komplexním multicelulárním organismům u rostlin, živočichů i člověka. Frekvence rytmů v přírodě pokrývají téměř každou sekci času, od rytmů, jež oscilují jedenkrát za sekundu (např. u elektroencefalogramu) a jednou za několik sekund (respirační rytmus, srdeční rytmus), k rytmům, které oscilují jedenkrát za rok (cirkannuální rytmus). Perioda je čas, který vyžaduje daný cyklus k jednomu proběhnutí (může to být zlomek vteřiny, 1 den, měsíc, rok nebo jiná doba). Frekvence udává počet cyklů, které proběhly za daný časový úsek. Amplituda udává rozdíl mezi výchozím stavem a maximem či minimem cyklu. 24 hodinové biorytmy jsou velice často sledovány u nejrůznějších rostlinných a živočišných druhů. Řada nálezů svědčí pro to, že některé cirkadiánní rytmy jsou skutečně relativně stálé, s individuálními variacemi pouze kolem 4%. Již první vědecká sledování ukázala, že některé rytmy setrvávají za měnících se podmínek, a to nejen u daného jedince, ale i u jeho potomků po řadu generací. Jiné biorytmy se naproti tomu měnily poměrně rychleji a přizpůsobovaly se tak změnám vnějších podmínek. Od té doby začal mezi vědci spor o otázku, zda biorytmy mají svoji regulaci uvnitř či vně organismu. Zda jsou exogenní nebo endogenní. Dnes víme, že rytmy jsou řízeny endogenně a ovlivňovány exogenně. Základní časová organizace organismu má přibližně 24 hodinovou periodicitu, která je v souladu s otáčením Země kolem osy. V rozmezí 24 hodin probíhá denní (cirkadiánní) biorytmus člověka tak, že má své funkční vrcholy a nejnižší polohy, které jsou synchronizovány především střídáním světla a tmy, dále zvyklostmi sociálního života a ekologickými podmínkami, v menší míře střídáním tepla a chladu a ticha. Biorytmy jsou nezávislé na vůli, avšak v určitých mezích jsou ovlivnitelné (Machová, 2005). Četné pokusy ukázaly, že periodicita fyziologických dějů je zachována i tehdy, vyloučí-li se nebo změní-li se některé vlivy prostředí (např. pokusy s pobytem v podzemních jeskyních, nastavením zimního času na letní a naopak). Vyplývá z toho, že příčinou biorytmů nejsou jen změny zevního prostředí, nýbrž také endogenní procesy. U nejvyšších organismů 8

9 (u savců, včetně člověka) existují centrální (hlavní) biologické hodiny (obr. 1), které řídí biorytmy jako celek. Průlomové objevy dokazující, že existují vnitřní hodiny zodpovědné za denní rytmy organismů, se udály ve skutečnosti už v 60. letech minulého století. V roce 1960 se uskutečnilo první symposium o biologických hodinách v Cold Spring Harbour v USA. Zdravý člověk je synchronizován s podmínkami zevního prostředí tak, že je ve dne činný a v noci spí. Vrcholy biorytmů mozkových, dechových, srdečních, svalových a ledvinových kapacit jsou dopoledne mezi 8. a 12. hodinou a odpoledne mezi 15. a 18. hodinou (obr. 2). Takto relativně ustálená podoba biorytmů je řízena jak nervově, tak hormonálně. Obr. 1 Znázornění účinku vnějšího podnětu vedoucího k cirkadiánnímu rytmu Cirkadiánní rytmus je řízen endogenními biologickými hodinami, které jsou synchronizovatelné vnějšími podněty (nejčastěji střídáním světla a tmy) (URL 1). 9

10 Obr. 2 Cirkadiánní rytmus člověka Křivka cirkadiánních biorytmů má dva vrcholy mozkových, dechových, srdečních, svalových a ledvinových kapacit: dopolední mezi 8. a 12. hodinou, odpolední mezi 15. a 18. hodinou. Podle Machová, (2005). Cirkadiánní biorytmy představují jistou vnitřní kopii časové struktury zevního prostředí. Jejich biologický význam spočívá v tom, že umožňují organismu předem se funkčně připravit na očekávané změny podmínek zevního prostředí. Obecně platí, že biologické hodiny u člověka neběží přesně v periodě 24 hodin, ale poněkud pomaleji. Rytmus teploty lidského těla, časovaný biologickými hodinami, má zhruba 25 hodinovou periodu za volně běžících podmínek, tzn. bez environmentálních časových podnětů Zeitgeberů (např. světlo, teplota). Tyto upravují cirkadiánní rytmus na přesně 24 hodinovou periodu. Zeitgebers jsou nezbytné k přizpůsobení živého objektu normální periodě 24 hodin. Tato rytmicita, vrozená všem živým systémům, jim umožňuje se snadněji adaptovat a přežít tak lépe za měnících se podmínek prostředí během 24 hodinového dne stejně jako během měnících se podmínek ročních období Vlastnosti cirkadiánních rytmů Všechny cirkadiánní rytmy mají tři základní vlastnosti: 1. jsou endogenní, tzn. přetrvávají v konstantních podmínkách s periodou přibližně 24 hodin. 2. jsou synchronizovatelné změnami prostředí (osvětlení, teploty atd.) na periodu přesně 24 hodin. 3. délka periody není příliš závislá na teplotě (teplotní kompenzace) (URL 2). 10

11 Endogenní perioda cirkadiánních rytmů se poměrně málo mění s teplotou - podstatně méně než rychlost většiny biochemických reakcí Synchronizace cirkadiánních rytmů s denní periodicitou prostředí V přírodě je důležité, aby rytmy měly periodu přesně 24 hodin (obr. 3) a také správnou fázi vzhledem k denní rytmicitě vnějších faktorů (listy sklopené v noci, produkce fotosyntetických proteinů přes den). Toto je zajištěno procesem zvaným synchronizace (obr. 4). Synchronizace je přizpůsobení endogenního cirkadiánního rytmu k rytmu prostředí. Cirkadiánní rytmus: 1. přebírá periodu vnějšího rytmu. 2. ustavuje stabilní fázi vzhledem k fázi vnějšího rytmu. Synchronizace je vždy zajištěna podnětem prostředí, zvaným časovač. Časovačem je nejčastěji světlo, běžně i změny teploty u živočichů, ale někdy i sociální stimuly - např. dostupnost potravy. Během synchronizace působí vnější rytmus (periodicita časovače) na endogenní (cirkadiánní) rytmus. perioda přesně 24 h perioda přibližně 24 h měřená veličina vyhasínání rytmu čas [hodin] světlo (L, stálé světlo LL) tma (D, stálá tma DD) Obr. 3 Graf závislosti světelné a temné fáze dne na měřené veličině Znázornění periody přesně 24 hodin a periody přibližně 24 hodin (URL 2). 11

12 Obr. 4 Znázornění volného běhu, synchronizace a maskování Šedé pole znázorňuje tmu a žluté pole světlo. Při volném běhu světlo neovlivňuje řízení cirkadiánních hodin. U maskování je synchronizace pouze vnějším projevem, ale neovlivní tím činnost cirkadiánních hodin (URL 3) Podmínky synchronizace Synchronizace musí splňovat tyto podmínky: 1. délka periody endogenních rytmů se rovná délce periody vnějšího rytmu. 2. ustaví se stabilní rozdíl fázi mezi endogenním a vnějším rytmem (např. listy jsou nejvíce sklopeny vždy 8 hodin po zhasnutí). 3. po přesunu do konstantních podmínek pokračuje endogenní rytmus volně běžící periodou s fází, která je určena předchozím působením vnějšího rytmu (URL 3). Pod pojmem rytmus se rozumí pravidelné kolísání hodnot (fyzikální veličiny stejně jako životní funkce) vyznačující se periodickým opakováním. Denní rytmus zůstává zachován i v prostředí trvalého světla nebo tmy (obr. 5A). Pokud začne účinkovat pulz světla na začátku tmavé fáze, dochází ke zpoždění rytmu. Uprostřed nedochází ke změně a při aplikaci pulzu světla na konci tmavé fáze dojde k předběhnutí rytmu (obr. 5B, 6). 12

13 Obr. 5 Fázové posuny Časovač (např. pulz světla během stálé tmy) vyvolá změnu fáze volně běžícího rytmu. Velikost a směr fázového posunu závisí na fázi rytmu, v níž časovač působí (URL 2). 13

14 posun fáze zpoždění žádný předběhnutí s u b je k tiv n í d e n c irk a d iá n n í č a s (C T ): d é lk a v o ln ě b ě ž íc í p e rio d y = 2 4 h C T o k a m ž ik ro z s v íc e n í je 0 h C T s u b je k tiv n í n o c d o b a a p lik a c e s v ě te ln é h o p u lz u (h o d in c irk a d iá n n íh o č a s u ) Obr. 6 Křivka fázové odpovědi Kvantitativně popisuje závislost fázového posunu na cirkadiánní fázi aplikace časovače. Nejčastější tvar křivky fázové odpovědi pro účinek krátkého pulzu světla během stálé tmy (URL 2). 2.2 Hodinové geny Cirkadiánní rytmy jsou endogenní, skutečně vrozené. Jejich podstatu je nutno hledat v genech. Říkáme jim hodinové geny a mají pod kontrolou to, jak na sebe jednotlivé biologické pochody v organismu navazují, a jak se zhruba každých 24 hodin mění. Byly objeveny v celé řadě organismů od prokaryotních bakterií, v rostlinách a octomilkách až po savce, včetně člověka. Hlavně mezi živočichy existují homologie mezi hodinovými geny (Young a Kay, 2001, Stanewsky, 2003, Allada, 2003). Společnými rysy ve fungování hodinových genů a jimi kódovaných proteinů je systém propojených pozitivních a negativních zpětnovazebných smyček na úrovni transkripce a translace, který vede k jednotným trvalým denním oscilacím. Tyto oscilace mohou vycházet z autonomních oscilací jednotlivých buněk a dokonce i ve vícebuněčných organismech nejsou závislé na interakcích mezi jednotlivými buňkami. Dnes víme, že oscilace neboli rytmické signály v buňkách biologických hodin vznikají na základě rytmického spínání a vypínání určité sady genů. U savců bylo v nedávné době objeveno 8 až 9 takových genů, ale tento počet nemusí být konečný. 14

15 Kdyby byl člověk nebo jakýkoli živý organismus v neperiodickém prostředí, rytmy v něm také budou probíhat. Jenom budou mít periodu ne přesně 24 hodinovou. Kdyby byly jednotlivé orgány vyňaty z organismu a přežívaly v in vitro podmínkách, zjistíme, že jednotlivé hodinové geny se v nich také zapínají a vypínají se zhruba 24 hodinovou periodou. Mají v sobě 24 hodinový rytmus zakódován. Pro funkci, pro vlastní běh hodin jsou nejdůležitější hodinové geny, které v sobě všechny živé organismy mají. Avšak pro modulaci vnějším prostředím a pro synchronizaci jsou pak nezbytné další pochody. Převážně jde o způsob, jakým organismy včetně člověka vnímají světlo, jak informace o světle dál postupuje až k biologickým hodinám a jak je dále ovlivňuje. Vědci mnoha laboratoří připravují v současné době linie myší, které mají cíleně mutovaný buď jeden nebo i více hodinových genů současně a sledují, jaký vliv to bude mít na chod jejich biologických hodin. Myši s cílenou mutací některého z těchto genů jsou po určité době arytmické, to znamená, že například vykazují namísto převážně noční pohybové aktivity roztroušenou aktivitu během celých 24 hodin. Z toho, jak rychle v neměnném prostředí stálé tmy vymizí rytmus v pohybové aktivitě, pak vědci usuzují na význam určitého genu pro vytváření rytmů v buňce. Mezi hodinovými geny a jimi kódovanými proteiny existují složité vzájemné vztahy. Výsledkem tohoto vzájemného působení jsou oscilace ve spínání a vypínání hodinových genů s cirkadiánní periodou. Světlo může zasáhnout do tohoto mechanismu tak, že náhle zapne určitý hodinový gen a tím nastaví fázi v rytmické oscilaci ostatních hodinových genů. Výsledkem je změna fáze rytmu hodin. Z hlavních biologických hodin se rytmický signál dostává na periferii, tedy mimo hodiny, pomocí řízeného spínání dalších genů, kterým říkáme hodinami řízené geny", a tak je následně celý organismus informován o tom, v jaké fázi se nachází vzhledem k vnějšímu prostředí. Vědci se snaží odhalit kompletní kaskády dějů, které následují po zapnutí hodinového genu až k tvorbě cílového proteinu. Tyto kaskády by měly pomoci porozumět, jak je spínání určitého genu v buňce a následné změny ve fyziologii a chování ovlivněny rotací Země kolem své osy (URL 4). 15

16 2.3 Hlavni (centrální) a periferní hodiny Organizace hlavních (centrálních) hodin u živočichů je velmi podobná mezi fylogeneticky vzdálenými skupinami, jako jsou savci a hmyz. U těchto dvou tříd můžeme najít podobnosti v cirkadiánních rytmech. Oba dva typy cirkadiánních hodin jsou anatomicky a funkčně spojeny s činností zraku a disponují mnoha výstupními cestami, které umožňují synchronizaci s cykly světla a tmy a umožňují také kontrolu nad různými endokrinními, autonomními a behaviorálními funkcemi. Hlavním hodinám v mozku pomáhají řídit biologické rytmy v našem těle ještě tzv. periferní hodiny (oscilátory). Hlavní jsou proto, že zřejmě synchronizují všechny ostatní hodiny tak, aby s nimi byly v určité fázi, protože je nutné, aby organismus měl časový řád, aby na jeden pochod navazoval druhý, na ten navazoval třetí a tak dále. Mezi periferní hodiny patří např. oči, játra, ledviny, kůže a svaly u savců (Herzog a Tosini, 2001, Balsalobre, 2002) a oči, tykadla, malpigické trubice, hrudní žlázy, střevo, reprodukční orgány a mnoho citlivých míst na povrchu těla octomilek (Giebultowicz, 2001). Periferní oscilátory mohou autonomně generovat své vlastní rytmy a vykazují tedy určitou nezávislost na hlavních hodinách, které jsou v mozku (Schibler a Sassone-Corsi, 2002). Původně se myslelo, že pokud se z organismu vyřadí hlavní hodiny, jednotlivé hodiny na periferii postupně vyhasnou, rytmy se budou stále více tlumit, až dozní. Ale ukazuje se, že i periferní orgány mají poměrně velice silné rytmy. Dnes se přichází na to, že i jednotlivé orgány mohou mít kmity netlumené, že rozdíl mezi hlavními hodinami a jednotlivými orgány spočívá v něčem jiném. Můžeme si to představit jako orchestr. Když zmizí dirigent, začnou se jednotlivé nástroje rozcházet, každý začne hrát v nějakou jinou dobu, v nepatřičnou, a to, co předtím tvořilo krásný soulad zvuků, se najednou rozpadne. Tak je to, když nejsou v organismu hlavní hodiny. Rytmy nevymizí, ale desynchronizují se. Jiný čas bude např. v ledvinách, srdci, mozku. Tato desynchronizace může vést k velice těžkým důsledkům. Navíc se v jednotlivých hodinách začnou pozvolna desynchronizovat i jednotlivé buňky, protože každá buňka má vlastnosti oscilátoru. Je zajímavé, že mechanismus periferních oscilátorů je téměř stejný jako v hlavních hodinách. Přesto jsou však hlavní hodiny neobyčejně důležité a naprosto nutné k tomu, aby 16

17 koordinovaly hodiny periferní ke zhruba stejnému času. V tom smyslu jsou nezastupitelné. Periferní hodiny nejsou schopny tedy udržet denní oscilace po delší časové období. U octomilky (Drosophily) periferní hodiny ochabují dokonce in vivo (tzn. při normálním spojením s hlavními hodinami), jakmile jsou zvířata vystavena konstantním podmínkám (Plautz a kol., 1997). Podstatné je, že hlavní hodiny, umístěné v mozku, jsou ovlivněny střídáním světla a tmy, to znamená dnem a nocí. To je naprosto základní synchronizátor hlavních hodin. Periferní hodiny, jak se ukazuje, mohou ale reagovat i na jiné podněty. Nepřímo jsou sice také synchronizovány světlem, protože jsou řízeny hlavními hodinami a informace o světle k nim dojde skutečně jen prostřednictvím hlavních hodin. Periferní hodiny jsou ale s vnějším prostředím propojeny i jinak, podle toho, kde jsou uloženy. Například játra jsou orgán metabolický, který proměňuje živiny přicházející do těla v jiné látky, a tím pomáhá při hospodaření s energií pro celý organismus. A hodiny v játrech reagují naprosto jednoznačně na příjem potravin. Bude-li člověk jíst během dne v určitou limitovanou dobu, játra mohou být synchronizována právě tímto rytmem příjmu potravin Umístění hlavních hodin mozku U savců leží hlavní hodiny přímo v mozku, v části zvané hypothalamus (obr. 7). Jedná se o dva shluky nervových buněk, kterým říkáme suprachiasmatická jádra (SCN) (obr. 8, 9), protože jsou uložena u křížení pravého a levého zrakového (optického) nervu (chiasma opticum). Obr. 7 Znázornění stavby mozku u člověka (URL 5). 17

18 Obr. 8 Znázornění polohy SCN v lidském mozku. Podle Helfrich-Forster, (2004). Obr. 9 Znázornění SCN ležícího v mozku, v části zvané hypotalamus. SCN vysílá informace o světle a tmě do celého těla (URL 6). 18

19 Obr. 10 Znázornění hypothalamu Hypothalamus tvořící spodinu III. mozkové komory (URL 7). Podhrbolí (hypothalamus) tvoří spodinu III. mozkové komory (obr. 10). Spodina III. mozkové komory je bohatě prostoupena vlásečnicemi (Machová, 2005). Podhrbolí je v těsném spojení s hypofýzou, se kterou tvoří hypothalamo-hypofyzární komplex. Má četná zpětnovazebná spojení s vyššími i nižšími oblastmi, z nichž získává informace o vnitřním a vnějším prostředí. Hypothalamus je tvořen šedou hmotou, v níž jednotlivé skupiny buněk vytvářejí jádra a je nejdůležitější nadřazeným koordinačním centrem vegetativních funkcí. 24 hodinový chod oscilátoru SCN hypothalamu je určující pro ostatní fyziologické rytmy organismu. Synchronizuje totiž rytmy periferních buněčných oscilátorů, které mají na starost lokální rytmická řízení. Transplantační studie prokázaly, že SCN určuje periodu behaviorálních rytmů. V těchto studiích se používaly mutantní linie křečků tau, kteří mají periodu okolo 20 hodin. Dárcovské SCN získané od mutanta tau obnovilo 20 hodinový rytmus v arytmickém příjemci s poškozeným SCN, který měl 24 hodinový rytmus před poškozením. Naopak SCN wildtype 19

20 (standardní fenotyp) dárce obnovilo wildtype periodu u mutanta křečka tau (Ralph a kol., 1990). To je důkaz, že denní perioda je vnitřní vlastností SCN, a že vliv periody SCN je silnější, než vliv periody periferních oscilátorů. Nejnovější studie na geneticky arytmických myších (mcry1, mcry2 - dvojití mutanti) prokázaly tyto výsledky: Transplantace SCN z wildtype myší do dvojitých mutantů obnovila behaviorální rytmy. To dokazuje, že SCN samo o sobě, bez periferních oscilátorů, je schopné řídit rytmické chování. Navzdory těmto přesvědčivým důkazům pro SCN jako hlavních hodin, existují v mozku savců ještě další cirkadiánní hodiny. Dobře známý je potravou aktivovaný oscilátor, který zůstává funkční i po poškození SCN (Stephan, 2002). Tento oscilátor funguje dokonce i při absenci časového genu Clk (Pitts a kol., 2003), ale jeho přesné umístění zatím není známé. 20

21 2.3.2 Neurony cirkadiánního řízení v mozku U octomilky existuje přibližně 150 neuronů, které jsou umístěny v oblasti laterální a dorzální části mozku a jsou odpovědné za řízení cirkadiánních rytmů (obr. 11). U savců se SCN skládá z přibližně neuronů, které mají méně než 1mm v průměru. Obr. 11 Cirkadiánní časovač u hmyzu Znázornění uspořádání neuronů cirkadiánního řízení u octomilky. Nad laterálními neurony se nachází ventrální dorzální podskupiny neuronů, regulující motoriku při střídání světla a tmy. Nově popsané neurony s prokázanou periodicitou (lateral posterior neurons (LNPs)) by mohly být základem synchronizace s teplotním cyklem (střídání teplot). Podle Herzog, (2007). 21

22 U myši jsou neurony SCN rozděleny do dvou topograficky odlišných oblastí - ventrolaterálního jádra" a dorzomedialního pláště" (obr. 12A). Neurony ventrolaterálního jádra jsou kulovité, mají cytoplazmu, která obsahuje mnoho organel a jsou oddělené gliovými buňkami, komunikující pomocí spojů gap junctions a uzavírají tak synaptické spoje neuronů. Neurony jádra obsahují vazoaktivní intestinální polypeptid (VIP) a peptid histidinisoleucin (PHI). Některé neurony produkují dokonce ještě třetí molekulu gastrin - uvolňující peptid (GRP). V kontrastu k ventrolaterálnímu jádru, neurony dorzomedialního pláště jsou malé a protáhlé a obsahují pouze málo organel. Jsou pevně zaobaleny a těsně k sobě naskládány a vzájemně propojeny somato-somatickými kontakty (Van den Pol, 1980). Z neuropeptidů zde produkovaných je obsažen hlavně vasopresin (VP), enkefalin a dynorfin. Malá část somatostatin (SS) - produkujících neuronů se nachází mezi ventrolateralním jádrem a dorzomedialním pláštěm. SS se nepřekrývá ani s VIP ani s VP. Další neuropeptidy zřetelné v SCN nemají jasnou topografickou pozici (např. angiotensin II, bombesin, kalcitonin, cholecystokinin, galanin, neurotensin, apod.). Jako klasické neurotransmitery obsahuje většina neuronů SCN ještě γ-aminomáselnou kyselinu (GABA). Ventrolateralní jádro je charakterizováno hustým zakončením aferentních vláken a dorzomedialní plášť obsahuje více eferentních vláken než ventrolateralní jádro. Většina z nich sahá až k dalším oblastem hypothalamu (Moore, 1996, Van Esseveldt a kol., 2000, Abrahamson a Moore, 2001). Regulace genů se liší v obou částech SCN. Některé neurony mají na starosti hlavně vstup světla z fotoreceptorových orgánů, jiné jsou zodpovědné za mezibuněčnou komunikaci buď v rámci jedněch hlavních hodin nebo mezi hlavními hodinami obou mozkových hemisfér a třetí skupina je zaměřena hlavně na přenos denních signálů směrem k mozkovým regionům mimo stimulující centrum. 22

23 Obr. 12 Organizace hlavních hodin u křečka (savec) - A a švába (hmyz) - B Jsou zobrazeny pouze neurony SCN (A) a ame (B) levé hemisféry. Podle Helfrich-Forster, (2004) Accessory medulla (ame) ame (obr. 12B, 13) byla poprvé objevena u holometabolického hmyzu jako pozůstatek larválního optického neuropilu (Pflugfelder, 1936, Hanstrom, 1940, Ehnbohm, 1948). Po metamorfóze larvální zrakový neuropil ztrácí svůj původní význam a stává se z něho centrum cirkadiánních rytmů. V mnoha případech však toto centrum zůstává inervováno extraretinalními fotoreceptorovými buňkami. Je zajímavé, že ame je přítomna také u hemimetabolického hmyzu, který nepotřebuje larvální optické centrum, protože už larvy mají funkční složené oči (Homberg a kol., 1991). U těchto druhů hmyzu ame obstarává čistě funkce cirkadiánních hodin. ame je nejlépe popsána u švábů (Leucophaea maderae). ame se skládá se ze sítě neuritů a dendritů, které pocházejí z neuronů. Těla neuronů leží v anterioventrální mozkové kůře a mají velikost µm. ame má tvar hrušky a je strukturována jako nodulární jádro a plášť, který obklopuje jádro stejně jako SCN u savců. 23

24 Jádro obsahuje hlavně lokální interneurony (Mas-alatotropin, imunoreaktivní neurony), nebo krátké" neurony, které spojují ame s přilehlou dření (GABA, leukokinin neurony), zatímco plášť se skládá z neuronů, které spojují ame na delší vzdálenosti s různými oblastmi mozku a se zrakovými laloky. Jádro ame dostává informace o vstupu světla, stejně jako jádro SCN. V případě švábů však tento vstup není přímý. Dochází k němu prostřednictvím vložených interneuronů, které mají tangenciální dendritické výběžky v medulle a skrze distální trakt, který se skládá z GABA-ergních neuronů (Petri a kol., 2002). Z výstupních drah ame pláště do dalších oblasti mozku jsou nejlépe popsány PDF-neurony. Pokud je ame odděleno od protocerebrea přetnutím optické stopky, živočichové se začínají chovat arytmicky. Obnovení rytmičnosti souvisí s regenerací PDF vláken vybíhajících z ame do středového protocerebrea (Stengl a Homberg, 1994). Ke stejné situaci dochází, pokud je ame rytmického dárce transplantována do arytmického hostitelského švába, což umožní opětovný růst PDF vláken. To znamená, že PDF-neurony mohou poskytnout spoje mezi hodinami a oblastmi, které řídí motoriku v protocerebreu. Zatímco živočichové s přerušenou optickou stopkou vykazují reinervaci všech oblastí v protocerebreu, k regeneraci u živočichů s transplantovanou ame došlo hlavně v oblasti horního středního a laterálního protocerebrea, což naznačuje, že tyto oblasti mohou být důležitější pro časovou kontrolu motoriky než ostatní oblasti (Helfrich-Forster, 2004). ame octomilky není tak dobře prostudováno jako ame švába. Tvar ame octomilky nemá přesně definovaný tvar, je špatně rozeznatelná od přilehlé medully a byla prostudována pouze ve vztahu k PDF-neuronům (Helfrich-Forster, 1997). Není také známo, jestli ame octomilky obsahuje další neuropeptidy a jaké klasické neurotransmitery používá. Chybí také anatomické rozlišení mezi jádrem a pláštěm. Nicméně octomilka je jediným zástupcem hmyzu, u kterého bylo prokázáno, že PDF-neurony, které vstupují do ame, exprimují hodinové geny rytmických způsobem (Helfrich-Forster, 1995, Kaneko a kol., 1997). Existují dvě skupiny PDF neuronů - LN v s malými a velkými těly (s-ln v malé a l-ln v velké). U těchto dvou skupin PDF-neuronů jsou hodinové geny řízeny rozdílně. Maxima hladin per/tim se objevují o 4 hodiny dříve v l-ln v než ve s-ln v (Shafer a kol., 2002). Dále l-ln v vykazuje silné oscilace pouze za podmínek LD (L-světlo, D-tma) cyklu, při stálých podmínkách oscilace ochabuje u l-ln v, ale pokračuje u s-ln v (Kaneko a kol., 2000, Yang a Seghal, 2001, Veleri a kol., 2003). Nejen hodinové geny, ale také peptidy PDF jsou řízeny odlišně u obou skupin LN v. U s-ln v jsou hodinové proteiny Clk a cyc nezbytné pro přepis pdf-genu (Park a kol., 2000), zatímco vri-protein potlačuje akumulaci PDF peptidu (Blau a Young, 1999). U l- LN v se hladiny PDF vyskytují nezávisle na Clk, cyc nebo vri. s-ln v sahá až do dorzálního 24

25 protocerebrea, které je nejdůležitější oblastí pro kontrolu motoriky. Zdá se tedy, že buňky s- LN v jsou podobně důležité při výstupních drahách jako neurony pláště ame u švábů a plášťové neurony SCN (Helfrich-Forster, 2004). Obr. 13 Znázornění medully a ame u Drosophily LN (LN d a LN v ) jsou nejdůležitější neurony cirkadiánního pacemakeru (časovače), AL (antennal lobe) - tykadlový lalok, CC (central complex) - centrální komplex, MB (mushroom body) - houbové těleso, PI (pars intercerebralis). Podle Helfrich-Forster, (2004). 25

26 2.4 Úloha sítnice a retinohypothalamického traktu savců Suprachiasmatické jádro má topografický a funkční vztah k zrakovému systému. Proto, aby byly oscilace vnitřních signálů přesně sladěny s astronomickým cyklem světla a tmy, mají zásadní roli sítnice (retina) a navazující dráhy retinohypothalamického traktu. Speciální trakt - retinohypothalamický trakt (RHT) začíná v oblasti gangliových buněk sítnice a vede přímo do SCN (Moore, 1973, Hattar a kol., 2002). Výběžky (axony) gangliových buněk tvoří nervus opticus (obr. 14), který vede vjemy do týlního laloku mozku, část drah však končí již v mezimozku v jádrech hypothalamu, odkud se podílí na hormonálním ovlivňování organismu. Proto jsou gangliové buňky důležité pro synchronizaci vnitřních hodin. Obr. 14 Schéma stavby sítnice Šipky označují místo dopadu světla. 1 - tyčinky, 2 - čípky, 3 - horizontální buňky, 4 - bipolární buňky, 5 - amakrinní buňky, 6 - gangliové buňky, 7 - zrakový nerv. Podle Machová, (2005). 26

27 SCN je dále spojeno multisynaptickou cestou s šišinkou. Šišinka (pineální orgán, nadvěsek mozkový, epifýza) je shora připojena k mezimozku. Produkuje hormon melatonin, který rozhodujícím způsobem ladí cirkadiánní (24 hodinovou) biologickou rytmicitu ostatních funkcí organismu (obr. 15). Množství uvolněného melatoninu se mění v průběhu čtyřiadvacetihodinovém cyklu. Nejvyšší koncentraci dosahuje v noci a pro život je nepostradatelný. Obr. 15 Znázornění účinku světla/tmy při cirkadiánním rytmu Sítnice detekuje střídání světla a tmy a vysílá dále informace do suprachiasmatického jádra, které je multisynaptickou cestou spojeno s šišinkou. Šišinka produkuje hormon melatonin, který rozhodujícím způsobem ladí cirkadiánní rytmicitu ostatních funkcí organismu (URL 1). 27

28 Obr. 16 Vzorec melatoninu (URL 8) Melatonin Melatonin (obr. 16) je derivát hydroxyindolu, obdobně jako serotonin, přesně N- acetyl-5-methoxytryptamin. Byl izolován A. Lernerem z hovězích epifýz (URL 9). Od té doby byl melatonin nalezen ve všech dosud zkoumaných živých organismech, od jednobuněčných mořských řas až po vyšší rostliny, bezobratlé živočichy jako jsou ploštěnky a obratlovce - plazy, ptáky i savce, včetně člověka. Jednou z nejdůležitějších funkcí melatoninu je spouštění nočního cyklu odpočinku a obnovy sil. Během spánku se hladina melatoninu zvýší v celém těle, kde přímo či nepřímo obnovuje poškozené buňky a pomáhá organismu při regeneraci. Hladina melatoninu vrcholí kolem druhé nebo třetí hodiny ráno, zvyšuje počet imunitních buněk a povzbuzuje obranyschopnost organismu. Podstatné je, že u všech živých organismů, ať už jsou aktivní ve dne jako člověk nebo v noci jako malí hlodavci, se melatonin tvoří výhradně v noci. Je to tedy jakýsi signál noci, který předává do organismu informaci o denní době. Aktivita enzymu v epifýze je v noci až stonásobně vyšší než ve dne. Cirkadiánní rytmus v tvorbě melatoninu pokračuje i tehdy, žijí-li živočichové v neperiodickém prostředí, např. ve stálé tmě. V takovém případě biologické hodiny volně běží" s periodou velice blízkou, ale nerovnající se 24 hodinám a vysoká tvorba melatoninu vyznačuje subjektivní noc jedince. K 24 hodinovému dnu jsou biologické hodiny a tudíž i rytmická tvorba melatoninu synchronizovány pravidelným střídáním světla a tmy. 28

29 2.5 Molekulární základ cirkadiánních rytmů Molekulární biologie pokročila natolik, že byly izolovány geny, které jsou zodpovědné za cirkadiánní rytmicitu. Byl také nalezen mechanismus, jak se mnohými zpětnými smyčkami, ať už pozitivními nebo negativními, tento zhruba 24 hodinový rytmus v organismu tvoří. Průlomem bylo tedy objevení molekulární podstaty této rytmicity. Molekulární mechanismy cirkadiánních hodin byly odvozeny hlavně ze studií dvou druhů: myši jako zástupce savců a octomilky (obr. 17) jako zástupce hmyzu z řádu Diptera. Octomilky jsou to drobné mušky hojné v domácnostech na zralém ovoci. Jsou v obrovském rozsahu používány jako modelový organismus, zejména v genetice. Z genetického hlediska jde o bezkonkurenčně nejlépe prozkoumaného zástupce říše hmyzu (URL 10). Obr. 17 Vývoj octomilky obecné, dospělý samec a samička (URL 11). 29

30 Existuje pro to řada důvodů: Je malá a snadno se chová v laboratoři. Má krátkou generační dobu (2 týdny) a vysokou plodnost (samičky mohou naklást 500 vajíček v 10 dnech). Má jen 4 páry chromozomů: 3 autozomy a 1 pohlavní chromozom. Největší drozofilí chromozóm má přibližně stejnou velikost jako nejmenší lidský. U samců nedochází k rekombinaci, což usnadňuje genetické studie. Octomilky vykazují pohlavní dvojtvarost: samičky mají přibližně 2,5 mm, samečci jsou o něco menší. Samečky lze od samiček snadno rozlišit podle rozdílů ve zbarvení (u samečků se vyskytuje odlišné zbarvení zadečku (tmavý konec) a pohlavní hřebínky (řada tmavých štětinek na tarsu předního páru nohou). Kromě toho mají samečkové věneček špičatých chloupků (štětinek) obklopujících řiť a genitálie, který se používá při páření pro přichycení k samičce (URL 12). Laboratorní myš (myš domácí, Mus musculus) má směsný původ. Kmeny laboratorních myší pocházejí jednak ze západoevropské Mus musculus domestici a jednak z východoevropské Mus musculus musculus. Z tohoto důvodu se laboratorní myš konvenčně označuje jako Mus musculus (obr. 18). Jako modelový organismus má několik nevýhod - relativně dlouhou generační dobu (3 měsíce), značnou velikost genomu, nepřístupnost časného embrya a poměrně drahý chov (Žurovec, 1999). Naopak výhodou tohoto systému je možnost provádět cílenou mutagenezi a zmražovat embrya. Myši se velmi ochotně a rychle množí, jsou dost malé, takže je lze snadno převážet a navíc je jejich genom velmi podobný lidskému. Okolo 99 % myších genů totiž odpovídá lidským - a je na místě otázka, proč se člověk od myší tolik liší. Podle názoru mnoha vědců tkví odpověď ne v genech jako takových, ale v jejich odlišném zapínání nebo vypínání (tedy v systémech genových regulací). Doba života myši je v laboratoři 1 až 2 roky, doba březosti 19 až 20 dní, počet mláďat bývá 6 až 8, doba odstavení mláďat 3 týdny, mláďata dosahují pohlavní dospělosti ve věku asi 6 týdnů. Přibližná váha myši při narození bývá asi 1 g, dospělci váží 30 až 40 g (samec>samice). 30

31 Obr. 18 Myš domácí (Mus musculus) (URL 13). 31

32 2.5.1 Hodinové geny u octomilky a myši U octomilky bylo popsáno nejméně 7 hodinových genů. Tyto geny jsou označovány předponou dm. dmclock (dmclk) dmcycle (dmcyc) dmperiod (dmper) dmtimeless (dmtim) doubletime (dmdbt) dmcryptochorme (dmcry) dmvrille (dmvri) Transkripce dmper a dmtim probíhá od ranních hodin do poledne. Toto tvrzení vyplývá z úrovně RNA píků, které dosahují vrcholu brzo večer. Nově syntetizovaný monomerní dmper v cytoplazmě je fosforylován v přítomnosti dmdbt - kinázy, která je homologem kasein kinázy. Dmdbt je cílem pro rychlou degradaci dmper a světlo stimuluje rychlou degradaci dmtim prostřednictvím proteozomů (Edery, 2000). Identifikace hodinových genů u myši je podobná sekvenci genů u octomilky, kromě toho, že v některých případech existuje více homologů. Tyto geny jsou označovány předponou m. Mezi hodinové geny u myši patří: mper - 3 homology - mper1, mper2, mper3 mclock mbmal1 mcry1, mcry2 mtim Kryptochrom (cry) je receptor modrého světla u octomilky, ale u myši funguje jako transkripční inhibitor mclock a mbmal. Period a Timeless blokují aktivaci cirkadiánních transkripčních aktivátorů Clock a Cycle (homolog Cycle pro myši je Bmal1). 32

33 Zdánlivý homolog dmtim, mtim u savčích cirkadiánních oscilací není v současné době objasněný. Pouze myší gen Clock byl identifikován při hledání genetické strategie, jakým způsobem izolovat mutace, které ovlivňují rytmické chování (Edery, 2000). mclock a mbmal1 stimuluje hromadění mper1, mper2, mper3, mcry1 a mbmal1 během dne. mper2 funguje jako pozitivní regulátor Bmal1 smyčky a je potřebný pro cirkadiánní oscilaci při expresi mper1 a mper2. mcry1 a mcry2 tvoří pár s každým z mpers2 a jsou tímto způsobem přemístěny do jádra (obr. 19). 33

34 Obr. 19 Model cirkadiánních hodin v SCN Tří různé mpers (mper1, P1, mper2, P2, mper3, P3) reagující mezi sebou navzájem a mezi dvěma různými mcrys (pouze jeden Cry je znázorněn pro zjednodušení). mcry1, mcry2 nebo oba reagují s Clock a Bmal1 a inhibují jejich transkripci. mper2 slouží jako regulátor Bmal1, který se hromadí během dne. Funkce mper1 a mper3 není objasněna, ale existují důkazy pro to, že mper3 reguluje vstup mper1 a mper2 do mcry. Podle Edery, (2000). 34

35 2.5.2 Zpětnovazebná smyčka u octomilky a myši U obou druhů (octomilka, myš) je cirkadiánní rytmus tvořen dvěma zpětnovazebnými smyčkami, které jsou navzájem molekulárně propojeny. Některé produkty hodinových genů působí negativně - zablokují přepis, jiné zase působí pozitivně, budou přepis aktivovat. Stálé se hledají geny, které jsou zapínány a vypínány s 24 hodinovou rytmicitou a zkoumá se, ve kterou denní dobu se přepisuje konkrétní mrna. První (hlavní) zpětnovazebná smyčka vede ke genové expresi a k akumulaci proteinů, které jsou nezbytným předpokladem rytmického chování. Tato smyčka generuje oscilace kolem střední hodnoty s určitou periodou. Pokud tedy produkt genové exprese tlumí, např. prostřednictvím cytoplazmatických poslů transkripci svého vlastního genu a tedy svou vlastní syntézu, je položen základ oscilujícího systému, jehož rytmus je v případě hodinových genů zhruba 24 hodinový. Druhá zpětnovazebná smyčka doplňuje hlavní smyčku tím, že kontroluje expresi buď Clock genů (octomilka) nebo Bmal1 (myš) rytmickým způsobem. Dalším zásadním rozdílem mezi octomilkami a myši spočívá v účinku světla na zpětnovazebné smyčky. Světlo vede k degradaci dmtim u octomilky, ale u myši způsobuje transkripci genů mper1 a mper2. Navzdory těmto rozdílům je molekulární stavba hodin hlavní zpětnovazebné smyčky octomilek nápadně podobná myším (Helfrich-Forster, 2004). 35

36 2.5.3 Cirkadiánní rytmy u octomilky U octomilek lze pozorovat cirkadiánní rytmy v pohybové aktivitě - jsou aktivní v době svého subjektivního dne, a to i v neperiodickém prostředí a při líhnutí z kukel. Líhnou se vždy v časných ranních hodinách. Za oba tyto cirkadiánní rytmy je u octomilek zodpovědný jeden gen. Tento gen se nazývá per, neboť kóduje tvorbu produktu podmiňujícího opakující se děje o periodě přibližně 24 hodin. Chemickou cestou nebo ozařováním byly připraveny cirkadiánní mutanti octomilek, tj. octomilky se změněnou periodicitou: per O, per S a per l. Octomilka s genem per O je arytmická. Nebyly u ní pozorovány cirkadiánní rytmy ani v pohybové aktivitě ani v líhnutí. Je-li však do zárodečné buňky této octomilky vpraven gen per z divokého, rytmického kmene, bude se octomilka s původním genem per O chovat také rytmicky. Octomilky s genem per S mají periodu cirkadiánních hodin pouze 19 hodinovou (s je z anglického short, tj. krátký), octomilky s genem per l mají periodu 29 hodinovou (l je z anglického long, tj. dlouhý). Gen per byl již izolován a pořadí bází v DNA bylo také stanoveno. Gen kóduje per-protein, který obsahuje okolo 1200 aminokyselin. Bodová mutace jedné jediné báze a následná změna jedné z aminokyselin v per-proteinu vede k výraznému zkrácení (per S ) nebo naopak k prodloužení (per l ) vnitřní periody (URL 14). 36

37 Obr. 20 Zpětnovazebná smyčka tvorby per proteinu Na per-genu se přepisuje mrna, vzniká a hromadí se per-mrna, na ní se překládá per-protein, hromadí se a při větším množství začíná blokovat přepis per-mrna z per-genu. Vlnovka označuje cirkadiánní rytmus (URL 14). mrna vzniklá transkripcí genu je tedy přítomná ve větším množství pouze v určitou denní dobu. Protein, který vzniká na matrici mrna, je proto přítomen také jen v určité denní době. Je-li přítomen, ovlivňuje jako transkripční faktor negativně přepis svého vlastního genu a zpětnovazebná smyčka se uzavírá. Modifikovaný protein by však také mohl ovlivnit transkripci dalších genů kontrolovaných hodinami. Cyklický přepis těchto genů ústí v konečné fázi ve výstupní měřitelné cirkadiánní rytmy (obr. 20) Zpětnovazebná smyčka tvorby per-proteinu Per-protein se tvoří periodicky v mozku octomilky. Maximálních koncentrací dosahuje v pozdní subjektivní noci, tj. k ránu. U arytmických octomilek s mutací per O se hladina proteinu cyklicky nemění. U octomilky s genem per S se hladina proteinu mění s periodou 19 hodin, u octomilky s per l s periodou 29 hodin. Perioda cyklické tvorby perproteinu odpovídá periodě rytmu v pohybové aktivitě nebo líhnutí. Cyklickým změnám 37

38 v hladině per-proteinu předcházejí cyklické změny v množství odpovídající mediátorové ribonukleové kyseliny (per-mrna). Tato mrna se přepisuje v jádře buňky z DNA pergenu. Na mrna je pak jako na matrici tvořen per-protein. Per-mRNA dosahuje maxima v časných nočních hodinách, o 6-8 hodin dříve než vlastní per-protein. Vzhledem k tomu, že per-protein je lokalizován v mozku octomilek v jádrech nervových buněk (jaderný protein), nabízí se představa, že by mohl v jádře buňky ovlivňovat přepis své vlastní mrna z per-genu (URL 14). Zpětnovazebná smyčka by potom vypadala takto: na per-genu (DNA) se začíná přepisovat mrna pro tvorbu per-proteinu, vzniká a hromadí se per-mrna, na ní se překládá per-protein, hromadí se a při větším množství začíná blokovat (inhibovat) přepis per-mrna z per-genu. Množství per-mrna klesá a v důsledku toho klesá i množství per-proteinu. K přijetí představy o fungování této zpětnovazebné smyčky však bránila skutečnost, že perprotein se na DNA neváže a nemůže sloužit jako přímý regulační faktor. Výzkumy v posledních letech však ukázaly, že per-protein by přesto regulačním faktorem mohl být a také by mohl ovlivňovat přepis vlastní mrna. Per-protein totiž obsahuje ve své molekule oblast zvanou PAS, kterou se může vázat s jinými proteiny obsahujícími obdobnou oblast a tvořit s nimi dimery (sloučeniny vzniklé spojením dvou molekul monomeru). Tyto jiné proteiny pak mohou mít schopnost vázat se na DNA v jádře a ovlivňovat transkripci. Jako dimer může být zřejmě per-protein navázán na per-gen. 38

39 U všech zkoumaných organismů je systém zpětnovazebných smyček podobný tomu, který byl objeven u octomilky (obr. 21). Obr. 21 Molekulární model cirkadiánního rytmu a) Model zpětnovazebné smyčky trvalých rytmů. Periodické chování vzniká, když mezi aktivací (A) a sebepotlačením (R) dochází ke zpoždění (znázorněno pomocí trojúhelníku). b) Molekulární části zpětnovazebné smyčky tvořící cirkadiánní rytmus u hmyzu a myši. Podle Herzog, (2007). 39

40 2.5.5 Nastavování biologických hodin per-proteinem Je-li per-protein a jeho tvorba součástí zpětnovazebné smyčky, mělo by umělé zvýšení tvorby per-proteinu v neodpovídající době vést k fázovému posunu časovače a k jeho přesunu do jiného vnitřního času. Vpraví-li se do zárodku octomilky takový per-gen, který umožní zahájit tvorbu per-proteinu pomocí teplotního podnětu, pak v závislosti na době působení tohoto podnětu může dojít nejen k prudkému vzrůstu tvorby per-proteinu, ale současně i k fázovému posunu, k předběhnutí rytmu v pohybové aktivitě. Změna koncentrace per-proteinu tedy může vyvolat i změnu fáze hodin. Rytmický přepis mrna, analogický s per-mrna octomilky, byl nalezen i v biologických hodinách jiných organismů, např. v SCN potkana. Tato mrna se ve větším množství přepisuje z DNA v době subjektivního dne než v době subjektivní noci. Je-li však potkan v noci osvícen, světelný podnět okamžitě fázově posune cirkadiánní časovač do jiného času a dojde k prudkému vzestupu transkripce. I v cirkadiánním časovači savců dochází tedy v okamžiku fázového posunu ke změnám v této mrna, která může být i součástí hodin savců (URL 14). 40

41 3. Experimentální část 3.1 Cíl experimentu Cílem experimentální části diplomové práce bylo analyzovat průběh pohybové aktivity švába amerického (Periplaneta americana, řád Blattodea) (obr. 22) během 24 hodin vyhodnocením již dříve získaných dat. 3.2 Úvod experimentální části Zástupci řádu Blattodea jsou oblíbeným modelovým objektem laboratorních, neurofyziologických, behaviorálních a jiných experimentů. Mají jako jiný hmyz rychlý generační čas a především relativně robustní tělo s velkým nervovým systémem umožňující spojení elektrofyziologických a anatomických metod. Mnoho informací o fungování cirkadiánních hodin hmyzu a o strukturách mozku, které jsou za řízení přirozené rytmicity odpovědné, bylo získáno na švábech např. rodu Nauphoeta (Sauders a kol., 1977) Blaberus (Fleissner a kol., 2001) nebo Leucophaea (Fleissner a kol., 2001, Petri a kol., 2002, Homberg a kol., 2003, Schneider a Stengl, 2007). Biologie švábů: Zploštělé tělo švábů má dobře vyvinutou předohruď, která jako štít přikrývá shora i hlavu. Hlava nese dlouhá tykadla, pár složených očí a pár jednoduchých oček. Ústní orgány jsou kousací, většina druhů je omnivorních. Přední pár křídel bývá kožovitý (tegminální) až krovkovitý, druhý pár je blanitý. Samice mívají křídla často zkrácená, u některých druhů jsou křídla u obou pohlaví zcela zakrnělá. Na konci těla jsou článkované štěty a u samců ještě nečlánkované styli. Samice kladou vajíčka ve společných obalech - ootekách. Volně žijící druhy se vyskytují většinou v tropech jako epigeické lesní formy, zdržující se pod opadaným listním a v humusu. U nás je asi 8 druhů, z nichž pět žije volně a tři jsou synantropní (žijící s lidmi). Celkem je známo asi 4000 druhů (Sedlák, 2006). 41

42 Obr. 22 Šváb americký (Periplaneta americana) (URL 15). Šváb americký je původem ze Střední a Jižní Ameriky, sekundárně má jako synantrop kosmopolitní rozšíření v tropech a subtropech celého světa. Dorůstá téměř do 4 cm, obě pohlaví jsou okřídlená. U nás se vyskytuje spíše v chovech, odkud může unikat (Sedlák, 2006). Švábi jsou pokládáni za zvířata noční a dá se proto předpokládat vrchol jejich motorické aktivity v nočních hodinách, zatímco minimum během dne. Výzkum denního rozložení motorické aktivity švába amerického během dne s trvání světelné a tmavé fáze 12:12 hodin byl zkoumán Robertsem (1974). Výsledný záznam (graf) na obr. 23 svědčí o tom, že vrchol pohybové aktivity je největší v noci mezi až hodinou, což je patrné zejména z grafu B a minimum je na konci světelné fáze mezi až hodinou - patrné zejména z grafu B, C, D. V laboratoři Neuroetologie a smyslové fyziologie Oddělení srovnávací fyziologie a imunologie, kde byla tato práce vypracovávána, bylo v průběhu testů pohybové aktivity švába amerického pořízeno několik 24 hodin trvajících záznamů. Tyto záznamy byly určeny pro analýzu průběhu motorické aktivity s cílem zjistit, kde leží maxima a minima aktivity Periplaneta a jako vodítko pro stanovení nejvhodnějšího časového okna pro studium vlivů jiných smyslových podnětů. Provedení této analýzy bylo hlavním úkolem experimentální části diplomové práce. 42

43 Obr. 23 Znázornění pohybové aktivity 4 jedinců (Leucophaea maderae) v LD 12:12 hodinovém cyklu Na všech grafech je patrné, že pohybová aktivita je největší v noci - patrné zejména na grafu B. Období nejvyšší aktivity nastává asi 1 až 2 hodiny po začátku tmavé fáze - patrné zejména na grafech A a D. Nejmenší aktivita je na konci světelné fáze, kolem až hodin - patrné zejména z grafů B, C, D. Podle Roberts, (1974). 3.3 Materiál a metody experimentální části Experimentální zvířata byla vybírána z chovu, kde byla udržována teplota 25 C (±2 C) a délka dne a noci nastavena na 12:12 hodin. Světlá část dne začínala v 6.00 a končila v Švábi vybraní pro experiment byli imobilizováni chladem a individuálně umisťováni do Petriho misek o průměru 15 cm v 15 hodin (± 30 minut). Misky pak byly umístěny na skleněnou desku, skrze kterou byl pohyb zvířat zespodu monitorován kamerou (Ikegami, Japan) a obraz byl automaticky každou minutu ukládán do počítače. Aréna byla vyrobena z bílého plastu a přikryta bílým plexisklem, nad kterým svítila 40 W bílá žárovka. Bílé osvětlení se spínalo časově identicky s chovem. Kromě žárovky trvale svítil zdroj infračerveného světla (sada LED), který umožňoval sledovat aktivitu švábů i v temnostní fázi, kdy žárovka nesvítila. Každá miska byla ohrazena papírovým okrajem tak, aby neexistoval vizuální kontakt mezi zvířaty. V testovacím zařízení byla teplota nastavena na 22 C a regulována v rozmezí ± 2 C. 43

44 V aréně bylo najednou testováno 10 zvířat, testy probíhaly ve dnech (1. 9., 8. 9., , , , ). Celkem bylo testováno 60 zvířat (jeden byl vyloučen z důvodu špatné viditelnosti na snímku). V průběhu 24 hodin jednoho experimentálního dne tak vznikla série 1440 snímků. Aktivita každého zvířete se vyhodnocovalo zvlášť tak, že v prohlížeči obrázků na počítači byly vizuálně zaznamenávány změny poloh osy těla větší než 15. V případě pochyb, byl přesný úhel na obrazovce změřen pomocí programu Screen Protractor. Počty změn polohy těla se zaznamenávaly v 30 minutových intervalech. Celkový počet všech rotací těla pro všechna zvířata v daném časovém intervalu byl podělen počtem zvířat a vynesen do histogramu - aktogramu pohybové aktivity. 3.4 Výsledky a diskuse experimentální části Obr. 24 uvádí výsledný záznam časového průběhu motorické aktivity získaný na 59 jedincích švába amerického. Sloupce histogramu ukazují aktivitu (počet otáček těla větších než 15 ) vztažených na jednoho jedince pro 48 30ti minutových intervalů od hodin do hodin dalšího dne. Předložené výsledky umožňují stanovit jako časovou periodu (okno) minimální aktivity interval mezi 4.30 až 5.00 hodin. Jako periodu maximální aktivity lze označit období mezi až hodin. Celkově je pohybová aktivita větší v tmavé fázi dne ve srovnání se světelnou fází. Aktivita prudce vzrůstá začátkem tmavé fáze, postupně klesá směrem k ránu, nejnižší aktivita se nachází před rozsvícením a v průběhu dne je zhruba konstantní (nízké hodnoty). Rovněž je patrný dočasný vzestup aktivity jako reakce na změnu osvětlení, a to jak rozsvícení v 6.00, tak zhasnutí v Zajímavé je, že k nárůstu aktivity dochází již v období před večerním zhasnutím světla - okolo 16. hodiny. Tento nárůst pak pokračuje prudkým vzrůstem reagujícím na zhasnutí a navazující období představuje vrchol celkové aktivity švábů. Výsledky potvrzují dříve publikovaná data, že noční aktivita švábů je celkově vyšší než aktivita denní. Potvrzuje se také dočasný nárůst aktivity při změnách osvětlení. Získané výsledky se však liší od publikovaných zejména polohou fáze nejmenší aktivity. Zatímco v práci Robertse (1974) je nejmenší aktivita švábů patrná v období na konci světelné fáze, v našich datech je obdobím největšího klidu konec tmavé fáze a konec světelné fáze je naopak doprovázen večerním nárůstem aktivity. 44