Úvod do studia biologie kmenových buněk. Jiří Pacherník tel:

Transkript

1 Úvod do studia biologie kmenových buněk Jiří Pacherník tel:

2 Co jsou kmenové buňky? - buňky schopné vlastní obnovy (sebeobnova) - buňky schopné dávat vznik jiným typům buněk (schopnost diferenciace / rozrůzňování)

3

4 Kmenové buňky v dospělém organismu

5 Původ kmenových buněk

6 SC auto- a parakrinně působící faktory niche diferenciace & proliferace Vnější faktory zodpovědné za zachování kmenových buněk diferenciace & proliferace

7 Niche (Naveiras, 2006)

8 Pluripotentní embryonální kmenové buňky ES EG EC Donovan 2001 Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cells ES) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cells EG) Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells EC)

9 Diferenciační potenciál ES buněk odvozených z vnitřní buněčné masy Gilbert 1997 / Bílek 2004

10 Verifikace kmenových buněk sebeobnova x schopnost diferenciace Embryonální kmenové buňky - specifické znaky/markery a vlastnosti - diferenciace in vitro - diferenciace in vivo - chiméry - teratomy Somatické kmenové buňky - specifické znaky/markery a vlastnosti - sebeobnova opakované transplantace - diferenciace in vitro - diferenciace in vivo

11 Diferenciace ES / EC buněk in vitro kultivace indukce selekce a) Embryoidní tělíska (Embryoid bodies - EB) +jednoduché, více buněčných typů + tolerující genotyp - špatně definované podmínky Rathjen 1998 / Bílek 2004 b) V monovrstvě + lépe definovné podmínky - malá výtěžnost - silně závislé na genotypu (myš)

12

13 izolace Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk kultivace indukce progenitory selekce diferencované buňky ES buňky somatické kmenové buňky

14 izolace Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk v našich experimentech kultivace indukce progenitory selekce diferencované buňky ES buňky s geneticky modifikovanými faktory podezřelýmy z regulace fenotypu somatických kmenových buněk specifické inhibitory somatické kmenové buňky - četnost vzniklých somatických kmenových buněk - jejich vlastnosti (fenotyp a potenciál pro další diferenciaci)

15 Neurogeneze

16 Hematopoéza

17 Laboratoř

18

19 Příklad signální kaskády cytokinů na dráze transdukce signálu interleukinu-6 (IL-6) JAK Janusova kináza (tyrosin kináza) STAT transduktor signálu a aktivátor transkripce (signal transducer and activator of transcription) Heinrich 2003

20

21 Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.a A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu Ross, 2000

22 Kyselina retinová - RA velmi silný induktor pleiotropní působení McCaffery a Dräger, 2000 ES / EC + EB + RA buňky neurální buňky kosterní svaloviny a adipocyty buňky srdeční a hladké svaloviny nm RA ES / EC + monovrstva + RA buňky primitivního entodermu neurální buňky (motoneurony?)

23 Serinové a threoninové zbytky fosforylované ( ) u RAR/RXR receptorů, ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné (čísla) AF-1 DBD LBD/AF-2 N- A/B C D E F -C RARa1 EEIVPS 74 PPS 77 PPPLPR RKRRPS 369 RP RARb2 RARg2 EELVPS 67 PPS 70 PLPPPR EEMVPSS 66 PS 68 PPPPPR MAPKs + cdk7 RKRRPS 362 KP RRRRPS 360 QP PKA RARg1 EEMVPSS 77 PS 79 PPPPPR RRRRPS 371 QP AF-1 DBD LBD/AF-2 RXRa A/B C N- -C D E SSSLNS 22 PTGR.S 44 P.. S 48 P.. S 54 P SS 61 P.. SS 75 P..PTT 87 P S 96 P..S 101 P LNPSS 265 PNDP AF-1 (A/B doména) oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu DBD (C doména) DNA vázající doména (DNA-binding domain) LBD/AF-2 (D/E doména) oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu JNK1 + JNK2

24 Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních (RARE-LacZ reportér) X-Gal RA b-galaktozidáza X-Gal X-Gal X-Gal X-Gal RA RA RA RAR RXR Xn* RARE * LacZ *další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru

25 Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc) A) In situ hybridizace mrna RALDH-2 B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter) Detekce buněk exprimujících indukovanou b-galaktosidázu McCaffery, 2000

26 Relative luciferase activity Relative luciferase activity AG490 (mm) LIF RA c a5 a40 L La5 La15 La40 R LR LRa5 LRa15 LRa RA i il ir ilr i-uo il-uo ir-uo ilr-uo i-ag il-ag ir-ag ilr-ag LIF AG490 (5 mm) UO126 (5 mm)

27 Protilátky Ab = antibody - produkt B-lymfocytů/plasmatických buněk - rozpoznání cizorodého materiál antigenu => regulace imunitních/obranných reakcí - detekce antigenů ve výzkumu - monoklonální x polyklonální (jeden nebo více klonů produkujících buněk) - primární x sekundární x terciální...

28 Schematický princip imunodetekce Enz Enz

29 Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci 6 days neuroektoderm entoderm RT-PCR analýza exprese liniově specifických genů

30 Nediferencované buňky EC P19 buněčná jádra cytokeratin EndoA pozitivní buňky entoderm N-CAM pozitivní buňky - neurony Diferencované buňky EC P19 monovrstva + RA - sérum Diferencovane buňky EC P19 monovrstva + RA + sérum

31 Leukemie inhibujicí faktor (LIF) posiluje RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk linie P19 Diferenciace Proliferace Apoptóza neuroektoderm entoderm

32 AG490? SB UO 126 exprese a postranslační modifikace regulačních proteinů Bowman 2000 transkripční aktivita Stat-3 (reporter papre-luc) transkripční aktivita AP-1 (reporter p3tp-lux) transkripční aktivita RAR/RXR (reporter prareb2-luc)

33 Detekce stupně diferenciace EC buněk indukovaných neurálním směrem (specifické protilátky) 4 ds RA RA+LIF 6 ds RA RA+LIF N-CAM Neuron-specific III b-tubulin AG UO Total protein Detekce fosforylace (posttranslační modifikace) Erk kinázy (specifické protilátky) P-Erk Erk UO LIF RA