Fyziologická a proteomická charakterizace vlivu abiotických stresů na ozimou formu brukve řepky olejky. Milan Urban

Transkript

1 Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta Katedra experimentální biologie rostlin Doktorský studijní program: Anatomie a fyziologie rostlin Autoreferát disertační práce Fyziologická a proteomická charakterizace vlivu abiotických stresů na ozimou formu brukve řepky olejky Milan Urban Školitel: Mgr. Pavel Vítámvás, Ph.D. Praha, 2017

2 Obrázek z publikace: Urban et al., 2017 Autoreferát disertační práce Milan Urban,

3 Abstrakt V některých letech je zemědělská produkce brukve řepky olejky významné plodiny České republiky ohrožena (kromě biotických stresů) mrazem či suchem. V prvním přehledovém článku jsme proto věnovali pozornost proteinům, které byly nalezeny ve studiích porovnávajících genotypy s různou mírou tolerance k abiotickým stresům. V tomto článku jsme se také zaměřili na aplikaci výsledků proteomických studií ve šlechtitelských programech a při zvyšování odolnosti plodin ke stresům obecně. Vlastní výsledky jsme pozorovali u chladově aklimovaných, nejarovizovaných rostlin řepky ve fázi listové růžice. V druhém článku jsme prokázali signifikantní vztah mezi mrazuvzdorností, akumulací dehydrinů a aklimací fotosyntetického aparátu u pěti odrůd řepky. Při porovnání s dřívějšími výsledky jsme pozorovali nejen specifickou akumulaci dehydrinu D97, ale i kvalitativní změny dalších dehydrinů. Tyto výsledky naznačují, že úroveň získané mrazuvzdornosti je závislá nejen na aklimaci fotosyntézy, ale i na vyšší akumulaci ochranných složek. Stres sucha (článek č. 3) byl navozen ve fázi prodlužování stonku před kvetením, což je fáze, ve které rostlina musí přijmout větší množství vody. Pozdní jarní přísušky před nebo během kvetení výrazně snižují výnos a kvalitu produkce. Tento článek poprvé detailně popsal dvě strategie hospodaření s vodou u čtyř odrůd řepky. Překvapením bylo zjištění, že obě strategie v této fázi vývoje mohou obsahovat adaptabilní (adaptované) odrůdy na sucho. Tyto výsledky naznačují, že relevantní informace o míře adaptability k suchu v době prodlužování stonku mohou být získány pouze v případě, pokud sledujeme a společně vyhodnotíme výsledky gazometrické, biochemické a proteomické. Osmotický stres (v PEG-em aktivizovaném médiu, článek č. 4) byl aplikován v in vitro kultuře mikrosporových embryí u dvou odrůd řepky proto, abychom vyhodnotili možnosti a limity této metody pro časnou selekci šlechtitelských materiálů. Diferenčně akumulované proteiny byly detekovány pomocí 2-D DIGE a u vybraných genů byly pomocí qrt- PCR stanoveny jejich expresní profily. Odrůda Cadeli (D) vykázala znaky tolerance díky akumulaci biomasy a akumulovaly se v ní proteiny energetického metabolismu, REDOX, targetingu a signalizace. Na druhou stranu, citlivá odrůda Viking (V) více akumulovala proteiny spojené s přeměnami ATP a využíváním živin, spolu s proteiny odpovídajícími na stres a ovlivňujícími buněčnou strukturu. Na základě těchto výsledků jsme doporučili některé znaky (akumulace biomasy, WUE, TE, fotosyntetická aklimace v chladu a během sucha) a techniky (akumulace DHN), které umožní fenotypování řepky olejky k odolnosti na mráz a sucho. Navíc jsme vybrali kandidátní proteiny a geny, které mohou selektovat adaptabilní genotypy k abiotickým stresům. Tyto výsledky mohou být použity ve Autoreferát disertační práce Milan Urban,

4 šlechtitelských programech, zaměřených na výběr adaptabilních komponentních odrůd či pre-selekci nových šlechtitelských materiálů. Klíčová slova: Brassica napus, proteomika, dehydriny, sucho, mrazuvzdornost, genotypy šetřící vodou, genotypy vodou plýtvající, mikrosporové kultury, adaptabilita Obsah Abstrakt... 2 Obsah... 4 Poděkování... 5 Zkratky Úvod Cíle práce Výsledky a diskuse Mrazuvzdornost ozimé formy řepky olejky je ovlivněna nejen aklimací fotosyntézy ale také akumulací chladově-indukovaných proteinů.. 11 Rozdílný geografický původ odrůd řepky vysvětluje pouze část jejich adaptability k suchu proteomický profil genotypů šetřících a nešetřících vodou Zdvojení haploidní regeneranti řepky odvození z mikrospor mohou být využiti k selekci adaptabilních odrůd nebo novo-šlechtěnců Závěry Závěry fyziologické a proteomické odpovědi řepky na chladovou aklimaci Vliv progresivního sucha na kontrastní odrůdy řepky ve fázi prodlužování stonku Analýza proteomického profilu mikrosporových embryí, vystavených osmotickému stresu Shrnutí výsledků Použitá literatura Curriculum vitae Autoreferát disertační práce Milan Urban,

5 Poděkování Rád bych poděkoval Pavlu Vítámvásovi (školitel) a Miroslavu Klímovi (konzultant), za jejich přátelské vedení, cenné rady během celého mého studia a čas, který věnovali společným publikacím. Chci také poděkovat Sylvě Zelenkové, která přede mnou poprvé otevřela proteomická vrátka poznání a nabídla mi téma disertační práce na KEBR UK. Rád bych poděkoval také druhému konzultantovi, Iljovi T. Prášilovi, za uvedení do světa mrazuvzdorářů. Upřímné a hluboké poděkování patří technikům Petře Bartošové, Vendulce Střeskové, Marice Coufové a Jardovi Šrámkovi, bez jejichž erudice by zdárné dokončení některých experimentů nebylo možné. Chci poděkovat také svým vědeckým kolegům, zvláště Klárce Kosové a Elizabeth Van Volkenburgh. Jana Kholová si zaslouží mé uznání a úctu, mimo jiné za to, že mi během mé 6 měsíční stáže v ICRISATU laskavě umožnila dokončit tuto doktorskou disertaci. Navíc jde o inspirativní silnou ženu, která mi pomohla zůstat ve vědeckém poli, když ostatní viděli především své vlastní strachem (ne)naplněné zájmy. Nejdůležitějším člověkem v mém životě je ale Jana Krtková bezbřehý, nekončící vodopád nápadů, znalostí a dovedností, výzev, ale i životní moudrosti. Výzkumné aktivity této doktorské disertační práci byly podpořeny těmito granty: NAZV QJ ( ) The use of non-conventional source materials, biotechnological methods and effective procedures in line and hybrid breeding of winter oilseed rape NAZV QI 111A075 ( ) Utilization of biotechnological methods, new original initial materials and efficient procedures in breeding of winter oilseed rape NAZV QH ( ) Methods development for efficient selection and utilization of genetic diversity for resistance improvement to the most important biotic and abiotic stresses Autoreferát disertační práce Milan Urban,

6 Zkratky 1D SDS-PAGE - one-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; jednorozměrná SDS foréza BEN - cultivar Benefit; odrůda Benefit C or CAL - Californium; odrůda Californium CA - cold acclimation; chladová aklimace Car - carotenoids; karotenoidy Chl - chlorophyll; chlorofyl C i/c a - ratio of leaf intercellular to ambient air [CO 2]; poměr mezi CO 2 uvnitř a vně listu Cor - Cold-regulated (gene); chladem regulované geny COR - Cortes; odrůda Cortes cv(s) - cultivar(s); odrůda D or CAD - Cadeli; odrůda Cadeli DAS - day(s) after beginning of treatment; dny po začátku působení stresoru DAP - differentially accumulated proteins; diferenčně akumulované proteiny DH - doubled haploids; zdvojený haploid DHN - dehydrin; dehydrin DIGE - fluorescent difference in gel electrophoresis; fluorescentní diferenční gelová elektroforéza DW - dry weight; sušina E - leaf transpiration rate; transpirace listová ET - evapotranspiration change; evapotranspirační změna EUW - effective use of water; efektivní využití vody FT - frost tolerance, mrazová tolerance FTSW - fraction of transpirable soil water; frakce využitelné půdní vody FW - fresh weight; čerstvá hmotnost GxExM - genotype by environment by management interactions; interakce genotypu, prostředí a managementu (zpracování) GS or gs - stomatal conductance; vodivost stomatální LT - low temperature; nízká teplota (nad bodem mrazu) LT50 - lethal temperature when 50 % of the sample die; teplota při které je 50% vzorků letálně poškozeno MDE - microspore-derived embryos; embrya, odvozená z mikrospor N or NAV - Navajo; odrůda Navajo NET - normalized evapotranspiration; transpirace listová normalizovaná ke kontrolám OP - osmotic potential; osmotický potenciál PEG - polyethylene-glycol; poly-ethylen glykol Pn - net CO 2 assimilation (net photosynthesis); čistá fotosyntetická asimilace PRO - proline; prolin RWC - relative water content; relativní obsah vody ROS - reactive oxygen species; reaktivní kyslíkové radikály SWC - soil water content; obsah vody v půdě TE - transpiration efficiency; efektivita transpirace TTSW - total transpirable soil water; celková transpirabilní půdní voda ÚKZÚZ Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský V - Viking; odrůda Viking WUE - water-use efficiency (Pn/E); efektivita využití vody WUEi - intrinsic water-use efficiency (Pn/GS); vnitřní efektivita využití vody Autoreferát disertační práce Milan Urban,

7 1. Úvod Abychom pokryly požadavky rostoucí populace, objem rostlinné produkce by se měl do roku 2050 zdvojnásobit a výnosy by měly meziročně stoupat o 2.4% (aktuálně 1.3%) [1-3]. Odolnost plodin k abiotickým stresům můžeme teoreticky zlepšit kombinací různých přístupů (fyziologie, omiky, využití QTL, epigenetické šlechtění, editace genomu apod.) [4]. Brukev řepka olejka (Brassica napus L.) ozimá forma je považována za velmi důležitou olejninu, která je pod stálým zájmem šlechtitelů, snažících se zvyšovat výnosové a kvalitativní parametry oleje [5]. Přestože je řepka třetí nejdůležitější celosvětovou olejninou, její agronomický potenciál je limitován citlivostí k mrazu, přezimování a suchu. Schopnost rostlin překonávat chlad je komplexním znakem. Chladová aklimace (CA) je ovlivněna mnoha faktory [6, 7]. CA se v rostlině indukuje během působení nízkých teplot nad bodem mrazu. Smyslem CA je totiž mrazová tolerance (FT), která je hlavním faktorem, působícím zdárné přežití zimy. FT je také výsledkem širokého spektra fyzikálních a biochemických procesů, jako je indukce a akumulace kryoprotektivních látek, změn plazmatické membrány a oxidativně-ovlivněných změn. Tyto adaptační procesy dovolují rostlinám překonat nepříznivé podmínky. FT se v čase mění (zvyšuje a snižuje) díky vnějším podmínkám a není ji tedy zcela jednoduché kvantifikovat [8]. Jednou z možností je stanovení FT u aklimovaných listů pomocí mrazového testu [9, 10]. Přesto se stále hledají vhodné skríninkové metody, které lépe dokáží selektovat materiály s (nedostatečnou) odolností [11]. Sucho stále patří mezi nejvíce ovlivňující faktory rostlinné produkce. Adaptabilita rostlin k suchu je polygenně řízený znak, zahrnující mnoho dílčích složek (vodní režim, buněčný metabolizmus, růst a vývoj...). Tyto složky interagují s genotypem a vlivy prostředí a tak determinují výnos. Jedna z důležitých otázek je podstata rostlinné Autoreferát disertační práce Milan Urban,

8 strategie, která ovlivňuje vyšší výnos. Konzervativní - vodušetřící - strategie (v článku č. 3 označena jako water-saver ) je založena na minimalizaci ztrát vody transpirací během nedostatku vody, což může vyústit k většímu zásobení vodou během vývoje a růstu semen, nebo strategie genotypů nešetřících vodou ( water-spender ), založená na vysoké transpiraci či fotosyntéze během vodního stresu? Překvapivě totiž v teplém vlhkém kontinentálním klimatu České republiky (Cfb; Koeppen-Geiger classification [12]), mohou obě tyto protichůdné strategie užitečně ovlivnit adaptaci rostlin k suchu, tak jak bylo postulováno i pro jiné světové regiony [13-21]. Genotypy šetřící vodou mohou sice vykázat vyšší výnosy při déletrvajícím suchu, na druhou stranu, během krátkých suchých epizod genotypy vodou nešetřící vykazují sníženou citlivost ke snižujícímu se množství vody v půdním profilu [20, 22-24]. Genotypy, které nezpomalí růst (v tomto případě ty vodou nešetřící) rostou a vyvíjejí se navzdory snižující se dostupnosti vody a tak mohou mít produktivní výhodu [18]. Tato strategie je vhodná v oblastech s nepříliš hlubokou hladinou podzemní vody, nebo s vyšší pravděpodobností srážek [20]. Brukev řepka olejka je považována za tolerantní k zasolení [25], přestože je spíše citlivá k suchu. Citlivost k nedostatku vody samozřejmě závisí na aktuálním vývojovém stádiu [26]: během klíčení [27], vegetativní fáze (prodlužování stonku) [28], a během kvetení [29-32] jsou rostliny více náchylné. Je zajímavé, že během pozdního vývoje semen v šešulích citlivost k suchu klesá, vzhledem k možnosti translokace asimilátů ze stonkových a listových pletiv [33]. Proto je fáze prodlužování stonku v odolnosti k suchu důležitá. Přestože je řepka významnou plodinou, mezi proteomickými publikacemi rodu Brassica [34-47], mimo naši publikaci najdeme pouze dva články zaměřené na odpověď řepky k suchu (komparativní studie kořenů [48] a šesti-týdenních rostlin [49]). Autoreferát disertační práce Milan Urban,

9 Šlechtění pro zvýšení tolerance/adaptability k suchu zůstává výzvou kvůli komplexní povaze suchovzdornosti a reakcí na sucho. Výběr nejvýhodnější strategie totiž mj. závisí na celkové odpovědi rostlin k GxExM. Na základě literární rešerše a vlastního výzkumu jsme vytvořili následující hypotézy: 1) Nižší hladina fotosyntetické aklimace a nižší akumulace protektivních složek během chladové aklimace způsobí u řepky olejky nižší odolnost k mrazu. 2) Citlivost řepky olejky k suchu (senzitivita nebo adaptace) je převážně závislá na strategii hospodaření s vodou: genotypy vodou šetřící vykážou nižší spotřebu díky pomalejšímu růstu (a snížené akumulaci biomasy). Na druhou stranu, genotypy vodou nešetřící budou růst rychleji a budou mít vyšší nároky na její dostupnost. Homeostatické equilibrium kteréžto udržet je energeticky náročné bude více narušeno u genotypů vodou nešetřících, protože tyto vyčerpají dostupnou vodu rychleji a pocítí silnější vliv stresu. 3) Technika mikrosporových kultur je důležitým zdrojem informací o jednotlivých odrůdách. Na základě diferenční proteomiky mikrospor vystavených osmotickému stresu bude možné rozlišit odrůdy podle jejich citlivosti. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

10 2. Cíle práce Obecným cíle této práce je popsat fyziologické, biochemické a proteomické odpovědi vybraných odrůd řepky olejky k třem typům abiotických stresů suchu, chladu a osmotickému stresu v různých vývojových fázích a doporučit znaky, které mohou být využity ve šlechtitelském procesu. Formulace dílčích cílů zahrnuje: 1) Sepsáním přehledového článku získat informace o přínosu proteomických studií pro pochopení komplexní odpovědi plodin na abiotické stresy a také identifikovat kandidátní proteiny ve šlechtitelském procesu (článek č. 1). 2) Rozpoznat efekt chladové aklimace na odrůdy řepky olejky (článek č. 2) se zvláštním zřetelem k: a) roli fotosyntetické aklimace pro dosažení mrazové tolerance, b) obsahu dehydrinů a vyhodnocení jejich akumulace jako možných kandidátních proteinů pro selekci ze zvýšené mrazové toleranci. 3) Pozorovat a objasnit efekt progresivního sucha ve fázi prodlužování stonku u vybraných odrůd, lišících se původem. Sumárně analyzovat gazometrická, biochemická a proteomická data tak, aby bylo možno pochopit strategie jednotlivých odrůd nakládání s vodou (článek č. 3). 4) Analyzovat diferenční proteinový profil MDE v podmínkách osmotického stresu a: a) najít vhodné kandidátní proteiny vhodné pro časnou selekci mikrospor kontrastních odrůd, b) ověřit vybrané profily akumulace proteinů transkriptomickými daty (článek č. 4). Autoreferát disertační práce Milan Urban,

11 3. Výsledky a diskuse Poznámka: Všechna čísla obrázků a tabulek odkazují k číslování v originálních verzích článků, které můžete dohledat online. Mrazuvzdornost ozimé formy řepky olejky je ovlivněna nejen aklimací fotosyntézy ale také akumulací chladově-indukovaných proteinů Vědecký přínos a teoretický význam výsledků Cílem studie bylo zhodnotit používané odrůdy řepky olejky z pohledu vývoje jejich mrazové odolnosti. Naše výsledky jsou inovativní ve smyslu propojení biochemických (v tomto smyslu akumulace dehydrinů DHN) a fyziologických (fotosyntetická parametry, spektrální indexy) znaků. Získaná data naznačují, že během aklimace řepky k chladu (CA) dochází ke složité interakci mezi gazometrickými výstupy a akumulací DHN. Všechny genotypy, které měly vysokou FT (genotypy COR, NAV), vykázaly také vysoké hodnoty čisté asimilace (Pn) během CA (viz Fig. 1, článek 2). Vysoká FT je ovlivněna mimo jiné také akumulací DHN (korelační koeficient DHN vs. FT, r = 0.815). Prokázání přímé a mechanistické vazby mezi Pn a FT ovšem nebylo cílem této studie. Spíše se přikláníme k názoru, podporovanému některými autory [50-56], která rozpoznává aklimovanou fotosyntézu jako energetický zdroj pro buněčné změny (DHN a další), nezbytné k dosažení vyšší FT. Diskuse a syntéza výsledků Hodnota čisté fotosyntetické asimilace (Pn) u vysoce mrazuvzdorných genotypů po CA překvapivě málo reagovala na nižší hodnoty transpirace (E) a stomatální vodivosti (GS), což se obecně může dít při vysokých teplotách [57]. Postulujeme tedy, že i CA může být metabolicky a signalizací spojena s variacemi O 2 a CO 2, a být limitována dostupností anorganického fosforu [57]. Dostupnost totiž Autoreferát disertační práce Milan Urban,

12 může být u řepky zvýšena díky expresi genů kódujících enzymy štěpení škrobu a sacharóza syntázy [51]. Projevy chladových změn navíc vykazují spojitost s receptory turgorové tlaku v buňkách [58] a ovlivňují tedy GS. Genotypy, tolerující chladem sníženou dostupnost vody mohou tudíž tohoto stavu dosáhnout včasnou regulací GS (viz Fig. 1B, článek 2), což je v souladu s Aroca et al. [58], kteří pozorovali otevřené průduchy k chladu citlivé kukuřice a rychlé zavírání u tolerantních odrůd. Průduchy mohou být přivřeny (a tudíž zvyšovat WUEi) v případě, pokud je C i dostatečně vysoká k saturaci karboxylačních pochodů. Navíc je GS regulována pomocí ABA, což podporuje naše výsledky akumulace DHN v kontextu komunikace mezi ABAzávislými a -nezávislými COR/LEA geny, jako finálními produkty signálních kaskád. Pokud je rostlina schopna efektivně regulovat dostupnost vody během chladu, potom nemusí být energeticky náročné kryoprotektivní metabolické procesy nijak ovlivněny. Využití výsledků v dalším výzkumu Návazný výzkum by měl být zaměřen na detailní sledování dynamiky akumulace DHN v souvztažnosti k vývojovým fázím rostlin. Také stanovení FT regenerací celistvých rostlin, odebraných z pole (a ne pouze listových segmentů, použitých v této studii) by mělo následovat pro jednoznačné posouzení vztahu mezi DHN a FT. Rozdíly mohou být způsobeny nejen různým poměrem akumulovaných DHN, ale také alelickými variantami stejných produktů mezi genotypy. Detailní hmotnostní spektrometrická analýza individuálních proteinových proužků (či spotů z 2-D SDS PAGE) by měla objasnit o které DHN se jedná. Analýzy DHN-mutantů by měly odpovědět na otázky přímého účinku jednotlivých genů/proteinů na FT a jejich lokalizaci. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

13 Rozdílný geografický původ odrůd řepky vysvětluje pouze část jejich adaptability k suchu proteomický profil genotypů šetřících a nešetřících vodou Vědecký přínos a teoretický význam výsledků V této studii jsme se pokusili objasnit diferenční proteom u jarovizovaných rostlin řepky olejky po dlouhodobém stresu sucha. Využili jsme k tomu gazometrické, biochemické a s vodním režimem spojené charakteristiky, které měly sloužit k objasnění změn proteomu jak ovlivňuje rostlinu a také jak je pravděpodobně modelován během odpovědi na sucho. Kombinací těchto dat jsme byli schopni rozlišit mezi dvěma strategiemi, tzv. water-saver (vodou šetřící genotypy) a water-spender (vodou nešetřící genotypy). Tyto výsledky poskytly nový vhled do problematiky adaptace kontrastních odrůd řepky. Diskuse a syntéza výsledků Reakce listového proteomu na 28. denní graduální stres suchem byla sledována u 4 odrůd řepky (Californium C; Cadeli D; Navajo N; a Viking V). Genotypy byly na základě reakcí na snižující se dostupnost vody rozděleny do dvou výše zmíněných strategií. U genotypů vodou šetřících (C+D) byly během stresu více akumulovány proteiny spojené s asimilací dusíku, APT a redox homeostáze, zatímco u nešetřících (N+V) to byly proteiny sacharidového/energetického metabolismu, fotosyntetické a stresem-ovlivněné proteiny, stejně jako proteiny spojené s úpravami RNA. Na základě všech získaných dat, jsme rozdělili genotypy takto: C suchu-adaptabilní, vodou-šetřící; D středně-adaptabilní, vodou-šetřící; N suchu-adaptabilní, vodou nešetřící; a V málo adaptabilní, k suchu citlivý vodounešetřící genotyp. Proteomická data jednoznačně pomohla Autoreferát disertační práce Milan Urban,

14 vyhodnotit dopad sucha na adaptabilitu (pozor, nehovoříme zde o toleranci!) genotypů a přispěla tak k pochopení jejich možné plastické odpovědi na změnu dostupnosti vody v půdním profilu. Genotypové rozdíly a přehled získaných výsledků Rychlé vyčerpání vody z květníku pozorované u genotypů vodou nešetřících převážně u RWC a OP způsobilo větší poškození vnitrobuněčné homeostáze. Tento fakt také výrazně ovlivnil buněčný, energetický metabolismus a met. dusíku. Rozdílný nástup stresu (metabolicky-ovlivněný práh citlivosti), ranost genotypů (C+N jsou středně rané, D středně/pozdně a V je raný genotyp) také mohly přispět podílem k jejich rozdílné reakci. Podobné výsledky každý genotyp řepky se chová specificky byly potvrzeny i ostatními studiemi [28, 59, 60]. Data z tohoto experimentu demonstrují, že odrůdy vystavené progresivnímu suchu není možné jednoduše a lacině porovnávat mezi sebou. Vzhledem k současnému stavu vědění, pouze detailní pochopení všech informací gazometrických, biochemických a proteomických může vést k pochopení podstaty adaptace řepky k suchu a tedy k výběru selekčních fyziologických znaků cílených na specifické pěstitelské oblasti. Překvapivě totiž obě strategie spenders i savers obsahují odrůdy, které byly vyhodnoceny jako dostatečně adaptabilní k suchu (C+N). Navíc jsou tyto dvě odrůdy vysoce výnosné, mají vysokou odolnost k mrazu a k chorobám (viz Tabulka S-1). Jednoznačně určení tolerance tedy bude záviset na rychlosti vysychání profilu, délce stresu a aktuálnímu vývojovému stádiu rostliny. Využití výsledků v dalším výzkumu Musíme bohužel zdůraznit, že dosažené výsledky a možné navrhované kandidátní proteiny nebyly vyzkoušeny v běžných polních podmínkách, což se zdá být logickým Autoreferát disertační práce Milan Urban,

15 dalším krokem výzkumu. Obecná strategie šlechtění k vyšší odolnosti k suchu, která by mohla být šlechtiteli využita nemůže být aplikována bez znalosti cílového agroekosystému a kvůli tomu, že některé fyziologické znaky odolnosti jsou vzájemně neslučitelné. Rostlinné modely (např. APSIM, SSM) ale mohou poskytnout dostatečnou pravděpodobnost úspěchu při testování odolnosti genotypů za použití dat a strategií z této studie. Zdvojení haploidní regeneranti řepky odvození z mikrospor mohou být využiti k selekci adaptabilních odrůd nebo novo-šlechtěnců Vědecký přínos a teoretický význam výsledků Cílem této studie bylo analyzovat diferenčně akumulované proteiny u mikrosporových embryí (MDE) řepky olejky po působení osmotického stresu (snížená dostupnost vody z růstového média). Diskuse a syntéza výsledků Do této analýzy byly zahrnuty dvě odrůdy řepky olejky (Cadeli D; Viking V), protože se odlišují odpovědí a fyziologickou strategií na sucho. V námi publikované studii [61], je D středně-adaptabilní vodou-šetřící a V málo adaptabilní k suchu citlivý vodou-nešetřící genotyp. Akumulace biomasy mikrospor byla u D signifikantně více než 3 x vyšší než u V. Tento pozorovaný růst mikrospor v PEG-em ovlivněném růstovém médiu podporuje tvrzení, že D je více adaptabilní k suchu než V. Nastiňuje také možnost vyšší akumulace osmolytů u D a/nebo jiných protektivních látek. Tato proteomická studie je prvním krokem potvrzení MDE technik jako vhodného modelu charakterizace novošlechtěnců a může být využita pro fenotypem-řízenou selekci. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

16 Využití výsledků v dalším výzkumu Pro mnoho druhů jsou MDE techniky ještě stále natolik neefektivní a neoptimalizované, že produkce dihaploidů (DH) je pro šlechtitelský sektor ztrátová a drahá. Přesto v posledních letech zažíváme renesanci DH technik i pro druhy, které byly v minulosti označeny jako problematické [62]. Je ovšem nutné zavést rychlejší a levnější metodu selekce jednotlivých mikrospor, což umožní výběr fenotypově/genotypově zajímavého šlechtitelského materiálu, který by samozřejmě měl být dopěstován do semene a zhodnocen v polních podmínkách (viz první česká odrůda řepky z DH materiálů Orex, registrována v 2015). Očekávané šlechtění nové generace (epigenetické šlechtění, výběr potomků na základě stress-memory, editace genomu apod.) hledá stabilní, ale široký zdroj genetické variability současně kultivovaných plodin. MDE techniky mohou pomoci zvládnout tento náročný úkol. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

17 4. Závěry Ve stručnosti, všechny tři hypotézy byly potvrzeny. Všechny cíle byly naplněny. Závěry fyziologické a proteomické odpovědi řepky na chladovou aklimaci Vztah mezi FT, DHN a fotosyntetickou aklimací byl signifikantní. Studie prokázala, že během CA spolu k dosažení vysoké FT komunikují fotosyntetické projevy spolu s akumulací specifických kryoprotektivních látek (DHN). Nepřítomnost některých DHN (zvláště D47) je spojena s nižší FT u odrůdy BEN. Tento kvalitativní rozdíl může být využit v následných studiích vlivu DHN na další parametry. Poprvé byl u řepky vizualizován DHN D97. Ostatní DHN vykázaly vždy blízkou kolokalizaci na membráně (např. D45+47), což nebylo v předchozích studiích pozorováno. Všechny genotypy s vysokou FT projevily také vysokou aklimaci fotosyntézy během CA. Překvapivě hodnoty čisté fotosyntetické asimilace (Pn) u vysoce FT odrůd nereflektovaly hodnoty E a GE (což je obecně známý fakt, který byl potvrzen i u kontrolních rostlin). Tento jev může být využit jako selekční znak u min. 4 týdny chladově aklimovaných rostlin řepky k selekci odrůd s vyšší FT. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

18 Vliv progresivního sucha na kontrastní odrůdy řepky ve fázi prodlužování stonku V této fázi vývoje řepky byly nalezeny a objasněny dvě strategie zacházení s vodou: genotypy šetřící (vysoké WUE) a nešetřící vodou (nízké WUE). Bylo identifikováno 62 diferenčně akumulovaných proteinů, které byly rozděleny do 7 funkčních skupin, z nichž např. energetický metabolismus, antioxidanty+ros a stresově-regulované proteiny hrály nejvýznamnější roli u suchem adaptovaných odrůd řepky. Genotypy vodou nešetřící (N+V) rychleji vyčerpaly vodu z květníků, čímž došlo k výraznému snížení OP, RWC a gazometrických hodnot. Proteiny těchto odrůd vykázaly zvýšenou akumulaci během stresu u těchto funkčních skupin: energetický, fotosyntetické proteiny, a stresověregulované. Genotypy vodou šetřící (C+D) naopak akumulovaly proteiny metabolismu dusíku, ATP a redox homeostáze. Výrazně vyšší adaptability k suchu bylo dosaženo u odrůd, které akumulovaly více sušiny během stresu suchem, a které překvapivě patří do protichůdných skupin zacházení s vodou (C+N). Všechny výsledky tak naznačují toto schéma: o C suchu-adaptabilní, vodou šetřící, o D středně-adaptabilní, vodou nešetřící, o N suchu-adaptabilní, vodou nešetřící, a o V slabě adaptabilní, k suchu citlivý, vodou nešetřící genotyp. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

19 Analýza proteomického profilu mikrosporových embryí, vystavených osmotickému stresu Analýzou profilu diferenčního proteomu bylo identifikováno 61 proteinů, které byly rozděleny do 8 hlavních funkčních skupin, z nichž tyto byly ovlivněny nejvíce: metabolismus dusíku, cukerný a proteinový metabolismus, energetický, redox-homeostáze, ROS a signalizace, a proteiny stresem-indukované. Proteiny, které byly nejvíce akumulovány v D (tolerantní odrůda, ve stresu akumulovala 3x více biomasy než V) patřily převážně do skupiny energetického metabolismu (převážně glykolytické enzymy), redox homeostáze, signalizace (fosfolipázy, MAPK4), transkripce a také proteolýzy. Vyšší akumulace určitých proteinů v V podporuje názor vyšší potřeby ATP a využití živin, ale také výraznější dopad stresu s ovlivněním buněčných struktur. Byl také pozorován vyšší počet proteinů, které se účastní anaerobní části metabolismu (např. alkohol dehydrogenáza). Na základě těchto výsledků konstatujeme, že D vykázala vyšší a rychlejší adaptaci mikrospor v osmoticky aktivizované růstové plotně, a že úprava primárního metabolismu, snížení oxidativního stresu a aktivní signalizace zvyšují odolnost MDE k osmotickému stresu. Odrůda V spíše projevila známky poškození. Tato citlivost může být přímým důsledkem nižší výkonnosti energetického metabolismu. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

20 5. Shrnutí výsledků V doktorské disertační práci jsem se pokusil několika přístupy zodpovědět problematiku stresové odpovědi u různých vývojových stádií brukve řepky olejky. V prvním přehledovém článku jsme porovnali výsledky proteomických studií stresovaných plodin mírného pásma se zaměřením na diferenční proteomické odpovědi různě odolných genotypů. Tyto informace jsme poté použili i k návrhu vlastního výzkumu. Druhý článek objasnil důležitost změn, souvisejících s energetickými změnami metabolismu (aklimace fotosyntézy, akumulace protektantů) k dosažení dostatečné mrazuvzdornosti řepky olejky. Ve třetím článku byl ukázán přínos studie, založené na porovnání strategie využití vody, biogeografického původu odrůd s biochemickými a proteomickými daty pro získání komplexní představy o chování odrůd během sucha. Kultura mikrosporových embryí (článek č. 4) také přinesla zajímavé a cenné výsledky pro další fenotypové či proteomické hodnocení šlechtitelských materiálů. Na základě získaných výsledků doporučujeme některé znaky a techniky pro fenotypování odolnosti k mrazu a suchu u řepky olejky, které mohou být použity ve šlechtitelských programech, zaměřených na více adaptabilní materiály: 1) Stanovení akumulace DHN pomocí imunoblottingu je metoda vhodná pro výběr vysoce mrazuvzdorných odrůd či novošlechtěnců řepky 2) Růstové charakteristiky, společně se znaky vodního hospodaření v pokusech s pomalým vysycháním v řádu týdnů. Šlechtitelé by také měli brát v potaz původ používaných komponent. 3) Selekce odrůd a materiálů s nižším poklesem Pn mezi kontrolními a chladově aklimovanými rostlinami po min. 3-4 týdnech působení jarovizační teploty (4 C). Autoreferát disertační práce Milan Urban,

21 4) Analýza listového proteomu suchem stresovaných rostlin umožnila identifikovat kandidátní proteiny, které mohou být dále testovány a sledovány u adaptabilních odrůd: Fruktóza-bisfosfát aldoláza 2 (NP_ ), triózafosfát izomeráza (NP_ ), chloroplastová beta-karbonic anhydráza (ADI ), ferredoxin-nadp reduktáza (BAD ), fibrillíny (NP_ ), chloroplast elongation faktor tub (XP_ ). 5) Technika mikrosporových embryí umožnila identifikovat proteiny, které jsou vhodné pro ranou selekci adaptabilních embryí: RuBisCO ssu prekurzor (CAA ), UDP-glukóza 6-dehydrogenáza (NP_ ), ABA modulovaný tyrozin-fosforylovaný protein (CDY ), puralpha-1 (XP_ ), glutathione S-transferáza (XP_ ), a lactoylglutathione lyáza (BAF ). Některé z použitých či navrhovaných metod bohužel nejsou ani levné ani objemově propustné (high-throughput). Stále tedy existuje snaha najít vhodnou laboratorní metodu, schopnou selektovat materiály s dostatečnou adaptabilitou k nadcházejícím klimatickým změnám, jejíž výsledky by byly porovnatelné s tolerancí, dosaženou v polních pokusech. Obecná strategie šlechtění k vyšší odolnosti k suchu, která by mohla být šlechtiteli využita nemůže být aplikována bez znalosti cílového agro-ekosystému a kvůli tomu, že některé fyziologické znaky odolnosti jsou vzájemně neslučitelné. Rostlinné modely (např. APSIM, SSM) ale mohou poskytnout dostatečnou pravděpodobnost úspěchu při testování odolnosti genotypů za použití dat a strategií z této studie. Autoreferát disertační práce Milan Urban,

22 6. Použitá literatura [1] D. Tilman, C. Balzer, J. Hill, B.L. Befort, Global food demand and the sustainable intensification of agriculture, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(50) (2011) [2] D.K. Ray, N. Ramankutty, N.D. Mueller, P.C. West, J.A. Foley, Recent patterns of crop yield growth and stagnation, Nature Communications 3 (2012). [3] D.K. Ray, N.D. Mueller, P.C. West, J.A. Foley, Yield Trends Are Insufficient to Double Global Crop Production by 2050, Plos One 8(6) (2013). [4] R. Mittler, E. Blumwald, Genetic Engineering for Modern Agriculture: Challenges and Perspectives, Annual Review of Plant Biology, Vol (2010) [5] Z.-Y. Hu, W. Hua, S.-M. Huang, H.-Z. Wang, Complete chloroplast genome sequence of rapeseed (Brassica napus L.) and its evolutionary implications, Genetic Resources and Crop Evolution 58(6) (2011) [6] P. Fu, R.W. Wilen, G.H. Wu, A.J. Robertson, L.V. Gusta, Dehydrin gene expression and leaf water potential differs between spring and winter cereals during cold acclimation, Journal of Plant Physiology 156(3) (2000) [7] P.I.T. Kosová K., Annual Field Crops, in: K.B. Storey, Tanino, K. K. (Ed.), Temperature adaptation in a changing climate: nature at risk, CAB International, Wallingford, UK, 2012, pp [8] Y. Castonguay, M.-P. Dube, J. Cloutier, A. Bertrand, R. Michaud, S. Laberge, Molecular physiology and breeding at the crossroads of cold hardiness improvement, Physiologia Plantarum 147(1) (2013) [9] J. Janacek, I. Prasil, Quantification of plant frost injury by nonlinear fitting of an s-shaped function, Cryo-Letters 12(1) (1991) [10] I. Prasil, J. Zamecnik, The use of a conductivity measurement method for assessing freezing injury I. Influence of leakage time, segment number, size and shape in a sample on evaluation of the degree of injury, Environmental and Experimental Botany 40(1) (1998) [11] R.J. Snowdon, F.L.I. Luy, Potential to improve oilseed rape and canola breeding in the genomics era, Plant Breeding 131(3) (2012) [12] M. Kottek, J. Grieser, C. Beck, B. Rudolf, F. Rubel, World map of the Koppen-Geiger climate classification updated, Meteorologische Zeitschrift 15(3) (2006) [13] C. Belaygue, J. Wery, A.A. Cowan, F. Tardieu, Contribution of leaf expansion, rate of leaf appearance, and stolon branching to growth of plant leaf area under water deficit in white clover, Crop Science 36(5) (1996) [14] O. Bouchabke, F. Tardieu, T. Simonneau, Leaf growth and turgor in growing cells of maize (Zea mays L.) respond to evaporative demand under moderate irrigation but not in water-saturated soil, Plant Cell and Environment 29(6) (2006) [15] G. Dignat, C. Welcker, M. Sawkins, J.M. Ribaut, F. Tardieu, The growths of leaves, shoots, roots and reproductive organs partly share their genetic control in maize plants, Plant Cell and Environment 36(6) (2013) [16] B. Parent, F. Tardieu, Can current crop models be used in the phenotyping era for predicting the genetic variability of yield of plants subjected to drought or high temperature?, Journal of Experimental Botany 65(21) (2014) [17] F. Tardieu, C. Granier, B. Muller, Water deficit and growth. Co-ordinating processes without an orchestrator?, Current Opinion in Plant Biology 14(3) (2011) [18] F. Tardieu, Any trait or trait-related allele can confer drought tolerance: just design the right drought scenario, Journal of Experimental Botany 63(1) (2012) [19] F. Tardieu, Plant response to environmental conditions: assessing potential production, water demand, and negative effects of water deficit, Frontiers in Physiology 4 (2013). [20] J.B. Passioura, Phenotyping for drought tolerance in grain crops: when is it useful to breeders?, Functional Plant Biology 39(10-11) (2012) [21] A. Blum, Drought resistance, water-use efficiency, and yield potential - are they compatible, dissonant, or mutually exclusive?, Australian Journal of Agricultural Research 56(11) (2005) [22] J.B. Passioura, R. Munns, Rapid environmental changes that affect leaf water status induce transient surges or pauses in leaf expansion rate, Australian Journal of Plant Physiology 27(10) (2000) [23] V. Vadez, J. Kholova, R.S. Yadav, C.T. Hash, Small temporal differences in water uptake among varieties of pearl millet (Pennisetum glaucum (L.) R. Br.) are critical for grain yield under terminal drought, Plant and Soil 371(1-2) (2013) [24] A.C. Ryan, I.C. Dodd, S.A. Rothwell, R. Jones, F. Tardieu, X. Draye, W.J. Davies, Gravimetric phenotyping of whole plant transpiration responses to atmospheric vapour pressure deficit identifies genotypic variation in water use efficiency, Plant Science (2016). [25] G. Marconi, R. Pace, A. Traini, L. Raggi, S. Lutts, M. Chiusano, M. Guiducci, M. Falcinelli, P. Benincasa, E. Albertini, Use of MSAP Markers to Analyse the Effects of Salt Stress on DNA Methylation in Rapeseed (Brassica napus var. oleifera), Plos One 8(9) (2013). [26] Q. Huang, Y.G. Zhao, C.Q. Liu, X.L. Zou, Y. Cheng, G.P. Fu, J.S. Xu, X.K. Zhang, G.Y. Lu, Evaluation of and selection criteria for drought resistance in Chinese semiwinter rapeseed varieties at different developmental stages, Plant Breeding 134(5) (2015) [27] M.H. Sangtarash, M.M. Qaderi, C.C. Chinnappa, D.M. Reid, Differential sensitivity of canola (Brassica napus) seedlings to ultraviolet-b radiation, water stress and abscisic acid, Environmental and Experimental Botany 66(2) (2009) [28] T. Mueller, D. Luettschwager, P. Lentzsch, Recovery from Drought Stress at the Shooting Stage in Oilseed Rape (Brassica napus), Journal of Agronomy and Crop Science 196(2) (2010) [29] D. Levy, E. Fogelman, Y. Itzhak, Q. Ma, D.W. Turner, W.A. Cowling, Osmotic adjustment in leaves of Brassica oilseeds in response to water deficit, Canadian Journal of Plant Science 86(2) (2006) [30] Q.F. Ma, D.W. Turner, D. Levy, W.A. Cowling, Solute accumulation and osmotic adjustment in leaves of Brassica oilseeds in response to soil water deficit, Australian Journal of Agricultural Research 55(9) (2004) [31] M. Norouzi, M. Toorchi, G.H. Salekdeh, S.A. Mohammadi, M.R. Neyshabouri, S. Aharizad, Effect of water deficit on growth, grain yield and osmotic adjustment in rapeseed, Journal of Food Agriculture & Environment 6(2) (2008) [32] T. Mueller, P. Lentzsch, M.E.H. Mueller, Carbohydrate Dynamics in Leaves of Rapeseed (Brassica napus) Under Drought, Journal of Agronomy and Crop Science 198(3) (2012) Autoreferát disertační práce Milan Urban,

23 [33] V.O. Mogensen, C.R. Jensen, G. Mortensen, M.N. Andersen, J.K. Schjoerring, J.H. Thage, J. Koribidis, Pod photosynthesis and drought adaptation of field grown rape (Brassica napus L), European Journal of Agronomy 6(3-4) (1997) [34] N. Fernandez-Garcia, M. Hernandez, J. Casado-Vela, R. Bru, F. Elortza, P. Hedden, E. Olmos, Changes to the proteome and targeted metabolites of xylem sap in Brassica oleracea in response to salt stress, Plant Cell and Environment 34(5) (2011) [35] B. Subramanian, V.K. Bansal, N.N.V. Kav, Proteome-level investigation of Brassica carinata-derived resistance to Leptosphaeria maculans, Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(2) (2005) [36] V. Billard, A. Ourry, A. Maillard, M. Garnica, L. Coquet, T. Jouenne, F. Cruz, J.-M. Garcia-Mina, J.-C. Yvin, P. Etienne, Copper-Deficiency in Brassica napus Induces Copper Remobilization, Molybdenum Accumulation and Modification of the Expression of Chloroplastic Proteins, Plos One 9(10) (2014). [37] Y.G. Chu P, Yang Q, Zhai LN, Zhang C, Zhang FQ, Guan RZ, itraq-based quantitative proteomics analysis of Brassica napus leaves reveals pathwaysassociated with chlorophyll deficiency, J Proteomics, 2015, pp [38] A. Bandehagh, G.H. Salekdeh, M. Toorchi, A. Mohammadi, S. Komatsu, Comparative proteomic analysis of canola leaves under salinity stress, Proteomics 11(10) (2011) [39] M. Zhu, N. Zhu, W.-y. Song, A.C. Harmon, S.M. Assmann, S. Chen, Thiol-based redox proteins in abscisic acid and methyl jasmonate signaling in Brassica napus guard cells, Plant Journal 78(3) (2014) [40] M. Zhu, B. Simons, N. Zhu, D.G. Oppenheimer, S. Chen, Analysis of abscisic acid responsive proteins in Brassica napus guard cells by multiplexed isobaric tagging, Journal of Proteomics 73(4) (2010) [41] D.R. Demartini, R. Jain, G.K. Agrawal, J.J. Thelen, Label-free, quantitative proteomic comparison of purified plastids from oilseed rape leaves and embryos reveals targeted expression differences in multiple metabolic pathways, Plant Biology (Rockville) 2008 (2008) [42] D.R. Demartini, R. Jain, G. Agrawal, J.J. Thelen, Proteomic Comparison of Plastids from Developing Embryos and Leaves of Brassica napus, Journal of Proteome Research 10(5) (2011) [43] M. Zhu, S. Dai, N. Zhu, A. Booy, B. Simons, S. Yi, S. Chen, Methyl Jasmonate Responsive Proteins in Brassica napus Guard Cells Revealed by itraq-based Quantitative Proteomics, Journal of Proteome Research 11(7) (2012) [44] L. Gan, C.-y. Zhang, X.-d. Wang, H. Wang, Y. Long, Y.-t. Yin, D.-R. Li, J.-H. Tian, Z.-y. Li, Z.-w. Lin, L.-J. Yu, M.- T. Li, Proteomic and Comparative Genomic Analysis of Two Brassica napus Lines Differing in Oil Content, Journal of Proteome Research 12(11) (2013) [45] V. Devouge, H. Rogniaux, N. Nesi, D. Tessier, J. Gueguen, C. Larre, Differential proteomic analysis of four nearisogenic Brassica napus varieties bred for their erucic acid and glucosinolate contents, Journal of Proteome Research 6(4) (2007) [46] Y. Shen, Y. Zhang, J. Zou, J. Meng, J. Wang, Comparative proteomic study on Brassica hexaploid and its parents provides new insights into the effects of polyploidization, Journal of Proteomics 112 (2015) [47] N. Vartanian, C. Damerval, D. Devienne, Drought-induced changes in protein-patterns of Brassica napus var. oleifera roots, Plant Physiology 84(4) (1987) [48] P.P. Mohammadi, A. Moieni, S. Komatsu, Comparative proteome analysis of drought-sensitive and drought-tolerant rapeseed roots and their hybrid F1 line under drought stress, Amino Acids 43(5) (2012) [49] J. Koh, G. Chen, M.-J. Yoo, N. Zhu, D. Dufresne, J.E. Erickson, H. Shao, S. Chen, Comparative Proteomic Analysis of Brassica napus in Response to Drought Stress, Journal of Proteome Research 14(8) (2015) [50] L.V. Savitch, E.D. Leonardos, M. Krol, S. Jansson, B. Grodzinski, N.P.A. Huner, G. Oquist, Two different strategies for light utilization in photosynthesis in relation to growth and cold acclimation, Plant Cell and Environment 25(6) (2002) [51] V.M. Hurry, A. Strand, M. Tobiaeson, P. Gardestrom, G. Oquist, Cold hardening of spring and winter-wheat and rape results in differential-effects on growht, carbon metabolism, and carbohydrate content, Plant Physiology 109(2) (1995) [52] N.P.A. Huner, G. Oquist, F. Sarhan, Energy balance and acclimation to light and cold, Trends in Plant Science 3(6) (1998) [53] R.G. Trischuk, B.S. Schilling, N.H. Low, G.R. Gray, L.V. Gusta, Cold acclimation, de-acclimation and re-acclimation of spring canola, winter canola and winter wheat: The role of carbohydrates, cold-induced stress proteins and vernalization, Environmental and Experimental Botany 106 (2014) [54] K. Miura, T. Furumoto, Cold Signaling and Cold Response in Plants, International Journal of Molecular Sciences 14(3) (2013) [55] Y. Jiang, D. Peng, L.-P. Bai, H. Ma, L.-J. Chen, M.-H. Zhao, Z.-J. Xu, Z.-F. Guo, Molecular switch for cold acclimation - anatomy of the cold-inducible promoter in plants, Biochemistry-Moscow 78(4) (2013) [56] L.V. Gusta, M. Wisniewski, Understanding plant cold hardiness: an opinion, Physiologia Plantarum 147(1) (2013) [57] R.F. Sage, D.S. Kubien, The temperature response of C-3 and C-4 photosynthesis, Plant Cell and Environment 30(9) (2007) [58] R. Aroca, R. Porcel, J.M. Ruiz-Lozano, Regulation of root water uptake under abiotic stress conditions, Journal of Experimental Botany 63(1) (2012) [59] D. Liu, L. Wu, M.S. Naeem, H. Liu, X. Deng, L. Xu, F. Zhang, W. Zhou, 5-Aminolevulinic acid enhances photosynthetic gas exchange, chlorophyll fluorescence and antioxidant system in oilseed rape under drought stress, Acta Physiologiae Plantarum 35(9) (2013) [60] T. Abedi, H. Pakniyat, Antioxidant Enzyme Changes in Response to Drought Stress in Ten Cultivars of Oilseed Rape (Brassica napus L.), Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 46(1) (2010) [61] M.O. Urban, J. Vašek, M. Klíma, J. Krtková, K. Kosová, I.T. Prášil, P. Vítámvás, Proteomic and physiological approach reveals drought-induced changes in rapeseeds: Water-saver and water-spender strategy, Journal of Proteomics 152(30) (2017) [62] A.M.R. Ferrie, K.L. Caswell, Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production, Plant Cell Tissue and Organ Culture 104(3) (2011) Autoreferát disertační práce Milan Urban,

24 Curriculum vitae Ing. Milan O. Urban, DiS. Datum narození: 17. srpna 1980 Adresa: Kobližnice 373, Smržice Občanství: České Vzdělání: 2009-dodnes Katedra experimentální biologie rostlin, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova Institut vzdělávání a poradenství při ČZU Praha (Osvědčení o absolvování programu celoživotního vzdělávání: Studium učitelství odborných předmětů) Česká zemědělská univerzita v Praze, Institut tropů a subtropů (Ing. summa cum laude) Česká zemědělská univerzita v Praze, Institut tropů a subtropů (Bc.) Teologický seminář CASD, Sázava (senior college) (DiS) Střední průmyslová škola Prostějov Strojírenská technická administrativa Zaměstnání (vědecké): Vědecký pracovník, Výzkumný ústav rostlinné výroby, vvi. Jazyky: Angličtina, francouzština, němčina, španělština Zahraniční stáže, pobyty: 08/2006 7/2007 Université Catholique de Louvain-la-Neuve, Belgium, study programme: General Phytopatology + Plant Production 04/2008 programme EMMA Comenius in IFAPA, Córdoba, Spain. 06/2013 1/2015 VISIT, study and scientific programme at the Department of Biology (prof. Van Volkenburgh, Dr. Rodriguez, Dr. Doty), University of Washington, Seattle, USA 4/2016 COST Action FA1204 Vegetable grafting Rootstock-scion and rhizosphere signalling 10/2016-5/2017 ICRISAT, Hyderabad, India (Dr. Jana Kholová, System Analysis for Climate Smart Agriculture, Innovation System for Drylands, ICRISAT, Patancheru) Obhájené akademické práce: Bakalářská práce, 2006, titul: The agriculture in the semi-arid regions in Sudan in consideration of Sorghum (Sorghum sp.) Magisterská práce, 2009, titul: The improvement of in-vitro microspore technique of oilseed rape (Brassica napus L.): role of polyethylene glycol (PEG) and amiprophos methyl (APM) on embryogenesis and doubled haploid production Konzultant bakalářské práce: Vliv abiotických stresů na klíčení vybraných odrůd řepky olejky (Brassica napus). Vedoucí práce: RNDr. Olga Vranova, PhD. Autor práce: Bc. et Bc. Eva Jurníčková. Univerzita Palackého, Olomouc, Teze obhájena: 27. května Autoreferát disertační práce Milan Urban,

25 Publikace vybrané pro vypracování a obhajobu předkládané doktorské disertační práce: Vědecké články (peer-review s IF > 1.1): Kosová, K., Vítámvás, P., Urban, M. O., Klíma, M., Roy, A., Prášil, I. Biological Networks Underlying Abiotic Stress Tolerance in Temperate Crops A Proteomic Perspective. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16 (9): Urban, M O., Klíma M., Vítámvás P., Vašek J., Kučera V. Significant relationship between frost tolerance and net photosynthetic rate, water use efficiency and dehydrin accumulation in cold-treated winter oilseed rapes. Journal of Plant Physiology, /j.jplph , (18): Urban MO, Vašek J, Klíma M, Krtková J, Kosová K, Prášil IT and Vítámvás P. Proteomic and physiological approach reveals drought-induced changes in rapeseeds: Water-saver and water-spender strategy. Journal of Proteomics, 152 (2017) pp , DOI: /j.jprot Urban MO, Jelínková I, Klíma M, Renaut J, Planchon S, and Vítámvás P. Proteomic analysis of two drought-tolerance contrasting oilseed rape microspore-derived embryos showed different profile after drought-simulation via infusion of polyethyleneglycol into cultivation media. Prepared manuscript Kapitoly v česky psaných knihách Urban M. O. Metody vhodné pro detekci odolnosti a citlivosti plodin vůči abiotickým stresům sucha, zasolení a teplotnímu diskomfortu. In: Rostliny v podmínkách stresu - Abiotické stresory, Publisher: Česká zemědělská univerzita v Praze, Editors: Hnilička F., Středa T., ISBN Články v časopise Úroda (J Rec; recenzované vědecké články se strukturou úplného vědeckého článku) Urban, M. O., Holá, D., Klíma, M., Vítámvás, P., Kosová, K., Hilgert-Delgado, A., Prášil, I. Vliv chladové aklimace na biochemické a molekulární parametry šesti vybraných genotypů řepky ozimé ve vztahu k parametrům fluorescence chlorofylu. Úroda, 2015, 63(12 vědecká příloha): Jelínková, I., Chikkaputtaiah, C., Havlíčková, L., Vítámvás, P., Urban, M. O. Genů/proteinů indukovaných v podmínkách stresu suchem u řepky olejky. Úroda, 2014, 62(12 vědecká příloha): Havlíčková, L., Jelínková, I., Chikkaputtaiah, C., Prášil, I., Urban, M. O. Studium exprese genů spojených s abiotickým stresem u řepky Úroda, 2013, 61 (13 vědecká příloha): Urban, M. O., Vítámvás, P., Klíma, M., Prášil, I. Vliv nedostatku vody na vybrané fyziologické parametry u řepky olejky. Úroda, 2013, 61 (13 vědecká příloha): Bláha, L., Vyvadilová, M., Urban, M. O. Vybrané znaky semen řepky ozimé ovlivňující růst, vývoj a výnos v podmínkách sucha Úroda, 2012, 60 (12 vědecká příloha): Urban, M. O., Klíma, M., Vítámvás, P., Kučera, V. Aktuální mrazuvzdornost řepky olejky (LT50) v závislosti na akumulaci dehydrinů. Úroda, 2012, 60 (12 vědecká příloha): Autoreferát disertační práce Milan Urban,