Gel-based a Gel-free kvantifikace v proteomice

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Gel-based a Gel-free kvantifikace v proteomice"

Petr Vávra
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Gel-based a Gel-free kvantifikace v proteomice Juraj Lenčo Ústav molekulární patologie Fakulta vojenského zdravotnictví U Hradec Králové

2 Funkce proteinů Proteomika Lokalizace proteinů Proteinové interakce Posttranslační modifikace ílem je získat komplexní a integrované znalosti o biologických dějích pomocí analýzy velké skupiny proteinů (než analýzou individuálních proteinů) Kvantitativní (komparativní) proteomika Kvalitativní a kvantitativní porovnání proteomů vzniklých za různých podmínek Proteom Časem a místem vyhrazený soubor proteinů kódovaný příslušným genomem Graves PR et al. Microbiol Mol Biol Rev Mar;66(1):39-63.

Kvantitativní (komparativní) proteomika Kvalitativní a kvantitativní porovnání proteomů vzniklých za různých podmínek

3 Metody kvantitativní proteomiky Gel-based Gel-free 100 ( ) ( ) % Zhang X et al. J Biomol Tech Sep;15(3):167-75; m/z

6841 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 Zhang X et al. J Biomol Tech. 2004 Sep;15(3):167-75; http://www.smalltimes.

4 2D-PAGE 1975 Separační metoda pro dělení proteinů pi isoelektrická fokusace MW SDS slektroforéza SDS Klose J. Humangenetik. 1975;26(3): ; 'Farrell PH. J Biol hem May 25;250(10): ; Bjellqvist B et al. J Biochem Biophys Methods Sep;6(4):317-39;

; Bjellqvist B et al. J Biochem Biophys Methods. 1982 Sep;6(4):317-39; http://www.sigmaaldrich.

5 2D-PAGE 1975 Separační metoda pro dělení proteinů pi isoelektrická fokusace MW SDS slektroforéza 1982 Ukotvené ph gradienty SDS Klose J. Humangenetik. 1975;26(3): ; 'Farrell PH. J Biol hem May 25;250(10): ; Bjellqvist B et al. J Biochem Biophys Methods Sep;6(4):317-39;

1975 May 25;250(10):4007-21.; Bjellqvist B et al. J Biochem Biophys Methods. 1982 Sep;6(4):317-39; http://www.

6 2D-PAGE Barvení proteinů v gelu itlivost Linearita odezvy Kompatibilita s MS ena

7 2D-PAGE

8 2D-PAGE 1997 Difference gel electrophoresis Kovalentní značení proteinů y 2, y 3 a y 5 Excitační spektra Emisní spektra Unlu M. Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis ct;18(11):

Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis.

9 Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today May 15;10(10):

com/en-us/lp35613.html http://www.waters.com/watersdivision/ontentd.asp?watersit=pstd-5zbauy https://products.appliedbiosystems.

10 Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů ástřik vzorku L, MudPIT Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today May 15;10(10):

dionex.com/en-us/lp35613.html http://www.waters.com/watersdivision/ontentd.asp?watersit=pstd-5zbauy https://products.

11 Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů ástřik vzorku L, MudPIT ESI, MALDI MS/MS 100 ( ) ( ) % Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today May 15;10(10):

$com/en-us/ic/systems/capillary_nano_lc/fraction_collector/ins3412.html 291.2163 390.2183 461.2516 533.2914 758.4517 759.4523 886.5014 1117.5543 1118.5776 1231.$

12 Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů ástřik vzorku L, MudPIT AIAEASDYDR MLDGVTLAAVK ESI, MALDI MS/MS Analýza dat Identifikované proteiny groel [Francisella tularensis] Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today May 15;10(10):

2005 May 15;10(10):719-25 www.expasy.ch http://www1.dionex.com/en-us/lp35613.html http://www.waters.com/watersdivision/ontentd.asp?

13 Kvantitativní metody shotgun proteomiky A) Bez značení (Label-free) utné softwarové vyrovnání t r

14 Kvantitativní metody shotgun proteomiky B) Značení proteinů/peptidů stabilními izotopy 12 / 13, 14 / 15, 16 / 18, 1 H/ 2 D Stejné h-f vlastnosti shodná separace ( 1 H/ 2 D!) Různé M r odlišení v MS

15 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 1) Metody pro isotopové in vivo značení Stav A Lehká AK Stav B Těžká AK Stav Střední AK? da Y et al. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc atl Acad Sci U S A Jun 8;96(12): ng SE et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILA, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol ell Proteomics May;1(5): Blagoev B et al. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. at Biotechnol Sep;22(9):

Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILA, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol ell Proteomics.

16 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 1) Metody pro isotopové in vivo značení SILA- Stable Isotope Labeling by AA in ell ulture [ 1 H 3 ]-Leu x [ 2 D 3 ]-Leu [ 12 6 ]-Lys x [ 13 6 ]-Lys [ 12 6, 14 4 ]-Arg x [ 13 6, 14 4 ]-Arg x [ 13 6, 15 4 ]-Arg da Y et al. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc atl Acad Sci U S A Jun 8;96(12): ng SE et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILA, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol ell Proteomics May;1(5): Blagoev B et al. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. at Biotechnol Sep;22(9):

Proc atl Acad Sci U S A. 1999 Jun 8;96(12):6591-6. ng SE et al.

17 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami Lehká značka Těžká značka da Y et al. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc atl Acad Sci U S A Jun 8;96(12): ng SE et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILA, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol ell Proteomics May;1(5): Blagoev B et al. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. at Biotechnol Sep;22(9):

18 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami Značení pomocí 16 / 18 během štěpení ve H 2 16 a H 2 18 H 2 R1 R2 R3 R4 H trypsin H 2 16 H 2 R1 16 R2 16 H + H 2 R3 R4 H H 2 R1 R2 R3 R4 H trypsin H 2 18 H 2 R1 18 R2 18 H + H 2 R3 R4 H Schnolzer M et al.protease-catalyzed incorporation of 18 into peptide fragments and its application for protein sequencing by electrospray and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Electrophoresis May;17(5): Mirgorodskaya A et al. Quantitation of peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using (18)-labeled internal standards. Rapid ommun Mass Spectrom. 2000;14(14): Heller M et al. Trypsin catalyzed 16-to-18 exchange for comparative proteomics: tandem mass spectrometry comparison using MALDI-TF, ESI-QTF, and ESI-ion trap mass spectrometers. J Am Soc Mass Spectrom Jul;14(7):

protease-catalyzed incorporation of 18 into peptide fragments and its application for protein sequencing by electrospray and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.

19 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami IAT, ciat Isotope oded Affinity Tags Biotin 8X 1 H/ 2 D -SH reaktivní skupina IAT avidin Lehký IAT Těžký IAT Biotin Štěpné místo 9X 12 / 13 -SH reaktivní skupina ciat Gygi SP et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. at Biotechnol ct;17(10): Yi E et al. Increased quantitative proteome coverage with (13)/(12)-based, acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagent and modified data acquisition scheme. Proteomics Feb;5(2):380-7.

Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. at Biotechnol. 1999 ct;17(10):994-9. Yi E et al.

20 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami GIST Global Internal Standard Technology IPL Isotope oded Protein Labaling X 3 GIST H H H H D D D D H H H H IPL hakraborty A et al. Global internal standard technology for comparative proteomics. J hromatogr A Mar 8;949(1-2): Schmidt A et al. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. Proteomics Jan;5(1):

Global internal standard technology for comparative proteomics. J hromatogr A. 2002 Mar 8;949(1-2):173-84. Schmidt A et al.

21 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami itraq - Isobaric Tags for Rel. and Abs. Quantification Vyrovnávací skupina H 3 H 2 - reaktivní skupina Reportérová skupina isobarické značky: celkové M r vždy = 145 Ross PL et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol ell Proteomics Dec;3(12):

22 Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami itraq - Isobaric Tags for Rel. and Abs. Quantification 114 H 3 Peptid H H 3 Peptid 2 Peptid 3 MS MSMS Peptid 4 H 3 Ross PL et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol ell Proteomics Dec;3(12):

23 Kvantitativní metody shotgun proteomiky SILA 16 / 18 IAT/cIAT GIST IPL itraq Úroveň značení Protein Peptid Protein Protein/ peptid Protein/ peptid Protein/ peptid Doba značení Metabolické značení Během štěpení proteinů Před štěpením proteinů Před/po štěpení proteinů Před/po štěpení proteinů Před/po štěpení proteinů Místo značení Arg, Lys -konec peptidů ys H 2 - H 2 - H 2 - Snížení komplexity e e Ano e e e Počet značek /8 Kvantifikace MS MS MS MS MS MSMS Putz S et al. Mass spectrometry-based peptide quantification: applications and limitations. Expert Rev Proteomics Jun;2(3):

Podobné dokumenty

Kvantitativní proteomická analýza. Martin Hubálek

Kvantitativní proteomická analýza Martin Hubálek Kvantifikace proteinů Většinou pouze relativní srovnání odezvy mezi dvěma experimenty, případně mezi experimentem a standardem Množství proteinu bývá odvozeno