Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk

Transkript

1 Lékařská fakulta Masarykovy univerzity v Brně DISERTAČNÍ PRÁCE Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk MUDr. Evžen Trupar BRNO, září 2009

2 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk zpracoval sám s použitím pramenů citovaných v seznamu literatury. Dále prohlašuji, že mezi mnou a výrobcem fibrinového lepidla TISSUCOL KIT (Baxter AG, Vídeň), ani žádným z jeho dodavatelů není osobní, pracovní či jiný obdobný poměr. V Brně Evžen Trupar 1

3 Poděkování Děkuji všem, kteří mi pomohli tuto práci zrealizovat. Poděkování patří především mému školiteli prof. MUDr. P. Brychtovi, CSc. za námět a odborné vedení po celou dobu postgraduálního studia, jeho rady, připomínky a pomoc s realizací projektu. Dále pak prof. MUDr. D. Horkému, DrSc. a jeho týmu z Ústavu histologie a embryologie LF MU Brno za zpracování a histologické vyšetření bioptických vzorků a pomoc s jejich vyhodnocením. Paní J. Komárkové, laborantce Tkáňové banky FN Brno, která realizovala zpracování kožních vzorků v buněčné laboratoři a svými podněty inicializovala řadu dílčích vylepšení v praktické části projektu. V neposlední řadě také Dr. J. Staňkovi za financování praktické části projektu, MUDr. I. Menšíkovi, Ph.D. za připomínky a rady k vyhotovení disertační práce a své ženě. 2

4 Obsah Obsah Úvod... 3 Cíl práce Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu Kůže Epidermis Dermis (corium, škára) Podkožní vazivo (tela subcutanea, hypoderm, subcutis) Kožní přídatné orgány Tvorba pigmentu a pigmentace kůže Poruchy kožní pigmentace Hyperpigmentace Hypopigmentace Vitiligo Definice, a patofyziologie Klinické typy vitiliga Histologický obraz vitiliga Diferenciální diagnostika vitiliga Přehled terapie vitiliga Kosmetická kamufláž achromických ploch Depigmentace Repigmentace Lasery v medicíně Rozdělení laserů v medicíně CO 2 laser Interakce laseru a tkání Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) Kvalitativní a kvantitativní složení fibrinového lepidla Experimentální část práce - Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Cíl práce Materiál a metodika

5 Obsah 6.3 Výsledky Hojení odběrové plochy Hojení transplantované plochy Repigmentace ošetřených ploch Fotodokumentace pacientů s repigmentací ošetřených ploch Mikroskopické vyšetření Výsledky dotazníkového šetření Výsledky dotazníkového šetření část 1.: Výsledky dotazníkového šetření část 2.: Diskuse Shrnutí a závěr Souhrn Summary Vysvětlivky zkratek použitých v textu Seznam literatury Seznam příloh

6 Úvod Úvod Vitiligo je získané idiopatické onemocnění, které se u postižených osob projevuje tvorbou ostře ohraničených depigmentovaných ložisek na kůži a na slizničních přechodech v důsledku destrukce melanocytů produkujících pigment. Vyskytuje se celosvětově bez ohledu na etnickou příslušnost či pohlaví a může propuknout v jakémkoliv věku. Depigmentovaná (achromická) kožní ložiska pacientů s vitiligem jsou zpravidla přecitlivělá vůči slunečnímu záření, jiné funkční potíže onemocnění nepůsobí a má benigní charakter. Závažnost tohoto onemocnění spočívá především v jeho dopadu psychosociálním. Vitiligo stejně jako další typy leukodermy výrazným způsobem ovlivňuje kvalitu života postižených jedinců. Léze na viditelných místech kůže pacienty stigmatizují a psychicky traumatizují, nejvíce jsou to léze v oblasti obličeje, rukou a genitálu. Pacienti mají narušené interpersonální vztahy v osobním životě i v práci, trpí nízkým sebevědomím a malou sebeúctou (1, 2, 3). Terapeutické pokusy ovlivnit toto onemocnění jsou stejně staré jako zmínky o něm a lze je nalézt již 2200 let před naším letopočtem (4). Přestože se v poslední době stále častěji spekuluje o autoimunitní příčině onemocnění, podstata choroby zůstává nejasná a kauzální terapie není možná. Právě absence kauzální terapie vyústila v řadu terapeutických metod zahrnujících postupy konzervativní i chirurgické. Konzervativní terapie zahrnuje fyzikální fototerapii, lokální i systémové podávání kortikoidů, psoralenů, případně v kombinaci jako fotochemoterapii atd. Chirurgické postupy jsou založeny na obnovení melanocytů v okrscích kůže s chybějícím pigmentem přenosem autologních melanocytů. Přenáší se jednotlivé buňky, nebo tkáně (kůže v plné tloušťce, dermoepidermální štěpy, epidermis). Jednou ze stále málo rozšířených metod k léčbě vitiliga je buněčná terapie autologními nekultivovanými kožními buňkami. Buněčnou terapií se v obecné rovině nazývá postup, jehož cílem je opravit poškozené části těla / tkání zdravými buňkami. Tato léčba vychází z předpokladu, že dojde k plné integraci nově dodaných buněk do poškozené tkáně, včetně obnovení příslušné tkáňové funkce. V poslední době je termín buněčná terapie spojován a zaměňován především s terapií prostřednictvím ještě nediferencovaných, tzv. kmenových buněk terapií kmenovými buňkami. Kmenové buňky se vyskytují u mnohobuněčných organismů a jsou charakterizovány 2 vlastnostmi: 1 - schopností sebereplikace mitotickým dělením beze změny svých vlastností a 2 - trvalou nebo dlouhodobou kapacitou diferencovat se do různých buněčných typů daného organismu (5, 6). Terapie kmenovými buňkami je úspěšně používána 3

7 Úvod řadu let k obnově imunitního systému pacientů po chemoterapii a je založena právě na jejich schopnosti diferenciace v cílový buněčný typ a tkáň. Pojem buněčná terapie zahrnuje rovněž terapii progenitorovými buňkami, které jsou schopné diferencovat se pouze v určité typy buněk, nebo terapii již plně diferencovanými buňkami (7). Každá buněčná terapie musí řešit minimálně 3 základní problémy spojené s touto specifickou technikou léčby: 1. zdroj buněk 2. média umožňující přechovávání, kultivaci a event. diferenciaci odebraných buněk 3. techniku implantace buněk do cílové tkáně Předmětem této práce je využití buněčné terapie k léčbě vitiliga. K buněčné terapii byly použity nekultivované autologní diferencované buňky melanocyty. Zdrojem buněk byl autologní dermoepidermální štěp a implantace buněk byla realizována jejich kontaktem s obnaženou dermis v místě, kde mělo dojít k jejich integraci do tkáně. 4

8 Cíl práce Cíl práce Léčba vitiliga transplantací autologních melanocytů do depigmentovaných kožních ložisek se v různých podobách zkouší od roku 1987, kdy Lerner a spolupracovníci nakultivovali autologní melanocyty a injikovali je zpět do kůže pacientovi postiženému piebaldismem. Melanocyty se začlenily do bazální vrstvy kůže a začaly plnit svou funkci, což se projevilo obnovením kožního pigmentu (8). Tato forma buněčné terapie pak byla v různých modifikacích zkoušena a publikována řadou dalších autorů. Společným pojítkem všech prací na toto téma je přenos autologních melanocytů kultivovaných či nekultivovaných do achromických kožních ložisek (9). Tato léčba je v České republice, ale i v zahraničí, málo rozšířená. V České republice se touto terapií zabýval tým lékařů v rámci grantového úkolu č Kožní kliniky FN Brno v letech Léčba vitiliga u dospělých osob transplantací autologních melanocytů. Terapie byla prováděna dvěma způsoby: 1. implantací kultivovaných autologních melanocytů do kůže zařízením Dermojet a 2. aplikací roztoku s autologními melanocyty na achromickou kožní plochu připravenou k přijetí buněk dermabrazí epidermis. Obnažení dermis bylo prováděno vysokoobrátkovou frézou až po dermoepidermální junkční zónu (10, 11). Méně nákladnou alternativou je přenos autologních nekultivovaných melanocytů nebo směsi autologních kožních buněk do depigmentovaného kožního ložiska. Hlavním problémem při volné aplikaci roztoku buněk na dermabradovanou kožní plochu je udržení přenesených buněk v místě aplikace tak, aby se neztrácely v obvazovém materiálu před jejich integrací do kůže. Jednou z možností jak řešit tento problém je použití vhodného buněčného nosiče, který by zabránil úniku buněk mimo léčenou plochu a současně nebránil jejich průniku do tkáně. Hlavním cílem této práce bylo ověřit možnost použití autologních kožních buněk k léčbě vitiliga modifikovaným postupem s využitím CO 2 laseru k ablaci epidermis v léčené oblasti a fibrinového lepidla Tissucol coby buněčného nosiče pro melanocyty. Dalším cílem pak bylo vyhodnotit úspěšnost léčby a stálost pigmentací s delším časovým odstupem v případě repigmentace. Vzorem k provedení práce byl postup publikovaný Nanny van Geelovou a spolupracovníky použitý na 4 pacientech. K léčbě použili směs nekultivovaných autologních melanocytů a keratinocytů obohacenou o hyaluronovou kyselinu za účelem zvýšení viskozity roztoku a k dermabrazi v příjmové oblasti použili CO 2 laser. 5

9 Cíl práce Výsledkem léčby byla % pigmentace ošetřených ložisek u všech pacientů ve sledovaném období do 5 měsíců od zákroku (12). V teoretické části práce je stručně zrekapitulována fyziologie a anatomie kůže, tvorba kožního pigmentu, princip fungování laseru a jeho použití k ablaci epidermis a specifikace fibrinového lepidla Tissucol. S ohledem na zaměření práce je dále uveden stručný výčet nejčastějších poruch pigmentace kůže, podrobněji je popsáno vitiligo včetně současných možností léčby. V experimentální části práce jsou popsány materiál a metodika, operace, dosažené výsledky, diskuse a závěr. 6

10 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu 1 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu 1.1 Kůže Kůže je zevní kryt lidského organismu a tvoří tak bariéru mezi zevním a vnitřním prostředím. Je to největší orgán těla, u dospělého člověka má plochu 1,6-1,8 m 2 a představuje asi 7 % z celkové tělesné hmotnosti (13). Zabraňuje poškození organismu mechanickými či chemickými vlivy, brání ztrátám tekutin, mikrobiální invazi, reguluje tělesnou teplotu a je zapojena do metabolických a imunitních procesů organismu. Prostřednictvím specializovaných buněk umožňuje vnímání teploty, doteku a bolesti. Z anatomického hlediska je kůže definována dvěma vrstvami, jsou to: epidermis (pokožka) a dermis (škára). S podkladem je kůže spojena podkožním vazivem (hypodermis, subcutis), některými autory přiřazovaným ke kůži, se kterou tvoří funkční celek. Součástí kůže jsou i mazové a potní žlázy, nehty a vlasy, tzv. kožní adnexa Epidermis Epidermis tvoří vícevrstevný dlaždicový rohovatějící epitel, nalézá se na povrchu kůže a histologicky lze rozlišit 5 vrstev. Od dermis směrem k povrchu následují v pořadí: stratum basale, spinosum, granulosum, lucidum a corneum. Základními buňkami epidermis jsou buňky ektodermálního původu tzv. keratinocyty. V oblasti stratum basale a stratum spinosum vykazují keratinocyty vysokou mitotickou aktivitu. Pro svou proliferační aktivitu jsou tyto vrstvy označovány jako stratum germinativum (Malpighi). S pomocí cytoskeletu se keratinocyty posouvají během zrání směrem k povrchovějším vrstvám epidermis a nahrazují odloupané zrohovatělé keratinocyty (14). Stratum granulosum tvoří 3-5 vrstev buněk s centrálně uloženým jádrem, je to poslední vrstva keratinocytů, ve které ještě obsahují jádro. Buňky v této vrstvě obsahují granula keratohyalinu, jádro a organely jsou narušeny činností lyzosomů, až v buňkách zůstanou kromě keratohyalinových granul jen svazky keratinizovaných tonofilament. Stratum lucidum je tvořeno již odumřelými buňkami bez jader, zato bohatými na četná vlákna keratinu a tzv. eleidin produkt transformace keratohyalinu. Stratum lucidum je identifikovatelné jen v pokožce chodidel a dlaní jako úzký eozinofilní proužek. Nejpovrchnější vrstvou je stratum corneum, tvoří ji mnoho vrstev pevně spojených, keratinizovaných, zcela zploštělých buněk. V nejpovrchnějších vrstvách se vytrácí 7

11 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu mezibuněčná spojení a keratinizované buňky se odlupují ve skupinách. Celý proces diferenciace od stratum bazale až po stratum corneum trvá dní. Tloušťka pokožky na těle se pohybuje od µm, přičemž nejsilnější je na chodidlech a dlaních. Mezi buňkami epidermis v germinativní vrstvě se nachází kromě keratinocytů i další typy buněk (15). Melanocyty původem se řadí mezi buňky z neuroektodermu, produkují pigment melanin a do epidermis migrují během 2. měsíce embryonálního vývoje. Za fyziologických poměrů jsou přítomny ve stratum bazale a spinosum v počtu na 1 mm 2 kůže, tedy přibližně v poměru 1 melanocyt na 5-12 keratinocytů (16, 17). Hustota epidermálních melanocytů je různá na různých částech těla. V oblasti hlavy a předloktí je hustota přibližně 2000 melanocytů na mm 2, zatímco na zbytku těla je hustota přibližně 1000 melanocytů na mm 2 (18). Langerhansovy buňky mají světlou cytoplasmu a nepravidelné laločnaté jádro, tvoří jen minimální subpopulaci buněk epidermis, derivují z mezenchymu kostní dřeně a účastní se imunitních reakcí kůže. Nachází se hlavně ve stratum spinosum, jejich nejdůležitější schopností je fagocytóza a schopnost předkládat antigeny a následně je transportovat do lymfatických uzlin. Hrají tak důležitou úlohu specifické T-buněčné odpovědi na antigen a jsou zodpovědné za kožní kontaktní hypersenzitivní reakce (např. kontaktní alergická dermatitis) (19). Merkelovy buňky jsou lokalizované výhradně ve stratum basale s dlouho nejasným původem. Mají světlou cytoplazmu a četné tmavé váčky, v nichž byla prokázána řada neuropeptidů. U člověka se nacházejí především ve hmatových lištách a jsou synapticky spojeny s terminálami senzitivních nervů. Nejnovější práce ukazují, že se jedná o deriváty neurální lišty a jsou považovány za sekundární smyslové buňky, slouží pravděpodobně jako mechanoreceptory. V kůži se vyskytují také neinervované buňky, které jsou podobné Merkelovým buňkám a pravděpodobně patří k difusnímu neuroendokrinnímu systému (20). Epidermis a dermis spojuje bazální membrána. Jedná se o acelulární strukturu tvořenou ze dvou vrstev: lamina basalis a lamina reticularis, přičemž laminu bazalis vytváří keratinocyty a laminu reticularis vytváří buňky pojiva Dermis (corium, škára) Dermis se skládá ze dvou vrstev: stratum papillare a reticulare. Podobně jako epidermis kolísá její tloušťka na různých místech těla od 0,1 mm do 4 mm. Zatímco 8

12 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu od pokožky je dermis ostře oddělena bazální membránou, hranice s podkožním vazivem je neostrá. Stratum papillare tvoří výběžky (papilly), které vybíhají proti epidermis, a tím je hranice mezi oběma vrstvami nepravidelně zvlněná. Hustota, tvar a výška papil koria se na různých místech těla liší a souvisí s tloušťkou pokožky. Vyšší a štíhlejší papily jsou typické pro tlustou kůži, nízké a široké papily nalézáme v kůži tenké. Vlákna kolagenu III a elastinu tvoří prostorově neuspořádanou řídkou síť a do povrchních vrstev zasahují kolmo k povrchu kůže kotvící fibrily bazální membrány, které tak pevně pojí epidermis s dermis. Vazivo papil je bohatě vaskularizované, jemné kapilární kličky se dostávají k linii kontaktu epidermis-dermis a zajišťují tak výživu avaskulární epidermis a podílí se významně na termoregulaci těla. V jednotlivých papilách rovněž začínají lymfatické kapiláry, mechanoreceptory Meissnerova tělíska, Vaterova-Paciniho tělíska a tělíska Krauseho. V oblasti dlaňové strany ruky a na plantární straně nohy vybíhá stratum papillare oproti pokožce ve formě vazivových hran, které se označují jako koriové lišty. Každá z těchto koriových lišt nese dvojici menších koriových papil. Mezi tyto papily vklesává epidermis v podobě hřebenového vyklenutí, zvaného crista intermedia a do těchto do koria prominujících hřebenů vyúsťují vývody malých potních žláz. Těmto koriovým lištám na povrchu pokožky odpovídají hmatové lišty (cristae cutis), které jsou vzájemně odděleny rýhami (sulci cutis) a tvoří u každého jedince originální, v průběhu života neměnný reliéf, tzv. papilární linie dermatoglyfy (15). Stratum reticulare pozvolna navazuje na stratum papillare a je vždy silnější než stratum papillare. Jedná se o kolagenní vazivo tvořené vlákny kolagenu I, III, V a elastinu, tvořící prostorovou síť připomínající proutěný koš. Amorfní složku v koriovém vazivu zastupuje zejména dermatan sulfát. Cévní zásobení je menší než v papilární dermis a v hlubších vrstvách přibývají adipocyty. V retikulární dermis jsou na některých místech těla přítomny i buňky hladké svaloviny, které kůží pohybují a mění její napětí či zvrásnění (např. scrotum, labia major, areola mammae) a další svalová vlákna vázaná na chlupové folikly (mm.arrectores) působící erekci chlupů. Další složkou retikulární dermis jsou mechanoreceptory Paciniho tělíska reagující na vibrace a tlak a Ruffiniho tělíska reagující na tah. Do škáry, zejména do stratum reticulare, jsou zasazeny přídatné kožní ústroje vlasové folikuly, potní a mazové žlázy (21). Veškeré rezidentní buňky dermis jsou mezodermálního původu, vyjímku tvoří nervové buňky. 9

13 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu Fibroblasty - jsou dominantní buněčnou populací dermis a největší hustoty dosahují v papilární dermis. Mají převážně vřetenovitý tvar a syntetizují velké množství kvantitativně a kvalitativně odlišných proteinů, které do značné míry ovlivňují mechanické vlastnosti kůže. Jejich schopnost produkce a přestavby kolagenu je klíčová v procesu hojení kůže. Makrofágy mononukleární fagocyty, efektorové buňky humorální imunity, jedná se o buňky předkládající antigeny, patřící mezi buňky s expresí antigenů II. třídy hlavního histokompatibilního komplexu (MHC-II) (21). T-lymfocyty buňky imunitního systému, pravidelně bývají nalézány v blízkosti kožních přídatných orgánů a postkapilárních venul. Mastocyty deriváty buněk kostní dřeně, jsou přítomny ve všech vrstvách dermis s maximem v blízkosti kožních adnex a v papilární dermis. Produkují řadu enzymů a chemotaktických mediátorů jako např. histamin, prostaglandiny, eozinofilní chemotaktický faktor, heparin, thromboxany atd., jsou součástí imunitního systému a zahajují anafylaktickou reakci (22). Dermální dendritické buňky jejich funkce není spolehlivě objasněna, pravděpodobně se jedná o součást imunitního systému kůže, nejčastěji je nalézáme perivaskulárně (23). Pericyty buňky s dlouhými cytoplazmatickými výběžky obklopují endoteliální buňky krevních kapilár, v cytoplazmě obsahují aktin, myosin a tropomyosin. Pravděpodobně jsou schopny kontrakce Podkožní vazivo (tela subcutanea, hypoderm, subcutis) Podkožní vazivo spojuje kůži s podkladem, kterým je dle lokalizace na těle buď svalová fascie, periost nebo perichondrium. Hustota podkožního vaziva a jeho složení z kolagenu a adipocytů se liší v různých lokalitách na těle a ovlivňuje především kožní pohyblivost vůči spodině. Kůže je tak zvýšeně pohyblivá v místech s řídkým kolagenním vazivem v podkoží (víčka, penis) a méně pohyblivá až nepohyblivá v místech s podkožím z hustého kolagenního vaziva (nos, ušní boltce, labium minus). V síti kolagenního vaziva subcutis jsou rozloženy adipocyty, jejich množství je regionálně rozdílné a závisí na stavu výživy a pohlaví. Souvislé tukové polštáře podkoží se označují jako panniculus adiposus a mohou tvořit až několikacentimetrovou vrstvu. Slouží jako zásobárna energie a mají rovněž tepelně izolační funkci. Strana podkožního vaziva přivrácená k podkladu bývá zpravidla zahuštěna v souvislou vrstvu označovanou jako fascia superficialis (15). 10

14 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu Kožní přídatné orgány Kožní přídatné orgány (kožní adnexa) tvoří nedílnou součást kůže, vesměs derivují z epidermis a patří mezi ně ústroje rohového typu (vlasy, chlupy a nehty) a kožní žlázy (apokrinní, ekrinní, mazové žlázy a žláza mléčná). Jejich struktura a funkce s ohledem na zaměření práce nebude blíže popsána. 1.2 Tvorba pigmentu a pigmentace kůže Barva kůže je pro svou viditelnost jedním z nejdůležitějších znaků, který hodnotíme při posuzování vzhledu, zdraví a krásy člověka. Zahrnuje široké spektrum barevných odstínů od téměř bílé po tmavě hnědou a koreluje s klimatem, kontinenty a genetickými předpoklady v rámci lidské rasy. Výsledná barva kůže je dána kombinací pigmentů hemoglobinu, karotenu, melaninu a funkčním stavem organismu. Hemoglobin coby červené krevní barvivo nepatří mezi kožní pigmenty, ale ovlivňuje barvu kůže v závislosti na funkčním stavu krevních kapilár koria, v některých oblastech pak ovlivňuje barvu dominantně červeň rtů. Dále může hemoglobin ovlivňovat zbarvení kůže nepřímo přes produkty svého odbourávání hemosiderin a bilirubin. Karoten je zodpovědný za žlutou až oranžovou barvu a barevný tón kůže ovlivňuje pouze při excessivním příjmu v potravě. Nejdůležitějším mezi pigmenty, které se na výsledné barvě kůže podílejí, je melanin. Kožní pigment melanin hraje důležitou roli v ochraně kůže před škodlivými vlivy ultrafialového záření (dále jen UV záření). Dokáže UV záření absorbovat, pohlcovat volné chemické radikály produkované v cytoplasmě, chránit před různými typy ionizujícího záření. Melanin je syntetizován specializovanými buňkami - epidermálními melanocyty a melanocyty vlasového folikulu. Epidermální a folikulární melanocyty tvoří dohromady asi 5 % z celkového počtu buněk v epidermis. Vývojově pocházejí z neurálních lišt, odkud proliferují jako melanoblasty a následně se diferencují v definitivní melanocyty (24). Výchozí látkou k syntéze kožního pigmentu melaninu je aminokyselina tyrosin (p-hydroxyfenylalanin) (25). Ta je metabolizována u lidí ve dva konečné produkty eumelanin (tmavohnědý a černý pigment) a feomelanin (světlý žlutočervený pigment) pomocí enzymu tyrosinázy. Tyto pigmenty jsou pak největší měrou zodpovědné za různou barvu kůže (černá, hnědá, žlutá). 11

15 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu Obr. 1 syntéza kožního barviva převzato a upraveno z knihy: MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A.; et al., Harperova Biochemie, Nakladatelství a vydavatelství H&H 2002, ISBN Aby mohla syntéza pigmentu probíhat, musí být k dispozici tyrosin a musí být přítomen fenoloxidázový enzymový komplex, jehož syntézu obstarávají ribosomy drsného endoplazmatického retikula. Vytvořený pigment je z buněk vylučován formou granul, tzv. melanosomů, které vznikají odštěpováním z Golgiho aparátu. Melanosomy mají velikost 12

16 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu 200 x 900 nm a maturují přes několik morfologicky odlišitelných stádií. Dá se rozlišit stádium I (nepigmentované), stádium II (pruhované, elipsového tvaru, s přítomností uspořádaných fibril), stádium III (s depozity elektron densního materiálu), až stádium IV (bohaté na výsledný melanin). Melanosomy s hotovým pigmentem putují v melanocytech z buněčného těla do jejich výběžků. Transport melanosomů je zajišťován mikrotubuly cytoskeletu a dochází tak k nahromadění maturovaných melanosomů v hrotech výběžků. Vlastní přesun pigmentu z melanocytů do keratinocytů připomíná injekci, hovoříme o tzv. cytokrinní sekreci. Předpokládají se 4 mechanismy tohoto děje viz obr. 2 (26, 27). Obr. 2 - přesun melaninu do keratinocytů, převzato a upraveno z článku: LAM DO PHUONG UYEN; DUNG HOANG NGUYEN; EUN-KI KIM. Mechanism of Skin Pigmentation. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008, 13: Mechanismus 1 předpokládá, že hrot výběžku melanocytu je fagocytován keratinocytem. Mechanismus 2 regulovaná exocytosa membrána melanosomu fúzuje s plazmatickou membránou melanocytu a uvolní melanin do intercellulárního prostoru odkud je fagocytován keratinocytem. Mechanismus 3 předpokládá přítomnost analogického tzv. SNARE proteinu na povrchu melanocytu a keratinocytu. SNARE protein iniciuje přímou fúzi obou zevních membrán, vznikne tak kanál, kterým se dostanou melanosomy z melanocytu do keratinocytu. Mechanismus 4 transport melanosomů do keratinocytů formou membránových vezikul. 13

17 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu Každý melanocyt je napojený přibližně na okolních keratinocytů svými dendritickými výběžky. Celé takovéto uspořádání melanocytu a okolních keratinocytů se nazývá epidermální melaninová jednotka viz obr. 3 (28). Obr. 3 epidermální melaninová jednotka, převzato a upraveno z článku: LAM DO PHUONG UYEN; DUNG HOANG NGUYEN; EUN-KI KIM. Mechanism of Skin Pigmentation. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008, 13: V keratinocytech jsou melaninová zrna intracelulárně uložena ve formě pigmentových čepiček vždy mezi jádrem a stranou orientovanou ke kožnímu povrchu. Tímto způsobem je pigment melanin uložen v bazální vrstvě epidermis a chrání její germinativní vrstvy před UV zářením (24). Vlastní barvu kůže určuje hlavně melanogenní aktivita melanocytů, kvantita a druh produkovaných pigmentů, ale ne hustota melanocytů (29). Obecně množství melaninu v kůži je závislé na dědičných faktorech a na velikosti expozice UV záření. U ras s více pigmentovanou pokožkou je produkce melaninu větší, melanin nalézáme i v keratinocytech ve stratum spinosum a zbytky melaninu lze zastihnout i v odlupujících se šupinkách rohové vrstvy. Opotřebené melanocyty se postupně dostávají k povrchu epidermis a odlupují se 14

18 Kůže anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu společně s buňkami rohové vrstvy. Počet melanocytů je udržován jejich množením v aktivní fázi melanogeneze, je stejný u všech ras a obou pohlaví. Aktivita melanocytů, včetně specifických charakteristik melanosomů (velikost, tvar, typ a barva), aktivita enzymů podílejících se na syntéze melaninu a transfer pigmentu do keratinocytů to vše je ovlivněno řadou faktorů. Faktory ovlivňující pigmentaci kůže lze rozdělit do 3 skupin: 1 ultrafialové záření, 2 léky, 3 genetické faktory α-msh (α-melanocyty stimulující hormon), ASP (agouti signální protein), β-fgf (Fibroblastový růstový faktor), ET-1 (endothelin-1) Na výsledném ztmavnutí epidermis vyvolaném UV zářením (opálení) se podílí: migrace melanocytů do povrchnějších vrstev, urychlení syntézy a předávání melaninu keratinocytům a tmavnutí melaninu, který je již v keratinocytech uložen (15, 30). Pigmentace způsobené UV zářením se dělí na okamžité ztmavnutí (IPD immediate pigment darkening) a pozdní (DPD delayed pigment darkening). Okamžité lze pozorovat během sekund po expozici UVA záření (vlnová délka nm) a typicky mizí během 1-3 dní, je důsledkem oxidace v kůži již dříve vzniklého a dále existujícího melaninu. Pozdní ztmavnutí se objevuje za 2-3 dny po expozici UVB záření. Barva kůže se během života mění, je ovlivněna hustotou melanocytů, počtem, velikostí a rozptýlením melanosomů transportovaných do keratinocytů (31). Neméně důležitý je také poměr a množství jednotlivých typů melaninu v melanosomech. Takřka všichni novorozenci, včetně dětí u tmavých ras jsou po narození světlejší a kůže jim tmavne během prvního týdne života. Naproti tomu lze pozorovat redukci hustoty melanocytů v místech kožního povrchu chráněných před sluncem přibližně o 8-10 % každou dekádu života, kromě kůže genitálu (32). 15

19 Poruchy kožní pigmentace 2 Poruchy kožní pigmentace Poruchy kožní pigmentace lze rozdělit do dvou skupin na nadměrné pigmentace (hyperpigmentace) a na nedostatečné pigmentace (hypopigmentace). Obě skupiny zahrnují řadu chorob a posttraumatické stavy. Začlenění onemocnění projevujících se poruchou pigmentace do těchto dvou skupin je problematické, jelikož některá onemocnění se mohou projevit oběma formami v závislosti na typu kůže, expozici UV záření a dalších faktorech. Například po mechanickém povrchním poranění kůže či po popálení může dojít jak k hyper, tak k hypopigmentaci. Proto se tyto poruchy kožní pigmentace následkem termického traumatu někdy označují jako tzv. dyspigmentace po popálení. Tvář a další viditelná místa kožního povrchu znetvořená poruchou pigmentu mohou výrazně ovlivnit psychiku pacienta. Mají vliv na jeho sociální život, snižují výkonnost v práci či ve škole a snižují sebeúctu postižených (3). 2.1 Hyperpigmentace Poruchy kožní pigmentace ve smyslu zvýšené pigmentace se projevují v různých formách a jsou v populaci poměrně časté. Nejčastější hyperpigmentace v populaci jsou melasma, lentigo soláris / senilis a pozánětlivé hyperpigmentace. Za hyperpigmentaci jsou zodpovědné odlišné mechanismy, které se mohou projevit v úrovni epidermis, dermis nebo v obou. Hyperpigmentace vznikne buď jako důsledek zvýšení množství melaninu tzv. melanotická hyperpigmentace (zvýšená tvorba melaninu při normálním počtu melanocytů). Nebo proliferací aktivních melanocytů melanocytotická hyperpigmentace (zvýšený počet melanocytů). Dalším mechanismem vzniku hyperpigmentace je přesun melaninu nebo v některých případech i melanocytů do dermis. Poslední možností je kombinace obou možností tzv. smíšená pigmentace viz obr. 4. Většina hyperpigmentací patří do skupiny melanotických (33). 16

20 Poruchy kožní pigmentace Obr. 4 histologický nález u různých forem hyperpigmentací, převzato a upraveno z článku: CAYCE, K.A.; MCMICHAEL, A.J.; FELDMAN, S.R. Hyperpigmentation: An Overview Of the Common Afflictions. Dermatology Nursing. 16(5): , , October 2004 Melasma, Chloasma Jsou to získané pigmentované makuly lokalizované zpravidla symetricky v obličeji na čele, tváři, nad horním rtem a na nose. Mimo kosmetického defektu, nepůsobí žádné potíže. Mezi vyvolávající příčiny patří těhotenství (Chloasma uterinum), zvýšená hladina estrogenu a progesteronu např. při užívání hormonálních kontraceptiv, hepatální dysfunkce. Pigmentace jsou zesilovány slunečním zářením. Histologicky nacházíme hyperpigmentovanou bazální vrstvu epidermis s normálním nebo jen mírně zvýšeným počtem melanocytů. Různé množství pigmentu bývá přítomno i v papilární dermis (volný melanin, roztroušené melanofágy). U těhotných dochází vlivem hormonálních změn i k dalším změnám pigmentace - ztmavnutí pih, bradavek, rodidel, perianální oblasti a výskytu tzv. linea nigra lineární, cca 1 cm široké pigmentace na ose symfýza umbilikus - sternum. Lentigo solaris (lentigo senilis, jaterní skvrna) Pojem lentigo (lentigines) zahrnuje řadu podobných hyperpigmentových lézí jako lentigo simplex, nevus spilus a lentigo solaris. Jedná se o světle hnědé makuly velikosti několika 17

21 Poruchy kožní pigmentace milimetrů až centimetrů čtverečních, oválného i nepravidelného tvaru především u starších osob, často v kombinaci s dalšími známkami chronického poškození kůže UV-zářením. Příčinou je zvýšené množství melanocytů. U solárního lentiga je příčina ve zvýšené produkci melaninu. Pigmentace se vyskytují v lokalitách exponovaných slunci (obličej, ruce) a perzistují i pokud se zamezí dalšímu působení UV-záření, afekce jsou benigní. Pozánětlivá hyperpigmentace Získaná porucha pigmentace, která se projevuje tmavými makulami a skvrnami na kůži v místech předchozího zánětu kůže. Vytvoření pigmentace předchází alterace kůže mechanickým či termickým poraněním, alergickou reakcí, primárním zánětem kůže či iatrogenním zásahem. Jedná se o jednu z nejčastějších hyperpigmentací, může vzniknout u všech typů kůže, nejčastěji však u tmavších fototypů. K vytvoření pigmentací mohou vést záněty kůže vyvolané jak endogenně, tak exogenně, predominantně se tyto hyperpigmentace tvoří u pacientů s atopickou dermatitidou, s alergickou kontaktní dermatitidou, s lupus erythematosus, s lichen planus, atd. (34). Jedná se o hyperpigmentace ze zvýšené melanogeneze spolu s akumulací melanofágů v horní části dermis pozůstatek po destrukci bazální vrstvy v pozánětlivém terénu (35). Cafe-au-lait Název je odvozen od vzhledu makul světle hnědé barvy (francouzsky - káva s mlékem). Na kůži jsou patrny už od narození, nebo v časném dětství, obvykle do 2 let věku. Bývají přítomny až u 95 % pacientů s neurofibromatózou typu I, ale jsou přítomny i u pacientů bez neurofibromatózy (36). Pihy (ephelides) Klinicky se projevují jako malé hnědé makuly většinou menší než 5 mm s lokalizací v obličeji a na ramenou, častější výskyt je u světlovlasých a rusovlasých osob. Nejsou na kůži přítomny od narození, objevují se v prvních letech života, jejich množství a vzhled ovlivňuje expozice slunečnímu UV záření po níž tmavnou. V histologickém obraze je patrná hyperpigmentace bazální vrstvy epidermis při normálním počtu melanocytů. 18

22 Poruchy kožní pigmentace Hyperpigmentace vyvolané léky Tento typ hyperpigmentací není nijak výjimečný. Podílí se na všech poruchách pigmentace %. Pigmentace mohou být způsobeny užíváním celé řady léků, nejčastěji vznikají při užívání amiodaronu, nesteroidních antiflogistik, antimalarik, antipsychotik, tetracyklinu, bleomycinu a těžkých kovů (37). Léky indukované pigmentace kůže mohou být výsledkem zvýšené syntézy melaninu, lipofuscinu, nebo depozit látek z léku v kůži (např. těžké kovy). Hyperpigmentace u systémových chorob Hyperpigmentace kůže mohou být součástí symptomů některých chorob, typické jsou například u syndromu gastrointestinální polypózy a Adissonovy choroby. Xeroderma Pigmentosum Jedná se o heterogenní skupinu autosomálně recesivních onemocnění charakterizovanou přecitlivělostí na UV záření, jejímž následkem je vznik kožních nádorů. Onemocnění se projevuje asi v polovině případů již od 18. měsíce věku tvorbou hyperpigmentových makulózních skvrn na částech těla exponovaných slunečním UV záření. Postupně vznikají hyperkeratózy, keratomy, fibromy a další benigní afekce s rozvojem kožní atrofie a následným vznikem hypopigmentovaných skvrn a mnohočetných kožních malignit (mnohočetné spinocelulární a basocelulární karcinomy, a maligní melanom) (38). Incontinentia pigmenti (Bloch-Sulzberger syndrom) Jedná se o raritní dědičné onemocnění vázané na X chromozom, postihuje převážně ženy. Je charakterizováno ztrátou melaninu v epidermis a jeho kumulací v dermis (39). 2.2 Hypopigmentace Hypopigmentace je způsobena snížením počtu až vymizením melanocytů, nebo redukcí syntézy melaninu. V následujícím textu jsou stručně charakterizovány nejčastější typy leukodermu, podrobněji je s ohledem na zaměření práce specifikováno vitiligo. Albinismus 19

23 Poruchy kožní pigmentace Název je odvozen z latinského albus bílý. Jedná se o kongenitální (autosomálně recesivní) deficit pigmentu melaninu v očích, kůži a ve vlasech. Postižení jedinci mají bílou až průsvitně vypadající kůži a trpí poruchami zraku (snížená zraková ostrost, nystagmus, myopie, astigmatismus, strabismus). Patofyziologicky jde o biochemickou poruchu syntézy melaninu způsobenou absencí fenoloxidázového komplexu, nebo neschopnost melanocytů střádat tyrosin. Klinicky rozlišujeme několik variant parciální (hypomelanosa, částečný albinismus), nebo totální (amelanosa, úplný albinismus). Hovoříme také o okulárním (postiženy pouze oči), nebo okulokutánním albinismu (postižení očí i kůže). Dříve se albinismus klasifikoval na tyrosinaza pozitivní a negativní formu dle přítomnosti enzymu tyrozinázy, který hraje klíčovou roli v syntéze melaninu. Tato klasifikace je však z dnešního pohledu obsolentní, protože melanocyty nejsou schopny produkovat melanin i z řady jiných příčin (32). Piebaldismus Lokalizovaná forma albinismu, označovaná jako tzv. částečný albinismus. Jedná se autosomálně dominantní onemocnění. Nejčastěji se projevuje tvorbou bílých lézí uprostřed, nebo po stranách čela s ohraničeným depigmentovaným pramenem vlasů, ale léze se mohou tvořit i jinde na těle. Typická je přítomnost léze ve stejné lokalizaci během celého života, někdy i u ostatních členů rodiny (41). Poliosis (trichopoliosis) Získaná, ložisková ztráta vlasového pigmentu. Tato ohraničená ložiska bílých vlasů mohou vzniknout současně s jiným onemocněním, nalézáme je např. u vitiliga, ložiskové alopecie, nebo po zánětlivých procesech. Ztráta pigmentu může být trvalá nebo dočasná (např. po ložiskové alopecii). Mimo kosmetického defektu nečiní potíže (42). Hypomelanosis guttata Idiopatický benigní typ leukodermu s tvorbou ostře ohraničených, depigmentovaných makul velikosti kolem 5 mm v místech vystavených slunečnímu záření. Histologicky nalézáme snížené množství melanocytů i pigmentu. V patogenezi onemocnění hraje pravděpodobně klíčovou roli expozice UV záření (43). 20

24 Poruchy kožní pigmentace Pityriasis alba Dermatitida s projevy hypopigmentací kůže na horní části trupu s nejasnou etiologií, někdy spojovaná s přítomností atopické dermatitidy. Nejčastěji vzniká u dětí ve věku 3-16 let a většinou spontánně vymizí v dospělosti. Histologický nález je nekonstantní - mírná hyperkeratóza, s normálním nebo sníženým počtem melanocytů. Jedná se o redukci množství a velikosti melanosomů bez přerušení jejich transportu do keratinocytů (44). Makuly se často vyskytují i ve tváři, velikost lézí je přibližně 1-4 cm v průměru, barva makul je bílá až narůžovělá (45). Postinflamační leukoderma Depigmentovaná ložiska na kůži u pacientů s anamnézou prodělané dermatózy, nebo termického poranění (například po laserovém resurfacingu CO 2 laserem). Lichen sclerosus et atrophicus Jedná se o chronickou dermatitidu, která se projevuje drobnými bílými plaky s epidermální atrofií, plaky spolu mohou postupně splývat. Zánět spolu s alterovanými fibroblasty v papilární dermis vede postupně k fibróze. Postihuje nejčastěji kůži genitálu, ale může se vyskytnout i jinde na těle, vyskytuje se u obou pohlaví, častěji u žen. Etiologie je neznámá, spekuluje se o genetické predispozici, infekci a autoimunitním postižení. Synonymem v případě postižení genitálu u mužů je balanitis xerotica obliterans, u žen craurosis vulvae, ložiska mohou přejít do spinocelulárního karcinomu, proto u postižených je nutná pravidelná observace a biopsie (46, 47). Achromický névus (naevus achromicus) Dobře ohraničené depigmentované ložisko, stabilní bez známek progrese, přítomné od narození s normálním nebo sníženým počtem melanocytů (48). Tinea versicolor (pityriasis versicolor) Jedná se o benigní kožní léze projevující se jako hypopigmentované nebo hyperpigmentované oválné makuly hrudníku a zad velikosti 0,5-2,5 cm. Původcem je mykotická infekce Malassezia furfur (synonyma: Pityrosporum ovale, Pityrosporum orbiculare) ve stratum corneum. Malassezia furfur je normálně přítomna na kožním povrchu u % dospělých. U pacientů s klinickými projevy lze zastihnout stádium hyfů i spór. 21

25 Poruchy kožní pigmentace Přechod ze saprofytismu do parazitismu iniciuje pravděpodobně imunosuprese, malnutrice, genetická predispozice a další faktory postižených, přesná příčina však není známá a větší část pacientů s klinickými projevy nemá imunologické postižení. Klinické projevy typu tvorby hypopigmentovaných makul jsou způsobeny inhibitory tyrosinasy, které kompetitivně inhibují enzymy melanocytů zodpovědné za tvorbu pigmentu. V případě hyperpigmentací indukují organismy zvětšování melanosomů produkovaných melanocyty v bazální vrstvě epidermis (49). U lidí se světlou kůží mají skvrny světle hnědou barvu, u lidí s tmavší barvou kůže jsou skvrny naopak světlejší než je barva kůže (50). 22

26 Vitiligo 3 Vitiligo 3.1 Definice, a patofyziologie Vitiligo je získané onemocnění, které patří do skupiny chorob projevujících se hypopigmentací kůže. Vyznačuje se tvorbou ostře ohraničených bílých achromických ložisek přítomných na sliznicích, slizničních přechodech a na kůži. Prevalence onemocnění se celosvětově pohybuje okolo 1-2 % s regionálními rozdíly (0,14 8,8 %) (51). Postihuje všechny rasy a obě pohlaví, častěji se vyskytuje u žen a u řady nemocných lze nalézt familiární výskyt. Přibližně u 50 % pacientů se onemocnění projeví do 20 let věku a u 95 % pacientů vznikne do 40. roku života (52, 53). Etiologie tohoto onemocnění je složitá a dosud nebyla spolehlivě objasněna, o čemž svědčí množství teorií zaměřených na příčiny a způsoby destrukce melanocytů u vitiliga (54). Pro náhled na složitost etiologie uvádím stručný přehled nejčastěji publikovaných teorií: 1. Teorie dědičnosti Je založena na údajích o zvýšeném familiárním výskytu onemocnění, různé zdroje uvádí rodinnou vazbu v 6,25 38 % pacientů (55, 56, 57, 58). Teorii podporuje rovněž nález vitiliga u jednovaječných dvojčat (59). Dědičnost hraje v patogenezi vitiliga velmi pravděpodobně důležitou roli, nicméně genetická příčina prozatím nebyla identifikována. Existují však také studie na velkých souborech pacientů s vitiligem, které tyto údaje popírají (60). 2. Teorie autoimunity Předpokládá, že abnormalita v imunitním systému pacienta vyústí v destrukci melanocytů, všímá si asociace vitiliga s dalšími chorobami považovanými za autoimunitní, viz níže. Autoimunitní mechanismus způsobující destrukci melanocytů může být zprostředkován cytotoxickými T-lymfocyty, nebo cytotoxicky působícími protilátkami proti melanocytům. U pacientů s vitiligem byla v periferní krvi zjištěna vysoká hladina melanocyto-reaktivních cytotoxických T-lymfocytů a také korelace mezi perilezionální infiltrací T-buněk a ztrátou melanocytů. Oproti zdravým jedincům byly v séru nemocných s vitiligem zastiženy specifické protilátky proti povrchovým antigenům melanocytů, proti buňkám nadledvin, parietálním buňkám a také protilátky proti tyrozináze. Titr protilátek proti melanocytům koreluje zpravidla s rozsahem depigmentací a aktivitou choroby (61). Tyto nálezy svědčí o významné roli buněčné autoimunity v patogenezi vitiliga (62). 23

27 Vitiligo 3. Teorie autotoxická (oxidačního stresu, autodestrukční) Tato teorie předpokládá, že melanocyty destruují samy sebe produkcí prekurzorů, nebo metabolitů melanogeneze, které jsou toxické pro melanocyty. Jedná se o toxicitu vysoce reaktivních volných radikálů, vznikajících v průběhu melanogeneze, které se lokalizují na membráně melanocytů. Teorii podporuje nález zvýšené aktivity melanocytů, která je možnou příčinou jejich vlastní destrukce a porušené rovnováhy oxidačního a antioxidačního systému (zvýšená hladina volných kyslíkových radikálů a snížená hladina antioxidantů) pacientů s vitiligem (63, 64). 4. Teorie konvergenční Tato teorie zahrnuje kombinaci všech uvedených teorií. Předpokládá, že vitiligo vzniká u pacientů geneticky predisponovaných s poruchou autoimunity, vlivem stresu, akumulací toxinů, po prodělané infekci, mutací, apod. Poskytuje tak vysvětlení podle různých typů onemocnění (63, 65). 5. Teorie neurální Tato teorie předpokládá přítomnost určitých neurochemických mediátorů toxických pro melanocyty, které jsou uvolňovány na koncích nervových vláken. Teorie se hodí především pro segmentální typ vitiliga. V achromických ložiscích předpokládá destrukci melanocytů jejich těsným kontaktem s periferním nervovým zakončením. Teorii rovněž podporuje výskyt vitiliga u pacientů s neurologickými poruchami, u dětí po prodělané virové encefalitidě a u pacientů s poraněním periferních nervů (66, 67). 6. Teorie stresová Tato teorie staví na údajích pacientů o prožité stresové situaci, která předcházela vzniku vitiliga cca 1-3 měsíce. Stresově se přitom mohou uplatnit různé fyzikální inzulty mechanické poranění, nadměrné vystavení UV záření (například spálení u moře), porod, prodělané onemocnění a psychické trauma. V diferenciální diagnostice k rozpoznání vitiliga od ostatních chorob projevujících se okrskovou depigmentací kůže pomůže znalost některých okolností, jsou to: přítomnost vitiliga v rodině 24

28 Vitiligo spálení sluncem, nebo jiné kožní trauma v místě výskytu depigmentace během posledních 2-3 měsíců před vznikem depigmentace předčasné šednutí vlasů (před 35 rokem života) stres, nebo jiné fyzické onemocnění předcházející vzniku achromických ložisek (63) Důležitým faktorem je rovněž přecitlivělost vůči UV záření a autoimunitní onemocnění u pacienta nebo někoho v rodině. O vazbě na imunitní systém svědčí souběžná přítomnost některých autoimunitních chorob u řady pacientů s vitiligem. Mezi často se vyskytující choroby u pacientů s vitiligem patří: Hashimotova thyreoiditis, Gravesova choroba, Addisonova choroba, diabetes mellitus typ I i II, alopecia areata, perniciozní anemie, Bowelova choroba, psoriáza, systémový lupus erythematodes, sklerodermie, myasthenia gravis, autoimunní polyglandulární syndrom - typ 1 a další (68). 3.2 Klinické typy vitiliga Dle rozsahu a topografického rozmístění jednotlivých nepigmentovaných ploch se vitiligo klasifikuje na několik typů. I. Lokalizované vitiligo (postižení do 20 % kožního povrchu) 1. Fokální vitiligo: s postižením kůže v rozsahu menším než 5 % povrchu s jedním nebo více ložisky, které nemají dermatomální distribuci 2. Segmentální vitiligo: jedno nebo více ložisek s asymetrickou lokalizací respektující dermatomální oblasti, léze nepřesahují střední čáru postiženého segmentu 3. Slizniční vitiligo: postihuje pouze sliznici genitálu a dutiny ústní II. Generalizované vitiligo 1. Akrofaciální vitiligo: zasahuje obličej okolo očí a úst a distální části končetin na dorsech rukou a nohou 2. Vulgární vitiligo: bilaterálně symetrická depigmentovaná ložiska postihující více než 5 % povrchu typicky nad klouby, v inguinách a na trupu 25

29 Vitiligo 3. Smíšené vitiligo: kombinace předcházejících forem, tedy formy akrofaciální + vulgární nebo segmentální + akrofaciální či vulgární III. Univerzální vitiligo (postihuje více než 80 % kožního povrchu) Pacient je téměř depigmentován (1, 24). 3.3 Histologický obraz vitiliga V histologických preparátech připravených z kůže nepigmentovaných ložisek nacházíme zřetelně zbytnělé stratum corneum, vymizení melanocytů s částečnou nebo úplnou ztrátou melaninu, což potvrzují histochemické reakce s monoklonálními a polyklonálními protilátkami proti melanocytům. Dále pak pozorujeme vakuolizaci buněk bazální vrstvy a normální, nebo zvýšený počet Langerhansových buněk. Horní část dermis bývá nekonstantně prostoupena lymfocytárním infiltrátem s převahou T-buněk, které bývají často lokalizovány perivaskulárně. Naproti tomu ve vzorcích kůže z okrajů vitiliginozních ložisek nalézáme abnormální keratinocyty a degenerované melanocyty s cytoplazmatickou vakuolizací, tukovou degenerací a pyknózou (69,70). 3.4 Diferenciální diagnostika vitiliga V diferenciální diagnostice je potřeba odlišit vitiligo od dalších onemocnění projevujících se tvorbou bílých ložisek na kůži. Při vyšetření pacienta je potřeba zaměřit se na pečlivou anamnézu (okolnosti vzniku léze, přítomnost u pokrevných příbuzných, další choroby pac., atd.). Pomůže i rozložení achromických ložisek na těle (unilateralita, bilateralita, symetrie) (70). Pityriasis alba lokalizace depigmentací je na horní části trupu, může vzniknout po ekzému, ale etiologie je nejasná, histologický nález je nekonstantní mírná hyperkeratóza, počet melanocytů je normální, jedná se o redukci množství melaninu. Pityriasis versicolor - mykologické vyšetření prokáže hyfy a spóry 26

30 Vitiligo Nepigmentované léze u lepry achromická ložiska přítomná na kůži u pacientů postižených leprou vykazují ztrátu citlivosti. Psoritická leukoderma mimo achromických lézí má pacient anamnézu psoriázy Postinflamační leukoderma pacient má anamnézu prodělané dermatózy Sklerodermie kůže vykazuje lokální zatvrdnutí, před vypadnutím pigmentu je okrsek zpravidla tmavší nebo načervenalý Lichen sclerosus et atrophicus plaky vznikají často splynutím z malých ložisek, mají porcelánově bílou barvu, často je postižen genitál Achromický névus (Nevus achromicus) dobře ohraničené depigmentované ložisko stabilní bez známek progrese, přítomné od narození, s normálním nebo sníženým počtem melanocytů 3.5 Přehled terapie vitiliga Historie léčby vitiliga je dle dochovaných záznamů stará přibližně 4000 let, za tu dobu byla vyzkoušena celá řada léčebných metod k obnově kožní pigmentace (24). Získaná depigmentace je nápadná a s jejím popisem se setkáváme u řady autorů. Byla opakovaně popsána lékaři Orientu, v bibli, koránu a jinde. Název vitiligo pochází pravděpodobně od Celsa z Říma. Sociální stigmatizace nemocných je tradičně vyšší u tmavších etnik, což například v indii podporovaly náboženské texty stavící nemocné s vitiligem do roviny s nemocnými postiženými leprou, která může mít podobný klinický obraz na kůži, proto byly dříve obě choroby často zaměňovány (71). Jelikož se jedná o idiopatické onemocnění, kauzální léčba v současné době není možná a žádná z dnes užívaných terapií vitiliga nedosahuje předvídatelně dobrých výsledků u všech pacientů. Navíc i po úspěšné terapii s repigmentací achromických lézí není zaručena stabilita repigmentací a u některých pacientů dochází k relapsu onemocnění (72). Proto někteří lékaři pacientům léčení vůbec nedoporučují (73). Léčba vitiliga zpravidla sleduje dva cíle: 1. obnovení přirozené ochrany kůže proti UV záření a 2. kosmetické hledisko. Obnovení ochranné funkce kůže je často přehlíženo i postiženými, jelikož se zpravidla velmi účinně chrání před UV zářením hlavně z důvodu menší nápadnosti achromických ploch v kontrastu s málo pigmentovanou neopálenou kůží. Ke zlepšení vzhledu kůže pacienta vedou 3 cesty: 27

31 Vitiligo A. kosmetická kamufláž achromických ložisek B. depigmentace kůže na zbytku těla C. repigmentace achromických ložisek Při výběru způsobu terapie záleží především na rozsahu onemocnění, lokalizaci achromických ploch a dalších faktorech, jako jsou věk pacienta, kožní fototyp, předchozí terapeutické pokusy, apod Kosmetická kamufláž achromických ploch Kamufláž achromických ploch není terapií v pravém slova smyslu, přispívá však ke zlepšení psychiky a psychosociálního cítění pacientů a má přímý dopad na kvalitu života nemocných, jak dokládá několik prací zabývajících se touto problematikou (74, 75, 76). K objektivizaci a srovnání dopadu kožních chorob na kvalitu života lze použít Dermatology Life Quality Index (DLQI) (77). Tento index se stanovuje na základě dotazníku vyplněného pacienty. Zvláště na viditelných místech nekrytých oděvem jako jsou tvář a ruce je kamufláž ploch pro většinu pacientů nepostradatelná. Provádí se makeupem, samoopalovacími krémy nebo permanentní tetováží. Tetováž / mikropigmentace je velmi stará metoda. Rozlišujeme medicínskou tetováž, kosmetickou (permanentní make-up) a ornamentální tetováž. Medicínská tetováž u vitiliga je vhodná zvláště pro velmi malé, dlouhodobě stabilní a přitom nápadné léze například v oblasti rtů či prsních dvorců. Výhodou je zejména trvalý efekt bez vedlejších účinků. Na některých pracovištích je toto tetování nabízeno přímo ve zdravotnických zařízeních profesionálními tetovacími přístroji. Ošetření se provádí zpravidla v lokálním znecitlivění, požadovaná barva je docílená mícháním základních pigmentů (78, 79, 80). Tetovat lze i sliznice a slizniční přechody, v některých případech je nutno tetováž po čase opakovat, tetováž sliznic bývá většinou trvalá (81, 82). Obr. 5 - tetováž stav před a 2 roky po, převzato a upraveno z článku: SINGH, A.K.; KARKI, D. Micropigmentation: Tattooing for the treatment of lip vitiligo, Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery, In Press, Corrected Proof, Available online 28 May 2009, ISSN

32 Vitiligo Kamufláž makeupem poskytuje při správném použití výborné výsledky, vyžaduje však nácvik správné techniky ze strany pacienta. Nejčastěji se používá v obličeji a na dorzech rukou, problémem jsou místa vyššího tření v ohybových rýhách na krku a zápěstí a volba adekvátního barevného odstínu make-upu. Ve světě existuje řada firem vyrábějící voděodolný klinický make-up určený pro pacienty s vitiligem. Jsou to: Covermark (Covermark, Northvale, New Jersey), Dermablend (Dermablend, Ridgefiled, New Jersey), Dermacolor (Dermacolor, Charles H Fox, Londýn, Velká Británie), Keromask (Christy, Londýn, Velká Británie), Veil Cover (Thomas Blake Cosmetics, Durham, Velká Británie), Perfect Cover (Shiseido, Tokyo, Japonsko) a další. Každý produkt má své výhody i nevýhody a jejich srovnání je problematické. Pacientům se zpravidla doporučuje vyzkoušet několik produktů i s ohledem na různé barevné odstíny a vybrat produkt, který nejvíce vyhovuje ve spolupráci se specialistou na danou problematiku (83). Obr. 6 kamufláž voděodolným make-upem, na snímcích je zachycen stav před a po kamufláži, převzato a upraveno z článku: TANIOKA, M.; MIYACHI, Y. Camouflage for vitiligo, Dermatologic Therapy 2009; 1 (22): 90-93, Wiley Periodicals, Inc. 29

33 Vitiligo Samoopalovací krémy jsou mezi pacienty velmi oblíbené, výsledné zbarvení kůže se dá sice obtížně odhadnout a zpravidla nekoresponduje přesně s barvou pigmentovaného okolí a vydrží 3-4 dny. Při aplikaci je třeba pečlivě aplikovat pouze na povrch achromické léze, při přesahu do pigmentované plochy kamufláž ztrácí smysl. Při opakovaném použití pro dosažení tmavšího odstínu je nutná pauza mezi jednotlivým nanesením látky na kůži cca 5 hod. Většina samoopalovacích krémů je na bázi dihydroxyacetonu, na kůži zanechává nahnědlé zbarvení (84) Depigmentace Depigmentace se provádí v případě, že achromické plochy postihují více než 80 % povrchu pacienta. Jedná se vždy o závažné rozhodnutí bez možnosti návratu, proto je potřeba tuto léčebnou modalitu vždy dobře uvážit. Úspěšná depigmentace určitě prospěje psychickému stavu pacienta, problémem je ale ztráta ochranné funkce kůže. Vysoká citlivost vůči UV záření představuje pro pacienta nutnost striktní ochrany před jeho účinky do konce života. Léčba se provádí pomocí melanocytotoxických látek hydrochinonů. Zpravidla se začíná s denní aplikací na testovací plošku, s vlastní terapií se pak pokračuje v případě, že se při aplikaci na testovací plošku nevyskytly nežádoucí vedlejší účinky a pacient snáší depigmentaci dobře. Celková doba terapie závisí na rozsahu zbývajících pigmentovaných ploch a k celkové depigmentaci bývá zpravidla zapotřebí 6 měsíců až 2 roky (1). Používané bělicí přípravky: a) 20 % monobenzyl ether hydrochinon b) kyselina retinová c) kyselina retinová + hydrochinon d) fenolové sloučeniny e) kyselina azelainová f) kyselina kojová 30

34 Vitiligo Repigmentace Repigmentační terapie zahrnuje postupy konzervativní a chirurgické. Obecně lze říci, že konzervativní léčba má přednost před chirurgickou a má jí vždy předcházet. Repigmentace při léčbě je možná díky produkci pigmentu melanocyty, které se do postižených ložisek při konzervativní terapii mohou dostat ze 3 zdrojů: a) vlasová jednotka okolí folliklu b) zbývající melanocyty v achromické lézi c) okraj achromické léze Konzervativní terapie Konzervativní terapii lze rozdělit na: a) lokální, b) systémovou, c) fyzikální. a) lokální terapie: Kortikosteroidy - aplikují se na postiženou plochu zevně nebo přímo intradermálně. Jedná se zpravidla o terapii první volby především na lokalizované formy vitiliga. Pro riziko sekundárního poškození kůže charakteru dermoepidermální atrofie v místě aplikace se v případě neúspěchu doporučuje léčbu po 3 měsících ukončit. Lokální takrolismus a pimekrolismus - topická aplikace imunosupresivních látek, původně vyvíjených na léčbu zánětlivých kožních stavů jako psoriasa, pyoderma gangrenosum a alopecia areata. Takrolismus je makrolidové imunosupresivum pocházející z houby Streptomyces tsukubaensis, v medicíně se užívá perorálně k profylaxi rejekce ledvin a jater u pacientů transplantaci (85). Takrolismus a pimekrolismus inhibuje transkripci a uvolňování T-buněčných cytokinů (64, 86). b) systémová terapie: Kortikosteroidy aplikují se perorálně, nebo intramuskulárně, léčba se opírá o autoimunitní teorii vzniku vitiliga 31

35 Vitiligo Betakaroteny jsou doporučovány především u akrální formy vitiliga v dávce 3x25 mg po dobu 6-10 týdnů. Ukládáním karotenázy ve stratum corneum epidermis dochází k žlutooranžovému zbarvení kůže. c) fyzikální terapie: Fototerapie systémová fototerapie je dle některých autorů v počátečních fázích, či u lokalizované formy onemocnění účinná až v 70 % (87). Léčba se zpravidla provádí 2-3x týdně po dobu nejméně 4 měsíců, ale nikdy ne v po sobě jdoucích dnech, k léčbě se používá: UVA záření UVB úzkopásmové záření (311 nm) UVB širokopásmové záření ( nm) Pro dobré klinické výsledky se v dnešní době preferuje úzkopásmové UVB záření. Tato terapie může být použita i u těhotných či kojících žen a u dětí a měla by být terapií první volby. Alternativou systémové fototerapie je UVB úzkopásmová mikrofototerapie zaměřená pouze na achromickou lézi. Užívá se u lokalizovaných forem vitiliga, záření z trubice je směrováno na lézi optickým vláknem (88). Fotochemoterapie (PUVA terapie) jde o překvapivě starou metodu léčby. První zmínky pochází ze 13. století z oblasti nilské delty. Egypťané zde užívali extrakt z rostliny Ammi majus Linnaeus, který obsahuje psoraleny. Nemocní užívali tento extrakt denně po dobu 15 dní a současně se vystavovali slunečnímu záření. Mezi další rostliny obsahující psoraleny patří Ficus hispida a Psoralea caryofolia, o nichž jsou zmínky v indické literatuře. V moderní medicíně pravděpodobně poprvé použil psoraleny v kombinaci se světelným zářením k léčbě vitiliga El Mofty v roce 1948 (69). Psoraleny vstupují do interakce s dvojvláknovou DNA při současném působení UV záření inhibují DNA, nepřímo snižují RNA a proteinovou syntézu. Předpokládá se, že repigmentace je navozená imunologicky snížením potenciálu pro tvorbu protilátek proti melanocytům, zvýšením aktvity tyrozinázy a zvětšením velikosti melanosomů. Nejlepších výsledků dosahuje PUVA terapie na tváři, trupu a proximálních částech končetin, nejvíce rezistentní k léčbě jsou dorsa rukou a nohou. PUVA terapie se provádí 2-3x týdně po mnoho měsíců a repigmentace se objevují v léčené ploše perifollikulárně. Celkové množství terapeutických sezení nutných k repigmentaci u PUVA terapie bývá Před zahájením léčby by pacient měl podstoupit vyšetření zraku 32

36 Vitiligo a biochemický screening se zaměřením na funkci jater a ledvin, tato vyšetření by se měla opakovat v průběhu léčby každých 6 měsíců. PUVA terapie je doporučována především u pacientů s rozsáhlým postižením u vulgární formy vitiliga, přesto úspěšnost léčby dle mnoha prací je jen lehce nad 50 % (89, 90, 91). Některé práce poukazují, že až 75 % pacientů po PUVA terapii má relaps onemocnění během 1-2 let po ukončení terapie (72). Systémová PUVA je indikována u pacientů s generalizovanou formou vitiliga, 8-methoxypsoralen se podává v dávce 0,5 mg/kg váhy 1,5-2 hod před aplikací UVA záření. UVA záření se aplikuje 2-3x týdně, počáteční dávka 1-2 J/cm 2 se zvyšuje postupně o 0,25 J/cm 2. Lokální PUVA - je indikována u pacientů s postižením do 20 % kožního povrchu. Lokálně se aplikuje na depigmentované plochy roztok 0,05-0,1 % 8-methoxypsoralenu s následným ozařováním UVA zářením. Doporučuje se počáteční dávka 1-3J/cm 2 po dobu 30 sekund 2-3x týdně s postupným zvyšováním po sekundách, event. i se zvyšováním koncentrace roztoku. Variantou lokální PUVA terapie je koupelová PUVA, kdy jsou psoraleny přidány do vodní lázně, ve které je pacient ponořen 15 minut před aplikací UVA záření, které se aplikuje na ještě mokrý kožní povrch (92). KUVA (Khellin + UVA) k aplikaci UVA záření se podává Khellin (dimethoxymethylfuranochromon z extraktu rostliny Ammi visnaga, stejně jako psoraleny patří mezi furokumariny) (69, 93), oproti PUVA terapii by nemělo docházet ke vzniku fototoxického erytému. PAUVA (Phenylalanin + UVA) podává se fenylalanin v dávce mg/kg hmotnosti se současnou aplikací UVA záření 3x týdně. PUVASOL jedná se o alternativní postup pro pacienty, u nichž je kontraindikována PUVA terapie. Podává se Trioxsalen (trimethylpsoralen extrakt z rostliny Psoralea corylifolia, patří mezi psoraleny a působí fotosenzibilizaci (94)) v dávce 10 mg/kg hmotnosti 2-3x týdně se současnou expozicí slunečnímu záření s počáteční expozicí 5-10 min, kterou je možno postupně zvyšovat až do 2 hodin. 33

37 Vitiligo Laserová terapie provádí se excimerovým laserem, který produkuje monochromatické záření o vlnové délce 308 nm. Tato terapie je efektivní u stabilních lokalizovaných lézí vitiliga nebo u forem postihujících maximálně 30 % povrchu těla. Léze jsou léčeny 2x týdně a průměrně je potřeba terapeutických sezení. Někteří autoři uvádí úspěšnou kombinaci s lokálním takrolismem i v terapii u UV záření rezistentních forem vitiliga (95) Chirurgická terapie Principem všech postupů chirurgické terapie vitiliga je transplantace autologních melanocytů do achromických lézí. Jednotlivé postupy se liší v přípravě recipientní achromické plochy, ve způsobu odběru melanocytů a jejich dalším zpracováním před vlastní transplantací. V současné době jsou definována obecná kritéria doporučovaná při výběru pacientů vhodných pro chirurgickou léčbu vitiliga (1, 86): a) pacienti nereagující na konzervativní terapii b) pacienti s lézemi stabilními nejméně 1 rok na ploše do 30 % tělesného povrchu c) pacienti bez známek hojení hypertrofickou nebo keloidní jizvou v osobní anamnéze d) pozitivní minigraft test (96, 97) e) pacienti bez přítomnosti Koebnerova fenoménu (vznik ložiskové depigmentace v místě předchozího poranění kůže) f) pacienti starší 12 let Limitem chirurgických metod je rovněž rozsah léčených achromických ploch. V jednom sezení se doporučuje léčit plochy maximálně do 200 cm 2 s ohledem na nutnost zachování přijatelné velikosti donorského místa (98). U pacientů s větším rozsahem stabilních achromických lézí refrakterních ke konzervativní terapii je k repigmentaci všech lézí nutná expanze melanocytů kultivací, jak bude uvedeno dále. I. postupy bez separace kožních buněk kožní štěpy split-thickness skin grafts (transplantace dermoepidermálních štěpů) Jedná se o přenos tenkých dermoepidermálních štěpů o tloušťce 0,1 0,2 mm odebraných dermatomem. Příjmovou achromickou plochu je nutné zbavit epidermis, to se zpravidla 34

38 Vitiligo provádí dermabrazí, nebo ablací laserem. Tato metoda se doporučuje u pacientů s výskytem achromických lézí do maximálně cca 150 cm 2. Jako komplikace bývá uváděna světlejší barva ošetřené plochy způsobená pravděpodobně menším množstvím melanocytů v přeneseném štěpu a pozánětlivá hypo- nebo hyperpigmentace odběrové plochy (1). punch grafting (transplantace štěpů kůže v plné tloušťce) Přenos okrsků kůže v plné tloušťce o průměru 3 mm odebraných nástrojem pro punch biopsii. Přenáší se pigmentované kožní štěpy do achromických lézí. V oblasti recipientní plochy se okrsky kůže implantují do otvorů stejného nebo lépe o 0,5 mm menšího průměru vytvořených opět mechanicky ve vzdálenosti 4-8 mm mezi sebou. Obvyklou komplikací je tzv. cobblestone effect, tedy hrbolatý povrch v místě přenesených okrsků kůže připomínající dlažební kostky (1, 99). Zvláště nepříjemně je tato komplikace vnímána pacienty na pohmat a v obličeji. Výskyt této komplikace lze omezit vytvořením hlubších otvorů v recipientní oblasti asi o 1mm než je tloušťka štěpu jak uvádí Boersma nebo dlahováním silikonovou ploténkou v pooperačním období (100). mini punch grafting (transplantace miništěpů kůže v plné tloušťce) Postup je stejný jako u punch graftů, okrsky kůže jsou však menší, mají průměr 1-2,5 mm a tloušťku 0,6 0,8 mm. Otvory v kůži v příjmové oblasti lze pro malé rozměry vytvořit jak mechanicky puncherem, tak i Erbium-YAG laserem (101). V lokalitách jako jsou rty, prsní dvorec apod. je zajištění imobilizace štěpů po zákroku velmi obtížné, v těchto případech se dá k fixaci štěpů použít tkáňové lepidlo(102). suction blister grafting (transplantace epidermis získané uměle vytvořeným puchýřem) Principem metody, kterou publikoval Falabella (103), je přenos epidermis z uměle vytvořeného puchýře, který se v donorské oblasti vytvoří podtlakem nebo aplikací tekutého dusíku na kožní povrch. Výhodou metody je odtržení epidermis přesně v místě dermoepidermální junkce. Recipientní plocha se pro přijetí štěpu připravuje dermabrazí, laserovou ablací (CO 2, nebo Erbium-YAG laserem) nebo opět vytvořením puchýře a odtržením epidermis. Nevýhodou metody je častá přechodná hyperpigmentace donorské i recipientní oblasti. 35

39 Vitiligo hair follicle grafting (transplantace vlasových folikulů) Jedná se o přenos vlasových folikulů. Metoda využívá přirozený rezervoár melanocytů v oblasti vlasového folikulu. Při tomto postupu se zpravidla odebírá okrsek kůže z temporální oblasti (cca 1x3 cm), ze kterého se připraví jednotlivé vlasové folikuly podobně jako při transplantaci vlasů. Rozdíl je pouze v tom, že spodní třetina vlasu včetně vlasového bulbu se odstraní. Dále je postup podobný jako při transplantaci vlasů u alopecie. Do jednotlivých otvorů v recipientní oblasti se implantují připravené štěpy. Pigmentace lze pozorovat přibližně za 2 měsíce, melanocyty migrují radiálně z místa implantace (104). Výhodou všech těchto metod je především možnost provedení zákroku ambulantně a bez návaznosti na buněčnou laboratoř. II. postupy se separací kožních buněk po odběru buněčné štěpy Výchozím pojítkem všech těchto postupů je enzymatické rozvolnění vzorku pigmentované kůže na jednotlivé kožní buňky. Toho se docílí mechanickým rozrušením kožního vzorku (rozstříhá se nůžkami) a trypsinem. Trypsinací se získá směs kožních buněk. V dalším zpracování lze tyto postupy dále rozdělit na postupy s kultivací melanocytů a na postupy bez kultivace melanocytů. Hlavní nevýhodou a tedy i překážkou většího rozšíření těchto postupů je nezbytná návaznost na buněčnou laboratoř a do jisté míry i finanční náročnost. přenos kultivovaných melanocytů Kultivaci lidských buněk zavedli do klinické praxe v roce 1975 Rheinwald a Green (105), kteří použili kultivované keratinocyty k léčbě středně hlubokých popálenin. Od té doby se kultivace lidských buněk stala rutinně užívanou metodou v klinické praxi. Expanzí počtu melanocytů kultivací lze ošetřit rozsáhlejší plochy. Čas potřebný k expanzi melanocytů je zpravidla okolo 4 týdnů. Metodu odběru a následné kultivace odebraných melanocytů vypracoval a publikoval v roce 1987 Lerner a spolupracovníci. Nakultivované melanocyty injikovali do achromických lézí, kde se začlenily do bazální vrstvy a začaly tvořit pigment. Výsledkem byla repigmentace ošetřených ložisek s barvou blížící se barvě okolní zdravé kůže (8). Postup úspěšně použili 36

40 Vitiligo a publikovali v roce 1993 i Olsson a Juhlin ze Švédska (106). Modifikovaný postup s užitím Erbium-YAG laseru pro ablaci epidermis z recipientní plochy publikoval v roce 1998 i tým Kaufmanna z Německa, jako buněčný nosič pro kultivované melanocyty použili vstřebatelnou matrix na bázi kyseliny hyaluronové - Laserskin (107). Úspěšnou transplantaci kultivovaných autologních melanocytů u recipientní plochy připravené CO 2 laserem publikoval v roce 2004 i tým Chena z Taiwanu (108). V České republice byl použit modifikovaný postup týmem lékařů Kožní kliniky Fakultní nemocnice Brno, kteří kultivované autologní melanocyty implantovali do achromických lézí tlakovým zařízením Dermojet (11, 109). Jiný postup použil tým Arenbergera z Prahy, který na dermabradovanou kožní plochu aplikoval směs autologních melanocytů a keratinocytů kultivovaných na acelulární prasečí dermis (110). Pravděpodobně první komerčně dostupný produkt využívající tento postup je MelanoSeed TM (Bio Tissue Technologies AG, Freiburg, Německo). Melanocyty se získávají ze vzorku kůže v plné tloušťce, kultivace probíhá 28 dní a suspenze kultivovaných melanocytů ve fibrinu se aplikuje na plochu připravenou dermabrazí (98). přenos nekultivovaných melanocytů Jednodušším a finančně méně nákladným postupem je transplantace separovaných nekultivovaných melanocytů ve směsi s dalšími kožními buňkami. Odebraný vzorek kůže, nebo dermoepidermálního štěpu je trypsinací rozvolněn na jednotlivé kožní buňky bez následné selekce melanocytů. Pacient pak dostává směs autologních kožních buněk v roztoku, resp. s buněčným nosičem. Modifikace této metody se liší dle jednotlivých pracovišť, kde se postup používá. V roce 1992 Gauthier a Surleve-Bazeille (Bordeaux, Francie) popsali přenos směsi nekultivovaných melanocytů a keratinocytů do puchýřů připravených v místě recipientní plochy tekutým dusíkem (111). Jako donorskou oblast zvolili skalp a proceduru prováděli ve dvou dnech. V roce 2001 Nanny Van Gellová a spolupracovníci (Ghent, Belgie) publikovali přenos směsi nekultivovaných melanocytů a keratinocytů u čtyřech pacientů. Recipientní plocha byla připravena laserovou dermabrazí CO 2 laserem, směs buněk obohatili kyselinou hyaluronovou za účelem dosažení větší viskozity aplikovaného roztoku (12). Soubor 184 pacientů ošetřených touto modifikovanou metodou publikoval v roce 2003 Sanjeev V. Mulekar z Indie (9). Léčbu provedl u pacientů s fokálním, segmentálním a generalizovaným vitiligem s lézemi stabilními 6 měsíců na maximálně 30 % povrchu těla. 37

41 Vitiligo Jako donorskou oblast pro odběr dermoepidermálního štěpu použil hýždě, velikost štěpu byla přibližně 1/10 velikosti plochy ošetřované léze. Recipientní achromické plochy připravil před vlastním přenosem buněk dermabrazí a aplikovanou suspenzi buněk kryl kolagenem a transparentním krytím. 38

42 Lasery v medicíně 4 Lasery v medicíně Pro pochopení použití laseru v medicíně je potřeba alespoň stručně ozřejmit některé základní pojmy. Slovo laser je akronym z anglických slov a vyjadřuje vlastní podstatu - Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (zesílení světla pomocí vynucené / stimulované emise záření). České pojmenování laseru je kvantový generátor světla, v praxi se ale nepoužívá. V moderní fyzice se hovoří o tzv. duálním charakteru světla. Na světlo (v širším smyslu slova na záření) je nutné nahlížet současně jako na elektromagnetické vlnění (mluvíme o vlnovém charakteru světla) i jako na proud částic (korpuskulární charakter světla). Na částicové úrovni vzniká světelné záření přechodem atomů z excitovaného do normálního stavu. Při tomto ději negativně nabité elektrony obíhající po kruhových drahách okolo atomového jádra přejdou z vnějšího na vnitřní okruh a při tomto přemístění uvolní určité kvantum světla foton, ve kterém je jejich přebývající energie. Tato spontánní emise se děje stále u všech molekul. Podmínkou tohoto vyzařování je v první fázi příjem energie odpovídající tomuto záření z vnějšku. Atom, který přijme energii, díky níž přesune obíhající elektrony na vyšší energetickou úroveň (dráhu vzdálenější od jádra) nazýváme excitovaný atom. V excitovaném stavu setrvávají atomy jen velmi krátkou dobu a energie uvolněná při přesunu elektronů na nižší orbity může být vydávána různými způsoby: jako elektromagnetické vlnění ve formě fotonů, nebo neradiačními přeměnami formou tepla či mechanickými nárazy. Řada atomů má elektrony v excitovaném stavu a pokud se objeví foton, jehož energie odpovídá energii mezi stavy elektronových drah atomu, vyvolá tento foton přestup elektronu z vyšší na energeticky nižší dráhu a vyzáří přitom další foton. Tento sekundární foton má stejnou energii jako foton původní a oba jsou dokonale synchronizovány. Tento proces může pokračovat i u dalších atomů v látce a hovoříme o stimulované emisi záření (112). Od normálního světla se laserové světlo liší svou organizovaností je monochromatické (jednobarevné), koherentní (uspořádané) a má malou divergenci (rozbíhavost) viz obr 7. 39

43 Lasery v medicíně Obr. 7 srovnání běžného a laserového světla: běžné světlo je rozptýlené, zatímco laserové světlo nediverguje Monochromatičnost je dána skutečností, že všechny svazky laserových paprsků mají stejnou vlnovou délku a tím i stejnou frekvenci a stejné množství energie. Naproti tomu běžné světlo má vlnové délky všech barev. Vlnová délka laseru je závislá na použitém aktivním prostředí a na mechanismu stimulace. Výběr určitých vlnových délek se provádí soustavou zrcadel v rezonátoru. Koherence jedná se o paralelní průběh světelných vln. Fáze i amplituda laserového záření setrvávají rovnoměrné i na velké vzdálenosti. Čím lepší je koherence, tím je vyšší kvalita laserového záření. Obr. 8 - srovnání běžného a laserového světla: běžné světlo má různé frekvence, zatímco laserové světlo má fixní frekvenci a je koherentní, převzato a upraveno z knihy: ACHAUER, B.M.; et al. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I., p , ISBN-10:

44 Lasery v medicíně Kolimace, směr paprsku svazky laserového záření jsou úzké a nerozptylující se jako běžné světlo. Směr svazku laserového záření se udržuje i na velkou vzdálenost. Laser obecně je tedy zdroj koherentního elektromagnetického záření nejčastěji ve viditelné, ultrafialové nebo v infračervené oblasti spektra, využívající jevu stimulované emise záření aktivních částic (atomů, molekul, iontů, elektronů) buzených vnějším zdrojem energie. Jednoduše řečeno jedná se o zařízení, které přeměňuje dodávanou energii na laserové světlo. Každý laser se skládá ze tří základních komponent: 1. aktivní prostředí - pevná látka s příměsemi (krystal, sklo, polovodič), kapalina, plyn nebo směs plynů (CO 2, He + Ne) 2. optický rezonátor - je tvořen obvykle zrcadly, mřížkami, světlovodem. V rezonátoru je umístěn pár zrcadel na dvou protilehlých stěnách aktivního prostředí a odráží uvolněné fotony, čímž dochází k zesilování efektu indukované emise fotonů. 3. zdroj budící energie / budící systém - proud elektronů, výbojky, jiné lasery, chemická reakce dodává energii do optického rezonátoru s laserovým médiem Obr. 9 - základní komponenty laseru budící systém, aktivní prostředí a optický rezonátor Laserový paprsek vzniká stimulací aktivního prostředí zdrojem budící energie. Čerpací (budící) záření podněcuje emisi v aktivním prostředí, které je ohraničeno rovnoběžnými 41

45 Lasery v medicíně zrcadly A a B, kde zrcadlo B je částečně propustné. Po vybuzení stimulované emise dochází k odrazu světla mezi zrcadly, mnohonásobnému průchodu záření aktivním prostředím a tím zvyšování jeho intenzity. Po dosažení dostatečného stupně intenzity uniká přes polopropustné zrcadlo koherentní laserový paprsek. Elektromagnetické spektrum Elektromagnetické spektrum má rozsah od gama záření po rádiové vlny. Viditelná část světla zahrnuje pouze malou část spektra o vlnových délkách nm. Laserové záření se skládá z paprsků vlnových délek od rentgenového po infračervené spektrum. Lasery emitující záření pod viditelnou oblastí spektra se označují též jako tzv. studené lasery (např. excimerový laser) a primárně působí především kontrolované poškození tkáně na atomární úrovni podobně jako ionizující záření. Naproti tomu lasery emitující záření ve viditelné, nebo infračervené oblasti primárně působí na tkáň termálními účinky. Obr. 10 elektromagnetické spektrum Terapeutické použití laserů závisí na velikosti energie dodané do tkáně a tzv. módu, jakým byla energie dodána. Velikost energie se udává v joulech (J) a je vyjádřením schopnosti konat práci. Výkon vyjadřuje množství práce vykonané za jednotku času a udává se ve watech (W). Hustota výkonu a hustota energie udává dávku na ozařovací bod W/cm 2, J/cm 2. Hustota energie v ozařované tkáni je důležitá pro vlastní biologické účinky laserového záření. Změnou velikosti ozařované oblasti (spotu laseru) dochází ke změnám hustoty dodané energie. Při zmenšení ozařované oblasti (zmenšením laserového spotu) se hustota energie zvýší a naopak zvětšením spotu dojde ke snížení hustoty energie. 42

46 Lasery v medicíně Modulace laserového paprsku Laserový paprsek můžeme aplikovat na tkáň v různých režimech. Hovoříme o kontinuální, nebo v přerušované formě v modulačních frekvencích. Intermitentního (přerušovaného) módu je dosaženo zapínáním a vypínáním laserového paprsku v určité frekvenci. V kontinuálním módu (CW continuous wave) opouští laserový paprsek nepřetržitě rezonátor přes polopropustné zrcadlo, jedná se o nepřerušovaný paprsek světla bez pulsů. V případě zablokování cesty paprsku záklopkou, která se intermitentně uvolňuje hovoříme o tzv. pulsním módu laserový paprsek je dodáván formou jednotlivých pulsů. Další možností je dodávka energie v tzv. Q-switch módu, kdy je laserový paprsek v pulsním módu dodáván v extrémně krátkých časech, řádově v nano, nebo pikosekundách. Posledním režimem je tzv. superpulsní mód, ve kterém při amplifikaci dochází k rychlému a prudkému nárůstu energie, která je následně uvolněna v krátkém časovém intervalu (113). Obr. 11 časové režimy dodávky laserové energie (pracovní mody laserů), převzato a upraveno z knihy: ACHAUER, B.M. et al. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I., p , ISBN-10:

47 Lasery v medicíně 4.1 Rozdělení laserů v medicíně Lasery používané v medicíně lze rozdělit podle aktivního prostředí, časového režimu provozu laseru, výkonu či podle typu ošetřovaných lézí. Podle aktivního prostředí: pevnolátkové lasery polovodičové lasery plynové lasery kapalinové lasery plazmové lasery lasery s volnými elektrony Podle časového režimu: kontinuální lasery impulzní lasery kvazi kontinuální lasery Podle výkonu: nízkovýkonné (neinvazivní, biostimulační) lasery vysokovýkonné (invazivní, operační) lasery Podle typu ošetřované léze: lasery pro terapii cévních lézí lasery pro terapii tetováží a kožních pigmentových lézí vaporizační lasery k odstraňování nežádoucích lézí lasery pro odstraňování nežádoucího ochlupení lasery a přístroje na léčbu akné lasery na fotorejuvenaci (omlazení pleti) Využití laserů v medicíně začalo koncem roku 1961, kdy byl rubínový laser poprvé využit při operaci sítnice Cambellem v USA. V roce 1963 Mester v Budapešti studoval účinky laserového světla na tkáně a zjistil urychlení růstu kožních buněk při ozařování 44

48 Lasery v medicíně malými dávkami energie. Postupně byla zkoumána interakce různých typů laserů s živou tkání a byly vyděleny dvě základní skupiny laserů užívaných v medicíně: operační (invazivní) a biostimulační (neinvazivní). Mezi biostimulační lasery řadíme přístroje s výkonem do 500 mw. Při vyšším výkonu laserového záření mizí stimulační odpověď buněk. Biostimulační lasery podle druhu zdroje dělíme na polovodičové a plynné (helium-neonové). Nejčastější indikace k použití biostimulačního laseru jsou: špatně se hojící rány, bércové vředy, jizvy, proleženiny, opary, bolesti po prodělaném pásovém oparu, akné, apod. (114). Z invazivních laserů se v medicíně v současné době používají především: KTP laser (kalium-titan-fosfátový) s využitím k odstraňování kožních afekcí, vaskulárních lézí a tetováže, Neodym:YAG laser (yttrium-aluminium-garnet) k léčbě vaskulárních lézí i kožních tumorů, Erbium:YAG laser k povrchní ablaci epidermis, Pulsní barevný laser napájený světelnou lampou k odstraňování vaskulárních lézí, CO 2 laser jako chirurgický nástroj, k odstraňovní kožních afekcí, k resurfacingu kůže a další. 4.2 CO 2 laser CO 2 laser emituje světlo v neviditelné oblasti spektra, má vlnovou délku nm, aktivním prostředím je směs plynů zpravidla ve složení CO 2 (10-20 %), N 2 (10-20 %), H 2 nebo Xe (jen několik málo procent), He (zbývající část směsi plynů) (115). Energie CO 2 laseru je při interakci s tkání selektivně absorbována vodou, tato absorbce vede k prudkému vysušení tkáně a její přeměnu v suchou substanci. S ohledem na fakt, že při použití CO 2 laseru se laserová energie nechává působit v extrémně krátkých časech (obvykle méně než 1ms), je vaporizovaná vrstva na povrchu relativně ostře ohraničena od spodní, termicky nepoškozené vrstvy (doba působení je kratší než tzv. termální relaxační čas kůže). Hloubku průniku CO 2 laseru do tkáně lze korigovat velikostí energie, její hustotou a dobou působení pulsu. Použitím vysokých dávek energie, úzkého paprsku (spotu) a krátkých časů docílíme řezu tkáně. Změnou šířky paprsku (laserového spotu) jeho zvětšením / defokusací se energie rozdělí na větší plochu a docílíme ablaci tkáně a koagulaci. Toho se využívá u tzv. resurfacingu kůže, což je výraz pro ablaci a dermabrazi současně. Jedná se o specifický druh ošetření používaný zejména v estetické chirurgii za účelem eliminace vrásek a pigmentových nepravidelností kůže. CO 2 laser v pulsním módu tedy umožňuje velmi přesně kontrolovanou vaporizaci horních vrstev pokožky do hloubky cca 30 μm. Účinky této laserové dermabraze jsou dobře zdokumentovány řadou prací 45

49 Lasery v medicíně a histologickými nálezy. Hloubku ablace lze prohloubit dvojnásobnou aplikací laseru do stejného místa po snesení suché substance na povrchu po prvním ošetření. Jedna dávka laseru na kožní povrch (jedno ošetření) se v anglické literatuře označuje jako pass (bez českého ekvivalentu) a zpravidla nepostačuje k průniku do papilární dermis, k tomu je potřeba tzv. druhý pass, další dávky pak prohlubují obnažení dermis až do retikulární vrstvy. Aby mohlo dojít ke zhojení plochy ze spodiny je potřeba nepřekračovat úroveň retikulární dermis, ošetřená plocha má tedy charakter popáleniny II.stupně. Ke zhojení ad integrum dojde epitelizací ze zbytků bazální membrány v ploše v časovém horizontu 7-10 dní. Hojení plochy po laserovém resurfacingu prochází přes stejné fáze jako u jiného poranění, během hojení lze tedy pozorovat obvyklé fáze hojení, jsou to: inflamatorní fáze vazodilatace, uvolnění cytokinů, migrace buněk, cca 3-10 dní proliferativní fáze - probíhá od 2-10 dne, dochází k proliferaci a migraci fibroblastů, keratinocytů a k reepitelizaci remodelační fáze od 2-3 týdne, dochází k přestavbě a vyzrávání kolagenu, trvá několik měsíců Současně s přeepitelizováním epidermis dojde k remodelaci kolagenu v dermis, což vede ke zlepšení kožního reliéfu eliminací mělkých a středně hlubokých vrásek. Nevýhodou je přechodný erytém ošetřené plochy, který v některých případech přetrvává 3-6 měsíců. Erytém je projevem doznívající remodelační fáze zánětlivé reakce po laserovém ošetření. Ablace epidermis CO 2 laserem v pulsním modu byla použita k obnažení dermis v souboru pacientů prezentovaných v této práci. 4.3 Interakce laseru a tkání Při dopadu laserového záření na povrch tkání dochází ve vzájemné interakci k několika dějům v závislosti na výkonu paprsku, délce působení a vlnové délce. Po dopadu laserového paprsku na živou tkáň mohou nastat 4 možné děje: odraz paprsku, průchod paprsku tkání, rozptyl a absorpce paprsku ve tkáni viz obr

50 Lasery v medicíně Obr. 12 interakce laserového paprsku a tkáně, po dopadu nastane jedna ze 4 možností: odraz, rozptyl, průchod, nebo absorpce paprsku (převzato a upraveno z ACHAUER, B.M. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I., p , ISBN-10: ) Důsledkem interakce laserového záření a tkáně jsou termální, mechanické a chemické změny ve tkáni. V souvislosti s těmito změnami rozlišujeme některé pojmy. Po absorpci paprsku tkání dochází primárně k termálním účinkům. Na rozdílné absorpci při průchodu paprsku tkání se významně podílejí tři složky: voda, hemoglobin a melanin, tzv. chromofory. Za chromofor je považována taková tkáňová struktura, kterou je laserové záření nejvíce absorbováno. Chromofory jsou však schopny pohltit jen záření o určité vlnové délce, čemuž odpovídá jejich absorpční spektrum. Míra absorpce záření tkání tedy ukazuje afinitu tkáně k danému laserovému záření / vlnové délce. Obr. 13 absorpční spektrum chromoforů kůže: melaninu, oxyhemoglobinu a vody (převzato a upraveno z: ACHAUER, B.M. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I., p , ISBN-10: ) 47

51 Lasery v medicíně Termální změny: Rozsah termálních účinků závisí na absorpci záření a difuzi tepla do přilehlého okolí, vyzářená laserová energie se mění v tepelnou. Prohřátím tkáně lze dosánout koagulace, nebo odpaření tkáně (vaporizaci). Klíčovými faktory určujícími rozsah termálních účinků na tkáň jsou hustota energie, trvání laserového pulsu a tepelná vodivost. Čím je vlnová délka laseru kratší, tím je menší hloubka průniku do tkání, ale větší koncentrace energie v místě působení. V místě působení laseru vznikají různé termické zóny tkáňových škod od reverzibilních po ireverzibilní viz obr. 14. vaporizace odpaření tkáně dojde k němu v případě lokálního zvýšení teploty tkáně na 100 o C, toho se využívá především k incizi fotokoagulace bílkovinný rozpad a zastavení krvácení Obr zóny termálního poškození v místě působení laseru na tkáň (převzato a upraveno z: ACHAUER, B.M. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I., p , ISBN-10:

52 Lasery v medicíně Obr účinky laseru s ohledem na hustotu absorbovaného záření a dobu působení (převzato a upraveno z: JAVŮREK, J. Fototerapie biolaserem - léčebná metoda budoucnosti, Grada 1995, ISBN ) Mechanické změny: Fotomechanický efekt je dán energií laseru. Jestliže trvání laserového pulsu je kratší než termální relaxační čas cílové tkáně, dojde k tzv. termoelastické expanzi. Termální relaxační čas je definován jako čas potřebný k tomu, aby tkáň absorbovala a přenesla termální energii záření specifické vlnové délky. kavitace / fotodisrupce (roztržení) účinkem laseru dojde k prudkému ohřátí až na o C s uvolněním vodní páry a plynů (CO 2 ), které výrazně zvýší tlak s výsledným roztržením a devastací zasažené tkáně, v místě působení se tak vytvoří konusovitý kráter Fotochemické změny: selektivní fototermolýza jedná se o preferenční absorpci elektromagnetického záření ve tkáni (chromoforu) bez nežádoucího termického poškození okolní tkáně. fotochemická interakce je navozena lasery vlnové délky v oblasti ultrafialového, či viditelného spektra. Dojde-li k uvolnění energie později než se v ozářeném místě zvýší teplota, vyvolá laser fotochemickou interakcí biologickou změnu 49

53 Lasery v medicíně fotochemická ablace neobvykle čistý řez umožněný excimerovým laserem, účinku je dosaženo kombinací fotochemického postižení, vysokou povrchovou teplotou a vlnovou délkou, využití je především v oftalmologii ke korekci refrakčních vad (116) 50

54 Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) 5 Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) Tissucol kit je dvousložkové fibrinové lepidlo. Obsahuje lyofilizovaný prášek Tissucol, který se rozpouští s roztokem aprotininu, čímž vzniká roztok TISSUCOL (složka 1) a dále obsahuje lyofilizovaný trombinový prášek, který se rozpouští s roztokem dihydrátu chloridu vápenatého, čímž vzniká roztok trombinu (složka 2). Jakmile jsou připraveny roztoky TISSUCOL (složka 1) a roztok trombinu (složka 2) v lahvičkách, je možno je smísit a aplikovat na povrchy tkání. Při smísení se vytvoří bílá elastická sraženina připomínající gel / želé. Sraženina vytvořená přípravkem TISSUCOL KIT je velmi podobná krevní sraženině. To znamená, že se rozpustí přirozenou cestou a nezanechává žádné zbytky. K prodloužení životnosti sraženiny se přidává hovězí aprotinin, aby se zabránilo jejímu předčasnému rozpuštění. TISSUCOL KIT obsahuje dva proteiny, které vyvolají srážení krve - fibrinogen a trombin, oba se získávají ze směsné lidské plazmy. V okamžiku, kdy dojde ke kontaktu složek tkáňového lepidla, se ihned nastartuje proces polymerace (přeměna fibrinogenu na fibrin a jeho stabilizace). Polymerace má za následek ztuhnutí tkáňového lepidla v řádu sekund. Obr. 16 schéma použití tkáňového lepidla Tissucol (převzato z webové stránky 51

55 Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) Obr. 17 dostupná balení tkáňového lepidla Tissucol (převzato z webové stránky Toto fibrinové lepidlo je vyráběno k použití v těchto indikacích: ke zlepšení hemostázy (zástavy krvácení) jako tkáňové lepidlo ke zlepšení utěsnění nebo k podpoře sutur u různých chirurgických výkonů včetně vaskulárních a gastrointestinálních anastomóz jako tkáňové lepidlo ke zlepšení pojivosti oddělených tkání (např. neštěpených transplantátů, štěpů, tkáňových transplantátů) 5.1 Kvalitativní a kvantitativní složení fibrinového lepidla Jedno balení přípravku TISSUCOL KIT obsahuje 5 lahviček s těmito látkami: 1) prášek TISSUCOL pro přípravu lepícího proteinového roztoku Humánní, ošetřený parou, po rozpuštění prášku obsahuje 1 ml roztoku TISSUCOL: proteinum humanum mg, proteinum coagulabilis mg, z toho fibrinogenum mg a plasmafibronectinum 2-9 mg, factor coagulationis XIII U2, plasminogenum μg 2) aprotinin, rozpouštědlo pro prášek TISSUCOL Aprotininum, bovinum 3000 KIU/ml 3 3) thrombin 4, prášek pro přípravu roztoku thrombinu Humánní, ošetřený parou, 1 ml rozpuštěného roztoku obsahuje: thrombinum humanum 4 IU4 52

56 Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) 4) thrombin 500, prášek pro přípravu roztoku thrombinu Humánní, ošetřený parou, 1 ml rozpuštěného roztoku obsahuje: thrombinum humanum 500 IU4 5) calcii chloridum dihydricum, rozpouštědlo pro přípravu roztoku thrombinu Calcii chloridum dihydricum 40 μmol/ml (4,4 mg/l) a pomocné látky S ohledem na bovinní složky přípravku je potřeba před použitím u pacienta zjistit případné alergie. Informace zde použité byly převzaty z příbalového letáku (117). 53

57 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk 6 Experimentální část práce - Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk 6.1 Cíl práce Hlavním cílem práce bylo ověřit: - použitelnost autologních kožních buněk k léčbě vitiliga v kombinaci s ablací epidermis v léčené oblasti CO 2 laserem - úspěšnost této terapie z pohledu stálosti repigmentace s časovým odstupem Vedlejším cílem práce bylo zjistit: - zda lze fibrinové lepidlo použít jako buněčný nosič pro transplantaci směsi kožních buněk u chirurgické léčby vitiliga 6.2 Materiál a metodika Pacienti Studie byla před svým zahájením schválena Etickou komisí FN Brno. Všichni zúčastnění pacienti byli seznámeni s obsahem studie a svůj souhlas se zařazením do studie potvrdili podpisem informovaného souhlasu, který byl rovněž schválen Etickou komisí FN Brno. Před zahájením léčby byli všichni pacienti standardně fyzikálně vyšetřeni a byla jim odebrána anamnéza s ohledem na dosavadní léčbu vitiliga (v kolika letech vznikla první léze, dosavadní terapie, problémy s kožním hojením, přítomnost vitiliga v rodině, onemocnění často asociovaná s vitiligem, atd.). Do studie byli zařazeni pacienti splňující tato kritéria: 1. pacienti s anamnézou neúspěšné konzervativní terapie 2. pacienti s vitiligem stabilním po dobu nejméně jednoho roku 3. pacienti bez anamnézy Kobnerova fenoménu (depigmentace po povrchním poranění kůže) 4. pacienti bez anamnézy hojení hypertrofickou či keloidní jizvou 5. pacienti starší 12 let 6. ženy ve studii nesměly být těhotné či kojící 54

58 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Charakteristika souboru pacientů: Ve studii bylo celkem 13 pacientů ve věku od 15 do 36 let. Celkem 10 žen a 3 muži. Průměrná doba vzniku vitiliga u pacientů v souboru byla v 10,2 letech. Nejmladší pacient měl 15 let, nejstarší 36 let, průměrný věk pacientů v souboru byl 26,8 let. Největší ošetřená jednotlivá léze měla velikost 42,7 cm 2, nejmenší 0,8 cm 2. U 2 pacientů byla ošetřena 1 léze, u 6 pacientů 2 léze a u 3 pacientů 3 léze a u 2 pacientů 4 léze. U 9 pacientů se jednalo o bilaterální typ vitiliga, u 4 pacientů o unilaterální rozložení lézí. Celkový přehled pacientů včetně velikosti a topografické lokalizace ošetřených lézí poskytuje tabulka 1. pac pohlaví, věk vitiligo od (let) typ vitiliga unilat / bilat lokalizace a velikost (cm 2 ) léčené plochy plocha 1 cm 2 plocha 2 cm 2 plocha 3 cm 2 plocha 4 cm 2 1 žena, 29 9 B pravý loket 22,8 levý loket 24,1 2 muž, U záda 11,8 záda 2,1 3 žena, 26 9 B pravé koleno 9,3 levé koleno 12,1 4 žena, B prox. předloktí vlevo 10,1 prox. předloktí vlevo 4,4 dist. předloktí vlevo 3,5 dist. předloktí vlevo 0,9 5 žena, B pravé koleno 42,7 6 žena, 22 8 B levé koleno 13,2 koleno vlevo 1,9 7 muž, B pravý loket 37,2 levý loket 28,8 8 žena, U břicho 1,0 záda 1,1 záda 0,8 záda 0,6 9 žena, B prox. bérec vlevo 4,9 dist. bérec vlevo 4,4 pravý bérec 8,1 10 muž, 36 8 U pravé koleno 9,6 pravý kotník 6,4 pravé koleno 8,4 11 žena, 31 3 U sakrum 5,4 bérec vlevo 8,4 břicho 5,4 12 žena, B pravé koleno 41,5 13 žena, B dorsum p. ruky 3,2 dorsum p. ruky 8,4 Tab 1 charakteristika pacientů ve studii 55

59 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Operace Zákrok byl proveden u všech pacientů během jednoho dne a skládal se ze tří na sebe navazujících kroků: krok 1 odběr dermoepidermálního štěpu, krok 2 zpracování štěpu v buněčné laboratoři, krok 3 transplantace kožních buněk. krok 1 odběr dermoepidermálního štěpu S ohledem na možné riziko depigmentace, či hyperpigmentace místa odběru byla jako donorská oblast u všech pacientů zvolena zadní strana stehna pod gluteofemorální rýhou nebo hýždě. Podmínkou byla normální pigmentace kůže v místě odběru. Odběr dermoepidermálního štěpu byl u všech pacientů proveden v lokální anestezii 1 % Trimekainem (Mesocain 1%, Zentiva a.s.) elektrodermatomem (Zimmer). Velikost odebraného štěpu u všech pacientů byla cm 2, tloušťka štěpu byla 0,6 0,8 mm. Odběrová plocha byla po odběru kryta mastným tylem (Sanavel) a sterilním mulem, nebo neadherentním krytím Melolin (Smith & Nephew) a ponechána bez převazu do úplného zhojení. Dermoepidermální štěp byl bezprostředně po odběru uložen do transportního média MEM (Biotech a.s.) ve sterilní nádobě a transportován do buněčné laboratoře k dalšímu zpracování. Současně se vzorkem kůže byla do laboratoře odeslána průhledná fólie se zakresleným obrysem achromické plochy plánované k transplantaci. Obrys achromické plochy byl zakreslen permanentním fixem na nesterilní průsvitnou fólii běžně dostupnou pro kancelářské potřeby viz následující fotodokumentace. Obr zakreslení obrysu achromické plochy Obr zakreslený obrys achromické plochy na fólii 56

60 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Obr lokální anestezie odběrové plochy Obr. 21 odběr dermoepidermálního štěpu Obr odběrová plocha po odběru Obr odebraný dermoepidermální štěp krok 2 zpracování štěpu v buněčné laboratoři Směs autologních kožních buněk byla připravována z odebraného dermoepidermálního štěpu ve Tkáňové bance FN Brno. Odebraný štěp byl za aseptických podmínek v laminárním boxu třídy A mechanicky a následně enzymaticky rozvolněn trypsinem (Trypsin 0,25 %, PAN Biotech GmbH). Pro rozvolnění štěpu bylo potřeba trypsinaci opakovat v průměru 5x za stálého míchání v inkubátoru při teplotě 36,6 o C. Výsledkem tohoto procesu byl roztok obsahující jednotlivé kožní buňky. Získaná směs kožních buněk byla smísena s fibrinovým lepidlem Tissucol (Baxter AG) a před ztuhnutím byla rozprostřena do požadovaného tvaru podle nákresu achromické plochy. Pro snadnější manipulaci a fixaci na těle pacienta byla u posledních 3 pacientů směs ponechána ke ztuhnutí na sterilní textilii. Celý proces separace kožních buněk trval přibližně 5 hodin. 57

61 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Obr laminární box třídy A detail Obr. 25 mechanické rozvolnění štěpu Obr detail na mechanicky rozvolněný štěp Obr. 27 trypsinace v inkubátoru Obr výsledný produkt - směs buněk v Tissucolu Obr výsledný produkt - směs buněk v Tissucolu 58

62 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk 3 transplantace kožních buněk Pro malý kontrast mezi pigmentovanou a nepigmentovanou kůží některých pacientů byl před vlastní ablací epidermis vyznačen obrys achromické léze na kůži permanentním fixem. Obnažení dermis v příjmové oblasti bylo u všech pacientů provedeno ablací epidermis CO 2 laserem (Sharplan 40 C) v lokální anestezii 1 % Trimekainem (Mesocain 1%, Zentiva a.s.). Bylo použito obvyklé nastavení laseru pro resurfacing obličeje 2 x pass 9,33 J/cm 2, 14 W. Druhá dávka laseru (pass) byla aplikována na léčenou kožní plochu po setření suché substance po prvním ošetření s částečnou defokusací paprsku. Výsledná suchá substance po laserovém resurfacingu byla z kožního povrchu setřena tampónem s antiseptickým roztokem BETADINE roztok (EGIS Pharmaceuticals Ltd., nebo Octenisept (farblos Schülke & Mayr GmbH) a na takto připravenou achromickou plochu byla aplikována připravená směs autologních kožních buněk v Tissucolu. U pacientů, kde byla směs buněk připravena na sterilní textilii, byla textilie fixována ke kůži několika stehy Prolenem 5/0 (Ethicon). U ostatních pacientů bez tohoto vylepšení byl přes směs kožních buněk v Tissucolu rozprostřen mastný tyl (Sanavel), který byl rovněž v několika okrajových bodech fixován ke kůži stehy. Jako další vrstva krytí rány byly u jedenácti pacientů použity sterilní čtverce zvlhčené Ringerovým roztokem, nebo neadherentí krytí TenderWet 24 (Hartmann). Vlhké čtverce nebo krytí TenderWet pacienti měnili v intervalu 24 hod, ke zvlhčení obvazového materiálu používali Ringerův roztok. U dvou pacientů byla zatransplantovaná plocha kryta transparentním obvazem s vysokým obsahem vody Hydrosorb (Hartmann). Toto krytí pacienti ponechali do první kontroly bez převazu. Poslední fixační vrstvu v případě ošetření lézí na končetinách tvořil elastický obvaz vázaný s lehkým stupněm komprese od distálního konce končetiny. Kontrola pacientů byla prováděna po 7 a 14 dnech od zákroku, pacienti byli instruováni kontaktovat lékaře při jakýchkoliv potížích souvisejících s léčbou. 59

63 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Obr ablace epidermis CO 2 laserem Obr. 31 olupující se suchá substance (termicky destruovaná vrstva kůže) na povrchu 60

64 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Obr aplikace suspenze buněk v tissucolu na obnaženou dermis Obr suspenze buněk v Tissucolu ztuhlá na sterilní textilii, fixace ke kůži stehy 61

65 lokalita Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Hodnocení repigmentací Stupeň repigmentace byl hodnocen škálou 1-5: 1 excelentní (repigmentace na % povrchu ošetřené léze) 2 dobrá (repigmentace na % povrchu ošetřené léze) 3 částečná (repigmentace na % povrchu ošetřené léze) 4 špatná (repigmentace na 1-19 % povrchu ošetřené léze) 5 žádná (repigmentace na 0 % povrchu ošetřené léze) 6.3 Výsledky Pacienti byli zváni na kontrolu za 7 a 14 dní a za 4-6 měsíců po zákroku ke zhodnocení výsledků terapie. Část pacientů se navíc dostavila ke kontrole i s delším časovým odstupem. U některých pacientů bylo ošetřeno více menších lokalit současně - viz charakteristika souboru pacientů. S ohledem na topografickou lokalizaci lézí byla nejčastěji ošetřenou lokalitou kolena a trup. Ve vztahu úspěšnosti repigmentací k lokalitě byla léčba nejvíce úspěšná v oblasti loktů a kotníků viz graf 1. Topografie všech ošetřených a repigmentovaných lokalit kotník bérec kolena 1 5 ruce 0 1 repigmentovaných celkem předloktí 0 1 loket 2 2 trup počet pacientů Graf 1 topografické rozložení všech ošetřených a repigmentovaných lokalit v souboru pacientů 62

66 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Hojení odběrové plochy Odběrová plocha byla zhojena u všech pacientů epitelizací ze spodiny bez komplikací během dnů od odběru dermoepidermálního štěpu. U všech pacientů byla zhojená odběrová plocha první 3-4 měsíce narůžovělá a do jednoho roku od odběru byla odběrová plocha prakticky nerozeznatelná od okolí u 11 pacientů, u 1 pacienta došlo k přechodné hyperpigmentaci odběrové plochy a u 1 pacientky došlo k trvalé depigmentaci odběrové plochy, viz obr Obr zhojená odběrová plocha : A - mírný erytém 4 měsíce po zhojení, B - rok po zákroku již odběrová plocha není patrná Obr trvalá depigmentace po odběru štěpu Obr přechodná hyperpigmentace po odběru štěpu 63

67 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Hojení transplantované plochy Hojení transplantované plochy probíhalo zcela bez komplikací u 11 pacientů ze 13 zúčastněných ve studii, u zbývajících 2 pacientů bylo hojení komplikováno lehkou inflamací. Všichni pacienti s nekomplikovaným průběhem měli transplantovanou plochu krytou vlhkými čtverci, nebo krytím TenderWet (Hartmann). Při kontrole po týdnu od zákroku byla transplantovaná plocha kryta suchou krustou ze zbytků fibrinového lepidla, při kontrole za další týden byla plocha již přeepitelizovaná s ojedinělými krustami. Pigmentace byly spolehlivě patrny nejdříve za 5-6 týdnů od zákroku. Průběh hojení lze pozorovat na sekvenci snímků (obr ), která je pro názornost vybrána u jednoho pacienta na stejném místě. Jedná se o lézi v oblasti pravého lokte u jednoho z prvních ošetřených pacientů v souboru, odstup mezi operací a finálním snímkem je 74 měsíců. Fotografie zachycují stav před ošetřením (obr. 37), bezprostředně po ablaci epidermis CO 2 laserem (obr. 38), bezprostředně po transplantaci buněk (obr. 39), první, druhý a třetí týden po ošetření (obr ). Na obrázcích 43 a 44 je tatáž plocha po delší době od zákroku. Obr achromická plocha pravého lokte Obr. 38 stav bezprostředně po ablaci epidermis 64

68 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Obr stav bezprostředně po transplantaci buněk Obr. 40 stejná plocha týden po zákroku Obr. 41 stejná plocha 2 týdny po zákroku Obr. 42 stejná plocha 3 týdny po zákroku 65

69 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Obr stejná plocha 38 měsíců po zákroku Obr. 44 stejná plocha 74 měsíců po zákroku Léčená plocha měla po 14 dnech u všech pacientů růžovou až načervenalou barvu, u prvních pacientů byl okraj plochy ohraničen bílým achromickým lemem. Tento lem byl patrný tehdy, pokud byla ablace epidermis provedena exaktně v achromické ploše. Při resurfacingu s přesahem do pigmentované kůže tento lem nevznikal. Obr. 45 achromická plocha v oblasti kolene 14 dní po ablaci epidermis CO 2 laserem a transplantaci autologních melanocytů, v okraji patrný achromický lem 66

70 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk U dvou pacientů ve studii byl ke krytí transplantované plochy použit transparentní hydrokoloidní obvaz Hydrosorb (Hartmann). Tento kryt byl použit ve snaze zlepšit komfort pacientů v pooperačním období, aby nebylo nutné léčené plochy převazovat. V obou případech došlo lokálně k lehké inflamaci všech léčených ploch s následnou pozánětlivou hyperpigmentací ve všech ložiscích. Jelikož byl pooperační průběh u obou pacientů shodný, tedy s lokální inflamací, u dalších pacientů již toto krytí použito nebylo. U jednoho z těchto pacientů došlo k hyperpigmentaci ložisek v těsné blízkosti plochy repigmentované stejnou terapií před šesti měsíci, ale s použitím hyperpigmentací je vidět v časové posloupnosti na obr krytu TenderWet. Průběh hojení s následnou Obr. 46 achromická ložiska pravého kolene v okolí repigmentované plochy (ohraničené modře) Obr. 47 hydrokoloidní krytí Obr nález týden po zákroku, léčená ložiska s lehkou inflamací Obr. 49 pozánětlivá hyperpigmentace 67

71 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Repigmentace ošetřených ploch S ohledem na erytém běžně přítomný po každém resurfacingu CO 2 laserem bylo hodnocení časných známek repigmentace velmi problematické jak je patrno na obr Na ztíženém hodnocení se podílela i skutečnost, že většina nemocných s vitiligem se účinně chrání před UV zářením a mají velmi světlou kůži Obr achromické léze kolene před ošetřením Obr. 51 stejná oblast týden po ošetření Obr stejná oblast 4 měsíce po ošetření Obr stejná oblast 62 měsíců po ošetření 68

72 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Na sekvenci obrázků je v časové posloupnosti zachycena léčená léze u pacientky v oblasti kolene. Počáteční snímek dokumentuje nález před zákrokem, obr. 51 nález při nekomplikovaném způsobu hojení týden po zákroku, obr. 52 pak stejnou oblast 4 měsíce po zákroku se zřetelně patrným lehkým erytémem a výsledný nález 62 měsíců po ošetření. Jiným příkladem obtížně hodnotitelných výsledků v prvních měsících po ošetření je u pacienta na obr. 54. Obr. 54 pac. s mírným erytémem ošetřené plochy 3 měsíce po zákroku s obtížně hodnotitelným stupněm pigmentace. Přestože počáteční erytém navozuje iluzi pigmentace, s delším časovým odstupem se ukázalo, že k pigmentaci nedošlo. Ke spolehlivě rozlišitelné repigmentaci došlo u 5 pacientů ze 13 pacientů ve studii, což představuje úspěšnost 38 % ve sledovaném období do 6 měsíců od zákroku. Průměrná doba, kdy bylo možné spolehlivě odlišit pigmentace od erytému v léčené oblasti u těch pacientů, kde k pigmentaci došlo, byla 5,4 týdnů od zákroku. Nejdříve byly pigmentace patrné za 4 a nejpozději za 8 týdnů, viz graf 2. 69

73 pacient Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Výskyt prvních pigmentací v týdnech od zákroku týdny od zákroku týdny od zákroku Graf 2 výskyt prvních známek repigmentace v týdnech od zákroku u úspěšně léčených pacientů v souboru Úplná repigmentace (v % léčené plochy) byla dosažena u dvou pacientů, jeden z nich měl s tímto výsledkem ošetřeny tři léze ve dvou dobách. Dobrá repigmentace (v % léčené plochy) byla dosažena u jednoho pacienta a částečná repigmentace (v % léčené plochy) byla dosažena u dvou pacientů v souboru. U zbývajících osmi pacientů po odeznění erytému repigmentace ploch nebyla patrná, viz graf 3 a tabulka 2. Stupeň repigmentace u pacientů ve studii do 6 měsíců od zákroku 2 (15%) 8 (62%) 0 (0%) 1 (8%) 2 (15%) excelentní (95-100%) dobrá (65-94%) částečná (20-64%) špatná (1-19%) žádná Graf 3 stupeň repigmentace ošetřených lézí u všech pacientů v souboru 70

74 Experimentální část práce Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk Tab 2 přehled všech pacientů, léčených ploch a stupně repigmentací v % (úspěšně léčení pacienti jsou vyznačeni oranžovou barvou) Fototerapii, která je pro stimulaci melanogeneze důležitá, podstoupili po zákroku pouze 4 pacienti převážně z důvodů nedostupnosti této terapie v místě bydliště. Zajímavý je fakt, že u 3 z těchto 4 pacientů, kteří fototerapii postoupili, došlo k repigmentaci ošetřených lézí. 71