DETEKCE CYANOTOXINŮ VE VODÁRENSKÝCH SYSTÉMECH

Transkript

1 DETEKCE CYANOTOXINŮ VE VODÁRENSKÝCH SYSTÉMECH 1)2) Blahoslav Maršálek, Doc. Ing. CSc., 1)2) Jakub Gregor, Mgr., 1)2) Pavel Babica, Mgr., 1) Botanický ústav AV ČR, Květná 8, Brno 2)RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii, Masarykova univerzita, Kamenice 3, Brno, marsalek@brno.cas.cz Souhrn Hygienicky významné koncentrace toxických látek ve vodárenských systémech nemusí pocházet jen z obávaných teroristických útoků. V září roku 2003 jsme dostali vzorky pitné vody s koncentracemi cyanotoxinů takovými, že úvahy vedly i směrem k úmyslné aplikaci. Realita byla prozaičtější nedostatečná úpravárenská technologie v době podzimní mixace ve stratifikované vodárenské nádrži. Není to v ČR zcela ojedinělý případ (registrujeme takových cca 4-9 ročně), přesto prověřil fakt, že provozovatelé v těchto případech nevědí, jaké analýzy realizovat, kdy, jak často atd. Vzhledem k ceně analýz sledovaných microcystinů doporučujeme průběžně sledovat koncentrace chlorofylu a fykocyaninu jako markerů přítomnosti řas a sinic v surové vodě a teprve při koncentraci sinic nad 2000 buněk/ml (1µg chl a ml -1 ) má smysl realizovat testy toxicity či analýzy microcystinů. Do té doby jde o plýtvání financemi, nerealizovat analýzy při koncentracích vyšších je zase hazard se zdravím lidí a jménem společnosti. V současné době pracujeme na vývoji detekčních systémů, které by byly schopny detekovat selektivně koncentraci cyanobakterií (automatický systém, který bude hlásit překročení bezpečné koncentrace cyanobakterií). Tento systém bude procházet v létě 2004 již poloprovozním a na podzim provozním ověřováním. Dále pracujeme na toxikologickém detekčním systému, který by měl být schopen upozornit i na malé koncentrace toxických látek v surové a upravené vodě. Systémy včasné detekce toxických látek: citlivé, praktické, automatické Tato kapitola asi zklame každého, kdo si pod těmito systémy představí akvárium se pstruhy, kudy protéká surová voda. Aby takový systém detekoval toxické látky, muselo by jít již o opravdu vysoké koncentrace látek a toxinů nebo by musel být založen na jiném signálním mechanismu, než je mortalita. Jistěže tyto systémy jsou lepší než nic a určitě by se daly modifikovat na citlivější systémy (například vyhodnocování změn v chování pokusné skupiny, rychlost, plynulost a směr pohybu atd.). K tomu by ale musely být odděleny od dalších podnětů a ne být v provozu, kudy chodí personál atd. Realita je, že 96h LD 50 pro microcystin je u pstruha 0,5mg/litr, což je 500x více než povoluje novela Vyhlášky 376/2000 Sb., takže pro detekci microcystinů je to zcela nevhodný systém. Chemické a biologické znečištění a jeho včasná detekce je důležitým aspektem kontroly kvality pitné vody. Pro tyto účely jsou vyvíjeny tzv. "early-warning systems" (systémy včasného varování), což jsou biologické systémy využívající různé typy organismů, u nichž jsou v on-line módu sledovány případné toxické účinky analyzované vody. Zmíněné účinky zahrnují nejen mortalitu, ale i změny v chování, pohybu, fyziologii, biochemické parametry detoxifikačních drah, enzymatické aktivity apod. V praxi jsou

2 nejčastěji využívány ryby (van der Schalie et al., 2001), nicméně jejich použití má řadu nevýhod, např. větší nároky na prostor či všeobecně nízká citlivost. Proto i v oblasti biologických detekčních systémů existuje podobný trend jako v klasických ekotoxikologických biotestech, tedy snaha o miniaturizaci a obecně co největší zjednodušení provozního uspořádání (pokud možno bez obsluhy v automatickém modu) za současného zvýšení citlivosti. Zatím nejpropracovanější systém pro on-line monitoring toxicity používá korýše rodu Daphnia (perloočka). Tyto organismy jsou běžně používány i ve standardizovaných ekotoxikologických biotestech. Sledovaným endpointem je v tomto případě pohyb perlooček. Ovšem zatímco v klasickém biotestu jsou pouze počítány nepohybující se jedinci (z jejich počtu se odvozuje procento inhibice a příslušné IC X ), u biomonitorovacích systémů je toto hodnocení mnohem komplexnější. Pohyb organismů je snímán kamerou a následně hodnocen pomocí speciálního software. Sledována je rychlost a změny směru pohybu, náhlé "propady" ve vodním sloupci či vzdálenost jedinců od sebe (seskupování). Každý z těchto parametrů má určitou bodovou hodnotu a pokud jejich součet přesáhne daný limit, okamžitě je spuštěn alarm indikující přítomnost toxické látky (Lechelt et al., 2000; Green et al., 2003). Na podobném principu jsou vyvíjeny i další monitorovací systémy použitelné i pro vodárenské systémy využívající např. zelené bičíkovce krásnoočka (Tahedl and Hader, 2001) nebo blešivce (Maltby et al., 2002). Pitná voda však může být kontaminována i biologickým znečištěním. Zde je velká pozornost věnována sinicím (cyanobakteriím), což jsou autotrofní bakterie, které tvoří společně s řasami společenstvo fytoplanktonu. Mnohé sinice produkují široké spektrum látek s toxickými, alergenními či karcinogenními účinky. Proto je důležité zachytit jak přítomnost samotných organismů, tak i jejich toxických produktů (např. microcystinů). Pro on-line monitoring řas a sinic existují přístroje detekující jejich přítomnost na základě fluorescence fotosyntetických pigmentů (především chlorofyl a a fykocyanin). Jedná se tedy v principu o fluorometry, které jsou buď spouštěny přímo do vody (tzv. ponorné fluorescenční sondy) nebo analyzovaná voda protéká měřící celou fluorometru. Fykocyanin je pigment typický pouze pro sinice (alespoň ve sladkých vodách) a jeho flurescenční vlastnosti jsou odlišné od pigmentů ostatních řas. Díky tomu lze sinice poměrně přesně odlišit a kvantifikovat. Nicméně tyto metody jsou stále ve stadiu výzkumu (Asai et al., 2001). Převést tyto principy do on-line modu a především zkalibrovat takový systém pro praktické použití ve vodárenském provozu je cílem naší výzkumné práce Cyanobakterie a jejich toxiny v legislativě a ve vodárenské praxi Od 1.října 2003 platí novela Vyhlášky 376/2000 Sb. kde je mj. zařazen požadavek na stanovování microcystinu. Je to bezesporu záslužné, microcystin je vskutku jedem ani ne tak extremně jedovatým (i když je jedovatější, než strychnin, kurare nebo amanitin z muchomůrek), ale jeho nebezpečí spočívá v tom, že je v přírodě v povrchových vodách ve velkých množstvích. Do vodárenských systémů se dostává především v průběhu července, srpna, září a října v hygienicky a toxikologicky nezanedbatelných koncentracích. Uvedení microcystinu mezi sledované parametry je tedy určitě lepší, než se k tomuto reálnému nebezpečí stavět legislativními zády. Microcystiny však zdaleka nejsou nejtoxičtější metabolity sinic jsou jen jaksi nejznámější Provozovatelé vodárenských systémů měli možnost analyzovat cyanotoxiny v pitné vodě již také na základě dříve platných předpisů především Zákona 258/200 Sb. o

3 zdraví lidu, který udává v 4, odst. 6: Zjistí-li provozovatel výskyt dalších látek nebo součástí pitné vody neupravených prováděcím právním předpisem, neprodleně oznámí tuto skutečnost příslušnému orgánu ochrany veřejného zdraví. To se také v praxi dělo a vím o několika úpravnách, které zastavily v letech produkci kvůli detekovaným microcystinům. V roce 2003 však vstoupila na území ČR v platnost také jiná vyhláška a to Vyhláška 474/2002 Sb., kterou se provádí zákon č. 281/2002 Sb. O opatřeních souvisejících se zákazem biologických a toxinových zbraních. V příloze jsou vedle látek jako antrax, botulotoxin nebo ricin uvedeny 4 toxiny řas a sinic: tetrodotoxin, saxitoxin, anatoxin a microcystin. Opravdu nechci domýšlet jak se odpovědné orgány (v tomto případě Státní ústav pro jadernou bezpečnost, kde je Odbor pro kontrolu zákazu chemických a biologických zbraní) poperou s faktem, že na desítkách nádrží v ČR máme v létě zdarma stovky tun materiálu na výrobu biologických zbraní pro teroristy. Zde se chci podělit pouze o osobní zkušenost s touto protiteroristickou vyhláškou a zákonem. Byl jsem navštíven pracovníky Státního ústavu pro jadernou, biologickou a chemickou ochranu (což je druhá instituce, která provádí kontroly a dozor nad dodržováním výše zmíněné legislativy) s návrhem, že (stručně řečeno) to máme skončit a odevzdat jim metodiky a standardy, ač vědí, že jsme sice jediné pracoviště v ČR, které analyzuje toxiny sinic, a ač vědí, že jsme se jako jediní z východního bloku účastnili mezinárodních okružních srovnávacích testů. Takto prý již v roce 2003 ukončilo na základě zmíněné protiteroristické vyhlášky činnost několik laboratoří v oblasti mykotoxinů a virů. Abych to zkrátil, výsledek 2 návštěv byl takový, že my je naučíme analyzovat microcystiny a pomůžeme je akreditovat, a sami si pak zařídíme podmínky, za kterých budeme moci realizovat další výzkum a analýzy těchto látek tak, aby odpovídaly duchu vyhlášky (ostraha objektu, několikanásobné jištění trezorů se standardy apod.). Již nyní je navíc vysoce pravděpodobné, že laboratoří, které budou mít prověření pro nakládání s materiály zmíněnými v zmíněné protiteroristické vyhlášce, nebude v ČR přehršel. V dubnu 2004 jsme byli dle informací SUJB jedinou laboratoří v ČR, která vlastnila jejich osvědčení umožňující vlastnit standardy microcystinů a realizovat analýzy microcystinů ve vodách, sedimentech a biologickém materiálu. Pevně věřím, že se tato situace do letní sezony rapidně změní, protože realizaci novely Vyhlášky 376/2000 Sb. nemůže zajišťovat jediná laboratoř. Chápeme, že se do toho žádná laboratoř za současných podmínek nepohrne, ale předpokládáme, že rutinu bude časem realizovat některá ze špičkově vybavených civilních laboratoří v ČR (pokud máme informace, protiteroristická jednotka Ministerstva vnitra si takovou laboratoř buduje, nebude však k dispozici pro civilní sektor). Do budoucna předpokládáme, že naše vybavení a zkušenosti budou k dispozici pro verifikace pozitivních nálezů, které vyjdou z testů rutinních laboratoří, metodické vedení, referenční laboratoř a organizace seminářů. Jak dodržet legislativu a nezatížit provoz zbytečnými náklady? Pro detekci cyanotoxinů je uznána jako standardní metoda s dostatečnou citlivosti HPLC s diodovým polem a knihovnou spekter typických pro microcystiny (v současnosti známých 67 variant), nebo ELISA test. Oba systémy je v případě pozitivních výsledků nutno verifikovat buď pomocí čerstvě izolovaných krysích hepatocytů, in vitro tkání nebo nezávislou analýzou kontrolní laboratoře. Přehled metod viz Bláha and Maršálek (1999, 2004).

4 Tento systém je ale finančně náročný, proto pracujeme na metodách, jak detekovat cyanotoxiny alternativními detekčními systémy (Maršálek and Bláha 2004), nebo jak detekovat hygienicky problémovou koncentraci cyanobakterií moderními detekčními systémy (Gregor and Maršálek, 2004), přičemž by bylo nutno realizovat analýzy na microcystiny teprve až se prokáže kritická koncentrace cyanobakterií a jejich toxinů v surové vodě. Automatická verze zcela originálního citlivého přístroje pro detekci cyanobakterií v surové a upravené vodě je vyvíjena na našem pracovišti ve spolupráci se soukromou firmou a poloprovozní i provozní zkoušky proběhnou již v roce Současná verze již umí rozlišit řasy a sinice do koncentrace 500 buněk/ml a realizovaná kalibrace ukazuje, že systém založený na flouorescenci pigmentů bude nejen citlivý, ale také selektivní. V současné době pracujeme na intuitivním módu, který umožní přechod do kalibračních skupin větších rozsahů. V praxi nejsou výjimečné případy, kdy znečištění bylo takové, že i laik si všiml, že umyvadlo či dokonce vana napuštěná vodovodní vodou byla lehce zelená. Rozbije-li úpravárenská technologie buňky sinic, uvolní se toxiny i pigmenty. Z pigmentů lze běžně stanovit chlorofyl a, ten je ale pro tyto sledování v rozvodné síti špatný parametr, protože je to labilní molekula, v prostředí chloru či ozonu se rozkládá a je špatným markerem havarijního stavu. V těchto případech lze doporučit stanovování fykocyaninu: je to stabilní molekula, je specifickým markerem přítomnosti buněk sinic (či jejich obsahu) a v přírodních populacích sinic lze předpokládat definovatelný poměr obsahu akcesorických pigmentů ku obsahu cyanotoxinů. Toto stanovení by mělo ještě minimálně další tři výhody: fykocyanin je markerem všech cyanotoxinů, nejen microcystinu, a je podstatně levnější než preventivní analýzy microcystinů. Hlavně ale by si poměr chlorofyl / fykocyanin mohly monitorovat vodárenské společnosti samy, tedy průběžně a v pravidelných intervalech (v automatickém modu po 20 min., což je důležité na podzim a při podzimním míchání a při kolapsu biomasy cyanobakterií při letních bouřkách, kdy jsou do systému surové vody náhodně přisávány oblaka biomasy a vzorkování s delší periodou neodhalí nebezpečí včas). Proplach a čištění úpravárenské technologie je pak ve svém důsledku dražší než technologie včasného varování. Jsme připraveni spolupracovat na další precizaci legislativy s odpovědnými orgány a věříme, že najdeme cestu přijatelnou pro duch platné legislativy i představy těch, kteří sledují náklady na produkci pitné vody. Literatura Asai R, Horiguchi Y, Yoshida A, McNiven S, Tahira P, Ikebukuro K, Uchiyama S, Masuda Y, Karube I (2001) Detection of phycobilin pigments and their seasonal change in Lake Kasumigaura using a sensitive in situ fluorometric sensor. ANALYTICAL LETTERS 34 (14): Bláha L., Maršálek B.(1999) Methods for detection of cyanobacterial toxins. ALGOLOGICAL STUDIES 99, Bláha L., Maršálek B.(2004) Metody detekce a kvantifikace cyanotoxinů. Sborník semináře Cyanobakterie, , Eds.:Maršálek B., Halousková O. str Green U, Kremer JH, Zillmer M, Moldaenke C (2003) Detection of chemical threat agents in drinking water by an early warning real-time biomonitor. ENVIRONMENTAL TOXICOLOGY 18 (6): Gregor J. and Maršálek B.(2004) Freshwater phytoplankton quantification by chlorophyll a: a comparative study of in vitro, in vivo and in situ methods. WATER RESEARCH, 38,

5 Maltby L, Clayton SA, Wood RM, McLoughlin N (2002) Evaluation of the Gammarus pulex in situ feeding assay as a biomonitor of water quality: Robustness, responsiveness, and relevance. ENVIRONMENTAL TOXICOLOGY AND CHEMISTRY 21 (2): Maršálek B., Bláha L. (2004) Comparative assessment of 17 bioassays for cyanotoxins detection. ENVIRONMENTAL TOXICOLOGY 19(5), van der Schalie WH, Shedd TR, Knechtges PL, Widder MW (2001) Using higher organisms in biological early warning systems for real-time toxicity detection. BIOSENSORS & BIOELECTRONICS 16 (7-8): Tahedl H, Hader DP (2001) Automated biomonitoring using real time movement analysis of Euglena gracilis. ECOTOXICOLOGY AND ENVIRONMENTAL SAFETY 48 (2): Lechelt M, Blohm W, Kirschneit B, Pfeiffer M, Gresens E, Liley J, Holz R, Luring C, Moldaenke C (2000) Monitoring of surface water by ultrasensitive Daphnia toximeter. ENVIRONMENTAL TOXICOLOGY 15 (5):