OPVK CZ.1.07/2.2.00/

Transkript

1 OPVK CZ.1.07/2.2.00/

2 Základy ADME a toxického hodnocení léčiv v preklinickém vývoji OCH/ADME LS 2012/2013

3 Metabolismus léčiv Indukční potenciál látek a interakce s nukleárními receptory PharmDr.Lucie Stejskalová, Ph.D. Mgr. Alice Rulcová

4 Metabolismus léčiv Indukční potenciál látek a interakce s nukleárními receptory

5 Metabolismus (biotransformace) metabolismus + exkrece = eliminace eliminace: je proces, při kterém se odstraňuje aktivní forma léčiva z organismu eliminace pentobarbitalu (epileptické záchvaty, předoperační sedace) bez metabolismu by trvala 100 let exkrece = vyloučení léčiva z organismu (nejčastěji močí a žlučí) TRANSPORTÉRY podílí se na exkreci metabolismus (biotransformace) = chemická přeměna molekuly léčiva na více hydrofilní a snáze eliminovatelné z těla

6 eliminace lze popsat následujícími farmakokinetickýmu parametry Systémová clearance (Cl, objem/čas) = objem plasmy, který se ireverzibilně očistí od dané látky za jednotku času vyjadřuje lépe účinnost vylučování léčiva z organismu než biologický poločas

7 Eliminační poločas (t1/2, čas) = čas potřebný ke snížení koncentrace látky v plasmě na polovinu

8 Biotransformační aktivita v orgánech Orgán Relativní aktivita (%) Játra 100 % Plíce % Ledviny 8 % GIT 6 % Placenta 5 %

9 Presystémová eliminace First-pass efekt: efekt prvního průchodu játry látka je před vstupem do systémové cirkulace částečně metabolizována v játrech

10 Metabolismus Při metabolické konverzi léčiva v organismu dochází k chemické změně molekuly, která může vyústit v přeměnu léčiva na látku s výrazně farmakologickou aktivitou přibližně stejnou farmakologickou aktivitou výrazně potencovanou aktivitou (PROLÉČIVO), kdy je látka podáná v neaktivní formě a k projevení účinku musí být nejdříve metabolizována (prontosil na sulfanilamid) (neaktivní látka se mění na látku toxickou prokarcinogeny)

11 dělí se na dvě fáze: Metabolismus 1. fáze tzv. nesyntetická - zahrnuje oxidaci, redukci, hydrolýzu 2. fázi tzv. syntetickou - kam patří konjugace

12 I. fáze metabolismus dochází k zavedené polární funkční skupiny do molekuly (např. OH, NH2, COOH) reakce 1. fáze jsou ve většině případech katalyzovány monooxygenázovým systémem cytochromu P450 oxidační reakce (hydroxylace, N-dealkylace, N- oxidace) redukční reakce hydrolytické reakce

13 I. fáze - oxidační reakce zavedení hydroxylové skupiny do molekuly léčiva lokalizovány výhradně v endoplasmatickém retikulu Mezi oxidační biotransformace řadíme hydroxylace N-oxidace O-deaminace O-dealkylace oxidace alifatických alkoholů

14 metabolismus endogenních látek transfer vodíku, enzymy mají vysokou substrátovou specifitu metabolismus xenobiotik inserce O2 do substrátu, enzymy mají nízkou substrátovou specifitu ( umožňuje řadu lékových interakcí) přenos je katalyzován monooxygenázovým systémem cytochromu P450 (nebo také mixed function oxidase system MFO)

15 Cytochrom P450 hladké ER Jaterní MFO je složen z: flavoproteinu (NADPH cytochrom P-450 reduktáza) hemoproteinu (cytochrom P-450) lipidová složka (phosphatidylcholin) Dva atomy kyslíku jeden do substrátu, druhý redukován na vodu

16 Cytochrom P450

17 CYP1-3 metabolizace xenobiotika CYP4-27 syntéza endogenních molekul

18 Podíl enzymů I. a II. fáze biotransformace na metabolismu léčiv

19 Rodina CYP1 Podrodina CYP1A isoformy CYP1A1, CYP1A2 podíl na biotransformaci xenobiotik inducibilita CYP1A1 a CYP1A2 může korelovat se zvýšenou incidencí onkologických onemocnění (aktivace prokarcinogenů, kontaminantů životního prostředí) substráty: kofein, paracetamol, omeprazol indukce: heterocyklické aminy, dioxiny (TCDD), PAH (3MC, β-naftoflavon), PCB, grilované maso, cigaretový kouř, znečištěné ovzduší, některé druhy zeleniny (květák, brokolice)

20

21 Podrodina CYP1A indukce exprese přes AhR receptor vzhledem k toxickému účinku CYP1A je jeho indukce nežádoucí (důsledek - výrazné snížení účinků léčiv, které jsou metabolizovány CYP1A u kuřáků, z důvodů jejich rychlejšího metabolismu) CYP1A1: extrahepatální tkáně (plíce, mozek, GIT, srdce, lymfocyty, placenta), CYP1A2: primárně exprimovaný v játrech

22 Podrodina CYP1B odpovědný za metabolismus endogenních estrogenů. aktivaci heterocyklických aminů, kůže, mozek, srdce, plíce, placenta, játra

23 Rodina CYP2 nejrozmanitější a nejpočetnější rodina mnoho podrodin, mezi nejdůležitější patří: CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2D, CYP2E

24 Podrodina CYP2A Tři základní formy: CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13 CYP2A6: převážně v játrech, biotransformace mnoha karcinogenů (aflatoxin B1, N- nitrosodietylamin)

25 Podrodina CYP2C u člověka 4 isoformy: CYP2C8, 2C9, 2C18, 2C19 významné pouze deaktivačním účinkem, zatím nebyl nalezen žádný substrát, který by byl isoformami metabolizován na toxičtější produkty CYP2C8: biotransformační procesy xenobiotik se nejeví jako velmi důležité, substráty: kyselina retinová a taxol.

26 Podrodina CYP2C CYP2C9: důležitý pro metabolismus léčiv (warfarin, nesteroidní antiflogistika), je polymorfní a klinickým projevem může být krvácení po aplikaci warfarinu nebo zvýšená toxicita fenytoinu (antiepileptikum) inhibice vede ke zpomalení metabolismu léčiv (warfarin) exprese je regulována PXR a CAR induktory: barbituráty, rifampicin výrazná stereoselektivita, stereospecifita

27 Podrodina CYP2D U člověka nejvíce diskutovaná forma CYP2D6 CYP2D6: druhý nejvýznamnější enzym, zejména játra, mozek (velké koncentrace jsou popisovány u alkoholiků), plíce, GIT (hladké endoplazmatické retikulum) v plodu je aktivita nízká a až po narození se zvyšuje je hlavním biotransformačním enzymem řady významných léčiv, karcinogenů, prokarcinogenů

28 CYP2D6 forma CYP2D6 není inducibilní, ale některé léčiva mohou zvýšit její aktivitu není znám mechanismus regulace exprese závažná interindividuální variabilita v aktivitě způsobená výskytem mutací vedoucích k modulaci jeho aktivity (nejvýraznější polymorfismus) další isoformy: CYP2D7, CYP2D8

29 Podrodina CYP2E U člověka definovaná jen jedna forma z této podrodiny CYP2E1: játra, plíce, GIT (hladké endoplazmatické retikulum) součást systému podílejícím se na odbourávání etanolu biotransformace i jiných xenobiotik: malé, neutrální hydrofilní zjištěna i významná reduktásová aktivita a jeho aktivita je doprovázena tvorbou radikálů aktivace karcinogenů: nitrosaminy indukce dvojím způsobem: zvýšením exprese a stabilizací proteinu indukce: substráty (etanol), hladovění inhibice: česnek, cibule, brukvovité Chronické užívání etanolu vede k indukce

30 CYP3A4 nejvýznamnější isoforma z hlediska metabolismu játra, střevo, menší množství ledviny, placenta, plíce, mozek (hladké endoplazmatické retikulum) metabolismus až 50% léčiv substráty: různá struktura (nízká substrátová selektivita) nebyl popsán polymorfismus, aktivita mezi jedinci je ale variabilní. příčina: výrazná indukovatelnost i značná citlivost k inhibičnímu působení složek potravy i kontaminantů prostředí

31 CYP3A4 exprese regulovaná přes PXR důsledek indukce a inhibice CYP3A4: interindividuální variabilita zvýšená či snížená aktivita CYP3A4 je častou příčinou selhání terapie či zvýšeného výskytu nežádoucích účinků játra plodu a novorozenců exprimují isoformu CYP3A7, krátce po narození přebírají její funkci CYP3A4

32 Zapojení CYP do endogenního metabolismu Rodina CYP CYP4 CYP5 CYP7 CYP11 CYP17 CYP19 CYP21 CYP24 CYP27 Funkce ω-oxidace mastných kyselin,, syntéza prostaglandinů a leukotrienů Syntéze tromboxanů 7α-hydroxylace cholesterolu 11β hydroxylace steroidů 17α- hydroxylace steroidů Aromatizace steroidů 21-hydroxylace steroidů Hydroxylace vitaminu D 27-hydroxylace cholesterolu

33 Další typy oxidáz Flavinové monooxygenázy (FMO) membránové proteiny, hladké ER nejvíce exprimované v játrech monomerní struktura + jedna molekula flavinového koenzymu FAD 5 isoforem častý polymorfismus dosud se nepodařilo nalézt induktora FMO a není známá ani regulace exprese Další oxidázy: peroxidázy, alkoholdehydrogenázy, aldehyddehydrogenázy, aldehydoxidázy, xanthinoxidázy, monoaminoxidázy, diaminoxidázy

34 I. Fáze - reduktivní reakce výskyt: ER, cytoplasma, mikroorganismy GITu u člověka má malý význam základními typy jsou azo-,nitro-,keto-redukce (redukční dehalogenace, redukce sulfoxidů, redukce peroxidů, redukce disulfidů, ) studovány okrajově v porovnání s CYP

35 I. Fáze - hydrolytické reakce výskyt mimo ER substráty: estery a amidy ester alkohol + kyselina amid amin + kyselina nejvyšší hydrolytickou aktivitu mají játra Esterázy, acetylcholinesterázy, epoxidhydrolázy,

36 II. Fáze biotransformace - konjugace konjugační reakce, konjugace reaktivní skupiny s endogenní molekulou: kys.glukuronová, sulfát, glycin, acetát, glutathion vzniká farmakologicky neaktivní, hydrofilní metabolit reakce katalyzuji transferázy (cytosolické nebo mikrosomální a vyskytují se v játrech, a v menší míře téměř ve všech orgánech a tkáních)

37 Typ konjugace Konjugované sloučeniny Konjugační činidlo Konjugace s kyselinou UDP-glukuronovou Sulfonace Konjugace s glutathionem Konjugace s aminokyselinami Acetylace Metylace Alkoholy, fenoly, thioly, karboxylové kyseliny, aminy Fenoly, alkoholy, aminy Elektrofilni sloučeniny Karboxylové kyseliny Aminy, hydraziny, hydrazidy Fenoly, thioly, heterocykly UDP-glukuronová kyselina 3 -fosfoadenosin-5 fosfosulfát Glutathion Aminokyseliny Acetyl-CoA S-adenosylmethionin

38 Glukuronidace nejčastější konjugační reakce substráty mají ve své molekule: -OH, -NH2, -COOH glukoronidaci podléhaji sloučeniny obsahujíci nukleofilní heteroatom (O,N,S) alkoholy, fenoly, karboxylové kyseliny tvořící O-glukuronidy, aminy, amidy tvořící N-glukuronidy a thioly pro tvorbu S- glukuronidů 9 isoforem velmi nízká aktivita je u novorozenců

39 Glukuronidace enzym:uridindifosfát (UDP) glukuronosyltransferáza výskyt: játra, ledviny, GIT, plíce, placenta kofaktor: kyselina glukuronová (tvořena z oxidace UDP-glukózy) exkrece do žluči tenké střevo (možnost reabsorbce)

40 Glukuronidace aktivita se během života mění významný polymorfismus Crigler-Najjar syndrome úplná deficience jaterní UDPglukuronyltransferázy žloutenka kernicterus > smrt Gilbert syndrome - částečná deficience jaterní UDPglukuronyltransferázy Kernicterus - ireversibilní poškození CNS Gray baby - chloramfenikol u novorozenců

41 Enterohepatální cirkulace β-glukuronidáza - enzym hydrolyzující glukuronidové konjugáty nejvíce v jejunu, přítomna i v jiných tkáních umožňuje enterohepatickou cirkulaci, prodloužení účinku léčiv

42 Sulfatace (Sulfonace) druhá nejdůležitější synthetická reakce enzym: sulfotransferáza (v buněčné cytoplasmě) kofaktor: (donor sulfátu) 3-fosfoadenosin-5-fosfosulfát (PAPS) koncentrace PAPS je nízká - limitující faktor pro rychlost sulfonace saturabilní (na rozdíl od GC) následkem deplece PAPS podléhají hlavně alkoholy, aminy, fenoly (obs. OH, NH2)

43 N-acetylace enzym:n-acetyltransferáza kofaktor: acetyl-coa výskyt: v cytoplazmě mnoha tkání (játra, GIT, ledviny, plíce) polymorfismus: rychlí a pomalí acetylátoři izoniazidu aromatické aminy, hydraziny

44 Metylace méně častá reakce enzym: metyltransferáza výskyt:v cytoplasmě nebo ER mnoha orgánů kofaktor: (donormetylu) S-adenosylmethionin různé typy metyl transferáz různé metabolity jediná reakce kdy dochází ke zvýšení lipofility sloučenin

45 Konjugace s glutathionem aromatické sloučeniny (naftalen) jsou vylučovány ve formě derivátů N-acetylcysteinu kyselina merkapturonová. důležitá pro detoxifikaci polutantů životního prostředí a chemických karcinogenů kofaktor: tripeptid glutathion substráty: epoxidy, alkyl a arylhalogenidy,.. enzym: glutathiontransferáza

46 Konjugace s aminokyselinami nejčastější je glycin (taurine,glutamine) konjugace mnoha strukturně odlišných kyselin (aspirin) enzym: vlastní konjugace s aminokyselinami: N- acyltransferáza

47 Faktory ovlivňující metabolismus Věk Pohlaví Farmakogenetické aspekty Intestinální mikroflóra Potrava Patologické stavy Současné podání více léčiv Mezidruhové rozdíly

48 Věk novorozenci mají výrazně nižší aktivitu než dospělí jedinci ve stáří opět aktivita pozvolna klesá. snížený jaterní průtok krve u starších jedinců snížení jaterní biotransformace

49 Pohlaví androgeny - stimulující efekt převážně u experimentálních zvířat (kastrace, sexuální dospívání) - nevýznamné u lidí. Vliv dalších hormonů: kortikosteroidy, tyroxin, insulin aktivace metabolismu xenobiotik

50 Farmakogenetické aspekty N-acetyltransferáza: N-acetylace -rychlí a pomalí acetylátoři isoniazidu (Skandinávci x Asiaté) pseudocholinesteráza sukcinylcholin SNP různých izoforem P450 (CYP2D6, 2C19 )

51 Rozdíly v: Mezidruhové rozdíly rychlosti metabolismu produkovaných metabolitech poměru produkovaných metabolitů

52 Nemoci Nemoci jater: hepatitidy (virové, lékové), rakovina, cirhóza (alkoholová, biliární), hemochromatóza, intoxikace hepatotoxickými látkami pokles aktivity P450, snížení konjugační přeměny, snížení jaterní eliminace (některá léčiva - velmi silná farmakologická odpověď organismu) Nemoci srdce: snížená perfúze jater nižší metabolismus léčiv závislých na průtoku Endokrinní poruchy: viz pohlavní a ostatní hormony

53 Intestinální mikroflóra přítomnost reduktáz biotransformace řady xenobiotik (azo-, nitro-redukce) β-glukuronidáza: štěpení glukuronidů enterohepatická cirkulace

54 Současné podávání více léčiv interakce léčiv: vzájemné působení mezi dvěma nebo více farmaky Léky s častými interakcemi mají některou z následujících vlastností: vysoká vazba na bílkoviny tyto léky lehce vytěsní jiné, u kterých se tak zvýší volná frakce stimulace metabolismu jiných léků indukcí mikrosomálních enzymů (cytochrom P450) inhibice metabolismu jiných léků ovlivnění renální clearance (diuretika, probenecid, aminoglykosidová antibiotika, látky ovlivňující ph v moči)

55 léky u kterých malá změna v dávce vyvolá relativně velkou změnu účinku (warfarin) léky s malým terapeutickým indexem léky, u kterých je terapeutická hladina jen o málo nižší než toxická hladina (antikoagulancia, antikonvulzíva, antihypertenzíva, digoxin, cytostatika a imunosupresíva)

56 Potrava nízký obsah tuků, proteinů, nadbytek sacharidů, nedostatek některých vitaminů, grapefruitová šťáva inhibice biotransformace grilované maso a uzené sýry, zelenina indukce biotransformace akutní konzumace alkoholu působí jako inhibitor chronická konzumace alkoholu působí jako induktor

57 Inhibice CYP450 = pokles rychlosti biotransformace jednoho léčiva v důsledku vazby jiného, současně podaného léčiva na stejný enzym Kompetitivní inhibice: kompetice o stejné aktivní místo enzymu Nekompetitivní inhibice: vazba na jiné místo enzym, konformační změny, znemožnění vazby substrátu do aktivního místa vyšší koncentrace mateřské látky a nízké koncentrace metabolitu, zpomalená eliminace léčiva prodloužení biologického poločasu

58 Indukce P450 zrychlený metabolismus induktoru i současně podaných léčiv lékové interakce induktoři léčivo - fenobarbital, fenytoin, rifampin další - alkohol,cigaretový kouř, zelenina, grilované maso Reversibilní děj!!

59 Mechanismus enzymové indukce regulace exprese daného genu (transkripční faktory, receptory) MECHANISMUS AKTIVACE TRANSKRIPCE vazba indukujícího léčiva na tzv. nukleární receptor komplex receptor + induktor je transportován do jádra vazba na specifický úsek (response element) regulační sekvence genu (promotor) zvýšení transkripce daného genu (indukce). zvýšená transkripce de novo syntéza enzymu Post-transkripční mechanismy mrna/protein stabilizace

60 Mechanismy enzymové indukce - některé induktory zvyšují aktivitu pouze jediného enzymu (isoformy) - většinou současně zvyšují aktivitu několika enzymů (transportérů) - mechanismus indukce u některých induktorů prozkoumán, u jiných je naznačen - změna aktivity má vliv na metabolismus endogenních a exogenních láte - modulací je pozměněna: intenzita, doba trváni účinku léčiva (změna plazmatických hladin)

61 Mechanismus enzymové indukce strukturní geny proteiny regulační geny molekuly regulující expresi dalších genů

62 Indukce regulace na několika úrovních: zprostředkovaná transkripčními faktory a nukleárními receptory, epigenetickaá regulace, regulace na úrovni stabilizace/degradace mrna, regulace na úrovni degradace proteinu proteosomu nejdůležitějším mechanismem genové regulace enzymu, transportéru je transkripční regulace prostřednictvím nukleárních receptorů

63 Nukleární receptory proteiny regulace navázání ligandu v cytoplasmě (často xenobiotikum) aktivace transkripční kaskády vazba na cílový gen v jádře často fenomem autoindukce transkripční regulace genové exprese enzymu hlavně prostřenictvím receptoru arylhydrokarbonového receptoru AHR pregnanového X receptoru PXR konstitutivního androstanového receptoru CAR glukokortikoidniho receptoru GR.

64 AhR receptor nejedná se o jaderný receptor!! člen rodiny PAS proteinů (obsahující PAS doménu) PAS: považovány ze proteiny podílející se na regulaci odpovědi organismu na rychlé změny v okolním prostředí tři domény (bhlh=basic helix/loop/helix, PAS, TAD=transaktivační doména)

65 AhR receptor transkripční faktor aktivován specifickými ligandy regulace exprese cílových genů neaktivní forma - v cytoplasmě v komplexu s Hsp90, XAP2, p23 vazba ligandu - translokace do jádra, uvolnění Hsp90 a XAP2. dimerizace s ARNT. Dohromady vazby na cílové regulační oblasti genu (XREs/DREs) XREs/DREs = xenobiotické/dioxinove responzivní elementy

66 AhR receptor ligandy AhR: toxické látky antropogenního původu (PCB,TCDD, PAH) látky přírodního původu (flavony) látky vznikající přímo v organismu obratlovců (tryptofan, kyselina arachidonová, bilirubin) regulované geny: CYP1, UGT, GST, chinonreduktasy regulace genů podílejících se na zásadních buněčných procesech (buněčná proliferace, diferenciace, apoptóza, mezibuněčná komunikace)

67 AhR Receptor

68 AhR receptor

69 PXR a CAR receptory nukleární orphan receptory: CAR (konstitutivní androstanový rec.) pro CYP2- fenobarbital PXR/SXR (steroidní xenobiotický rec.) pro CYP3Arifampicin nukleární receptory jsou aktivovány xenobiotiky heterodimer s Retinoid X Receptor (RXR) vazba na XRE zvýšená transkripce

70 PXR a CAR z rodiny transkripčních faktorů aktivovaných nízkomolekulárními látkami a jsou proto označovány jako nukleární receptory. spolu s CAR, PXR do této rodiny patří i receptor pro vitamin D (VDR), GR, estrogenní receptor (ER) PXR a CAR působí jako senzory toxických endogenních metabolitů a exogenních chemických látek

71 PXR a CAR PXR a CAR = sirotčí (orphan) nukleární receptory, protože u nich nebyl doposud identifikován fyziologický ligand, který by primárně vyvolal svoji fyziologickou funkci prostřednictvím PXR a CAR v těle je PXR ve velké míře v játrech, méně v tenkém a tlustém střevě, v žaludku a v ledvinách. tato lokalizace významně koreluje s expresi CYP3A4 a P-gp.

72 PXR a CAR PXR a CAR regulují celou řadu genů pro 1. a 2. fázi biotransformace a transportérů: viz tabulka k nejdůležitějším patří CYP3A4

73 Nukleární receptor PXR CYP1A2 CYP2B6 CYP2C9 CYP3A4/5 SULT2A1 UGT1A1, 3, 4 ABCB1 CYP3A7 CAR UGT1A1 CYP2C9,19 CYP3A4 CYP2B6 CYP2A6 ABCB1 GR CYP2C9 CYP2B6 CYP3A4, 5 ABCB1 PXR CAR

74 PXR aktivace PXR probíhá přímou vazbou ligandu na receptor následně tvorba dimeru s retinoidním X receptorem-α (RXRα) a společně rozpoznávají specifické sekvence promotorové oblasti DNA regulovaných cílových genů označované jako responzivní element PXR-RE (PXR response element).

75 PXR ligandy: látky z různých terapeutických skupin, některé toxiny, endogenní steroidy díky širokému spektru ligandů, množství regulovaných enzymu a transportérů je PXR považován za jeden z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících farmakokinetiku léčiv

76 PXR receptor

77 PXR receptor

78 CAR receptor kromě genů pro enzymy 1. a 2. fázi a transportéry řídí i transkripci důležitých genů podílejících se na metabolismu endogenních látek (bilirubin, žlučové kyseliny, hormony štítné žlázy, steroidní hormony, mastné kyseliny)

79 CAR receptor aktivace CAR dvěma způsoby: přímou aktivací nukleárního receptoru ligandem tj. vazbou ligandu na nukleární receptor (modelová látka CITCO) fenobarbital, fenytoin (nejznámější induktory kooperující s CAR receptorem) aktivují transkripci regulovaných genů prostřednictvím tohoto nukleárního receptoru nepřímo bez vazby na nukleární receptor

80 CAR receptor po translokaci komplexu CAR a koaktivátorů do jádra se komplex proteinů CAR a RXRα váže na CAR-RE v promotoru regulovaných genů transkripční aktivace pak probíhá podobně jako v případě PXR receptoru

81 CAR receptor

82 GR receptor převážně v cytoplasmě v komplexu s Hsp90s a imunofiliny po navázání ligandu oddělení Hsp90s, translokace do jádra a jako homodimer vazba na GRE responzivní elementy dané DNA GR ubikvitně ve všech typech buněk endogenní glukokortikoidy řídí glukózovou homeostázu, metabolismus tuků a proteinů, apoptózu, růst, chování, podílí se na imunitní odpovědi buněk řízením exprese mnoha genů pro cytokiny, chemokiny, transkripční faktory

83 GR receptor GR se podílí na transkripční regulaci cytochromů CYP2C9, CYP2B6, CYP3A4 a transportéru P- glykoproteinu. známý crosstalk nukleárních receptoru: AhR, CAR, PXR a GR glukokortikoidy reguluji vazbou na GR expresi těchto receptorů a tím modulují odpověď jejich ligandů

84 GR receptor

85 Metody studia metabolického profilu látky

86 Metody studia metabolického profilu látky In vivo studie na zvířatech In situ perfundované orgány Jaterní řezy In vitro buněčné modely (izolované hepatocyty suspenze, primární kultury, imortalizované buněčné linie, stabilně transfekované buněčné linie) In vitro subcelulární frakce (mikrozomy, S9, cytosol) In vitro rekombinantní xenobiotika metabolizující enzymy In silico nástroje

87 Morfologická stavba jater Základní morfologická jednotka jater - lalůček centrální žíly (lat. lobulus venae centralis) - šestiboký hranol tvořený hvězdicovitými trámci jaterních buněk uspořádaných kolem centrální žíly ve středu lalůčku mezi trámci - jaterní sinusoidy zvláštní typ krevních kapilár Uprostřed trámců žlučové kapiláry - prostory mezi hepatocyty, kam je produkována žluč

88 Hepatocyt

89 Perfundovaná játra Model nejbližší podmínkám in vivo Výhody: Zachovaná trojrozměrná architektura tkáně s mezibuněčnými kontakty Polarita hepatocytu apikální, bazální Tvorba a vylučování žluče (analýza) Metabolismus, jaterní uptake, biliární sekrece Nevýhody: Obtížná manipulace, náročnost, použitelnost několik hodin Nedostupné lidské vzorky

90

91 Jaterní řezy komplexní model in vitro zařízení umožňující nakrájet tkáň na um řezy (Krumdieckrův mikrotom) difuze živin k hepatocytům + zachování lobulární struktury látkou de Graaf IA, Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nat Protoc., 2010 Krumdieck Tissue Slicer - Model MD4000

92 Jaterní řezy Inkubace řezů v pufru nebo buněčném médiu s testovanou látkou Výhody: intaktní buňky Jednoduchá manipulace Redukce počtu zvířat Lidské vzorky (biopsie)

93 Izolace primárních hepatocytů

94 Izolované hepatocyty Hepatocyty izolovány z jater (potkan, člověk) Perfuze jater kolagenázou Izolované hepatocyty okamžitá inkubace s testovanou látkou nebo kryoprezervace nebo klutivace primární kultury intaktní buňky metabolické reakce fáze I + II Nevýhody: ztráta diferenciace hepatocytů na krevní a žlučový pól Lidské hepatocyty: primární kultury dostupné komerčně, interindividuální variabilita, indukce biotransformačních enzymů léky, potravou

95 Izolované hepatocyty Hepatocytární suspenze Méně nákladné Kulovitý tvar Pokles viability, použitelnost několik hodin (lze ovlivnit kultivačním médiem)

96 Primární kultury hepatocytů Kultivace v monolayeru Dediferenciace nutné zachovat mezibuněčné interakce, extracelulární matrix (kolagen) obnova polarity buňky Glukokortikoidy (dexametazon) a inzulin nezbytné pro udržení metabolických funkcí

97 Sendvičové kultivace hepatocytů Hepatocyty mezi 2 vrstvy kolagenového gelu zvýšení mezibuněčných kontaktů Kultivace až 4 týdny Buňky - polygonální tvar, tvorba žlučových kanálků Produkce albuminu, aktivita cytochromu P450

98 3D kultivace hepatocytů Matrigel mezibuněčná hmota z myšího Engelbreth- Holm-Swarmova sarkomu Polarita hepatocytů Funkční parametry produkce albuminu, udržení exprese a možnost indukce biotransformačních enzymů A kolagen B kolagenový gel C matrigel

99 Mnohobuněčné sféroidy Kultivace hepatocytů v porézních systémech porézní polyuretanová pěna Shluky buněk o velikosti 100 um počet mezibuněčných interakcí udržení polarity buněk Tight junctions

100 Subcelulární frakce Izolace ze zvířecích nebo lidských jater Studium metabolismu, predikce metaboického profilu látky, potenciální DDI (drug-drug interactions) Mikrosomy high-throughput metabolický screening

101 Jaterní mikrosomy Ultracentrifugace x g Mikrosomy obsahují biotransformační enzymy CYP, FMO, UDP-GT vázané na membránu Studium metabolismu prostřednictvím CYP Není buněčná membrána přímý přístup látky k metabolizujícím enzymům

102 Rekombinantní enzymy cdna specifického xenobiotika metabolizujícího enzymu se rekombinuje s expresním vektorem transfekce buněčné linie schopné produkce velkých množství humánních enzymů homogenizace, centrifugace, izolace mikrozomů nebo enzymů Purifikace Komerčně dostupné

103 Rekombinantní enzymy

104 Buněčné modely Imortalizované buněčné linie Imortalizace proces, při němž buňky získají neomezený proliferační potenciál znesmrtelnění Transformace chemická nebo virová Imortalizovaný fenotyp nádorové buňky, nádorové buněčné linie Somatické buňky, primární buněčné kultury po čase proliferačně inaktivní stádium senescence (stárnutí) HeLa buněčná linie Henrietta Lacks

105 Buněčné modely Schopné exprimovat velká množství specifických enzymů Možnost kultivace velkého množství Nemusí exprimovat všechny xenobiotika metabolizující enzymy HepG2 buněčná linie odvozená od hepatocelulárního karcinomu

106 Transfekované buněčné linie

107 Transfekované buněčné linie Transfekce vnesení plazmidové DNA do eukaryotní buňky Ovlivnění genové exprese studovaného proteinu

108 In vitro metabolismus Rychle metabolizovaní látka vícenásobné dávkování za den nebo kontinuální infuze pro dosažení požadované koncentrace v krvi Pomalu metabolizovaná látka může mít toxický efekt, pokud zůstává v krvi příliš dlouho Metabolická stabilita in vitro: Mikrosomální stabilita hepatocytární stabilita, S9 stabilita, metabolická stabilita detekovaná pomocí rekombinantních enzymů Metabolický profil látky Lékové interakce - DDI

109 Lékové interakce Inhibice a indukce xenobiotika metabolizujících enzymů = nebo metabolismu léčiva, pokud podány 2 a více léčiv současně Inhibice CYP - plazmatická hladina současně podané látky toxicita Indukce CYP - metabolismus současně podané látky terapeutický efekt nebo tvorba toxického metabolitu

110 Lékové interakce Identifikace enzymů (P450, UGT) metabolizujících látku pomocí rekombinantních enzymů Indukce P450 Inhibice P450 Aktivace PXR a AhR nukleárních receptorů UGTa1 inhibice

111 Identifikace enzymů (P450, UGT) metabolizujících látku Rekombinantní enzymy P450 mohou vykazovat polymorfismy ovlivnění plasmatických hladin důležité identifikovat v počátečních stádiích vývoje léku Identifikace enzymu zodpovědného za metabolismus identifikace potenciálních lékových interakcí

112 Indukce P450 CYP1A1, CYP2B6, CYP3A4 Rekombinantní enzymy nebo v hepatocytech ocols/technical%20bulletins/101/p450%20glo%20ass ays%20protocol.pdf

113 Inhibice P450 The Vivid screening assay A. The Vivid Substrate fluoreskuje po oxidaci P450 enzymem B. Výsledná fluorescence odráží stupeň inhibice P450 aktivity Discovery/Target-Based-ADME-Tox-Assays/p450-assays/P450-Metabolism- Assays.html

114 In vitro intrinsic clearance Intrinsic clearance schopnost enzymů metabolizovat léčivo, nezávislá na fyziologických faktorech jako průtok krve játry nebo vazba na bílkoviny Mikrosomální stabilita Asi 60% léčiv metabolizováno P450 Jaterní mikrosomy obsahují na membránu vázané metabolizující enzymy Referenční substrát kontrola aktivity enzymů

115 In vitro intrinsic clearance S9 stabilita S9 frakce - microsomy a cytosol Enzymy fáze I a fáze II Možnost použití suplementů s kofaktory metabolické dráhy fáze II

116 In vitro intrinsic clearance Hepatocyty všechny xenobiotika metabolizující enzymy (fáze I, fáze II) obsaženy v intaktní buňce Profil metabolitů tvořených jak enzymy fáze I, tak fáze II

117 Aktivace PXR, CAR a AhR Aktivace nukleárního receptoru transkripce genu P450 Indukce P450 pregnane X receptor (PXR) CYP3A4 aryl hydrocarbon receptor (AhR) CYP1A1 constitutive androstane receptor (CAR) CYP2B6

118 Gene reporter assay Široké využití - studium genové exprese, buněčné fyzilogie, receptorové aktivity, transkripčních faktorů, inracelulární signalizace Vnesení plazmidové DNA do buňky Reportérový vektor - promotor studovaného genu (CYP)+ strukturní gen reportéru = luciferáza Transkripční faktor nukleární receptor Látka indukující expresi studovaného CYPu transkripce translace reportérového genu (luciferáza) + substrát luciferin chemiluminiscence detekce

119 Gene reporter assay

120 High-throughput screening

121 Děkuji za pozornost