Obranné mechanismy rostlin v interakcích hostitel-patogen

Transkript

1 Obranné mechanismy rostlin v interakcích hostitel-patogen Aleš Lebeda Michaela Sedlářová Katedra botaniky Přírodovědecká fakulta Univerzita Palackého Šlechtitelů 11, Olomouc-Holice

2 Struktura přednášky 1. Rostlinné patosystémy 2. Infekční cyklus 3. Životní strategie patogenních hub 4. Obranné mechanismy 5. Základní kompatibilita resp. inkompatibilita 6. Teorie gen-proti-genu, rozdělení R-genů 7. Modelový patosystém Lactuca spp. -Bremia lactucae 7.1. Mechanismy rezistence u Lactuca spp Životní cyklus a infekční struktury Bremia lactucae 7.3. Vliv faktorů prostředí na vývoj patogenu 7.4. Kvalitativní a kvantitativní aspekty tvorby infekčních struktur B. lactucae 7.5. Šlechtění na rezistenci vůči plísni salátové 7.6. Nevratné poškození membrán 7.7. Oxidativní stres AOS, antioxidační enzymy 7.8. Fenolické látky v obranných procesech 7.9. Vliv patogenu na cytoskelet hostitele Hypersenzitivní reakce Cytokininy a reprodukce patogenu 8. Souhrn 9. Poděkování

3

4 Trojúhelník a čtyřúhelník choroby

5

6

7 Fáze a subfáze infekčního cyklu Kůdela et al., 1989

8 Posloupnost procesů během infekce a jejich terminologie Kůdela et al., 1989

9 Životní strategie patogenních hub (lze vymezit fakultativní a obligátní formy) Biotrofní Hemibiotrofní Nekrotrofní -napadají živé buňky -invaginace plazmatické membrány -rovnováha s hostitelem -speciální forma parazitismu - během životního cyklu bio-, nekro-, saprotrofní fáze -dlouhou dobu nedochází k narušení buněčné stěny -saprofáze redukována -napadají a rychle usmrcují živé buňky enzymy, toxiny -narušení BS, protoplastu, metabolismu -mohou existovat jako saprotrofové Fusarium Exobasidium vaccinii Phytophthora infestans

10 Způsoby penetrace - chemická (enzymatická) - mechanická přímá = přes buněčnou stěnu nepřímá -poranění -přirozené otvory: stomata, lenticely, hydatody, nektária Magnaporthe Bremia Uromyces viciae-fabae

11 Vlivy patogenu resp. infekce na buňku stimulativní (obligátní biotrofní parazité v počátečních fázích svého vývoje: podpora růstu, zvýšení počtu organel) green islands - typické před. pro biotrofní bakterie, viry (nerovnováha kinetinu) Hordeum vulgare - Blumeria graminis degenerativní (nekrotrofní a v pozdních fázích i někteří obligátní biotrofní parazité: narušení cytoskeletu, organel, membrán) Beta vulgaris Fusarium oxysporum nárůst počtu mitochondrií a ribozómů nutné zvýšení syntézy proteinů, intenzivnější respirace respirace + oxidační procesy + degradace látek uvolnění chemické energie na pokrytí biosyntéz Životaschopnost rostlinné buňky závisí na: -fungující vakuole -intaktním vezikulárním transportu Katedra botaniky a Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci

12 Obranné mechanismy rostlin -pasivní (strukturní) fyzikální bariery proti průniku patogenu preformované: buněčná stěna, vosky, kutikula, fenolické látky indukované: lignifikace, suberinizace, depozice kalózy -aktivní (fyziologické, biochemické) produkce látek toxických pro patogen sekundární metabolity (specifické podle hostitele a patogenu): alkaloidy, saponiny, antokyany, fenoly, taniny, melaniny, aromatické AK proteiny extenziny (bohaté na hydroxyprolin) PR-proteiny (glukanasy, chitinasy, peroxidasy)

13 Schéma konceptu základní inkompatibility a základní kompatibility (Lebeda, 1984) Rostlina - mikroorganismus Preformované obranné mechanismy; iniciace obecných obranných reakcí Základní inkompatibilita (interakce nehostitel-nepatogen) Obecné obranné mechanismy neúčinné Základní kompatibilita (hostitel-patogen) Obecné metabolické a genetické obranné mechanismy Vysoce specifické metabolické a genetické adaptace hostitele Specifický komplex metabolických a genetických obranných mechanismů Nespecifická inkompatibilita -kompatibilita Specificky diferencovaná inkompatibilita -kompatibilita Specificky nediferencovaná inkompatibilita -kompatibilita

14 Odezva na infekci a případný rozvoj či potlačení projevů choroby primárně závisí na genetické výbavě obou partnerů Teorie gen-proti-genu (Flor, 1946 resp. 1947) -geny rezistence (u hostitelské rostliny) resp. avirulence (u patogenu) kódují proteiny důležité pro rozpoznání (buněčné receptory resp. molekuly elicitorů) -platnost tohoto předpokladu byla potvrzena později klonováním genů avirulence různých patogenů (Keen, 1990) Model koevoluce hostitele a patogenu

15 Klasifikace R-genů podle struktury a funkce (Tör et al., 2003)

16 Specifita interakcí rostlina-patogen je různorodý a komplikovaný fenomén Interakce Lactuca spp. - Bremia lactucae L. sativa, plané druhy rodu Lactuca a některých příbuzných rodů jsou charakterizovány rasově specifickou (RS), rasově nespecifickou (RNS) a polní rezistencí (FR) Z Lactuca spp., blízce příbuzných L. sativa, je pouze u L. saligna předpokládána nehostitelská rezistence (NR) -faktory nejsou příliš dobře známy -nehostitelská rezistence není primárně asociována s HR Variabilita mechanismů rasové specificity je podmíněna variabilitou genů kódujících -epikutikulární vosky -enzymy -cytoskelet -IMD -HR -fenoly Výsledkem je rozdílné načasování potlačení růstu houby Na rasově nespecifické a polní rezistenci se podílí řada mechanismů -roli hraje i ontogenetický stupeň vývoje a podmínky prostředí

17 Možné mechanismy rezistence L. sativa a planých Lactuca spp. vůči Bremia lactucae (Lebeda et al., 2000) Section/subsection Response to B. lactucae from Possible resistance Lactuca spp. L. sativa L. serriola mechanisms Lactuca Lactuca L. aculeata +/ +/ RS L. altaica +/ +/ RS L. dregeana +/ +/ RS L. livida + + RS? L. saligna +/ ( ) RS, NR? L. sativa +/ +/ RS, FR L. serriola +/ +/ RS, RNS, FR L. virosa +/ +/ RS, FR Cyanicae L. perennis +/ RS L. tenerrima +/ +/ RS

18 Možné mechanismy rezistence L. sativa a planých Lactuca spp. vůči Bremia lactucae (Lebeda et al., 2000) Section Response to B. lactucae from Possible resistance Lactuca spp. L. sativa L. serriola mechanisms Phaenixopus L. viminea +/ ( ) RS Mulgedium L. taraxacifolia + *? L. tatarica +/ ( )/ RS Lactucopsis L. aurea *? L. quercina +/ * RS Tuberosae L. indica +/ RS Micranthae L. undulata *? African group L. capensis *? L.homblei? North American group L. biennis ( )?

19 Vliv teploty na efektivitu některých genů rezistence (Dm genů) u Lactuca sativa a L. serriola vůči Bremia lactucae (modifikováno podle Judelson a Michelmore, 1992) Lactuca spp. Temperature/reaction type B. lactucae cultivar/accession Dm gene 5 o C 10 o C 15 o C 22 o C isolate (race) L. sativa Capitan Dm11 + -* - - Avr11: CG1, SF avr11: CS9, CS12 Fila Dm11 + -* - - Avr11: SF5 Empire Dm13 -* Avr13: CS avr13: CS9 UCDM14 Dm Avr14: CG avr14: CS9, CS12 L. serriola PIVT 1309 Dm15 +** Avr15: CS avr15: CS9, SF3 LSE/18 Dm16 + +** +** - Avr16: CS9, SF avr16: CS12 LSE/57/15 Dm Avr7: SF5 Hilde x L. serriola Dm11 + -* - - Avr11: CG1, SF5 -= incompatible reaction * = visible necrosis without sporulation + = compatible reaction (profuse sporulation) ** = sparse sporulation

20 Po kontaktu parazitické/patogenní houby s rostlinou se odehrává kaskáda jevů depozice spor klíčení tvorba primárních a sekundárních inf. struktur penetrace kolonizace infikovaných rostlinných pletiv specifické reakce na dané infekční agens proces rozpoznání (recognition) Hodnocení jevů: Kvalitativně Semikvantitativně Kvantitativně (Lebeda, 1988b)

21

22 Infekční struktury patogenu Vývoj Bremia lactucae v pletivu kompatibilní hostitelské rostliny

23 Načasování fází infekce a tvorby infekčních struktur Bremia lactucae u náchylných genotypů salátu (Sargent et al., 1973) Hodiny po inokulaci (hpi) Stadium vývoje patogenu 0 Inokulace 1-2 Klíčení konidie 2-3 Růst klíčního vlákna a tvorba apresoria 3-4 Penetrace a vývoj primárního vezikulu 4-13 Zvětšování sekundárního vezikulu 13 a později První dělení jader, invaze do okolních buněk a pletiv haustorii a intracelulárními hyfami

24 Vliv stáří semenáčků Lactuca spp. na klíčení Bremia lactucae (Dickinson a Crute, 1974) Relativní intenzita sporulace (%) 100% 80% 60% 40% 20% 0% 3 týdny 4 týdny 5 týdnů 6 týdnů Dny po inokulaci

25 Vliv teploty na klíčení Bremia lactucae (Sargent, 1976) 100 Klíčení (%) Teplota ( C)

26 Vliv teploty na penetraci semenáčků L. sativa (cv. Avondefiance) konidiemi Bremia lactucae (Maclean and Tommerup, 1979) Počet penetrací /25 um Teplota ( C) W2(N) W5

27 Vliv ontogenetického stáří hostitele: rozdíly v parametrech vývoje Bremia lactucae (rasa NL 15) 6 h po inokulaci (modif. podle Lebeda a Reinink, 1991) klíčení Great Lakes = RSR Iceberg = high level of FR Cotyledons Leaf disc Great Lakes Iceberg délka klíčních vláken 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% Incidence of germination tvorba apresorií Cotyledons Leaf disc Great Lakes Iceberg Cotyledons Leaf disc Great Lakes Iceberg Length of germ tube (um) 0% 20% 40% 60% 80% 100% Incidence of appressorium formation

28 Kvalitativní a kvantitativní aspekty tvorby infekčních struktur Bremia lactucae

29 Diversity in formation of Bremia lactucae infection structures in L. sativa and wild Lactuca spp. genotypes representing nonhost and host-parasite interactions and different types of resistance mechanisms resp. (compiled according to Lebeda and Reinink (1991, 1994); Lebeda et al., 2000, Lebeda et al., 2004) Interaction Type of resistance Lactuca spp. (cultivar/accession) Response to B. lactucae / Sporulation intensity (%) Relative frequency of occurrence and size of infection structures (48 hpi) PV/D SV HY/L HA (14 dpi)/ Nonhost resistance L. saligna (LSA/6) /0 1/ Host resistance /susceptibility Race specific Cobham Green + /100 4/ /174 4 Dandie + /100 4/ /156 1 Valmaine /0 4/ /18 0 L. saligna (CGN 5147) /0 3/ /38 0 L. serriola (PIVT 1168) /0 2/ /18 0 L. virosa (LVIR/57/1) ( ) /2 3/ /42 1 Race nonspecific L. serriola (PI ) ( )/21 4/ /82 2 Field resistance Iceberg + /75 3/ /102 1 Inoculation: races CS9 and NL5; Intensity of sporulation (0-100); Relative frequency (0-4) and size of infection structures: PV/D = primary vesicle / diameter (μm), SV = secondary vesicle, HY / L = intercellular hyphae / length (μm ), HA = haustoria formation

30 Diversity in phenotypic and microscopic plant tissue (epidermal and subepidermal cells) response to B.lactucae of L. sativa and wild Lactuca spp. genotypes representing nonhost and host-parasite interactions and different types of resistance mechanisms resp. (compiled according to Lebeda and Reinink (1991, 1994); Lebeda et al., 2000, Lebeda et al., 2004) Interaction Type of resistance Lactuca spp. (cultivar/accession) Phenotypic expression of response to B. lactucae (14 dpi) Degree of tissue response (48 hpi) HR NNC SEN DSEN Nonhost resistance L. saligna (LSA/6) Host resistance /susceptibility Race specific Cobham Green Dandie Valmaine L. saligna (CGN 5147) L. serriola (PIVT 1168) L. virosa (LVIR/57/1) N, SE, SS Race nonspecific L. serriola (PI ) N, SE Field resistance Iceberg N = necrotic response, SE = sporulation only along the leaf dics cut surface, SS = sparse sporulation on the disc surface; HR = hypersensitive response (number of necrotic cells/infection site), NNC = mean number of necrotic epidermal cells per infection site with a necrotic response, SEN = subepidermal necrosis, DSEN = degree of SEN (0-3) Inoculation: races CS9 and NL5

31

32 Šlechtění salátu na rezistenci vůči plísni salátové (B. lactucae) LIBUSA

33 Fyziologické změny působené patogeny 1/ Permeabilita napadených buněk (membrány, strukturní změny BS) 2/ Metabolismus vody vnapadených rostlinách 3/ Minerální výživa (absorpce, transport) 4/ Fotosyntéza (obsah, funkce pigmentů) 5/ Respirace (zvýšená intenzita; enzymy glykolýzy) 6/ Oxidativní stres (aktivní formy kyslíku, antioxidační enzymy) 7/ Syntéza proteinů (PR-proteiny, enzymy) na úkor zásobních látek 8/ Metabolismus fenolických látek (akumulace) 9/ Fytohormony (obsah a zastoupení aktivních/neaktivních forem)

34 Rozdíly v načasování nevratného poškození membrán (IMD) determinovaných různými geny rezistence vůči plísni salátové (podle Mansfield et al., 1997)

35 Aktivní formy kyslíku singletový kyslík ( 1 O 2 ),superoxid (O - 2), peroxid vodíku (H 2 O 2 ), hydroxylový radikál (OH - ) Místa vzniku: chloroplasty, mitochondrie, membrány peroxisomů, glyoxysomů, mikrozomů Účinky -negativní: peroxidace lipidů, poškození struktury proteinů (enzymů), NK, lipidů - pozitivní: signalizace, genová regulace HOSTITEL Přímé antimikrobiální účinky Signální molekula v regulaci aktivity genů zodpovědných za syntézu -PR-proteinů -fenolických látek -fytoalexinů Zesíťování prekurzorů polyfenolických látek lignifikace BS HR PATOGEN Signalizace rozpoznání v inkompatibilních interakcích? Penetrace? štěpení komponent buněčné stěny, membrán

36 Spektrofotometrické stanovení aktivity katalasy (E.C ) (nkat/1g) L. sativa UCDM2 L. sativa Mariska L. serriola LSE/18 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Katalasa - L. sativa UCDM 2 0hai 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai Katalasa - L. sativa Mariska 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0hai 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai Katalasa - L. serriola LSE/18 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0hai 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai náchylný rezistentní náchylný L. serriola PIVT1309 L. saligna CGN L. virosa NVRS Katalasa - L. serriola PIVT 1309 Katalasa - L. saligna CGN Katalasa - L. virosa NVRS ,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0hai 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0hai 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0hai 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai rezistentní rezistentní silně rezistentní Kontrola Infikovaná rostlina

37 Histochemická lokalizace POX Cévní svazky Lokalizace v penetrované buňce Spektrofotometrické stanovení aktivity g-pox (EC ) L. sativa UCDM2 L. sativa Mariska L. virosa NVRS POX - L.sativa UCDM2 POX - L.sativa Mariska POX- L. virosa NVRS ,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0, ,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0, ,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0, náchylný rezistentní silně rezistentní Kontrola Infikovaná rostlina

38 Izoenzymy SOD (E.C ) -aktivita SOD nebyla zaznamenána -superoxid nebyl histochemicky detekován -v izoenzymovém spektru nebyly pozorovány změny po infekci B. lactucae L. virosa NVRS hai 12hai 24hai 48hai L. saligna CGN K i K i K i K i

39 Histochemická lokalizace H 2 O 2 Periplazmatický prostor Během penetrace patogenu Větší rozsah v pozdějších fázích Spektrofotometrické stanovení obsahu H 2 O 2 L. sativa UCDM2 L. sativa Mariska L. virosa NVRS c H2O2 - L.sativa UCDM2 c H2O2 - L. sativa Mariska c H2O2 - L. virosa H c H2O2/1g 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai Hai c H 2O 2/1g 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai Hai Hai c H 2O 2/1g 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai náchylný rezistentní silně rezistentní

40 Fenolické látky Autofluorescence fenolů v infikované buňce -obecně inhibitory enzymů -jejich tvorba v rostlině indukována poraněním, infekcí -přítomny u rezistentních i náchylných genotypů, liší se kvalitativně a kvantitativně -antibiotické účinky -strukturní polymery - zesílení buněčné stěny, lignituber v místě penetrace -irreversible membrane damage (IMD) -autofluorescentní fenoly - de novo syntéza během HR

41 Fenolické látky histochemická detekce Detekované látky Lactuca spp. genotypy Reakce s NL16 Fenoly Taniny Lignin Kalóza L. sativa Cobham Green kompatibilní -/ Mariska inkompatibilní L. serriola LSE/18 kompatibilní L. saligna CGN inkompatibilní L. virosa NVRS inkompatibilní +++* STUPNICE: - žádný signál + slabá exprese v hostitelských buňkách ++ středně silný signál +++ silná akumulace * = reakce kromě penetrované buňky i ve 2-3 okolních Lokalizace místo penetrace periplazmatický prostor invaginovaná plazmalema okolo haustorií

42 Cytoskelet imunohistochemická detekce MT basket L. serriola LSE/18 24hai L. sativa UCDM2 MT patches HR 48hai L. serriola PIVT hai L. sativa Mariska

43 Změny mikrotubulárního cytoskeletu epidermálních buněk Lactuca spp. inkompatibilních resp. kompatibilních s Bremia lactucae vzhledem ke stadiu infekce (Sedlářová, Lebeda a Binarová, 1999) Tvorba apresoria a penetrace Inkompatibilní interakce - agregace MT pod apresoriem - tvorba MT cables v penetrovaných buňkách Kompatibilní interakce - žádné detekovatelné změny Tvorba primárního a sekundárního vezikulu Proces HR a nekróza epidermálních buněk - tvorba MT basket kolem vezikulů - tvorba MT basket kolem vezikulů - tvorba patches (signál ve formě lokálních shluků) - depolymerizace MT v celé buňce - autofluorescence fenolů

44 HR histochemická detekce penetrace L. serriola PIVT hai-laktoglycerol-wu

45 HR histochemická detekce L. virosa H hai-chloralhydrát rezistentní

46 Vliv koncentrace exogenně aplikovaných cytokininů na časový průběh sporulace B. lactucae c(ck)=10-5 M c(ck)=10-4 M L. serriola LSE/18 L.serriola LSE/18 intenzita sporulace (%) den 9.den 13.den mt-p mt-0 MeOR-P MeOR-0 DMSO H2O LSE/18 intenzita sporulace (%) 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 5.den 7.den 9.den 11.den mt-p mt-0 MeOR-P MeOR-0 DMSO H2O L. sativa Cobham Green 80,0 mt meta-topolin MeOR metoxybenzylaminopurin-ribosid DMSO - dimetylsulfoxid CG intenzita sporulace (%)) 60,0 40,0 20,0 mt-p mt-0 MeOR-P MeOR-0 DMSO H2O 0,0 5.den 7.den 9.den 11.den

47 Vliv exogenní aplikace cytokininů na intenzitu sporulace B. lactucae Výsledky Bonferoniho testu mnohonásobných porovnávání výnosu spor, 14dai L. sativa Cobham Green L. serriola LSE/ Pocet spor Výnos spor DMSO MeOR mt voda 0.0 DMSO MeOR mt voda

48 Infekce Předpokládaný Produkce sled genotypově-specifických procesů vedoucích elicitorů k -signalizace obranné reakci buňky po napadení biotrofním patogenem Primární rozpoznání Aktivace odpovědi De novo syntéza proteinů v penetrovaných buňkách IMD a uvolňování fenolických látek Uvolnění endogenních elicitorů Akumulace fenolů vázaných s BS Sekundární signalizace Sekundární rozpoznání Transkripce mrna kontrolujících biosyntézu ligninových prekurzorů v okolních buňkách Depozice ligninu v místě a okolí infekce Hypersenzitivní reakce, rozpad jádra Oxidativní procesy Depozice strukturních látek zesilujících buněčné stěny Kyselina benzoová, salicylová, jasmonová, etylen PR proteiny a další proteiny spojené s obranou Lypoxygenázy Fytoalexiny

49 Obranné mechanismy hostitele vyvolané infekcí patogenu je možno studovat hierarchicky na řadě úrovní biologické organizace: Organismus Orgán Pletivo Buňka Fyziologické procesy Molekulární struktura Všechny tyto úrovně se více či méně podílejí na výsledném projevu interakce, přičemž jedna úroveň projevu velmi úzce souvisí s další, vzájemně na sebe navazují a podmiňují se.

50 Poděkování P. Binarová (UEB AV ČR Olomouc) - cytoskelet L. Luhová (K.biochemie PřF UP Olomouc) - AOS M. Výtisková (studentka) - CK, M. Duchoslav (KB PřF UP Olomouc) - statistika MSM Stresová a patologická biologie, biochemie a bioenergetika rostlin GAČR 522/02/D011 Cytologické a biochemické aspekty interakcí rostlin a patogenů (model Lactuca spp.-bremia lactucae) MZe ČR 75/2004 Národní program využití genofondu mikrooganismů a drobných živočichů a mnoho dalších

51 Pro cestu do neznáma jsou pochybnosti a diskuse nezbytné. Jestliže chceme vyřešit problém, jaký se nám ještě nikdy vyřešit nepodařilo, musíme ponechat dveře do neznáma pootevřené. (R. Feynman)