Ověření technologie hormonální synchronizace umělého výtěru jikernaček lososovitých ryb

Transkript

1 TECHNICKÁ ZPRÁVA PILOTNÍHO PROJEKTU Název pilotního projektu: Ověření technologie hormonální synchronizace umělého výtěru jikernaček lososovitých ryb Registrační číslo pilotního projektu: CZ.1.25/3.4.00/

2 Příjemce dotace: Název nebo obchodní jméno: RYBÁŘSTVÍ LITOMYŠL s.r.o. Adresa: Sokolovská 121, Litomyšl IČ: Registrační číslo pp: CZ.1.25/3.4.00/ Název pilotního projektu: Ověření technologie hormonální synchronizace umělého výtěru jikernaček lososovitých ryb Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna příjemce dotace zastupovat: Ing. Oldřich Holcman Vědecký subjekt: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, Vodňany IČ: Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna vědecký subjekt zastupovat: prof. RNDr. Tomáš Polívka, Ph.D. Zpracovatel technické zprávy pilotního projektu: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, Vodňany IČ: Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, Jména a příjmení osob, které zpracovaly technickou zprávu: Ing. Viktor William Švinger Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna zpracovatele technické zprávy zastupovat: prof. RNDr. Tomáš Polívka, Ph.D. 2

3 Souhlas s publikací technické zprávy: Souhlasím se zveřejněním této technické zprávy pilotního projektu v rámci opatření 3.4. Pilotní projekty z Operačního programu Rybářství na internetových stránkách Ministerstva zemědělství a s využíváním výsledků této technické zprávy všemi subjekty z odvětví rybářství. Podpis osoby oprávněné zastupovat: 1. Příjemce dotace: Ing. Oldřich Holcman 2. Partnera projektu (vědecký subjekt): prof. RNDr. Tomáš Polívka, Ph.D. 3. Zpracovatele technické zprávy: prof. RNDr. Tomáš Polívka, Ph.D. 3

4 Obsah: 1. CÍL Co je cílem pilotního projektu V čem tkví inovativnost testované technologie Proč je nutná inovace, která je předmětem testování ÚVOD MATERIÁL A METODIKA Generační hejna a hormonální přípravky Použité experimentální designy Kontrola kvality jiker Kontrola zdravotního stavu ryb Statistické vyhodnocení VÝSLEDKY A ZÁVĚRY Pstruh duhový Indukce synchronizované ovulace Kvalita jiker Povýtěrová mortalita a stav generačních ryb Siven americký Indukce synchronizované ovulace Kvalita jiker Povýtěrová mortalita a stav generačních ryb Teplota, kyslík a vodní prostředí ZÁVĚR Pstruh duhový Siven americký PŘÍLOHY

5 1. Cíl 1.1. Co je cílem pilotního projektu Cílem projektu je ověření využití technologií hormonální kontroly reprodukce hospodářsky významných lososovitých ryb v podmínkách českého pstruhařství V čem tkví inovativnost testované technologie Bude ověřeno, zda je výhodné provádět hormonální stimulaci jikernaček lososovitých ryb s cílem dosažení synchronizace termínu ovulace a umělého výtěru. Inovativnost spočívá v ověření a evaluaci těchto postupů v umělém rozmnožování lososovitých ryb v podmínkách ČR. Výsledek by měl prokázat lepší organizaci práce, snížení pracnosti při umělém výtěru a tím zvýšení konkurenceschopnosti našich podniků a lepší vyhovění poptávce Proč je nutná inovace, která je předmětem testování V ČR se v současné době v chovu lososovitých ryb používají klasické metody umělé reprodukce, bez indukce a synchronizace ovulace pomocí hormonálních přípravků. Podstatou řešení projektu je ověření možnosti hormonálně indukované ovulace jikernaček ve výrazně užším časovém rozpětí. Dosavadní postup, založený na opakovaném, každotýdenní kontrole (tzv. přebírání ) generačních ryb po dobu 1-2 měsíce (podle druhu ryb) a selektování ovulujících jikernaček (značná spotřeba lidské práce, stresování a riziko poškození generačních ryb) bude při použití nové metody nahrazeno jen třemi manipulacemi s generačními rybami. Výsledky projektu by měly přispět ke zhodnocení získaných vědeckých poznatků v souvislosti s inovačními technologiemi v umělé reprodukci lososovitých ryb, podobně jako je tomu již několik desítek let u dalších skupin druhů ryb, jež jsou předmětem rybniční akvakultury (kapr, amur, tolstolobici, lín, sumec) a v poslední době i u dalších (reofilní kaprovité druhy ryb, či nové objekty intenzivní akvakultury, jakými jsou candát, okoun a keříčkovec červenolemý). Realizace projektu přispěje ke snížení pracnosti, lepší organizaci práce a lepšímu využití kapacit rybích líhní. To by mělo přispět ke zvýšení konkurenceschopnosti českého chovu lososovitých ryb. 5

6 2. Úvod I přes řadu úspěšných pokusů s hormonální synchronizací ovulace u lososovitých ryb (Crim et al., 1983a; Crim et al., 1983b; Crim and Glebe, 1984; Breton et al., 1990; Mylonas et al. 1993; Goren et al., 1995; Gillet et al., 1996; Haffray et al., 2005; Park et al., 2007, Kouřil et al., 2010) realizovaných v zahraničí, nejsou prozatím tyto postupy (ale ani jiné, založené např. na úpravě světelného režimu s cílem úpravy termínu ovulace) v chovech lososovitých ryb v ČR vůbec využívány. Výjimkou u této skupiny ryb jsou snad jen převážně pozitivní experimentální výsledky s hormonální stimulací a synchronizací ovulace u lipana podhorního (Kouřil a Barth al., 1989, Kouřil et al. 1987a, b, c, Randák et al., 2009). Na rybích líhních však není tento postup doposud využíván. Možnost využití syntetických neuropeptididů, funkčních analogů spouštěcího hormonu gonadotropinu GnRH-A (Gonadotropin Hormone Releasing Hormone-Analogue), i indukci, resp. synchronizaci ovulace jikernaček ryb je v akvakultuře známa již více než 35 let. V principu se jedná se o metodu hormonální indukce ovulace třetí generace u mnoha druhů ryb včetně salmonidů. Ve srovnání s dřívějšími metodami s sebou přinesla řadu nesporných výhod a ve vývoji hormonálních terapií znamenala významný krok vpřed. Nutné je poznamenat, že trendem hormonální terapie posledních let bylo a doposud je upřednostňování právě syntetických analogů GnRH-A a odklon od starších metod, jako je hypofyzace či nasazení lidských choriogonadotropinů (hcg - human Chorio Gonadotropin). V Evropské Unii navíc existuje pouze jediný pro akvakulturu legalizovaný přípravek obsahující GnRH-A azagly-nafarelin Gonazon (Intervet International bv, The Netherlands), i když se na trhu nacházejí i jiné přípravky (Ovaplant, Supergestran, Dagin aj.), které mohou být i více efektivní a to především z hlediska rychlosti uvolňování účinného peptidu GnRH-A. Hormonální zásah může v rozmnožování ryb sloužit k částečně rozdílným účelům. To je závislé především na čeledi ryb, u které má být hormonální zásah proveden. Generační ryby chované v zajetí mohou z hlediska reprodukce na diametrálně změněné podmínky oproti přirozenému prostředí reagovat tzv. reprodukčními dysfunkcemi vyznačující se různým stupněm závažnosti. Nejtěžší forma reprodukční dysfunkce se bezpochyby vyskytuje například u úhoře říčního (Anguilla anguilla), kde zatím ještě nebyl nalezen dostatečně funkční způsob jejího odstranění, přestože je tomuto problému již delší dobu v několika evropských zemích věnována značná pozornost. Reprodukční dysfunkce střední závažnosti je typická například pro čeleď kaprovitých (Cyprinidae). Generační 6

7 ryby prodělají vitelogenezi, nejsou ale schopny adekvátně dokončit finální dozrání oocytů (Mylonas a Zohar, 2007). Hormonální terapie v tomto případě slouží k finálnímu dozrání a dosažení ovulace, aby bylo následně možno, zpravidla pomocí umělého výtěru, od jikernaček získat jikry. Naproti tomu lososovité ryby (Salmonidae) chované v zajetí prodělají vitelogenezi i finální dozrání oocytů, avšak jikry nejsou synchronně ovulovány a uvolněny z tělní dutiny a musí následovat opakovaná kontrola a umělý výtěr. Jedná se tedy o nejlehčí formu reprodukční dysfunkce (Mylonas et al., 2010). Nicméně salmonidi se mohou vyznačovat z mnoha různých důvodů značně asynchronním dozráváním a výtěrová sezóna se tím může prodloužit do období dlouhého 1,5 měsíce či více (Breton et al., 1990). Po toto období musí být jikernačky na ovulaci kontrolovány alespoň jedenkrát týdně, protože vlastní zralost jiker tzn. čas ideální výtěrové zralosti jikernaček trvá u salmonidů pouze 7 dní (Schmidt, 1998). Zde tedy hormonální zásah slouží k synchronizaci výtěrů do období týdne či dokonce několika dní. To významným způsobem snižuje manipulaci a stres generačních ryb, zefektivňuje plánování výtěrových prací na líhních, snižuje náklady a riziko spojené s dlouhým obdobím odchovu jikernaček ve výtěrové sezóně, přispívá ke zvýšení kvality a kvantity získaných jiker a umožňuje výtěr jikernaček salmonidů i v environmentálně (především teplotně) změněných podmínkách. Literatura: Breton, B., Weil, C., Sambroni, E., Zohar, Y Effects of acute versus sustained administration of GnRH on GtH release and ovulation in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 91: Crim, L.W., Evans, D.M., Vickery, B.H. 1983a. Manipulation of the seasonal reproductive cycle of the landlocked Atlantic salmon (Salmo salar) by LH-RH analogues administered at various stages of gonadal development. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 40: Crim, L.W., Sutterlin, A.N., Evans, D.M., Weil, C. 1983b. Accelerated ovulation by pelleted LH-RH analogue treatment of spring spawning rainbow trout (Salmo gairdneri) held at low temperature. Aquaculture 35: Crim, L.W., Glebe, B.D Advancement and synchrony of ovulation in Atlantic salmon with pelleted LHRH analog. Aquaculture 43: Gillet, C., Breton, B., Mikolajczyk, T Effects of GnRHa and pimozide treatments on the timing of ovulation and on egg quality in Arctic charr (Salvelinus alpinus) at 5 and 10 C. Aquat. Living Resour. 9: Goren, A., Gustafson, H. and Doering, D Field trials demonstrate the efficacy and commercial benefit of a GnRHa implant to control ovulation and spermiation in salmonids. In: Goetz, F.W. and Thomas, P. (eds.), Reproductive Physiology of Fish. Fish symposium 95, Austin, Texas: pp Haffray, P., Enright, W.J., Driancourt, M.A., Mikolajczyk, T., Rault, Breton, B Optimalization of Breeding of Samonids: Gonazon, the first officialy approaved inducer of ovulation in the EU. World Aquaculture 36(1): Kouřil, J., Barth, T Použití syntentických analogů Gn-RH k indukci a synchronizaci ovulace jikernaček lipana podhorního (Thymallus thymallus). In: Sb. mezinár. konf. Chov lososovitých ryb (Mariánské Lázně, 1988); Vodňany ČSVTS při VÚRH a SRŠ, s Kouřil, J., Barth, T., Fila, F., Příhoda, J., Pospíšek, J., Krchňák, V., Flegel, M. 1987a. Použití syntetického analogu lososího Gn-RH k indukovanému umělému výtěru jikernaček lipana podhorního (Thymallus thymallus L.). Bul. VÚRH Vodňany, 23(3):3-10. Kouřil, J., Barth, T., Štěpán, J., Filla, F., Příhoda, J., Flegel, M. 1987b. Umělý výtěr jikernaček lipana podhorního (Thymallus thymallus L.) při použití indukované ovulace pomocí analogu LH-RH a hypofýzy. Bul. VÚRH Vodňany, 23(2):

8 Kouřil, J., Barth, T., Fila, F., Příhoda, J., Pedaj, M., Pospíšek, J., Krchňák, V., Flegel, M. 1987c. Das bei reifen Weibchen der Äsche (Thymallus thymallus L.) induzierte Ablaichen durch ein neues synthetisches Analogon des Lachs-GnRH. In: Proc. Physiologie, Biologie und Parasitologie von Nutzfischen, Rostock, Wihelm-PieckUniversität, Section Biologie (Gustrow), s Kouřil, J., Švinger, V., Mikodina, E.V., Sedova, M.A., Pavlišta, R., Hamáčková, J Induced and synchronized ovulation and other improvements of artificial reproduction in northern whitefish (Coregonus peled) using hormonal stimulation and anaesthesia. In: Litvinenko, A. I., Reshetnikov, Yu. S. (ed.). Biology, Biotechnology of Breeding and Condition of Whitefish Stocks, VII International Scientific and Practical Workshop about whitefish, Tyumen: pp Mylonas, C.C., Hinshaw, J.M., Sullivan, C.V GnRHa-induced ovulation of brown trout (Salmo trutta) and its effects on egg quality. Aquaculture 106: Mylonas, C.C., Zohar, Y Promoting oocyte maturation, ovulation and sparing in farmed fish. In: Babin, J. P., Cerda, J., Lubzens, E., (ed): The Fish Oocyte. Springer, The Netherlands, pp Mylonas, C.C., Fostier, A., Zanuy, S Broodstock management and hormonal manipulations of fish reproduction. General and Comaparative Endokrinology 165: Park W.D., Lee, Ch.H., Lee, Ch.S., Kim, D.-J., Kim, J.-H., Tamaru, C.S., Sohn, Y.Ch Effects of gonadotropin-releasing hormone analog combined with pimozide on plasma sex steroid hormones, ovulation and egg duality in freshwater-exposed female chum salmon (Oncorhynchus keta). Aquaculture 271: Randák, T., Turek, J., Kolářová, J., Kocour, M., Kouřil, J., Hanák, R., Velíšek, J., Žlábek, V. Technologie chovu generačních lipanů podhorních za účelem udržitelné produkce kvalitního násadového materiálu pro zarybňování volných vod. Edice Metodik (technologická řada), FROV JU Vodňany, 2009, č. 97, 24 s. Schmidt, G.W Forellenteichwirtschaft-Wirtschaftlich wichtige Salmonidenarten. In: Schäperclaus, W., von Lukowitz, M Lehrbuch der Teichwirtschaft 4., Neubearbeitete Auflage. Berlin: Parey, ISBN X. pp

9 3. Materiál a metodika 3.1. Generační hejna a hormonální přípravky Předmětem testování byly pro české pstruhařství dva hospodářsky nejdůležitější druhy lososovitých ryb, pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) a siven americký (Salvelinus fontinalis). U obou druhů byl pro účely synchronizace ovulace využit syntetický analog lososího gonadotropin hormonu uvolňujícího hormon (GnRHa) D-Arg6Pro9NEt. Tento analog je účinnou látkou většiny komerčních přípravků určených pro hormonálně řízenou reprodukci lososovitých ryb. Syntetické analogy mohou být generačním rybám podány různými způsoby, které lze podle kinetiky uvolňování molekuly peptidu rozdělit na akutní a protrahované. Obě dvě metody byly použity u výše zmíněných druhů ryb. Akutní podání GnRHa spočívá v rozpuštění krystalického GnRHa ve 0,9% fyziologickém roztoku NaCl a jeho injikaci. Tato metoda je vhodná u těch lososovitých, u kterých délka výtěrové sezóny nepřekračuje 1-1,5 měsíce (siven americký). Injikace pak může být jednorázová nebo dvojitá, s druhou aplikací hormonu 3. den po podání první dávky. Existuje řada metod využívající protrahované uvolňování aktivního peptidu. Tyto metody jsou vhodné pro ty případy, pokud se výtěrová sezóna protahuje z různých důvodů déle než 1,5 měsíce (pstruh duhový, siven arktický). V našem případě byla pro tyto účely využita metoda emulsifikace GnRHa ve Freundově inkompletním adjuvanciu, jenž je ekonomicky nejvýhodnější pro generační hejna menší velikosti (300g-3000g), která se ve střední Evropě nejčastěji vyskytují. Vzhledem k tomu, že existují prameny o zvýšené mortalitě generačních ryb po hormonálním zásahu, byly injikované jikernačky sledovány po dobu tří měsíců po jejich vlastním výtěru Použité experimentální designy Zkratky FIA Freunds Incomplete Adjuvant (Freundovo inkompletní adjuvancium) sgnrha Salmon Gonadotropin Releasing Hormone Analogue (analog lososího gonadotropin hormon uvolňujícího hormonu) FR Fyziologický roztok 0.9% NaCl sgnrha-fia emulgovaný sgnrha ve FIA sgnrha-fr sgnrha rozpuštěný ve fyziologickém roztoku 9

10 Byly provedeny dva experimenty s hormonální indukcí synchronizace ovulace, jeden u pstruha duhového (místní formy s jarním výtěrem) a druhý u sivena amerického (podzim 2011). V obou případech byly ryby před provedením hormonálního zásahu pečlivě vytříděny tak, aby byla ve výsledných experimentálních skupinách dodržena co nejvyšší velikostní a hmotnostní homogenita. Vlastní experimenty byly sestaveny tak, aby v co nejvyšší možné míře odpovídaly fyziologickým požadavkům jednotlivých testovaných druhů. Pstruh duhový Vzhledem k tomu, že u této místní formy Pd se výtěrová sezóna táhne po dobu až 4 měsíců, bylo od použití sgnrha podaného v akutní formě předem upuštěno. Testovány byly dvě dávky sgnrha-fia. Vytříděné generační jikernačky byly rovnoměrně rozděleny do 3 skupin po 20 jedincích (označených A, B a C): A. jednorázová injikace sgnrha-fia v dávce 100 µg.kg-1 B. jednorázová injikace sgnrha-fia v dávce 25 µg.kg-1 C. kontrolní skupina bez podání sgnrha Od šestého dne po aplikaci sgnrha-fia bylo u jikernaček v třídenních intervalech kontrolováno dosažení ovulace. Jikernačka se považovala za ovulující pokud pouštěla jikry v důsledku mírného manuálního tlaku na dutinu břišní. Jednotlivé dny po podání GnRHa, ve kterých došlo k ovulaci, byly zaznamenávány pro výpočet průměrného intervalu latence (doby od podání hormonu do dosažení ovulace). Ovulující jikernačky byly před výtěrem anestetizovány pomocí lázně v hřebíčkovém oleji (0.03 ml.l-1), následně zváženy a vytřeny. Po výtěru bylo zváženo celkové množství získaných jiker od každé jikernačky pro zjištění tzv. psedogonadosomatického indexu (pgsi = hmotnost vytřených jiker/hmotnost jikernačky před výtěrem 100). Siven americký Výtěrová sezóna u sivena amerického není tak protažená, jako u místně chované formy pstruha duhového. Proto byla u tohoto druhu ryby testována i metoda akutního hormonálního zásahu sgnrha-fr. Vzhledem k tomu, že jsme již z minulých let měli výsledky o účinných dávkách sgnrha-fia a sgnrha-fr, byly tyto 2x sníženy. V případě jednorázové akutní dávky ve skupině C se jedná o dávku 2x vyšší než v našich minulých pokusech. Pokud by se prokázalo, 10

11 že i nižší dávky hormonu jsou účinné, představovalo by to velmi výrazné snížení nákladů na provádění podobných operací v praxi. Vytříděné generační jikernačky byly rovnoměrně rozděleny do 4 skupin po 25ks. Výsledný design experimentu vypadal takto: A. jednorázová injikace sgnrha-fia v dávce 12,5 µg.kg-1 B. dvojitá akutní injikace sgnrha-fr v dávce 12,5+12,5 µg.kg-1 C. jednorázová akutní injikace sgnrha-fr v dávce 50 µg.kg-1 D. kontrolní skupina injikována FR a FIA bez GnRHa Po provedení druhého podání sgnrha ve skupině B bylo u jikernaček v třídenních intervalech kontrolováno dosažení ovulace. Jikernačka byla považována za ovulující pokud pouštěla jikry v důsledku mírného manuálního tlaku na dutinu břišní. Jednotlivé dny po podání GnRHa, ve kterých došlo k ovulaci, byly zaznamenávány pro výpočet průměrného intervalu latence (doby od podání hormonu do dosažení ovulace). Ovulující jikernačky byly před výtěrem anestezovány pomocí lázně v hřebíčkovém oleji (0,03 ml.l-1), následně zváženy a vytřeny. Po výtěru bylo zváženo celkové množství získaných jiker od každé jikernačky pro zjištění tzv. psedogonadosomatického indexu (pgsi = hmotnost vytřených jiker/hmotnost jikernačky před výtěrem 100) Kontrola kvality jiker Kvalita jiker byla hodnocena a mezi jednotlivými skupinami porovnávána měřením následujících parametrů u všech jikernaček: ph ovariální plasmy, individuální hmotnost jiker, přežití do stadia očních bodů, líhnivost embryí a četnost deformit. U sivena amerického byla provedena korelace velikosti jiker s velikostí vykuleného váčkového plůdku. ph ovariální plasmy bylo měřeno multifunkčním inolab 720 ph metrem (WTW, Weilheim, SRN) ihned po výtěru. Pro zjištění individuální hmotnosti jiker bylo použito analytických předvážek (d = 0,001 g) KERN (Kern & Sohn GmbH, Balingen-Frommern, SRN), sítka a sacích filtračních papírků. 25 ks jiker bylo vloženo do malého sítka a pomocí sacích filtračních papírků byla z jiker opatrně odstraněna přebytečná ovariální plasma. Takto osušené jikry byly následně váženy na Petriho miskách. Od každé jikernačky byly odebrány tři vzorky jiker (150±10 ks jiker na každý vzorek) za účelem sledování přežití do stadia očních bodů a líhnivosti. Tyto vzorky byly, po kontrole motility, oplozeny stejným objemem spermatu, odebraným od 3-4 mlíčáků. Inkubace vzorků jiker probíhala na miniaturních aparátech typu Rückl-Vacek uložených ve 11

12 sklolaminátových žlabech. Každý aparát byl individuálně napájen z vodního zdroje, který je využíván v líhni v Nedošíně. Procento jiker v očních bodech a vykulených embryí bylo počítáno z celkového počtu nasazených jiker na inkubátoru Kontrola zdravotního stavu ryb Nad chovnými rybami i jikrami byl pravidelný veterinární dohled veterinárním specialistou, který pravidelně posuzoval zdravotní stav ryb (odborná kontrola žaberního aparátu, vývoj zaplísnění ryb i jiker, posuzování chování a reflexů ryb, účast při pitevních operacích a hodnocení stavu vnitřních orgánů). V povýtěrovém období probíhalo držení a sledování generačních ryb po určitou dobu za účelem sledování potencionální povýtěrové mortality. Ryby byly v tomto období krmeny ad libitum, byl prováděn veterinárním dohled a sledování chemických parametrů Statistické vyhodnocení Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno v programu Statistica 9 na hladině významnosti α = 0,05 (pokud není uvedeno jinak). Výsledky statistické analýzy a k tomu použitých testů jsou uvedeny u všech prezentovaných výsledků v této zprávě. Data jsou zobrazena ve tvaru mean±sem (průměr±sem Standard Error of Mean - standardní chyba průměru). 12

13 4. Výsledky a závěry 4.1. Pstruh duhový Indukce synchronizované ovulace Obě dvě dávky hormonu podané ve formě sgnrha-fia signifikantně synchronizovaly ovulaci v porovnání s kontrolou (P<0,01, Z-test). První ovulace byly zaznamenány 11 den ( ) po provedení aplikace hormonů a vytřeno bylo 20% a 30% jikernaček (4 a 6 z 20 ks, resp.) ve skupině A a B, resp. (Graf 1) (18. den po aplikaci) bylo ve skupinách A a B vytřeno již 65% jikernaček (13 z 20ks), zatímco u kontrolních ryb byla k tomuto datu vytřena pouze 1 jikernačka (5%) (28. den po aplikaci) ve skupině B dosáhlo kumulativní procento ovulací hodnoty 90% oproti 65% a 10% ve skupině A a C, resp. 100% podílu ovulovaných a vytřených jikernaček v kontrolní skupině C bylo dosaženo až , tedy až 80. den po aplikaci hormonů ve skupině A a B. Oproti tomu je nutno podotknout, že 85% jikernaček ve skupině B bylo vytřeno v časovém úseku 10 dní. 100% jikernaček v této skupině pak v rozmezí 38 dní, což představuje jen poloviční délku doby než u kontrolní skupiny B (Graf 1). Poslední ovulující jikernačka byla ve skupině A zaznamenána (Graf 1), a když (49. den po aplikaci) bylo ve skupině B vytřeno 100% ryb, bylo rozhodnuto o provedení pitvy u zbývajících 7 ryb za účelem zjištění polohy zárodečného jádra v ovocytech. Pitva a následné prosvětlení ovocytů v prosvětlovacím roztoku prokázalo, že hormonální zásah u těchto jikernaček nebyl účinný. Poloha zárodečného jádra se u všech 7 ryb nacházela stále v centrální pozici, což bylo vzhledem k výši použité dávky sgnrha překvapením Kvalita jiker Hodnota ph ovariální plasmy se mezi jednotlivými skupinami lišila. Nicméně rozdíly, ačkoliv signifikantní, nebyly tak významné, aby ovlivnily kvalitu pohlavních produktů. Obecně se ve všech skupinách hodnota ph pohybovala v rozmezí 8,00-8,44, což naznačuje, že žádná jikernačka neměla jikry ve stavu degradace jikerných obalů. Navíc nebyla zjištěna žádná korelace mezi ph ovariální plasmy a přežitím do stadia očních bodů. Individuální hmotnost jiker byla signifikantně nižší (P<0.05, one-way ANOVA, Tukeyho HSD test mnohonásobného porovnání) u hormonálně ošetřených skupin A a B v porovnání s kontrolou C (Graf 5). V průměru byly jikry o 7-9 mg.ks-1 od jikernaček kterým byl aplikován 13

14 sgnrha. Individuální hmotnost jiker dosáhla 55,3±2,6, 53,1±2,1 a 62,2±2,1 mg ve skupinách A, B a C, resp. Nicméně signifikantní závislost přežití jiker do očních bodů a líhnivosti na hmotnosti jiker nebyla prokázána. Přežití do stádia do očních bodů bylo signifikantně nižší (P<0,05, one-way ANOVA, Tukeyho HSD test mnohonásobného porovnání) u jiker ve skupinách A a B v porovnání s kontrolou C (Graf 6). Podíl jiker ve stádiu očních bodů byl 67,8±6,1, 71,3±4,9 a 87,8±5,1% ve skupinách A, B a C, resp. Byla zjištěna pozitivní korelace mezi číslem kontroly ryb na ovulaci, tj. délkou doby od aplikace hormonálního přípravku do ovulace, a přežitím do stádia očních bodů ve skupině B (P<0,01, R2= 0,3) (Graf 2). U kontrolní skupiny takovýto fenomén nebyl pozorován (Graf 2). U skupiny A nemohla být signifikance prokázána z důvodu malého počtu jikernaček zakomponovaných do analýzy (7 nevytřených). Nicméně počáteční průběh podílu přežitých jiker do očních bodů v závislosti na čísle kontroly v této skupině je téměř identický jako ve skupině B. Mortalita embryí mezi stádiem očních bodů a kulením byla vyšší u jiker ve skupinách A a B v porovnání s kontrolou C (Graf 7). Rozdíly ale nebyly signifikantně průkazné. Nicméně hodnota P=0,066 je pod indikační hladinou významnosti α=0,1, která se v biologii ještě dá považovat za signifikantní (P<0,1, one-way ANOVA, Tukeyho HSD test mnohonásobného porovnání). To naznačuje fakt, že při větším počtu dat a eliminaci velké variability souboru by výsledky s velkou pravděpodobností byly signifikantní i na hladině významnosti α=0,05. Mortalita jiker v tomto období dosáhla hodnot 11,3±3,9, 11,5±3,2 a 1,6±3,3% ve skupinách A, B a C (Graf 7). Byla zjištěna pozitivní korelace mezi číslem kontroly ryb na ovulaci, tj. délkou doby od aplikace hormonálního přípravku do ovulace, a mortalitou mezi stádiem očních bodů a kulením v hormonálně ošetřených skupinách A a B (P<0,01, R2= 0,59 a P<0,01, R2= 0,3, resp.) (Graf 3). U kontrolní skupiny takovýto fenomén nebyl pozorován (Graf 3). Líhnivost byla signifikantně nižší (P<0,01, one-way ANOVA, Tukeyho HSD test mnohonásobného porovnání) u jiker ve skupinách A a B v porovnání s kontrolou C (Graf 8). Podíl vykulených jiker byl 61,8±6,4, 64,6±5,2 a 86,6±5,3% ve skupinách A, B a C. Byla zjištěna pozitivní korelace mezi číslem kontroly ryb na ovulaci, tj. délkou doby od aplikace hormonálního přípravku do ovulace, a hodnotou líhnivosti v hormonálně ošetřených skupinách A a B (P<0.05, R2= 0,15 a P<0,01, R2= 0,45, resp.) (Graf 4). U kontrolní skupiny takovýto fenomén nebyl pozorován (Graf 4). Četnost deformit se mezi jednotlivými skupinami signifikantně nelišila (P>0,05, one-way ANOVA). Zaznamenaný podíl deformit byl pro skupiny A, B a C 0,1±0,1, 0,15±0,1 a 0,2±0,1%. 14

15 Povýtěrová mortalita a stav generačních ryb Žádné signifikantní rozdíly v povýtěrové mortalitě pokusných ryb nebyly zjištěny. V poovulačním období ve skupině A odumřely 3ks jikernaček. V tělní dutině byl zjištěn drobný zánět ve svalovině u 1 ks a silné překrvení v tělní dutině u 2. kusu. 3. kus uhynul na následky silného zaplísnění. Ve skupině B uhynuly 4 ks jikernaček. Z toho 3 ks uhynuly na následky silného zaplísnění. 1 kus uhynul pravděpodobně na následky nedostatečného vytření jiker a silného vnitřního krvácení v dutině břišní (pitva prokázala přítomnost velkých krevních sraženin). V kontrole C uhynulo celkem 6 ks jikernaček. 5 ks v důsledku silného zaplísnění, u jednoho kusu se příčina úhynu nedala stanovit. U 7 vypitvaných ryb ve skupině A v předovulačním období nebyly zjištěny žádné degenerativní změny či alergické reakce jak na ovariích, tak ve svalovině Siven americký Indukce synchronizované ovulace Všechny použité hormonální zásahy signifikantně (P<0,05, Z-test) urychlovaly a synchronizovaly ovulaci v porovnání s kontrolou (Graf 9). První ovulace byly zaznamenány 10. den po provedení první aplikace hormonů V tento den dosáhl podíl vytřených jikernaček 8, 24, 12 a 0% ve skupinách A, B, C a D (13. den po první aplikaci) bylo již ve skupinách A, B a C vytřených již 12, 28 a 12% jikernaček, zatímco v kontrolní skupině neovulovala zatím žádná jikernačka. Obecně měla synchronizace ovulace v tomto pokusu velmi pozvolný průběh ve všech hormonálně ošetřených skupinách, lišila se jen jeho dynamika v závislosti na použití akutní či protrahované metody uvolňování GnRHa, tj. sgnrh-fr či sgnrha-fia. Zatímco se ve skupině A podíl ovulovaných a vytřených jikernaček kontinuálně zvyšoval po celou dobu experimentu, ve skupinách B a C došlo k prudšímu nárůstu ovulací 10. a 13. den po první aplikaci hormonů. Potom se ovulace v těchto skupinách zastavily až do (27. den po 1. aplikaci), kdy již byly zaznamenány první ovulace a provedeny první výtěry v kontrolní skupině D. Lze rovněž tvrdit, že nízká jednorázová dávka protrahovaného sgnrha-fia (skupina A) a nízká dvojitá dávka akutního sgnrha-fr (skupina B) jsou téměř dvakrát účinnější, než vysoká jednorázová dávka akutního sgnrha-fr (skupina C). To je patrné (34. den po 1. aplikaci), kdy podíl vytřených jikernaček ve skupinách A, B, C a D byl 15

16 56, 52, 28 a 16%. Procento ovulací v žádné skupině nedosáhlo 100% z důvodu předvýtěrové mortality ve všech skupinách Kvalita jiker Hodnota ph ovariální plasmy se mezi jednotlivými skupinami lišila. Nicméně rozdíly, ačkoliv signifikantní, nebyly tak dramatické, aby ovlivnily kvalitu pohlavních produktů. Obecně se ve všech skupinách hodnota ph pohybovala v rozmezí 8,00-8,35, což naznačuje, že žádná jikernačka neměla jikry ve stavu degradace jikerných obalů. Navíc nebyla zjištěna žádná korelace mezi ph ovariální plasmy a přežitím do stadia očních bodů. Individuální hmotnost jiker byla vysoce signifikantně nižší (P<<0,01, one-way ANOVA, Tukeyho HSD test mnohonásobného porovnání) u hormonálně ošetřených skupin A, B a C v porovnání s kontrolou D (Graf 10). V průměru byly jikry o 5-6 mg.ks-1 lehčí od jikernaček, kterým byl aplikován sgnrha. Individuální hmotnost jiker dosáhla 39,2±0,9, 39,1±1,0, 38,5±1,0 a 44,7±0,9mg ve skupinách A, B, C a D, resp. Nicméně signifikantní závislost přežití jiker do očních bodů a líhnivosti na hmotnosti jiker nebyla nalezena. Individuální hmotnost váčkového plůdku byla signifikantně nižší (P<0,05, one-way ANOVA, Tukeyho HSD test mnohonásobného porovnání) u hormonálně ošetřených skupin A, B a C v porovnání s kontrolou D (Graf 11). V průměru byl váčkový plůdek o 4-6 mg.ks-1 lehčí od jikernaček kterým byl aplikován sgnrha. Individuální hmotnost váčkového plůdku dosáhla 44,0±1,0, 43,9±1,1, 42,3±1,1 a 48,2±1,1mg ve skupinách A, B, C a D, resp. Nicméně signifikantní závislost přežití jiker do očních bodů a líhnivosti na hmotnosti váčkového plůdku nebyla prokázána. Oproti tomu velikost váčkového plůdku byla prokazatelně přímo závislá na velikosti jiker (R2=0,76, P<<0,01) (Graf 12), což je velmi důležité zjištění. Regresní analýza rovněž potvrdila vysokou závislost líhnivosti na procentu přežití jiker do očních bodů (R2=0,93, P<0,01) (Graf 13). Procento přežití jiker do očních bodů se signifikantně nelišilo mezi jednotlivými skupinami. Podíl jiker ve stádiu očních bodů byl 82,0±3,3, 82,3±3,7, 74,5±3,6 a 79,4±3,5% ve skupinách A, B, C a D, resp. Nebyla zjištěna korelace mezi číslem kontroly ryb na ovulaci, tj. délkou doby od aplikace hormonálního přípravku do ovulace, a přežitím do stádia očních bodů. Mortalita embryí mezi stádiem očních bodů a kulením byla vyšší u jiker ve skupinách B (7,1±1,0%) a C (6,3±1,0%) v porovnání se skupinou A (4,3±0,9%) kontrolou D (3,9±1,0%) (Graf 7). Rozdíly ale nejsou průkazné na hladině významnosti α=0,05. Nicméně hodnota 16

17 P=0,0621 je pod indikační hladinou významnosti α=0.1, která se v biologii ještě dá považovat za signifikantní (P<0,1, one-way ANOVA, Tukeyho HSD test mnohonásobného porovnání). To naznačuje fakt, že při větším počtu dat a eliminaci velké variability souboru by výsledky s velkou pravděpodobností byly signifikantní i na hladině významnosti α=0,05. Líhnivost se signifikantně nelišila mezi jednotlivými skupinami. Podíl vykuleného váčkového plůdku byl 77,7±3,4, 75,2±3,9, 68,2±3,8 a 75,5±3,7% ve skupinách A, B, C a D, resp. Nebyla zjištěna korelace mezi číslem kontroly ryb na ovulaci, tj. délkou doby od aplikace hormonálního přípravku do ovulace, a líhnivostí. Nebyl zaznamenán výskyt deformit vylíhnutého plůdku, jak u kontrolní, tak u všech experimentálních skupin Povýtěrová mortalita a stav generačních ryb V tomto experimentu došlo hlavně k předvýtěrové mortalitě z důvodů zaplísnění generačních ryb. To je však u sivena amerického obecně známá skutečnost. Ve skupinách A, B, C a D uhynulo 3, 8, 7 a 6 ks jikernaček. Nebyly zaznamenány ale žádné degenerativní změny či alergické reakce v souvislosti s aplikací hormonů na ovariích, či ve svalovině Teplota, kyslík a vodní prostředí Grafy a hodnoty teplot a kyslíku jsou uvedeny na konci příloh. Ani v jednom experimentu tyto hodnoty nepřekročily míru, která by jakýmkoliv způsobem mohla ohrozit generační ryby nebo inkubované jikry. Teplota se u pokusu s pstruhem duhovým pohybovala vzestupně od února do května v rozmezí 7-13 C. Obsah kyslíku kolísal v rozmezí 7-14 mg.l-1. U pokusu se sivenem americkým se teplota pohybovala sestupně od října do prosince v rozmezí 10 C-6,7 C. Teplota vody při inkubaci jiker kolísala v rozmezí 7-10 C, kyslík okolo 10-12mg.l-1 u obou experimentů. Akreditovanou laboratoří byly pravidelně prováděny fyzikálně-chemické rozbory přítokové vody k chovným rybám a líhňařským aparátům, za účelem podrobnějšího sledování parametrů vodního prostředí, jejichž náhlé změny by mohly ovlivnit průběh experimentu (t, ph, O2, N-NH4+, N-NO3-, Pc, CHSKMn, BSK5). Během celé doby tyto parametry byly stálé, nedocházelo k výkyvům hodnot. Ty se pohybovaly v mezích, které jsou na místním pstruhařství běžné. 17

18 5. Závěr 5.1. Pstruh duhový Emulgovaná forma sgnrha-fia byla pro účely indukce synchronizované ovulace dostatečně účinná především v dávce 25 µg.kg-1 hmotnosti jikernaček. Vysoká dávka hormonu (100 µg.kg-1) ve formě sgnrha-fia se ukázala jako nespolehlivá a příliš drahá. Nelze jí tedy pro další praktické účely doporučit. Otázkou nicméně zůstává, proč účinnost vyšší dávky sgnrha byla menší, než u dávky čtyřnásobně nižší. Nižší dávka sgnrha nabízí managementu líhní vyšší flexibilitu v řízení a kontrole reprodukce svého generačního hejna, průkazně zkracuje délku výtěrové sezóny a tím může znatelně přispět k lepší organizaci prací na takovýchto zařízeních. Velmi znatelně ulehčuje predikci nejvyšší vlny výtěrů u salmonidů se značně dlouhou výtěrovou sezónou. Z těchto důvodů může být takovýto hormonální zásah (technologie) doporučen pro rybářskou praxi. Management líhní si musí být při nasazení podobných metod u pstruha duhového vědom, a důkladně jejich nasazení podle toho zvážit, že ovlivňují kvalitu samičích pohlavních produktů, a to hlavně u jikernaček, které byly vytřeny v nejkratším období po aplikaci hormonálních přípravků. Konkrétně se jedná o redukci velikosti jiker, přežití jiker do očních bodů, zvýšení mortality mezi stádiem očních bodů a kulením a redukci líhnivosti. Dále je nutné podotknout, že není známo, po jak dlouhou dobu je aktivní peptid po aplikaci z Freundova inkompletního adjuvancia uvolňován a zůstává aktivní. Vyloučení využití těchto ryb pro lidskou spotřebu je tedy nutností. Podobné změny v kvalitě pohlavních produktů po hormonálním zásahu nebyly doposud podobně hlouběji studovány a je povinností vědecké veřejnosti se tímto problémem v budoucnosti vážně zabývat. Z našich dosavadních výsledků i z jiných experimentů s největší pravděpodobností navíc vyplývá, že v ovlivnění především kvality jiker hormonálním zásahem může existovat mezidruhová rozdílnost Siven americký I přes statistickou průkaznost výsledků se všechny hormonální zásahy v tomto pokusu ukázaly jako méně účinné pro účely indukce synchronizované ovulace. To bylo způsobeno především zkoušením 2x nižších dávek aktivního peptidu. Za jako naprosto nevhodnou lze označit metodu jednorázové dávky (50 µg.kg-1) akutního sgnrha-fr. Dvojitou dávku

19 µg.kg-1 akutního sgnrha-fia lze rovněž jen těžko doporučit, protože v tomto případě je nutno ryby 2x přelovovat a výsledný efekt neodpovídá vynaloženému úsilí. Podle našich jiných výsledků je takováto dvojitá aplikace vysoce účinná, je-li použita dávka 25 µg.kg-1 jikernaček. Nejlepší výsledky v tomto experimentu byly dosaženy při použití protrahovaného sgnrha-fia v dávce 12,5 µg.kg-1. Vzhledem k malému množství použitého sgnrha je tento výsledek celkem uspokojivý. Avšak synchronizace ovulace nebyla tak prudká, jak by bylo třeba. To naznačuje, že použitá dávka hormonu byla částečně poddimenzována. Jako vysoce efektivní lze na základě našich výsledků u sivena amerického z roku 2009 označit dávku sgnrha-fia 25 µg.kg-1, kde bylo dosaženo 100% podílu vytřených jikernaček v období 6 dnů. Všechny použité hormonální zásahy u sivena amerického signifikantně snížily velikost jiker a váčkového plůdku zrovna tak, jako u pstruha duhového. Nicméně přežití jiker do očních bodů a líhnivost byla shodná, anebo lepší než u kontrolní skupiny. Takovýchto výsledků bylo dosaženo již po druhé v řadě. Využití těchto technologií u sivena amerického lze doporučit ze stejných důvodů jako u pstruha duhového. V budoucnosti je však nutné pracovat na zjištění příčin zmenšené velikosti jiker, váčkového plůdku a jejich vlivu na další odchov těchto jedinců. Hmotnostní rozdíly v mg v takto raném věku ryb by mohly hrát velkou roli při následném odkrmu násad a tržních ryb. Ve Vodňanech dne doc. Ing. Jan Kouřil, Ph.D. řešitel projektu 19

20 6. Přílohy Pstruh duhový Graf 1. Průběh ovulace v jednotlivých skupinách vyjádřený v kumulativních četnostech. Šipka představuje den provedení hormonálního zásahu. Rozdílná písmenka značí signifikantní rozdíly mezi skupinami (p<0.01, Z-test). 20

21 Graf 2. Závislost přežití jiker do očních bodů délce intervalu latence (časový interval ve dnech od provedení hormonálního zásahu do dosažení ovulace jikernačky). 21

22 Graf 3. Závislost výše mortality (počítána od stádia očních bodů do kulení) na délce intervalu latence. 22

23 Graf 4. Závislost líhnivosti embryí na délce intervalu latence. Graf 5. Rozdíly mezi individuální hmotností jiker mezi jednotlivými skupinami. Rozdílná písmenka značí signifikantní rozdíly mezi skupinami (p<0,05; ANOVA následovaná Tukeyho HSD testem mnohonásobného porovnávání). 23

24 Graf 6. Rozdíly v přežití jiker do očních bodů mezi jednotlivými skupinami. Rozdílná písmenka značí signifikantní rozdíly mezi skupinami (p<0,05; ANOVA následovaná Tukeyho HSD testem mnohonásobného porovnávání, Kruskal-Wallis test). Graf 7. Mortalita jiker v období mezi stádiem očních bodů a kulením. Rozdíly nejsou signifikantní. Nicméně p = 0,066, což je pod hranicí indikační hladiny významnosti α=0,1, což naznačuje vysokou pravděpodobnost rozdílnosti při vyšším počtu pozorování. (p<0,1; ANOVA následovaná Tukeyho HSD testem mnohonásobného porovnávání). 24

25 Graf 8. Rozdíly v líhnivosti mezi jednotlivými skupinami. Rozdílná písmenka značí signifikantní rozdíly mezi skupinami (p<0,01; ANOVA následovaná Tukeyho HSD testem mnohonásobného porovnávání, Kruskal-Wallis test). 25

26 Siven americký Graf 9. Časový průběh ovulace jikernaček jednotlivých skupin vyjádřený v kumulativních četnostech. Šipky představují dny provedení hormonálního zásahu. Rozdílná písmenka značí signifikantní rozdíly mezi skupinami (p<0,01, Z-test). 26

27 Graf 10. Rozdíly mezi individuální hmotností jiker mezi jednotlivými skupinami. Rozdílná písmenka značí signifikantní rozdíly mezi skupinami (p<0,01; ANOVA následovaná Tukeyho HSD testem mnohonásobného porovnávání). Graf 11. Rozdíly v individuální hmotnosti váčkového plůdku mezi jednotlivými skupinami. Rozdílná písmenka značí signifikantní rozdíly mezi skupinami (p<0,01; ANOVA následovaná Tukeyho HSD testem mnohonásobného porovnávání). 27

28 Graf 12.. Závislost hmotnosti žloutkového váčku na hmotnosti vlhkých jiker (bez přítomnosti mezijikerné tekutiny, váženo ihned po výtěru, před jejich oplozením a nabobtnáním) Graf 13. Závislost líhnivosti embryí na přežití do očních bodů. 28

29 Rozdíly mezi ztrátami jiker mezi stádiem očních bodů a kulením. Rozdíly nejsou signifikantní. Nicméně p = 0,0621, což je pod hranicí indikační hladiny významnosti α=0,1, naznačuje vysokou pravděpodobnost rozdílnosti při vyšším počtu pozorování. (p<0,1; ANOVA následovaná Tukeyho HSD testem mnohonásobného porovnávání). Obr 1. Pitva nevytřených jikernaček pstruha duhového ve skupině A 29

30 Obr 2. Ovaria jedné z vypitvaných jikernaček pstruha duhového ve skupině A Obr 3. Oplodňování vzorků jiker. 30

31 Obr 4. Aplikace hormonů u pstruha duhového Obr 5. Příprava hormonálních preparátů v laboratoři. 31

32 Obr 6. Měření ph ovariální plasmy u jiker sivena amerického Obr 7. Vážení vzorků jiker u sivena amerického Obr 8. Umísťování vzorků jiker do malých aparátů 32

33 Obr 9. Vzorek jiker sivena amerického na aparátech Obr 10. Výtěr jikernačky sivena amerického 33

34 Obr. 11 Kulení plůdku sivena amerického Měření teploty a kyslíku Pstruh duhový 34

35 35

36 Siven americký 36

37 37