Význam prokaryot z hlediska molekulární biologie. Doporu ená literatura:

Transkript

1 OSNOVA PEDNÁŠKY Molekulární biologie prokaryot Prokaryotický genom, jeho složky a vzájemné interakce A. Bakteriální chromozom B. Plazmidy (F-, R-, Ti-, Col-plazmidy), C. Prokaryotické mobilní elementy (IS, Tn) Mutace baktérií, jaderná segregace, fenotypové zdržení, fluktuaní test, metody selekce mutant Reparace mutaních poškození DNA Využití transpozon ke studiu prokaryotického genomu (Transpozonová mutageneze) Zpsoby penosu genetické informace u prokaryot Doporuená literatura: Rosypal S. a kol.: Obecná bakteriologie, SPN Praha Joset F.: Guespin-Michel J. Prokaryotic Genetic. Blackwell Science ltd Lewin B.: Genes V-VII, Oxford University Press, Oxford, New York Tokyo Maloy S.R. et al.: Microbial Genetics, 2. vydání, Jones and Barlett Publ, Boston-London, Birge E.A.: Bacterial and bacteriophage genetics. Springer Rosypal S. a kol. Úvod do molekulární biologie A. Konjugace B. Transdukce, kapsdukce C. Transformace Restrikní a modifikaní systémy prokaryotických bunk Evoluce bakteriálního genomu Význam prokaryot z hlediska molekulární biologie - Modelové organismy pro studium základních biologických proces - krátká generaní doba, vysoký poet jedinc - snadná kultivace na definovaných pdách (alespo u vtšiny) - dobe pístupné studiu, snadná izolace biol. makromolekul a struktur - možnost sledování genomových zmn v krátkých asech - studium evoluce

2 Praktický význam prokaryotických organism - patogenita (parazitismus, symbioza) - využití v biotechnologiích (kvasný prmysl, píprava nápoj a potravin) - producenti významných látek (antibiotika, enzymy, farmaka, sekundární metabolity) - producenti cizorodých látek pipravených metodami GI (inzulin, hormony aj). - píprava probiotik - píprava vakcín - využití extrémofil a jejich produkt Srovnání velikosti genom prokaryot a eukaryot U prokaryot neplatí paradox hodnoty C

3 replikony Obsah GC = 22-75mol% Prokaryota s lineárním chromozomem Streptomyces (ambofaciens, lividans) 10 Mb Borrelia burgdorferi (B. hermsii) 0.95 Mb Coxiella burnetii 2,1 Mb Paracoccus denitrificans -ti molekuly DNA 2 Mb; 1,1 Mb; 0,64 Mb, dv jsou lineární Agrobacterium tumefaciens

4 Genom Agrobacterium tumefaciens C58 Sekvencované genomy prokaryot BAKTERIE Velikost Poet gen rok genomu (kb) Haemophilus influenzae KW Mycoplasma genitalium G Synechocystis sp.pcc Mycoplasma pneumoniae M Escherichia coli K12-MG Helicobacter pylori Bacillus subtilis Borrelia burgdorferi B Mycobacterium tuberculosis H37Rv Aquifex aelicus Treponema pallidum Nichols Chlamydia trachomatis serovar D Rickettsia prowazekii Madrid E Helicobacter pylori J Chlamydia pneumoniae CWL Thermotoga naritima MSB Deinococcus radiodurans RI Vibrio cholerae EI Tor N Campylobacter jejuni NCTC Chlamydia pneumoniae AR Chlamydia trachomatis MoPn Nigg Pseudomonas aeruginosa PAO Neisseria meningitidis Z Xylella fastidiosa E. coli 0157:H7 EDL (K ) 2001 Mycobacterium leprae 3268 ~ ARCHAEA Methanococcus jannaschii DSM Methanobacterium thermoautotrophicum Archaeoglobus fulgidus DSM Pyrococcus horikoshii (shinkaj) Aeropyrum pernix K Pyrococcus abyssi GE EUKARYOTA Saccharomyces cerevisiae S288C 12, Caenorhabditis elegans 97, Drosophila melanogaster 137, Arabidopsis thaliana 115, Lidský genom (Collins) 2693(84%) Lidský genom (Venter) 2654(83%) Typy sekvencí prokaryotického genomu Kódující oblasti (ORF se známou nebo neznámou funkcí) Inzerní sekvence Transpozony Profágy a defektní fágy Sekvence pepisované do RNA (rrna, trna) Repetice (15 stovky bp) Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice Krátké roztroušené repetitivní sekvence Dlouhé roztroušené repetitivní elementy Mosaikové repetitivní elementy Hypervariabilní mikrosatelity, mononukleotidová opakování Chi-místa a jim podobné (oktanukleotidy) Rhs elementy(9,6 kb u E. coli)

5 Výsledky získané ze srovnání sekvencovaných genom (30 genom - 45 Mbp DNA ORF, z nichž polovina má dosud neznámou funkci) 1. Poet informaních gen (nap. geny pro replikaci, transkripci nebo translaci aj) je v každém genomu zhruba stejný, i když se jejich velikosti liší až 5x. Tyto procesy vyžadují základní sadu protein. 2. Poet gen ostatních funkních kategorií (biosyntéza aminokyselin, získávání energie, metabolismus a transport, regulaní funkce) je mnohem variabilnjší a má tendenci se zvtšovat 3. Se zvtšováním velikosti genomu pibývá paralogních gen a zvtšuje se též biochemická komplexita organismu. 4. Jedna tvrtina ORF u každého druhu je jedinená a nemá významnou sekvenní homologii k žádné dostupné proteinové sekvenci. Horizontální penos gen (z analýzy 17 kompletních genom bakterií a 7 archeií rozdíly v obsahu GC a používání kodon) Poet HT gen kolísá od 1,56 do 21,4%. asto penášené geny: operaní geny pro komunikaci (regulace, bunné procesy) a bunnou strukturu Mén asto penášené geny: informaní geny (replikace, transkripce, translace aj) Vtšina HT gen je jen v jedné nebo dvou vývojových liniích. Nkteré z tchto gen jsou geny tvoící ásti profág, ostrovy patogenity, transpozony, intergázy, rekombinázy. Genomické ostrovy (bloky DNA se znaky mobilních genetických element) - fitness ostrovy ekologické ostrovy saprofytické ostrovy symbiosové ostrovy ostrovy patogenity TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH GENOMECH A. Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice Trinukleotid TGG nejastjší trinukleotid E. coli (souást penta nebo oktanukleotid) Nonamer AAGTGCGGT (uptake signal sequence USS) H. influenzae kopií Tandemov opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n nebo (GCC)n - vysoce repetitivní u E. coli, S. typhimurium a Shigella sp. Short tandemly repeated repetitive (STRR) sequences - heptanukleotidová opakování u sinice Calothrix Major polymorphic tandem repeat (MPTR) - polymorfní 10-bp DR u Mycobacterium tuberculosis a dalších mykobakterií (podobnost s místy Chi a roztroušenými REP elementy) B. Krátké roztroušené repetitivní sekvence (kratší než 50 bp) REP (repetitivní extragenové palindromatické sekvence) 38 bp, 500 REP u E. coli PU (palindromic units) u E. coli a S. typhimurium. Mnohokopiový 26-mer (Ngrep) u Neisseria gonorrhoeae a N. meningitidis Mnohokopiový 24-mer DR element u Mycobacterium bovis (38 kopií) C. Dlouhé roztroušené repetitivní elementy (vtší než 50 bp) intergenic repeat unit (IRU) enterococcal repetitive intergenic consensus (ERIC) 126 bp nebo zkrácené formy. Chromozomová lokalizace se liší u kmen a druh ERIC-like sekvence celá bakteriální íše. RLEP ( bp) u Mycoplasma leprae 28 (0,6% genomu) Mx-rep u Myxococcus xanthus - 87 pb jádrová sekvence Dr-rep (SARK) u Deinocccus radidurans Element o variabilní délce ( bp RepMP2, RepMP1, SDC1 (150 bp 1 kb) u Mycplasma pneumoniae, v genomu 8-10 kopií.. RepMP2-like u Staphylococcus D. Mosaikové repetitivní elementy Bacterial Interspersed Mosaic Elements (BIME) (kombinace REP a sedmi dalších repetitivních motiv). 500 u E. coli a dalších G- enterobakterií (Klebsiella pneumoniae, S. typhimurium) REP MP bp element ohraniený kratšími reeptitivními sekvencemi u M. pneumoniae. BOX elementy rozptýlené repetitivní elementy u G+ (Streptococcus pneumoniae).

6 Chromozomové pestavby Podmínny pítomností opakujících se sekvencí = substrát pro homologní rekombinace Genetická organizace prokaryotického genomu - velmi kompaktní genom s malými mezerami mezi geny - vtšina genomu obsazena strukturními geny - malá ást (11%) tvoena nekódující DNA - operonové uspoádání gen (vtšinou funkn píbuzné) - poadí gen není u prokaryot konzervováno

7 Fyzikální organizace bakteriálního chromozomu - ds DNA, neobalené jadernou membránou - vazba malých protein typu HU (histon-like) molekul, ovlivujících flexibilitu DNA (ohýbání DNA do kruh) - 50 superhelikálních smyek, bez úasti RNA - kontrola stavu superhelicity: topoizomeráza, gyráza rozmotání po replikaci, pichycení na membránu - Struktura chromozomu E. coli 4,6 Mbp, 50% GC, 1 m Charakteristika plazmid dsdna kružnicová nebo lineární, velikost: kb Základní typy plazmid: kryptické - funkce neznámá epizomální - reverzibilní intergace do chromozomu hostitele konjugativní - schopné penosu konjugací mobilizovatelné penositelné za pítomnosti konjugativního plazmidu Píklady plazmid: * F-plazmidy (fertilitní faktor, konjugativní) - zodpovdné za konjugaci, píp. mobilizaci jiných plazmid * R-plazmidy (R-faktory) - zodpovdné za rezistenci k antibiotikm, ada z nich konjugativní * kolicinogenní (Col-plazmidy) - tvorba protein s antibiotikovým charakterem (Enterobacteriaceae) * Ti-plazmidy (tumory indukující) - tvorba nádor u dvoudložných rostlin (Agrobacterium tumefaciens) * plazmidy odbourávající organické sloueniny (Pseudomonas) * plazmidy podílející se na fixaci vzdušného dusíku (Rhizobium). * Plazmidy používané jako vektory pro penos DNA (pbr322, puc)