Úvod do strukturní analýzy farmaceutických látek

Transkript

1 Úvod do strukturní analýzy farmaceutických látek Garant předmětu: doc. Ing. Bohumil Dolenský, Ph.D. A28, linka 4110, Hmotnostní spektrometrie I. Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Hmotnostní spektrometrie ( MS, Mass Spectrometry ) Vzorek Hmotnostní spektrometr Elementární a isotopové složení vzorku Hmotnostní spektrum Informace o struktuře organických látek a biomolekul Stanovení fyzikálněchemických vlastností iontů a molekul Kvalitativní a kvantitativní složení vzorku. Knihovny spekter

3 Hmotnostní spektrometrie ( MS, Mass Spectrometry ) Hmotnostní spektrometrie je fyzikálně-chemická metoda analýzy látek spočívající v převedení látek na plynné ionty, jejich rozdělení dle náboje a hmotnosti interakcí s magnetickým a elektrickým polem, a následné detekci odrážející jejich množství. Hmotnostní spektrometrie není spektrální metodou (nedochází k interakci s elektromagnetickým zářením), avšak pro podobnost výstupu se mezi spektrální metody formálně řadí. Termín hmotnostní spektroskopie je zcela nesprávný. Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013) Pure Appl. Chem., 2013, 85 (7), Mass Spec Terms Project

4 Hmotnostní spektrometrie ( MS, Mass Spectrometry ) Výhody vysoká citlivost minimální spotřeba vzorku Nevýhody destruktivní metoda vysoké pořizovací a provozní náklady

5 Hmotnostní spektrum Základní pík Molekulový ion M Isotopové píky [M+1] + C 4 H + 7 a/nebo C 2 H 3 O m/z = 98 O + C 5 H 7 O + CH 3 + a/nebo 83 15

6 Hmotnostní spektrometrie v analýze organických látek a biomolekul Sumární vzorec Strukturní fragmenty Fragmentace molekuly Isotopové zastoupení Ekvivalent dvojných vazeb 2D struktura (konstituce) 3D struktura (konformace) (konfigurace) (stereochemie) Funkční skupiny

7 Hmotnostní spektrometr je iontově-optické zařízení, které rozlišuje ionty podle hodnoty poměru m/z m... je relativní hmotnost iontu, z... je množství náboje iontu bez udané polarity m/z... (Od označení Thomson (Th) či mass-to-charge se upouští). Zkratka vyjadřuje bezrozměrné množství vzniklé vydělením hmotnosti iontu atomovou hmotnostní jednotkou a jeho nábojem (bez ohledu na jeho znaménko). Dalton (Da) 1 Da = 1 u = (10) kg = atomové hmotnostní jednotce u (unified atomic mass unit, = 1/12 hmotnosti 12 C) Nejčastěji se používá v biologii pro molekulové hmotnosti proteinů (kda)

8 Hmotnostní spektrometr Hmotnostní spektrometr se skládá z několika základních částí: Vstup vzorku Ionizace a zplynění Separace iontů Přímý vstup nebo spojení s plynovou (GC-MS) či kapalinovou (LC-MS) chromatografií; též TLC-MS Zásadní vliv na získaná data (informace) a využitelnost MS Hmotnostní analyzátor. Separátorů je obvykle řazeno více, buď pro zvýšení rozlišení nebo pro snadné měření MS-MS, MS n, nebo pro reakce iontů Detekce iontů Hmotnostní spektrum

9 Hmotnostní spektrum ( MS spektrum ) Zobrazuje závislost intenzity iontů daného m/z. Intenzita daného iontu odráží jeho množství v ionizovaném vzorku. Spektrum se normalizuje k základnímu píku (base peak, nejintenzivnější pík spektra). Získané profilové (kontinuální) spektrum gaussovský tvar píků kontrola kvality záznamu velké množství dat se obvykle převádí na čárové (centroidální) spektrum. pozice čáry odpovídá středu píku intenzita ploše či výšce píku menší množství dat nelze převézt zpět na profilové spektrum

10 Hmotnostní spektrum ( MS spektrum ) Ion prekurzoru - ion, který reaguje za vzniku konkrétních produktových iontů (od termínu rodičovský ion se upouští). Produktový ion - vzniká jako produkt po reakci z jednotlivých iontů prekurzoru disociací (fragmentový ion), reakcí iontu s molekulou, nebo změnou počtu nábojů. (od termínu "dceřiný ion se upouští). Fragmentový ion - produktový ion vzniklý disociací iontu prekurzoru. Aduktový ion - ion tvořený interakcí iontu s jedním či více atomy nebo molekulami, např.: [M+Na] +, [M+K] +, [M+Cl] -, atd. (tzv. kvazi-či pseudo-molekulové ionty) Molekulový ion - Ion vzniklý odtržením jednoho či více elektronů z molekuly (vznik pozitivního iontu) nebo přidáním jednoho či více elektronů k molekule (vznik negativního iontu). Isotopový ion ( isotopové satelity ) Ionty stejného prvkového složení, lišící se složením isotopovým.

11 Hmotnostní spektrum Exact mass iontů Prvek je definován přirozeným zastoupením isotopů stejného protonového čísla. Isotopy prvku se liší počtem neutronů v jádře (atomovým číslem), tj. hmotností. Např.: uhlík obsahuje 98,90 % isotopu 12 C a 1,10 isotopu 13 C m ( 12 C) = 12, Sumární vzorec iontu m ( 13 C) = 13, Průměrná hmotnost uhlíku = 0,989 * m ( 12 C) + 0,011 * m ( 13 C) = 12,011 Stupeň nenasycenosti V hmotnostní spektrometrii se isotopy prvků rozlišují

12 Molekulový ion [M] Ion s nejvyšším m/z ve spektru muže, ale nemusí být molekulový 2. Molekulový ion je vždy ion-radikál s lichým počtem elektronů 3. Z molekuly se odštěpují smysluplné fragmenty radikály m/z 15, 29, 43 (alkyl), 19 (F), 35 (Cl), 79 (Br), 31 (OCH 3 ), aj. nebo molekuly 18 (H 2 O), 20 (HF), 28 (CO nebo C 2 H 4 nebo N 2 ), 32 (CH 3 OH), 36 (HCl) aj. 4. Zakázané ztráty: m/z = 3 14, neodpovídají žádné reálné fragmentaci molekulového iontu 5. Dusíkové pravidlo: vzhledem k tomu, že dusík je trojvazný, ale jeho majoritní isotop ( 14 N) má sudou nominální hmotnost pak dle počtu dusíků v molekule pozorujeme nominální hmotnosti: a) lichý počet = lichý M + a sudé fragmenty b) sudý počet nebo žádný dusík = sudý M+ a liché fragmenty Molekulová hmotnost Sumární vzorec molekuly

13 Average mass M AV Průměrná hmotnost ~ Molární hmotnost Hmotnost iontu nebo molekuly zohledňující isotopové složení. Exact mass Správná hmotnost (?) Vypočítaná hmotnost iontu nebo molekuly daného isotopového složení. Accurate mass Přesná hmotnost (?) Experimentálně stanovená hmotnost iontu o známém náboji. Nezaměňovat s předchozí. Lze využít pro stanovení elementárního složení iontu. Monoisotopic mass M MONO Monoisotopická hmotnost Exact hmotnost iontu nebo molekuly vypočtená užitím hmotnosti nejvíce zastoupeného isotopu pro každý prvek. Nominal mass Nominální hmotnost Hmotnost iontu nebo molekuly vypočtená užitím hmotnosti nejvíce zastoupeného isotopu pro každý prvek zaokrouhlenou na celé číslo.

14 Spektrometry s nízkým rozlišením umožňují rozlišit ionty lišící se alespoň o m/z 1 m/z (C 2 H 4 ) = 28 m/z (CO) = 28 m/z (N 2 ) = 28 Spektrometry s vysokým rozlišením umožňují rozlišit i ionty o stejné nominální hmotnosti. m/z (C 2 H 4 ) = 28,0313 m/z (CO) = 27,9949 m/z (N 2 ) = 28,0062 Rozlišovací schopnost ( RP ) RP = m/z m/z + m/z dva stejně vysoké píky jednotkového náboje mající překryv s údolím v 10% jejich výšky též používáno RP = m/z m/z m/z je šířka píku m/z v 50% jeho výšky. (též se používá v 5% či v 0,5% jeho výšky)

15 ESI (nanoelectrospray) MS spektrum apomyoglobinu (koňské srdce) voda/acetonitril s 1% HCOOH

16 Hmotnostní spektrum (ESI + ) hemoglobinu je náboj píku rozdíl nábojů mezi píky a hmotnost iontu s nábojem molární hmotnost proteinu molární hmotnost vodíku

17 Hmotnostní spektrum (ESI + ) hemoglobinu

18 Hmotnostní spektrum Exact mass iontů Isotopové složení iontů Sumární vzorec Původ studované látky Stupeň nenasycenosti

19 Přírodní zastoupení isotopů prvků běžných organických sloučenin Prvek M NOM M % M NOM M+1 % M NOM M+2 % Typ H ,015 M C ,1 M+1 N ,37 M+1 O , ,2 M+2 F M Si ,1 30 3,4 M+2 P M S , ,4 M+2 Cl M+2 Br ,3 M+2 I M

20 Nominal mass m/z (C 2 H 4 ) = 28 m/z (CO) = 28 m/z (N 2 ) = 28 Exact mass m/z (C 2 H 4 ) = 28,0313 m/z (CO) = 27,9949 m/z (N 2 ) = 28,0062 Isotopové klustry (%)

21 Isotopový klastr - Skupina píků reprezentující ionty stejného prvkového složení, inzulín C 257 H 383 N 65 O 77 S 6 lišící se však odlišným isotopovým složením. Accurate monoisotopic mass = 5803,64 Exact monoisotopic mass = 5803, Principal ion nejintenzivnější ion isotopového klastru Nominal mass = 5801 Average mass = 5807,59 Exact mass Average mass

22 Hmotnostní spektrum Přesná hmotnost molekulárního iontu s nábojem z = 1 Hmotnost molekulárního iontu s nábojem z > 1 Isotopový klastr Elementární analýza Empirický vzorec Sumární vzorec NMR ( stanovení molární hmotnosti )

23 Sumární vzorec = Molekulový vzorec udává prvky z nichž se látka skládá a skutečný počet jejich atomů v molekule sloučeniny. Stechiometrický vzorec udává pouze poměr atomů v sloučenině, tj. bez ohledu na skutečný počet atomů v molekule. Empirický stechiometrický vzorec = Empirický vzorec stechiometrický vzorec neznáme sloučeniny stanovený kvantitativní prvkovou analýzou (např.: elementární analýzou). Konstituční vzorec V konstitučním vzorci zobrazuje spojení jednotlivých atomů pomocí jednoduchých, zdvojených či ztrojených úseček (v případě potřeby zakřivených čar), znázorňující vazby mezi atomy (jednoduché, dvojnéči trojné vazby). Přitom délka spojovacích úseček a úhly mezi sousedními úsečkami nevyjadřují ani skutečnou délku vazeb v molekuly, ani skutečné úhly mezi vazbami.

24 Ekvivalent dvojných vazeb (DBE) Číslo (stupeň) nenasycenosti ( UN... Unsaturation Number ) Ekvivalent dvojných vazeb ( BDE... Double Bond Ekvivalent ) Ekvivalent dvojných vazeb a ( RDBE... Ring Double Bond Ekvivalent ) kruhů (EDK) ( PBoR... Pi Bonds or Rings ) DBE odráží kolik je v molekule daného sumárního vzorce násobných vazeb a cyklů Informace o počtu cyklů a násobných vazeb Test na funkční skupiny a substruktury Ověření správnosti sumárního vzorce

25 Výpočet DBE ze známé struktury DBE = počet dvojných vazeb + počet cyklů + 2 * počet trojných vazeb C H 3 COOH C H 3 N NO 2 O O HO CF 3 O Cl CH 3 N NH O O NH O H 3 C CH 3 OH O CHO O 2 N N N COOH SO 3 H

26 Ekvivalent dvojných vazeb (DBE) ze sumárního vzorce 1. Spočítejme valence vícevazných atomů (dvouvazné lze vynechat). např.: C 6 H 11 ClO * 4 = 24 např.: C 12 H 11 F 3 N 2 O * * 3 = Odečtěme valence nezbytné k jejich propojení; pro n atomů je to 2*(n-1) valencí. např.: C 6 H 11 ClO * (6 1) = 14 např.: C 12 H 11 F 3 N 2 O * (14 1) = Odečteme počet valencí jednovazných atomů. např.: C 6 H 11 ClO = 2 např.: C 12 H 11 F 3 N 2 O = Zbylé valence vydělíme dvěmi. např.: C 6 H 11 ClO / 2 = 1 BDE = 1 např.: C 12 H 11 F 3 N 2 O / 2 = 7 BDE = 7 Pro C a H b O c N d X e (X = F, Cl, Br, I) DBE = a (b+e)/2 + d/2 + 1

27 Ekvivalent dvojných vazeb (DBE) ze sumárního vzorce Obsahuje-li sumární vzorec prvky, které mohou nabývat různých vazností, pak je nutné uvážit všechny možnosti. Např.: Síra je dvojvazná v sulfidech, čtyřvazná v sulfoxidech a šestivazná v sulfonových kyselinách. Dusík je trojvazný v aminech či pyridinu, ale pětivazný v nitroderivátech.

28 Interpretace DBE DBE musí mít celočíselnou hodnotu. Pokud ji nemá je sumární vzorec nesprávný. DBE = 0 Molekula neobsahuje žádnou násobnou vazbu ani žádný cyklus. DBE = 1 Molekula obsahuje jednu dvojnou vazbu nebo jeden cyklus. DBE = 2 Molekula obsahuje dvě dvojné vazby nebo dva cykly nebo jednu dvojnou vazbu a jeden cyklus nebo jednu trojnou vazbu. DBE = 3 Molekula obsahuje 0 3 dvojné vazby, 0 3 cykly, 0 1 trojné vazby DBE = 4 Molekula obsahuje 0 4 dvojné vazby, 0 4 cykly, 0 2 trojné vazby

29 Accurate mass Molární hmotnost Elementární analýza výpočet Sumární vzorec výpočet Exact mass Elementární složení

30 Elementární analýza ( EA, Elemental analysis ) Elementární analýza poskytuje hmotnostní podíl jednotlivých prvků v analyzovaném vzorku. Obvykle vyjádřen v hmotnostních procentech. Je-li vzorek čistou látkou, pak obsah odpovídá hmotnostnímu podílu jednotlivých prvků v molekule dané látky. Je-li znám sumárníči alespoň empirický vzorec látky lze hmotnostní podíly snadno vypočítat. Výpočet ze sumárního vzorce např.: C 12 H 11 F 3 N 2 O 2 %C = 12 * A r (C) * 100 M r (C 12 H 11 F 3 N 2 O 2 ) = 52,93 %H = 11 * A r (H) * 100 M r (C 12 H 11 F 3 N 2 O 2 ) 3 * A r (F) * 100 = 4,07 %F = = 20,95 M r (C 12 H 11 F 3 N 2 O 2 ) %N = 2 * A r (N) * 100 M r (C 12 H 11 F 3 N 2 O 2 ) 2 * A r (O) * 100 = 10,29 %O = = 11,76 M r (C 12 H 11 F 3 N 2 O 2 )

31 Elementární analýza Empirický vzorec EA 53,15 %C 4,12 %H 10,05 %N 21,74 %F = 10,94 %O Pokud látka obsahuje již jen jeden prvek, který je znám (např. kyslík), lze jeho obsah dopočítat a získat tak úplný empirický vzorec. Pokud látka obsahuje neznámý prvek nebo nečistotu neobsahující stanovované prvky, pak získáme pouze molární poměr stanovovaných prvků v molekule. Pokud látka obsahuje neznámou nečistotu obsahující stanovované prvky, pak je interpretace nemožná. Pokud experimentální EA neodpovídá očekávané, pak je vhodné zvážit existenci solvátů látky pro EA jsou obvykle čištěny krystalizací. EA směsi látek lze vypočíst analogicky jako u čistých látek jen je nutné zahrnout jejich obsah, např.: C 12 H 11 F 3 N 2 O 2.½CHCl 3 budeme uvažovat jako molekulu C 12,5 H 11,5 F 3 N 2 O 2 Cl 1,5 K ověření správnosti vypočteného vzorce lze využít: a) zpětný výpočet obsahu prvků; b) hodnotu DBE, která musí být celočíselná; c) NMR spektra; d) MS data.

32 Elementární analýza Empirický vzorec EA 53,15 %C 4,12 %H 10,05 %N 21,74 %F = 10,94 %O A r 12,011 1,008 14,007 18,998 15,999 EA / A r 4,425 4,087 0,717 1,144 0,684 DBE / min 6,17 5,70 1,00 1,60 0,95 zokrouhlit ,5 EA calc 49,32 % 4,14 % 9,59 % 26,00 % 10,95 % rozdíl EA -3,83 +0,02-0,46 +4,26 +0,01 * 2 12,34 11,40 2,00 3,20 1,90 zokrouhlit ,0 EA calc 52,93 % 4,07 % 10,29 % 20,95 % 11,76 % rozdíl EA -0,22-0,05 +0,24-0,79 +0,82 * 4 24,68 22,80 4,00 6,40 3,80 zokrouhlit ,5 EA calc 53,84 % 4,16 % 10,05 % 20,46 % 11,48 % rozdíl EA +0,69 +0,04 0,00-1,28 +0,54

33 Elementární analýza ( EA, Elemental analysis ) 6 5 Limity elementární analýzy 4 %C (alkenu) %C (alkanu) C 41 H 84 nebo C 41 H

34 Úvod do strukturní analýzy farmaceutických látek Garant předmětu: doc. Ing. Bohumil Dolenský, Ph.D. A28, linka 4110, Hmotnostní spektrometrie II. Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

35 Hmotnostní spektrum Exact mass iontů Isotopové složení iontů Hmotnost fragmentů molekuly Fragmentace molekuly Sumární vzorec Původ studované látky Stupeň nenasycenosti Struktura molekuly

36 Nejběžnější ionizační techniky Electron Impact (EI) Vhodná pro malé těkavé stabilní látky do 1 kda; tvrdá ionizace poskytující značnou fragmentaci informace o struktuře vhodná pro strukturní analýzu. Chemical Ionization (CI) Vhodná pro malé těkavé látky do 1 kda; měkká ionizace obvykle poskytující pseudo-molekulový ion [M+H] + Electrospray (ESI) Vhodná pro netěkavé látky do 200 kda (peptidy, proteiny), měkká ionizace, často poskytující ionty mající více nábojů [M+nH] n+ Fast Atom Bombardment (FAB) Vhodná pro netěkavé látky do 6 kda (sacharidy, organokovy, peptidy), vyžaduje viskózní matrici, měkká ionizace, ale tvrdší než ESI nebo MALDI. Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) Vhodná pro netěkavé látky do 500 kda (peptidy, proteiny, nukleotidy), vyžaduje pevnou matrici, měkká ionizace. APCI, APPI,... a desítky dalších

37 Molekulový ion [M] Ion s nejvyšším m/z ve spektru muže, ale nemusí být molekulový 2. Molekulový ion je vždy ion-radikál (při EI ionizaci) s lichým počtem elektronů 3. Z molekuly se odštěpují smysluplné fragmenty radikály m/z 15, 29, 43 (alkyl), 19 (F), 35 (Cl), 79 (Br), 31 (OCH 3 ), aj. nebo molekuly 18 (H 2 O), 20 (HF), 28 (CO nebo C 2 H 4 nebo N 2 ), 32 (CH 3 OH), 36 (HCl) aj. 4. Zakázané ztráty: m/z = 3 14, neodpovídají žádné reálné fragmentaci molekulového iontu 5. Je vhodné využít ionizačních technik různé tvrdosti.

38 Dusíkové pravidlo Na rozdíl od běžných prvků (C, H, N, O, F, Si, P, S, Cl, Br, I) je dusík je trojvazný, ale jeho majoritní isotop ( 14 N) má sudou nominální hmotnost. Dle počtu dusíků v molekule pak tedy pozorujeme nominální hmotnosti M + iontu a) lichý počet dusíků = lichý M + a sudé fragmenty b) sudý počet nebo žádný dusík = sudý M + a liché fragmenty Pro případy pseudo-molekulových iontů [M+H] +, [M-H] -, [M+Na] +, [M+CH 3 CO 2 ] -, [M+NH 4 ] +,... je potřeba modifikace dusíkového pravidla zřejmá.

39 Využití isotopových iontů M+1 Odhad počtu uhlíků 1. Pokud intenzita m/z položena rovna 100, pak intenzita píku (m/z + 1) dělená 1,1 (tj. přirozeným zastoupením izotopu 13 C) dává odhad počtu uhlíků v iontu m/z. 2. Hodnota je přibližná (+/- 1 uhlík), je potřeba zvážit více možností. Hledání molekulového iontu Vypočtením přibližné hodnoty počtu uhlíků z dvojice M + a [M+1] + lze odhadnout molární hmotnost molekuly, která musí korespondovat s m/z posuzovaných iontů. Počet vodíků a halogenů nesmí být větší než 2C+2.

40 Využití isotopových iontů M+2 Odhad počtu M+2 prvků Nejprve Cl (32,0 %) a Br (97,3 %) Následně S (4,4 %) a Si (3,4 %) Kyslík obtížně (0,2 %) Zvážit možnost méně běžných prvků Neopomenout isotopy 13 C Příspěvek izotopů 13 C k intenzitě iontů M+1, M+2, M+3

41

42 Br 2 Cl ( 1, Cl + 0, Cl ) ( 1, Br + 0, Br ) ( 1, Br + 0, Br ) = 1,000 1,000 1, Cl 79 Br 79 Br + 0,320 1,000 1, Cl 79 Br 79 Br + 1,000 1,000 0, Cl 79 Br 81 Br + 1,000 0,973 1, Cl 81 Br 79 Br + 0,320 1,000 0, Cl 79 Br 81 Br + 0,320 0,973 1, Cl 81 Br 79 Br + 1,000 0,973 0, Cl 81 Br 81 Br + 0,320 0,973 0, Cl 81 Br 81 Br 1, , , ,303 13

43 Výpočet isotopového klastru

44 Hmotnostní spektrum Základní pík Molekulový ion M Isotopové píky [M+1] + C 4 H + 7 a/nebo C 2 H 3 O m/z = 98 O + C 5 H 7 O + CH 3 + a/nebo 83 15

45 Typická fragmentace nerozvětvených alkanů. m/z = 15 (methyl), 29 (ethyl), 43 (propyl), 57 (butyl). větvení ovlivní fragmentaci. více methylů M-15 ion (m/z = 71) je intenzivnější ztráta butylu (m/z = 57) téměř chybí dominantní je C 3 H 6 (m/z = 42) cyklický uhlovodík má stabilnější molekulový ion základní pík m/z=56 důsledkem ztráty ethenu alkenylové kationty m/z = 41 a 27 jsou intenzivnější ztráta CH 3 (m/z = 69) důsledkem přesmyku vodíku

46 Aromatické látky mají velmi stabilní molekulový pík; často vícenásobně nabitý.

47 alkylový řetězec m/z = 29 (27), 43 (41), 57 slabý molekulový ion, přítomnost M-H ztráta CO... m/z = = 28 ztráta C 3 H 6... m/z = = 44 Intenzivnější molekulový ion fragmentace u ketoskupiny C 3 H 7 COCH 3... m/z = 43 a 43 C 3 H 7 CO CH 3... m/z = 71 a 15 Intenzivnější molekulový ion fragmentace u ketoskupiny C 2 H 5 COC 2 H 5... m/z = 29 a 57

48

49 pro alkoholy typické m/z = 31 ztráta vody m/z = = 70 ztráta ethenu m/z = = 42 alpha-fragmentace C 2 H 5... m/z = = 59 ztráta vody m/z = = 41 silný molekulový pík silný M+2 u m/z = 92, 75 a 47 C 2 H 5 SC 2 H 5... m/z = 29 a 61 M - CH 3 m/z = 75 M - C 2 H 4 m/z = CH 3 m/z = 47

50 Ethery

51 slabý molekulární ion alpha-fragmentace m/z = 30 M - CH 2 NH 2 slabý molekulový ion alpha-fragmentace M - C 2 H 5 m/z = 58 ztráta amoniaku 58 - NH 3 m/z = 41 cyklická látka dává dobrý molekulový pík m/z = 85 alpha-fragmentace vodíku M-H m/z = 84 ztráta ethylu či ethenu m/z = 56 a 57 ztráta allylu M - C 3 H 5 m/z = 44

52

53 slabý molekulový pík alpha-fragmentace M - C 2 H 5 O m/z = 43 kuriosní ztráta vody m/z = = 70 alpha-fragmentace CH 3 CO 2 C 2 H 5 m/z 15 a 73 slabé CH 3 a C 2 H 5 m/z = 15 a 29 Isomerní ester silnější molekulový pík alpha-fragmentace M - CH 3 O m/z = 57 stabilní molekulový pík m/z = 73 alpha-fragmentace M - HCO m/z = 44

54 U nižších karboxylových kyselin jsou dominantní píky: M - OH, tj. M - 17 a M - CO 2 H, tj. M - 45

55 Halogenderiváty

56 Common Small Ions Common Neutral Fragments m/z composition mass loss composition 15 Da CH 3 1 Da H 17 OH 15 CH 3 18 H 2 O 17 OH 19 H 3 O, F 18 H 2 O 26 C 2 H 2, CN 19 F 27 C 2 H 3 20 HF 28 C 2 H 4, CO, H 2 CN 27 C 2 H 3, HCN 29 C 2 H 5, CHO 28 C 2 H 4, CO 30 CH 2 NH 2 30 CH 2 O 31 CH 3 O 31 CH 3 O 33 SH, CH 2 F 32 CH 4 O, S 34 H 2 S 33 CH 3 + H 2 O, HS 35(37) Cl 33 H 2 S 36(38) HCl 35(37) Cl 39 C 3 H 3 36(38) HCl 41 C 3 H 5, C 2 H 3 N 42 C 3 H 6, C 2 H 2 O, C 2 H 4 N 42 C 3 H 6, C 2 H 2 O, C 2 H 4 N 43 C 3 H 7, CH 3 CO 43 C 3 H 7, CH 3 CO 44 CO 2 O, CONH 2 44 C 2 H 4 O 45 C 2 H 5 O 46 NO 2 55 C 4 H 7 56 C 4 H 8 57 C 4 H 9 57 C 4 H 9 59 C 2 H 3 O 2 60 CH 4 CO 2 60 C 2 H 4 O 2 79(81) Br 64 SO 2 80(82) HBr 79(81) Br 91 C 7 H 7 80(82) HBr 127 I 127 I 128 HI 128 HI

57 Collision induced dissociation (CDI) MS/MS, MS 2,... MS n Vhodné pro získání strukturních informací a studium fragmentačních cest Analyzátor 1 Kolizní část Analyzátor 2 Spektrum Výběr iontu ( prekurzoru ) Fragmentace iontu Separace iontů ( produktů ) MS/MS

58

59 Molekulový ion Normalizace m/z 87 (100 %), 88 (46,9 %), 89 (3,1 %) 46,9/1,1 = 42,6 uhlíků 42*12 = 504, ale m/z je pouze 87 m/z 87 není molekulový pík Normalizace m/z 88 (100 %), 89 (6,7 %) 6,7/1,1 = 6,1 uhlíků 5*12 = 60 (5,5 % M+1)... C 5 H 28, C 5 N 2, C 5 H 12 O (DBE = 0), 6*12 = 72 (6,6 % M+1)... C 6 H 16 (příliš H, DBE = -1), C 6 O (DBE = 7) 7*12 = 84 (7,7 % M+1)...

60 fragmenty ztráty

61

62 4,4 % pro M+2 jedna síra... též má 0,8 % M+1 ( 5,1 0,8 ) / 1,1 = 3,9 uhlíků M + = 84 uhlíky ( 4 * 12 ) síra ( 1 * 32 ) = 4 vodíky DBE pro C 4 H 4 S = 3

63 žádné CH 3 ani C 2 H 5 cyklus

64 8-methylheptadekan

65 pyren

66 ethylbenzen

67 1,2-dichlorbenzen

68 1,2-dibrombenzen

69 1-chlorethan