Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoesi

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoesi"

Nikola Vítková
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 Cvičení

2 Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoesi ) 1)( ( ) ( H m z H m z M k j j j m z z zh M Molekula o hmotnosti M se nabije z-krát protonem, pík iontu ve spektru je na m z : ) ( H m z M z Pro dva sousední píky ve spektru (j,k) platí: j k k j m m H m z j k j k m m H m z vzorce pro výpočet nábojového stavu dvou sousedních iontů ve spektru = určení nábojového stavu (z) u některého iontu z lze určit z izotopického klastru ze vzdálenosti sousedních píků tj. 2

14 Interpretace MSMS spekter peptidů

15 Přehled aminokyselin v číslech AK Mono. Immoniové ionty Gly G Ala A Ser S Pro P Val V Thr T Cys C Leu L (72) Ile I (72) Asn N (70) Asp D Gln Q (84,129) Lys K (129, 112, 84, 70) Glu E Met M (61) His H (166,138,123,121,82) Phe F (91) Arg R (112, 100, 87, 73, 70, 59) Tyr Y (107, 91) Trp W (171, 170, 130, 117)

16 Jak spočítat hmotnost iontu? MW Σ(AK zbytek) + 18 b-ionty 1+b1+b2+b3+b4+ y-ionty 1+18+y1+y2+y3+y4+ A-ionty b-28 (CO) Immoniové ionty AK zbytek - 27

17 Cvičení I T F W Y N I L G E D K Určete MW, [M+H] +, [M+2H] 2+, [M+3H] 3+ Ionty: b5, y7

18 TFWYNILGEDK Monoisotopic (M) (M+H) (M+2H) (M+3H) (M+4H) Seq # B Y # T F W Y N I L G E D K

19 Cvičení II Určete MW peptidu, který nese současně následující modifikace Pyroglutamát na N-konci Amidace C-konce Fosforylace T4 Acylace C10 Disulfid C5-C7 Esterifikace MeOH Q D F T C I C Y I C N D K Dále spočítejte hodnoty m/z těchto fragmentů: a8, b4, y4

20 De novo sekvenování QTOF DDA experiment, CID fragmentace Určete sekvenci peptidu

21 Pravidla pro čtení peptidové sekvence Zjisti nábojový stav a spočítej M peptidu Zjisti jaká AK bude C- nebo N-koncová na základě štěpení a diagnostických markerů Tryptický štěp na C-konci R nebo K diagnostický y1 ion 175 pro R, 147 pro K Začni de novo od velkých m/z hodnot Zjisti pořadí AK dle rozdílu mezi fragmentačními ionty sekvenční Tag Dopočítej komplementární ionty, použij: y + b 1= [M+H] + y = (M+H) 1+ - b +1 b = (M+H) 1+ - y +1 Hledej komplementátrní ionty ve spektru, pozor na chybné kombinace sérií Hledej a- / b-iontové páry (rozdíl 28) Ztráta vody a amoniaku y a b ionty fragmentů obsahujících R, K, Q, N mohou ztrácet amoniak -17 y a b ionty fragmentů obsahujících S, T, E mohou ztrácet vodu -18. E (Glu) musí být na N-konci fragmentu Přítomnost immonioých iontů napovídá přítomnosti aminokyseliny v sekvenci (ale nemusí se nutně objevit) Nehledej b1 fragment, najdeš ho zřídka. Díky tomu je obtížnější určit pořadí prvních dvou aminokyselin na N-konci. Oblast o 60 m/z pod hodnotou m mateřského iontu může obsahovat ionty ztrácející vodu a amoniak. Opatrně na G, může být první v sekvenci Fragmenty mohou být vícenásobně nabité - zjisti dle isotopické obálky

22 Isobarické hmoty Leucine vs. Isoleucine isobarické. Nerozlišitelné v nízkoenergetických srážkách Lysine vs Glutamine si jsou blízké hmotností a (Rozdíl ) High res MS přístroj nutný (Q-TOF, orbitrap, ICR) Řešení - Acetylace Lys posune hmotnost peptidu a příslušných fragmentů o 42u Dipeptidy vs samotné aminokyseliny 114 (GG=N), 128(AG=Q,K), 156 (VG=R), 186 (EG, AD, SV=W)

23 Specifická fragmentace Zvýšená fragmentace v místě AK Histidine, Proline, kys. asparagová, kys. glutamová Výsledek nekompletní b-, y- série komplikace pro manuální nebo automatickou interpretaci

24 Vliv prolinu na MSMS spektrum Selektivní štěpení na N-konci Pro Vysoké intenzity y- a b- iontů z místa štěpení na C-konci ke štěpení nedochází P preferované místo pro zachycení náboje Jednosměrná fragmetnace Interní fragmenty s Pro na N-konci PROLINOVÉ Hyperštěpení

25 Vliv Histidinu na MSMS spektrum Zvýšení štěpení na obou koncích H Protonace postranního řetězce His + Arg, 1+ - NE His + Arg, 2+ - ANO His bez Arg - ANO His - preferované místo pro zachycení náboje Dvousměrné štěpení Interní fragmenty

26 Vliv Asp/Glu na MSMS spektrum Interakce mezi postraními řetězci Asp/Glu a Arg Specifické štěpení na C-konci Asp/Glu - y- ionty Počet Arg v sekvenci = počet přidaných protonů Lys nemá tento efekt

Podobné dokumenty

Aminokyseliny. Gymnázium a Jazyková škola s právem státní jazykové zkoušky Zlín. Tematická oblast Datum vytvoření Ročník Stručný obsah Způsob využití

Aminokyseliny. Gymnázium a Jazyková škola s právem státní jazykové zkoušky Zlín. Tematická oblast Datum vytvoření Ročník Stručný obsah Způsob využití Aminokyseliny Tematická oblast Datum vytvoření Ročník Stručný obsah Způsob využití Autor Kód Chemie přírodních látek proteiny 18.7.2012 3. ročník čtyřletého G Určování postranních řetězců aminokyselin