DISTANČNÍ OPORY PRO KOMBINOVANÉ STUDIUM BIOLOGIE GENETIKA. Jan Ipser. UNIVERZITA JANA EVANGELISTY PURKYNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA katedra biologie

Transkript

1 DISTANČNÍ OPORY PRO KOMBINOVANÉ STUDIUM BIOLOGIE GENETIKA Jan Ipser UNIVERZITA JANA EVANGELISTY PURKYNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA katedra biologie Ústí nad Labem

2 ÚVODNÍ POZNÁMKA Vážené studentky a studenti, dostává se vám do rukou studijní opora k předmětu Genetika. Je určena vám, kteří jste se stali posluchači bakalářského stupně studia oboru biologie realizovaného v kombinované formě na Přírodovědecké fakultě Univerzity J. E. Purkyně Ústí nad Labem. Záměrem autora bylo vytvořit relativně ucelený text z obecné genetiky, který by vám pomohl získat základní znalosti a orientaci v této biologické vědě. Obsahuje podstatné informace k tématickým celkům, které jsou blíže probírány na konzultacích, seminářích a cvičeních v rámci základního kurzu genetiky. Snahou autora zároveň bylo omezit na nezbytné minimum ty partie, které jsou probírány podrobně v jiných předmětech vašeho studijního programu, aby bylo zamezeno nadměrné duplicitě. Do předložené studijní opory proto nebyly zařazeny samostatné kapitoly z oblasti evoluční genetiky, genetiky prokaryot, hub, rostlin, živočichů a člověka, neboť jsou náplní jiných kurzů biologie, například biologie prokaryot nebo biologie člověka. Z obdobných důvodů byl rozsah některých dalších kapitol redukován (např. molekulární genetika). Studijní opora není koncipována jako učebnice pokrývající proporcionálně všechny stěžejní oblasti genetiky, ale jako studijní materiál, který je kompatibilní s příbuznými předměty zařazenými do výše uvedeného studijního programu biologie a tvoří s nimi jednotný celek. Je upravenou variantou učebního textu Základy genetiky, na který navazují již dříve vydaná skripta Úlohy a praktická cvičení z genetiky od téhož autora. Dovoluji si upozornit, že elektronická verze studijní opory Genetika je určena pouze pro vaše osobní studijní účely a nesmí být dále rozšiřována (kopírována). Přeji vám hodně úspěchů ve studiu genetiky i ostatních předmětů. V případě potřeby se neostýchejte využít všech dalších obvyklých a dostupných forem komunikace s vyučujícími (elektronické, telefonické, osobní) nad rámec uskutečněných konzultací. Autor 2

3 I. INFORMAČNÍ BIOMAKROMOLEKULY Za makromolekuly jsou obvykle označovány molekuly o relativní molekulové hmotnosti M r v rozsahu řádů V biologických systémech patří mezi základní makromolekuly (tzv. biomakromolekuly) polysacharidy, proteiny a nukleové kyseliny. Každá z těchto tří skupin organických látek představuje určitý typ polymerů. Polymer je makromolekula složená z mnoha kovalentně spojených nízkomolekulárních podjednotek (monomerů). Jsou-li tyto jednotky shodné chemickým složením, jedná se o homopolymery, liší-li se navzájem chemickým složením, jedná se o heteropolymery. Polymery, které se vyskytují v biologických systémech a tvoří jejich látkovou podstatu, jsou nazývány biopolymery; mezi ně náleží především nukleové kyseliny a proteiny. Nukleové kyseliny lze v tomto smyslu označit za specifický druh heteropolymerů, tvořených polynukleotidovými řetězci (tj. polymery nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovými vazbami); v případě DNA jsou to polydeoxyribonukleotidové řetězce (polydeoxyribonukleotidy) s deoxyribonukleotidy (damp, dgmp, dtmp, dcmp) jako monomery, v případě RNA jsou to polyribonukleotidové řetězce (polyribonukleotidy) s ribonukleotidy (AMP, GMP, UMP, CMP) jako monomery. Proteiny (bílkoviny) představují specifický druh heteropolymerů sestávajících z jednoho nebo více polypeptidových řetězců, což jsou polymery tvořené aminokyselinami jako monomery, navzájem spojenými peptidovými vazbami. Pojmem informační molekuly se označují ty (bio)makromolekuly, které zprostředkují uchování a přenos genetické informace v souladu s centrálním dogmatem molekulární biologie (tj. obecně ve směru DNA DNA a DNA RNA proteiny). Tomuto vymezení vyhovují polymery, jakými jsou nukleové kyseliny a proteiny; právě z polymerního charakteru těchto látek je možno vyvozovat jejich schopnost působit jako informační makromolekuly. Nukleové kyseliny a proteiny tak představují základní složky všech živých systémů s evolučně etablovanými, těsnými, vzájemně propojenými strukturně-funkčními vztahy determinujícími a zprostředkujícími na základě vnitřní jednoty autoreprodukci, autoregulaci a metabolismus (homeostázu) jako základní atributy živé hmoty i umožňujícími na základě vnitřní rozpornosti vývoj jak ve smyslu ontogenetickém, tak fylogenetickém. V další části tohoto učebního textu je pojednáno pouze o nukleových kyselinách, problematika ostatních biomakromolekul je rozvedena jinde. 3

4 I.1. NUKLEOVÉ KYSELINY Nukleové kyseliny jsou makromolekuly tvořené polynukleotidovými řetězci. Podle druhu polynukleotidového řetězce se rozlišují dva základní typy nukleových kyselin: 1. ribonukleové kyseliny (RNA) jsou to nukleové kyseliny (heteropolymery) složené z jednoho polyribonukleotidového řetězce, nebo ze dvou komplementárních polyribonukleotidových řetězců (obsahujících jako monomery AMP, GMP, UMP, CMP) spojených vodíkovými vazbami. 2. deoxyribonukleové kyseliny (DNA) jsou to nukleové kyseliny (heteropolymery) složené z jednoho deoxyribonukleotidového řetězce, nebo ze dvou komplementárních polydeoxyribonukleotidových řetězců (obsahujících jako monomery damp, dgmp, dtmp, dcmp) spojených vodíkovými vazbami. Stavební složky nukleových kyselin tvoří: 1. sacharid 2. kyselina fosforečná (zbytek) 3. dusíkaté báze pyrimidinové (C cytozin, T tymin, U uracyl) a purinové (A adenin, G guanin) Zastoupení těchto jednotlivých stavebních složek v DNA a RNA je uvedeno v následující tabulce: složka DNA RNA sacharid β-d-2 -deoxyribóza β-d-ribóza (cyklická furanóza) fosfát estericky vázaný estericky vázaný zbytek H 3 PO 4 zbytek H 3 PO 4 dusíkaté báze a) pyrimidinové tymin (T) uracyl (U) cytozin (C) cytozin (C) b) purinové adenin (A) adenin (A) guanin (G) guanin (G) Vytvořením N-glykozidové vazby mezi atomem C1 ribózy a atomem dusíku N1 pyrimidinové báze nebo atomem dusíku N9 purinové báze vznikne příslušný ribonukleozid (uridin U nebo Urd, cytidin C nebo Cyd, adenozin A nebo Ado, guanozin G nebo Guo). Vytvořením N-glykozidové vazby mezi atomem 4

5 C1 deoxyribózy a atomem dusíku N1 pyrimidinové báze nebo atomem dusíku N9 purinové báze vznikne příslušný deoxyribonukleozid (deoxytymidin dt nebo dthd, deoxycytidin dc nebo dcyd, deoxyadenozin da nebo dado, deoxyguanozin dg nebo dguo). V důsledku pseudorotace ribofuranózového kruhu se může sacharidová složka nukleozidů vyskytovat v nukleových kyselinách v konformaci C3 - endo (tzn. že oproti koplanárním atomům C1 - O C4 leží atomy C3 - C5 - N v jedné rovině, odlišné od roviny, ve které leží atom C2 ), nebo v konformaci C2 - endo (tzn. že oproti koplanárním atomům C1 - O C4 leží atomy C2 - C5 - N v jedné rovině, odlišné od roviny, ve které leží atom C3 ). N-glykozidová vazba mezi sacharidem a pyrimidinovou bází je antiklinální, kdežto N-glykozidová vazba mezi sacharidem a purinovou bází může být antiklinální nebo synklinální. Popsané jevy se tak spolupodílejí na výsledné konformaci nukleových kyselin. Vytvořením esterické vazby mezi zbytkem kyseliny fosforečné a OH-skupinou, vázanou na atom uhlíku C5 ribózy ribonukleozidu, vznikne příslušný ribonukleotid-5 -monofosfát, resp. zkráceně ribonukleotid (uridinmonofosfát UMP, cytidinmonofosfát CMP, adenozinmonofosfát AMP, guanozinmonofosfát GMP). Vytvořením esterické vazby mezi zbytkem kyseliny fosforečné a OH-skupinou, vázanou na atom uhlíku C5 deoxyribózy deoxyribonukleozidu, vznikne příslušný deoxyribonukleotid-5 -monofosfát, resp. zkráceně deoxyribonukleotid (deoxytymidinmonofosfát dtmp, deoxycytidinmonofosfát dcmp, deoxyadenozinmonofosfát damp, deoxyguanozinmonofosfát dgmp). V RNA se vytváří fosfodiesterová vazba mezi C3 jednoho ribonukleotidu a C5 následujícího ribonukleotidu. Postupným lineárním napojováním dalších ribonukleotidů prostřednictvím této vazby se kondenzačními reakcemi syntetizuje polyribonukleotidový řetězec. Obdobně se vytváří fosfodiesterová vazba v DNA mezi C3 jednoho deoxyribonukleotidu a C5 následujícího deoxyribonukleotidu a postupným lineárním napojováním dalších deoxyribonukleotidů se jejím prostřednictvím syntetizuje polydeoxyribonukleotidový řetězec. Syntéza polyribonukleotidového řetězce (RNA) i polydeoxyribonukleotidového řetězce (DNA) se v biologických systémech uskutečňuje ve směru 5 3 (je orientovaná); to znamená, že vždy následující ribonukleotidfosfát, resp. deoxyribonukleotidfosfát se za vzniku fosfodiesterové vazby připojí svým fosforylovaným 5 - koncem k 3 - konci předcházejícího (v řetězci již zabudovaného) ribonukleotidu, resp. deoxyribonukleotidu. I.1.1. KYSELINA DEOXYRIBONUKLEOVÁ - DNA DNA je obsažena v buňkách všech organizmů a virových částicích kromě RNA-virů. Vyskytuje se v nich v různých formách, a tak může být podle zvolených kritérií klasifikována do několika základních skupin: 5

6 1. podle počtu deoxyribonukleotidových řetězců DNA jednořetězcová = ssdna (single-stranded DNA): sestává z jednoho polydeoxyribonukleotidového řetězce DNA dvouřetězcová = dsdna (double-stranded DNA): sestává ze dvou komplementárních, antiparalelně orientovaných polydeoxyribonukleotidových řetězců V izolované douřetězcové DNA bylo opakovaně zjištěno, že: (a) molární množství purinových bází je rovno molárnímu množství pyrimidinových bází (A+G = T+C), (b) molární množství adeninu je rovno molárnímu množství tyminu (A=T) a molární množství guaninu je rovno molárnímu množství cytozinu (G = C). Tyto vztahy jsou známy jako tzv. Chargaffovo pravidlo. Později, v souvislosti s objasněním dvoušroubovicové struktury DNA, bylo prokázáno, že v dvouřetězcové molekule DNA se vytvářejí páry bází (v konfiguraci cis) spojené vodíkovými vazbami, přičemž: (a) vždy jedna z bází daného páru je purinová a jedna pyrimidinová, (b) se páruje adenin (v aminoformě) s tyminem (v oxoformě) dvěma vodíkovými vazbami (A = T) a guanin (v oxoformě) s cytozinem (v aminoformě) třemi vodíkovými vazbami (G C). Popsaný princip párování bází v dvouřetězcové molekule DNA, jehož důsledkem je vznik komplementárních polydeoxyribonukleotidových řetězců (resp. téměř komplementárních, neboť případný vznik chyby při párování bází nelze nikdy vyloučit), popisuje tzv. Watsonovo Crickovo pravidlo. Toto pravidlo lze též aplikovat při replikaci nukleových kyselin, při syntéze mrna (primárního transkriptu) podle templátu v průběhu transkripce, při hybridizaci nukleových kyselin a při interakci kodonu s antikodonem v průběhu translace; o těchto procesech je pojednáno dále. Z Watsonova Crickova pravidla existují některé výjimky. Mezi ně patří paralelní řetězce dsdna s bázemi v postavení trans a stejně orientovanými fosfodiesterovými vazbami, úseky dsdna, ve kterých jsou vodíkovými vazbami spárovány stejné báze (A-A, T-T, C-C, G-G) a více než dvouřetězcové (třířetězcové, čtyřřetězcové) DNA, resp. triády a tetrády bází. Výskyt takovýchto útvarů je omezen na specifické úseky nukleových kyselin, resp. na specifické molekulárně genetické procesy, a jejich vznik je podmíněn fyzikálně-chemickými vlastnostmi jednotlivých komponent DNA. S ohledem na mechanizmus syntézy polydeoxyribonukleotidových řetězců lze na každém z nich rozeznat 5 - konec a 3 - konec. V dvouřetězcové DNA (dsdna) jsou fosfodiesterové vazby obou řetězců navzájem opačně orientované a proto proti 5 - konci jednoho řetězce leží 3 - konec druhého řetězce a naopak (proti 3 - konci jednoho řetězce leží 5 - konec druhého řetězce). Oba řetězce jsou tedy vůči sobě orientovány antiparalelně. 6

7 2. podle tvaru DNA kružnicová jednořetězcová: nemá volné konce - dvouřetězcová a) kovalentně uzavřená kružnice (CCC, covalently closed circle): nemá volné konce, ani zlom v řetězcích b) otevřená kružnice (OC, open circle): má volné konce a alespoň jeden zlom v jednom řetězci DNA lineární jednořetězcová: má volné konce 5 a 3 - dvouřetězcová: má volné konce 5 a 3 3. podle lokalizace v buňce DNA jaderná (ndna): je součástí chromozomů eukaryot. Jejím analogem u prokaryot je nukleoid (prokaryotický chromozom). - mimojaderná mitochondriální (mtdna): v mitochondriích - chloroplastová (ctdna): v chloroplastech - plazmidová: v plazmidech DNA se může vyskytovat ve více strukturních úrovních: 1. PRIMÁRNÍ STRUKTURA DNA Primární strukturou DNA se rozumí sekvence deoxyribonukleotidů v řetězci DNA. Jednotlivé deoxyribonukleotidy (damp, dgmp, dtmp, dcmp) nejsou rozloženy v polydeoxyribonukleotidových řetězcích DNA rovnoměrně, náhodně, a proto můžeme v rámci genomu (resp. i jediné molekuly DNA či jednotlivých chromozomů) rozlišit určité typy dílčích sekvencí. Sekvence, které se v haploidním genomu vyskytují pouze jednou, označujeme jako sekvence unikátní; většinou jsou lokalizovány ve strukturních genech. Sekvence, které se v haploidním genomu vyskytují ve více kopiích, označujeme jako sekvence repetitivní (opakující se). Repetitivní sekvence mohou sestávat z různého, avšak pro danou repetici konstantního počtu deoxyribonukleotidů, který vyjadřuje délku repetice; zastoupení jednotlivých nukleotidů, jejich pořadí a počet v dané repetitivní sekvenci se označuje jako jednotka repetice a počet jednotek repetice v haploidním genomu jako četnost repetice. Repetitivní sekvence (repetice) lze klasifikovat v rámci genomu do několika dílčích typů: (1) krátké tandemové repetice: jednotky repetice jsou v nich uspořádány za sebou, např. ATGCATGC, obecně (ATGC) n, kde n = četnost repetice (2) přímá repetice: opakuje se na jednom řetězci DNA, avšak jednotlivé jednotky repetice jsou přerušovány jinými úseky nuleotidového řetězce, např....atgc...atgc...atgc...atgc... (3) rozptýlené repetice: jejich repetitivní jednotky jsou v genomu rozloženy na různých chromozomech haploidního genomu 7

8 (4) obrácené repetice: jsou vůči sobě komplementární, např....atgcgcat... nebo...atgc...gcat...; přiléhají-li komplementární úseky obrácené repetice bezprostředně k sobě (v našem případě...atgcgcat...), nazývají se palindromy (osově symetrické sekvence). Obrácené repetice umožňují párováním bází na jednom řetězci nukleové kyseliny tvorbu vlásenky bez smyčky (spárováním komplementárních bazí v palindromu, v našem případě...atgcgcat...), nebo vlásenky se smyčkou (spárováním komplementárních bází v rámci obrácené repetice přerušené jiným úsekem nukleotidového řetězce, v našem případě...atgc...gcat...). Obdobně párováním komplementárních bází v rámci obrácených repetic na obou řetězcích nukleové kyseliny vzniká křížová struktura. Vlásenky a křížové struktury jsou však již útvary vyšší, sekundární struktury DNA (resp. RNA). (5) dlouhá terminální repetice (= LTR-sekvence): vyskytuje se na obou koncích téhož řetězce DNA, přičemž konce takové sekvence jsou navzájem komplementární, např. ATGC...GCAT V primární struktuře DNA všech organizmů (kromě RNA-virů) je zakódována genetická informace, kterou se rozumí informace o primární struktuře proteinů (polypeptidů), ribonukleových kyselin typu rrna a trna a o vazbě specifických proteinů k určitým sekvencím DNA. Primární struktura DNA je tedy určující pokud jde o obsah genetické informace, její reprodukci (replikaci), přepis (transkripci) a následně též překlad (translaci). Konvenčně se sekvence deoxyribonukleotidů (bází) v řetězci DNA uvádí od 5 - konce. 2. SEKUNDÁRNÍ STRUKTURA Dvouřetězcová DNA může vytvářet vyšší, sekundární strukturu. Nejčastěji se vyskytující formou sekundární struktury je dvoušroubovice (helix), jejíž základní model lze popsat následujícími znaky: sestává ze dvou komplementárních antiparalelně orientovaných polydeoxyribonukleotidových řetězců ovíjejících společnou osu a uspořádaných tak, že páry bází (spojené vodíkovými vazbami podle Watsonova - Crickova pravidla) směřují dovnitř šroubovice a oporná pentózafosfátová (přesněji deoxyribózafosfátová) kostra na povrch šroubovice. V důsledku otáčení řetězců kolem osy dvoušroubovice dochází jednak v rámci jednotlivých komplementárních párů bází ke změně jejich vzájemné polohy v prostoru (tzv. vrtulový zkrut) a tím k posunu rovin proložených jednotlivými bázemi každého komplementárního páru bází o úhel zkrutu, který se udává pro C1 - atomy komplementárních deoxyribonukleotidů, jednak rotací párů bází kolem osy dvoušroubovice dochází ke změně jejich poloh (tzv. rovinný zkrut). Vzájemným obtáčením komplementárních řetězců se vytváří dvoušroubovicové vinutí, které může být pravotočivé nebo levotočivé. Protože jednotlivé páry bází jsou posunuty o určitou vzdálenost od osy dvoušroubovice, spojnice C1 - atomů příslušejících deoxyribózovým zbytkům jednotlivých komplementárních párů bází obvykle nejsou kolmé na osu dvoušroubovice a neprocházejí jí, vytváří povrch 8

9 dvoušroubovice reliéf, na kterém se rozlišují dva žlábky: menší a větší; ve žlábcích se některé skupiny atomů komponent polydeoxyribonukleotidových řetězců mohou účastnit interakcí s dalšími látkami, zejména proteiny. V závislosti na konkrétní deoxyribonukleotidové sekvenci a na vlastnostech prostředí (vlhkost, iontová síla apod.) může DNA vytvářet na úrovni sekundární struktury konformace energeticky adekvátní daným podmínkám. Konformace B se v živých buňkách vyskytuje nejčastěji (je přítomna ve všech buněčných organizmech a DNA virech) a představuje konformaci dvoušroubovice, popsané Watsonem a Crickem. Další základní konformací je konformace A, která je dobře známá z podmínek in vitro; v buňkách se vyskytuje za nižší vlhkosti (ve sporách mikroorganizmů). Konformace B a konformace A mohou v sebe navzájem přecházet. Vinutí u konformace A i B je pravotočivé. Třetí základní konformací DNA je konformace Z, která se uplatňuje při procesu rekombinace, některých regulacích genové exprese (např. při aktivaci určitých genů) a víceméně specifických molekulárně-biologických procesech; na rozdíl od předchozích dvou konformací je vinutí konformace Z levotočivé. Jednotlivé typy konformací DNA se liší v řadě znaků, z nichž hlavní jsou uvedeny v následující tabulce: znak dvoušroubovice DNA při konformaci B A Z vinutí pravotočivé pravotočivé levotočivé počet bp na 1 závit 10, zvýšení na 1 závit [nm] 3,4 2,5 4,6 zvýšení na 1 bp [nm] 0,34 0,23 0,38 větší žlábek široký, hluboký úzký, mělký mělký menší žlábek úzký, hluboký široký, mělký úzký, hluboký osa šroubovice vede přes páry bází větší žlábek menší žlábek konformace deoxyribózy C2 - endo C3 - endo konformace glykozidové anti anti C anti, G - syn vazby Sekundární struktura DNA (dvoušroubovice) může přecházet ve strukturu primární a naopak v závislosti mimo jiné na fyzikálně-chemických podmínkách prostředí. Účinek vyšších teplot nebo některých chemických látek (např. močoviny v dostatečně vysokých koncentracích v alkalickém prostředí) na dvoušroubovici DNA se může projevit přerušením vodíkových vazeb spojujících oba komplementární řetězce a přechodem dvoušroubovicové struktury v samostatné polydeoxyribonukleotidové řetězce. Takový proces se označuje jako denaturace (tepelná, resp. chemická). Průběh denaturace odráží nukleotidové složení konkrétní molekuly DNA, resp. relativní podíl deoxyribonukleotidových párů G-C v ní. Při tepelné denaturaci obecně platí, že se zvyšujícím se podílem párů G C se 9

10 zvyšuje teplota denaturace. Příčinou je spojení bází v každém páru G C třemi vodíkovými vazbami, kdežto bází v každém páru A T pouze dvěma vodíkovými vazbami a tudíž tomu odpovídající větší spotřeba energie na rozrušení tří vodíkových vazeb než dvou. Grafickým vyjádřením závislosti míry denaturace na teplotě je sigmoidální křivka. Praktický význam má teplota tání T m (melting temperature) definovaná jako teplota, při které zdenaturuje 50% dvoušroubovicových molekul DNA; poskytuje orientační informaci o složení konkrétní dsdna, uplatňuje se při analýze DNA (např. při přípravě ssdna pro PCR nebo sekvenování), hybridizaci nukleových kyselin, blotingu apod. Je třeba podotknout, že kromě nukleotidového složení DNA závisí T m na řadě dalších faktorů (jako je ph, iontová síla roztoku, přítomnost kationtů). Pominou-li podmínky pro denaturaci dvoušroubovicové DNA (např. povlovným poklesem teploty), mohou se oddělené polynukleotidové řetězce znovu komplementárně spojit a obnovit výchozí dvoušroubovicovou strukturu; takový proces se označuje jako renaturace. Je však třeba upozornit, že stav po renaturaci nemusí být zcela identický s původním stavem molekuly DNA před denaturací; jednou z příčin určité odchylky v těchto případech může být ne zcela důsledné dodržení principu komplementarity v průběhu renaturace. Reverzibilita přechodů z jedné strukturální úrovně DNA na jinou, popsatelná v termínech denaturačně-renaturační kinetiky, se uplatňuje v základních molekulárně-genetických procesech, jakými jsou replikace DNA a transkripce genetické informace a je rovněž využívána v řadě metod (technik) aplikovaných při genových manipulacích. 3. TERCIÁRNÍ STRUKTURA Fyzikálně-chemické vlastnosti sekundární struktury lineární i kružnicové DNA typu dvoušroubovice umožňují ještě její další vinutí (nadšroubovicové) do vyššího stupně spiralizace za vzniku nadšroubovice (superhelixu). Přechod šroubovice DNA (sekundární struktura) nadšroubovice (terciární struktura) je reverzibilní; jestliže sekundární struktura nebo primární struktura DNA vznikla relaxací terciární struktury, označuje se jako relaxovaná. Nadšroubovicové vinutí může být dvojího typu: (1) záporné, které se realizuje mechanismem odvíjení řetězců DNA. Toto odvíjení rezultuje v redukci vodíkových vazeb mezi řetězci DNA, což souběžně indukuje pnutí ve dvoušroubovici, které může být uvolněno vytvořením nadšroubovicových závitů (nadšroubovice). Záporné vinutí vede k vytvoření záporných nadšroubovicových závitů a záporné nadšroubovice. Záporným vinutím tak z relaxované kružnicové pravotočivé dsdna vznikne buď pravotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s levotočivými smyčkami; analogicky z relaxované kružnicové levotočivé dsdna vznikne buď levotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s pravotočivými solenoidovými smyčkami. 10

11 (2) kladné, které se realizuje mechanismem svinování řetězců DNA. Toto svinování rezultuje ve zvětšení počtu závitů ve dvoušroubovici DNA, což souběžně indukuje pnutí ve dvoušroubovici, které může být uvolněno vytvořením nadšroubovicových závitů (nadšroubovice). Kladné vinutí vede k vytvoření kladných nadšroubovicových závitů a kladné nadšroubovice. Kladným vinutím tak z relaxované kružnicové pravotočivé dsdna vznikne buď levotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s pravotočivými solenoidovými smyčkami; analogicky z relaxované kružnicové levotočivé dsdna vznikne pravotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s levotočivými solenoidovými smyčkami. Předpokladem vzniku nadšroubovicového vinutí v lineární molekule dsdna je fixace jejích konců (v případě chromozomů eukaryot k proteinovému lešení). Mechanismus spiralizace dvoušroubovice je pak obdobný jako v případě dsdna a rezultuje v nadšroubovicovou lineární DNA s nadšroubovicovými závity v podobě solenoidových smyček. Z výše uvedeného je zřejmé, že neexistuje pouze jediný, přesně definovaný typ nadšroubovice, ale může se jich vytvářet celá škála. K přesnější charakteristice konkrétní nadšroubovice (molekuly DNA) je možno využít topologické parametry: (l) celkové číslo vinutí (L) udává počet závitů v nadšroubovici, resp. celkový počet překřížení jednoho řetězce DNA druhým v nadšroubovici (2) dvoušroubovicové číslo (T) udává počet závitů v dvoušroubovici, resp. celkový počet překřížení jednoho řetězce druhým v dvoušroubovici (3) nadšroubovicové číslo (W) udává celkový počet nadšroubovicových závitů v nadšroubovici, resp. celkový počet překřížení dvoušroubovice v nadšroubovici. Mezi těmito topologickými parametry platí vztah: L = T + W přičemž čísla L a T konvenčně nabývají kladných hodnot (pro pravotočivou dvoušroubovici), číslo W nabývá záporných hodnot pro záporné nadšroubovicové závity (záporná nadšroubovice), kladných hodnot pro kladné nadšroubovicové závity (kladná nadšroubovice), nebo hodnotu 0 pro relaxovanou molekulu DNA. Prostřednictvím uvedeného vztahu můžeme posuzovat stupeň relaxace nebo nadšroubovicového vinutí určité molekuly DNA. K tomu lze rovněž využít komparace konkrétní hodnoty celkového čísla vinutí L s hodnotou celkového čísla vinutí L 0 udanou pro úplně relaxovanou molekulu DNA za daných podmínek. Obecně platí: je-li L = T (W = 0), jedná se o relaxovanou molekulu; je-li L < T, jedná se o zápornou nadšroubovici; je-li L > T, jedná se o kladnou nadšroubovici. Molekuly DNA, které se navzájem liší celkovým číslem vinutí L a molekuly DNA, jejichž celkové číslo vinutí L L 0, se označují jako topologické izomery. Na topologických proměnách molekul DNA (kladných i záporných nadšroubovic) participují topoizomerázy. Tyto enzymy jsou přítomny v buňkách 11

12 prokaryotických i eukaryotických organismů. Podle mechanismu, kterým se realizuje změna celkového čísla vinutí dsdna, jsou klasifikovány do dvou základních skupin: Topoizomerázy I katalyzují v nadšroubovicové DNA přenos intaktního řetězce přes zlom ve druhém řetězci. Projevem jejich účinku na kružnicovou ssdna může být též vznik uzlů tím, že se volné konce v místě zlomu polydeoxyribonukleotidového řetězce provléknou a znovu spojí; proces vzniku uzlů se označuje jako zauzlení. Topoizomerázy II katalyzují přenos intaktní dsdna přes zlomy obou řetězců dvoušroubovice. U kružnicových dsdna mohou vést k vytvoření katenanů tím, že mezi dvěma či více takovými molekulami DNA katalyzují jejich vzájemné provlečení volnými konci v místech zlomů deoxyribonukleotidových řetězců, následované restitucí zlomů; proces vzniku katenanů se označuje jako katenace. 4. CHROMATIN Chromatin je komplex dsdna a proteinů tvořící významnou složku buněčného jádra (chromozomů) eukaryot. Stav chromatinu se dynamicky mění v průběhu celého buněčného cyklu. Tyto změny se cytologicky projevují rozdílným stupněm spiralizace (kondenzace) chromatinových vláken (resp. chromozomů), který úzce souvisí především s realizací základních genetických procesů v buněčném jádru (replikace, transkripce), s karyokinezí, cytokinezí a s procesy diferenciace buněk. Elementární stavební jednotkou chromatinu je nukleozom; sestává z oktameru histonů (H2A, H2B, H3, H4), úseku DNA obtáčející histonový oktamer (necelé dva závity, délka přibližně 200 bp) a histonu H1, který není součástí histonového oktameru, ale z vnější strany se napojuje na koncové oblasti úseku DNA obtáčející histonový oktamer. Oktamer histonů je v úseku nukleozomu uspořádán jako soubor tetrameru (H3) 2 -(H4) 2 a dvou dimerů (H2A-H2B) 2. Z nukleozomu lze enzymaticky uvolnit histon H1 (při částečné degradaci DNA); vzniklý útvar se označuje jako jádro nukleozomu (= histonový oktamer + úsek DNA, která ho obtáčí). Zpravidla se vymezují tři organizační úrovně chromatinu odpovídající třem stupňům jeho spiralizace: (1) nukleozomové řetězce (10 nm vlákno) Nukleozomový řetězec je tvořen souborem jader nukleozomů spojených molekulou lineární dsdna. Průměr tohoto řetězce je přibližně 10 nm a proto se též označuje jako 10 nm chromatinové vlákno; je typické pro interfázní buněčné jádro, představuje nejvyšší stupeň despiralizace chromozomů a strukturu, která umožňuje replikaci DNA i transkripci genetické informace. (2) solenoid (30 nm vlákno) Na vzniku solenoidu participuje histon H1. Každá zúčastněná molekula histonu H1 se z vnější strany jedním svým fibrilárním koncem napojí na oktamer histonů 12

13 jednoho nukleozomu v místě výstupu úseku DNA, která ho obtáčí a svou globulární (hydrofobní) částí na specifická místa úseku DNA, která leží mezi oběma sousedními nukleozomy (resp. jádry nukleozomů) nukleozomového řetězce. V důsledku takového připojení histonu H1 dochází k přiblížení a spiralizaci nukleozomů v nukleozomovém řetězci za vzniku solenoidu, ve kterém na jeden závit připadá šest nukleozomů. Průměr solenoidu je přibližně 30 nm a proto se též označuje jako 30 nm vlákno; toto vlákno se váže na tzv. proteinové lešení oblastí DNA označovanou jako SAR (scaffold attachment region), kdežto ostatní úseky DNA jsou uspořádány ve formě smyček jako tzv. chromatinové domény. Proteinové lešení je tvořeno řadou proteinů převážně nehistonového typu, které plní významné biologické funkce (např. polymerázy, topoizomerázy, proteiny HMG, některé transkripční faktory). 30 nm vlákno je útvarem, který umožňuje transkripci genetické informace v chromatinových doménách; vyskytuje se v interfázním jádře a v časných stadiích profáze. Histon H1, kromě zřejmě nezastupitelné funkce při formování solenoidu (spiralizaci nukleozomového řetězce), plní též funkci ochrany DNA před účinkem nukleáz. (3) mitotický chromozom ( nm vlákno) Postupnou kondenzací 30 nm vláken v průběhu mitózy se vytvářejí nm chromatinová vlákna (chromatidy), charakteristická zejména pro metafázní chromozomy, v nichž stupeň spiralizace dosahuje maxima. Toto uspořádání chromatinu již neumožňuje replikaci DNA, ani transkripci genetické informace. Chromatin chromozomů eukaryotických organismů lze rozdělit do dvou kategorií: (1) euchromatin je to chromatin dekondenzovaný, transkripčně aktivní (2) heterochromatin je to chromatin kondenzovaný, transkripčně inaktivní Heterochromatin, který je v některých částech chromozomů (telomery, centromery) obsažen trvale (tj. po celý buněčný cyklus, ve všech buňkách a ve všech ontogenetických stadiích) se označuje jako konstitutivní. Heterochromatin, který se v závislosti na stadiu ontogenetického vývoje může stát euchromatinem (a naopak), se označuje jako fakultativní. Molekulární mechanizmy přechodu chromatinu ze stavu heterochromatinového do stavu euchromatinového a ze stavu euchromatinového do stavu heterochromatinového je možné považovat za bazální mechanismy plnící zřejmě nezastupitelnou roli při realizaci diferenciačních a specializačních procesů v ontogenezi každého jedince. Právě jejich působením lze přijatelně vysvětlit časoprostorově přesně vymezené zapínání a vypínání zcela určitých genových oblastí v průběhu ontogenetického vývoje, resp. funkční zapojení pouze specifické množiny genů z komplexního (zpravidla diploidního) buněčného genomu v diferencované tkáni nebo orgánu mnohobuněčného organismu. 13

14 I.1.2. KYSELINY RIBONUKLEOVÉ - RNA Základní údaje o stavbě ribonukleových kyselin byly již uvedeny. Na tomto místě pouze připomeneme, že RNA může sestávat z jednoho nebo dvou polyribonukleotidových řetězců. Základními stavebními jednotkami RNA jsou ribonukleotidy (AMP, GMP, UMP, CMP) spojené fosfodiesterovou vazbou mezi atomy C3 a C5 dvou sousedních zbytků ribózy. Dusíkaté báze vytvářejí v dvouřetězcových molekulách RNA (resp. v dvouřetězcových úsecích molekul RNA) podle Watsonova - Crickova pravidla platného pro RNA komplementární páry, spojené vodíkovými vazbami (tedy páry A = U se dvěma vodíkovými vazbami a G C se třemi vodíkovými vazbami). Na základě principu komplementarity bází mohou vznikat hybridní molekuly mezi různými molekulami RNA ( hybrid RNA RNA), nebo mezi molekulou DNA a molekulou RNA ( hybrid DNA RNA). V buňkách prokaryot i eukaryot se vyskytují tři základní druhy RNA: mediátorová (informační) ribonukleová kyselina (mrna), ribozomová nukleová kyselina (rrna) a transferová ribonukleová kyselina (trna). RNA se může vyskytovat na třech strukturních úrovních: primární, sekundární, terciární. Primární strukturou RNA se rozumí sekvence ribonukleotidů v polyribonukleotidovém řetězci RNA. Sekundární struktura vzniká vytvořením dvouřetězcové molekuly RNA, resp. dvouřetězcových úseků v molekule RNA. Dalšími interakcemi mezi určitými oblastmi molekuly může vzniknout i struktura terciární, která je mnohdy nezbytná pro plnění biologické funkce příslušné makromolekuly. Jednotlivé základní druhy RNA vytvářejí různé typy sekundární a terciární struktury, v nichž se odráží zejména odlišný způsob syntézy a funkcí mrna, rrna a trna v buňce. Všechny základní druhy RNA se podílejí na realizaci (expresi) genetické informace, každý z nich specifickým způsobem. Kromě toho u RNA-organismů (RNA-viry) je RNA nositelkou genetické informace, zakódované v její primární struktuře. I MEDIÁTOROVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA mrna Mediátorová ribonukleová kyselina (mrna = messenger RNA, dříve též informační ribonukleová kyselina = irna) se syntetizuje v průběhu přepisu (transkripce) genetické informace podle matričního řetězce (templátu) DNA, příp. RNA (u některých RNA-virů). U prokaryotických organismů je produktem transkripce (tzv. primární transkript) přímo mrna, která je bezprostředně transportována (obvykle ještě před dokončením transkripce) na ribozomy (resp. polyribozom), kde se podílí na překladu (translaci) genetické informace z formy sekvence ribonukleotidů do formy sekvence aminokyselin (tj. do primární struktury) polypeptidového řetězce (proteinu) jednoznačně určené právě sekvencí ribonukleotidů mrna. U eukaryot bývá primárním transkriptem zpravidla premediátorová RNA (pre-mrna), která je posttranskripčně upravována. Chemické úpravy na jejích 14

15 koncích (čepička na 5 - konci, polyadenylace na 3 - konci) souvisejí se stabilizací molekuly RNA, jejím transportem do cytoplazmy a částečnou ochranou před účinkem ribonukleáz (v buňce je mrna účinně enzymaticky hydrolyzována ribonukleázami; proto je její životnost většinou časově omezená a podíl na celkovém obsahu RNA velmi nízký). Sestřihem mohou být z molekuly pre-mrna odstraněny určité úseky (tzv. introny), které se nepřekládají (netranslatují) do primární struktury polypeptidového řetězce. mrna je tedy tím druhem RNA, který vzniká transkripcí strukturních genů (tj. genů kódujících primární strukturu určitého polypeptidového řetězce či proteinu) a v průběhu translace plní funkci matrice při biosyntéze polypeptidového řetězce na ribozomu. I TRANSFEROVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA trna V buňce neexistuje pouze jeden typ transferové RNA, ale více. Teoreticky musí být přítomen minimálně jeden typ trna pro každou ze souboru 20 (resp. 21 včetně selenocysteinu) standardních aminokyselin, avšak ve skutečnosti je jednotlivých typů trna v buňce ještě více. Přes tuto různorodost existují obecné zákonitosti ve struktuře jednotlivých typů trna. Všechny molekuly trna sestávají z poměrně krátkých ribonukleotidových řetězců (kolem ribonukleotidů) a jejich relativní molekulová hmotnost je tudíž poměrně malá (kolem ). Kromě standardních bází (A, G, U, C) trna obsahují ještě několik nestandardních bází rezultujících z enzymatických modifikací již nasyntetizovaného polyribonukleotidu: jsou to pseudouridin, dihydrouridin, hypoxantin, inozin, ribotymidin, tiouridin, 5-metyl-2-tiouracyl, 1-metylguanozin, quenozin, N 6 -izopentenyladenozin, kyselina uracyl-5-octová nebo její metylester. Velká část polyribonukleotidového řetězce trna obsahuje komplementární báze a proto trna vytvářejí sekundární strukturu, která má charakteristickou podobu jetelového listu. Tento útvar sestává ze čtyř hlavních ramen (akceptorové, pseudouridinové, antikodonové, dihydrouridinové) a jedné variabilní smyčky (dlouhé nebo krátké). Akceptorové rameno zahrnuje 5 - i 3 -konec, přičemž přes OH-skupinu C2 nebo C3 zbytku ribózy AMP koncové sekvence CCA na 3 -konci se váže příslušná aminokyselina. Pseudouridinové rameno (TψC) vytváří smyčku obsahující pseudouridin. Dihydrouridinové rameno (DHU) vytváří smyčku obsahující dihydrouridin. Antikodonové rameno vytváří smyčku, ve které je lokalizován antikodon, což je triplet komplementární k příslušnému tripletu (kodonu) mrna. Variabilní smyčka se nachází mezi pseudouridinovým a antikodonovým ramenem; podle délky této smyčky (vyjádřené počtem ribonukleotidů, z nichž sestává) se trna dělí na dvě skupiny: na trna první třídy (s krátkou variabilní smyčkou) a trna druhé třídy (s dlouhou variabilní smyčkou). 15

16 Četnými interakcemi a především vlivem vodíkových vazeb mezi bázemi ribonukleotidů smyčky dihydrouridinového ramena a variabilní smyčky se formuje terciární struktura trna. Tato struktura se uplatňuje, mimo jiné, při realizaci proteosyntézy na ribozomech. trna vznikají přepisem genů pro trna. I RIBOZOMOVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA rrna Rovněž ribozomová ribonukleová kyselina existuje ve více typech, které vznikají přepisem (transkripcí) genů pro rrna, lokalizovaných většinou v jadérku. Zpravidla se charakterizují hodnotou sedimentační konstanty. Jednotlivé typy rrna se podílejí především na stavbě ribozomů a spoluúčastní se procesů, které se na nich realizují (proteosyntéza). 16

17 II. GENETICKÁ INFORMACE A GENETICKÝ KÓD Jak již bylo uvedeno výše, termínem genetická informace se rozumí informace determinovaná sekvencí deoxyribonukleotidů v DNA (resp. ribonukleotidů v RNA u RNA-organizmů) o primární struktuře proteinů, o primární struktuře trna a rrna (obecně funkčních RNA), o vazbě specifických proteinů k molekule DNA (resp. RNA) a v případě RNA-organizmů též o primární struktuře DNA. Mezi významné vlastnosti genetické informace patří vysoká stabilita, vysoký stupeň specifičnosti v rámci druhu, schopnost téměř bezchybné autoreprodukce (replikace) a přenosu směrem vertikálním (z generace na generaci) i horizontálním (např. při konjugaci, transdukci, transformaci nebo mitotickém dělení buněk mnohobuněčného organizmu); tyto vlastnosti jsou nezbytné pro zachování evolvovaných struktur a funkcí uspořádaných otevřených systémů, jakými organizmy na jakékoli úrovni fylogenetického vývoje jsou. Zároveň je však nukleovým kyselinám vlastní možnost změny nukleotidové sekvence (mutabilita) rezultující v adekvátní změnu genetické informace (mutace); mutabilita v nejobecnější rovině prezentuje další základní vlastnost DNA, jejímž prostřednictvím se vytváří nový materiál pro biologickou evoluci. Genetickou informaci lze charakterizovat jako vnitřně rozpornou, protikladnou: na jedné straně se projevuje jako konzervativní tím, že se reprodukuje, přenáší a exprimuje v nezměněné podobě (smyslu), na straně druhé se projevuje jako progresivní tím, že může být pozměněna následkem změny struktury jejího materiálního substrátu (DNA, resp. RNA) a ve změněné podobě, není-li tato ve svých důsledcích letální, následně zakonzervována. Je třeba podotknout, že ve způsobu řešení této dialektické rozpornosti genetické informace v interakci s faktory prostředí (environmentu) spočívají základní zákonitosti vývoje ve smyslu fylogenetickém i ontogenetickém. Uvědomění si a pochopení nerozlučitelnosti momentu konzervativního a progresivního při jejich současně relativní protikladnosti v případě genetické informace (resp. struktury nukleových kyselin) je východiskem pro pochopení vzájemnosti (vzájemné podmíněnosti a souvislosti) dědičnosti a proměnlivosti organizmů, respektive pro pochopení jednoty základních principů darwinizmu a mendelizmu. Je-li genetická informace obsažena v sekvenci nukleotidů DNA (popř. RNA) a determinuje-li tato sekvence nukleotidů sekvenci aminokyselin v polypeptidových řetězcích proteinů, pak je třeba se ptát: Jaký je vztah (kvantitativní i kvalitativní) mezi těmito dvěma kategoriemi sekvencí? Jak je genetická informace zakódována? Jaké jsou vlastnosti genetického kódu? Jak se genetická informace uchovává, jak se přenáší, jaký je její vnější (fenotypový) projev? Pokusme se tyto otázky zodpovědět. V polydeoxyribonukleotidových řetězcích DNA je jedinou reálnou variabilní komponentou jejich struktury pořadí (sekvence) deoxyribonukleotidů (zkráceně bází); jednotky deoxyribózafosfátové kostry jsou uniformní. Z definice genetické 17

18 informace vyplývá, že soubor variant o určitém počtu nukleotidů determinuje soubor dvaceti (příp. jednadvaceti) standardních aminokyselin zabudovávaných při proteosyntéze do polypeptidových řetězců proteinů. Za předpokladu, že jedna báze DNA (A, G, T nebo C) určuje právě jednu aminokyselinu v polypeptidovém řetězci, byly by takto jednoznačně určeny pouze čtyři aminokyseliny, neboť jejich počet by byl dán počtem variací s opakováním k-té třídy z n-prvků V k (n) = 4 1 = 4. Za předpokladu, že jednu aminokyselinu v polypeptidovém řetězci jednoznačně determinuje dvojice bází, pak by mohlo být determinováno 16 aminokyselin, neboť celkový počet variací s opakováním by v tomto případě byl V k (n) = 4 2 = 16. V obou uvažovaných případech je počet variací s opakováním nižší než počet standardních aminokyselin a proto předpoklady, že k jednoznačnému určení každé ze souboru standardních aminokyselin je postačující jedna báze nebo dvojice bází DNA, zamítáme. Za vyhovující lze přijmout až předpoklad, že každá ze souboru standardních aminokyselin je determinována trojicí bází; v tomto případě by počet variací s opakováním byl V k (n) = 4 3 = 64. Na základě takovéto deduktivní úvahy byla Watsonem a Crickem odvozena jedna ze základních vlastností genetického kódu, která byla experimentálně mnohokrát potvrzena: genetický kód je tripletový, to znamená, že je sestaven z třínukleotidových sekvenčních jednotek (z nichž každá determinuje určitou standardní aminokyselinu, anebo plní jinou funkci). Vzhledem k tomu, že počet možných variací tripletů za účasti čtyř různých bází je 64, lze připustit, že některé aminokyseliny jsou kódovány jednou variantou tripletu, jiné více variantami tripletů a že některé varianty tripletů nemusejí kódovat žádnou aminokyselinu. Experimentálně byly tyto předpoklady plně potvrzeny. Skutečnost, že některé varianty tripletů mohou kódovat stejný druh aminokyseliny a současně některé varianty tripletů nekódují žádnou aminokyselinu, se označuje jako degenerace genetického kódu a proto je genetický kód označován jako degenerovaný. Genetická informace se exprimuje prostřednictvím transkripce (přepisu) a translace (překladu). Transkripcí strukturních genů vzniká jako konečný produkt mrna, jejíž sekvence ribonukleotidů je komplementární (podle pravidla o párování bází) k sekvenci deoxyribonukleotidů toho řetězce DNA, který plnil funkci templátu (matrice). Triplety mrna jsou označovány jako kodony. O kodonech mrna, které determinují aminokyseliny v polypeptidovém řetězci říkáme, že mají smysl, kdežto o kodonech, které nekódují žádnou aminokyselinu, říkáme, že jsou nesmyslné nebo beze smyslu (nonsens); nesmyslné kodony signalizují začátek (iniciační kodon AUG) nebo konec syntézy polypeptidového řetězce (terminační kodony UAA, UAG, UGA). Při translaci (překladu genetické informace) se s jednotlivými kodony, jejichž pořadí v molekule mrna determinuje pořadí aminokyselin v konkrétním polypeptidovém řetězci, dočasně komplementárně spojují příslušné druhy trna takzvanými antikodony, tj. triplety lokalizovanými v jejich antikodonovém rameni. Každá trna, která se účastní procesu translace na ribozomu, má na svém 18

19 akceptorovém rameni navázánu molekulu aminokyseliny odpovídající danému kodonu. Lineárním řazením jednotlivých molekul trna (s navázanými aminokyselinami) komplementárně k sekvenci ribonukleotidů mrna jsou při translaci vytvořeny na ribozomu podmínky pro vznik peptidové vazby mezi karboxylovou skupinou jedné aminokyseliny a aminoskupinou sousední (následující) aminokyseliny. Vzájemným uspořádáním molekul mrna, trna s navázanými aminokyselinami a specifických oblastí ribozomů je umožněna translace jako základní mechanizmus proteosyntézy. Genetický kód (tvořený celkem 64 kodony) tedy můžeme definovat jako systém pravidel, podle nichž jednotlivé kodony mrna určují řazení aminokyselin do polypeptidu. Standardní genetický kód je přehledně uveden v následující tabulce: první ribonukleotid druhý nukleotid kodonu třetí ribonukleotid kodonu U C A G kodonu Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser term. term. A (SeCys) Leu Ser term. Trp G Leu Pro His Arg U C Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A inic. Thr Lys Arg G Met Val Ala Asp Gly U G Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Aminokyseliny kódované šesti různými kodony: arginin (Arg) CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG leucin (Leu) UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG serin (Ser): UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC 19

20 Aminokyseliny kódované čtyřmi různými kodony: alanin (Ala) GCU, GCC, GCA, GCG glycin (Gly) GGU, GGC, GGA, GGG prolin (Pro) CCU, CCC, CCA, CCG treonin (Thr) ACU, ACC, ACA, ACG valin (Val) GUU, GUC, GUA, GUG Aminokyseliny kódované třemi různými kodony: izoleucin (Ile) AUU, AUC, AUA Aminokyseliny kódované dvěma různými kodony: asparagin (Asn) AAU, AAC tyrozin (Tyr) UAU, UAC cystein (Cys) UGU, UGC fenylalanin (Phe) UUU, UUC glutamin (Gln) CAA, CAG histidin (His) CAU, CAC kys. asparagová (Asp) GAU, GAC kys. glutamová (Glu) GAA, GAG lyzin (Lys) AAA, AAG Aminokyseliny kódované jedním typem kodonu: metionin (Met) AUG (též kodon iniciační) tryptofan (Trp) UGG selenocystein (Secys) UGA (též kodon terminační) Odlišné kodony se stejným smyslem jsou kodony synonymní a jak je patrné z tabulky standardního genetického kódu, je jich většina. Z nich ty, které se liší pouze ribonukleotidem ve třetí pozici, vytvářejí tzv. kodonovou rodinu. Některé další synonymní kodony lze seskupit do tzv. dvoukodonových sad, přičemž každá dvoukodonová sada sestává ze dvou synonymních kodonů, z nichž jeden má ve třetí pozici G a druhý A, anebo jeden má ve třetí pozici C a druhý U. Kodony nesmyslné lze z hlediska jejich funkce rozdělit do dvou skupin, z nichž jednu představují kodony terminační (UAA, UAG, UGA) a druhou skupinu představuje jeden kodon iniciační (AUG). Zde je však třeba poznamenat, že některé z těchto kodonů jsou bifunkční; jedná se o iniciační kodon AUG, který jednak signalizuje začátek syntézy polypeptidového řetězce, jednak kóduje aminokyselinu metionin, a o terminační kodon UGA, který jednak signalizuje ukončení syntézy polypeptidového řetězce, jednak může kódovat aminokyselinu selenocystein. 20

21 Při podrobnější analýze tabulky standardního genetického kódu je možno všech 64 variant kodonů rozdělit do těchto skupin: 8 kodonových rodin, 13 dvoukodonových sad (5 typu GA, 8 typu CU), 1 bifunkční iniciační kodon, 3 terminační kodony (z nichž 1 je bifunkční), 1 nesynonymní kodon (UGG pro tryptofan) a 1 kodon (AUA) pro izoleucin. Při vytváření vazby kodonu s antikodonem se neuplatňuje vždy Watsonovo- Crickovo pravidlo o párování bází zcela důsledně. Je-li totiž v prvním ribonukleotidu antikodonu guanin, může se párovat s uracylem nebo cytozinem ribonukleotidu ve třetí pozici kodonu; je-li v prvním ribonukleotidu antikodonu uracyl, může se párovat s adeninem nebo guaninem ribonukleotidu ve třetí pozici kodonu, případně je-li v prvním ribonukleotidu antikodonu hypoxantin, může se párovat s adeninem, uracylem nebo cytozinem ribonukleotidu ve třetí pozici. Tento jev se označuje jako kolísavé párování bází. V jeho důsledku může být počet molekulárních typů trna, postačujících k syntéze polypeptidových řetězců za využití souboru dvaceti různých aminokyselin, zredukován až na 32 (včetně iniciační trna ) z 61, jichž by bylo zapotřebí v případě striktního uplatnění pravidla o párování bází. Smysl jednotlivých kodonů je ve všech organizmech shodný (až na nečetné výjimky týkající se především odchylek v mitochondriálním genetickém kódu). Genetický kód (či přesněji standardní genetický kód, uvedený v tabulce) lze tudíž považovat za univerzální. Shrneme-li výše uvedené informace, můžeme konstatovat tři charakteristické znaky genetického kódu: je tripletový, degenerovaný a univerzální. 21

22 III. KONCEPCE GENU Genetická informace je strukturně a funkčně diferencovaná. Její základní jednotkou je gen. Gen lze definovat jako určitý úsek molekuly DNA (resp. RNA u RNA-virů), který obsahuje informaci o primární struktuře určitého polypeptidu (proteinu), trna, rrna, nebo o vazbě specifických molekul proteinů k molekule DNA. Geny, které kódují primární strukturu nějakého polypeptidu jako produktu translace, se označují jako geny strukturní. Geny, které kódují primární strukturu funkčních trna a rrna, tedy molekul RNA, které nejsou translatovány, se označují jako geny pro funkční RNA. Geny, které obsahují informaci nutnou pro rozpoznání specifickým proteinem, jsou označovány jako geny (nebo oblasti) regulační. Expresí genetické informace strukturních genů a genů pro funkční RNA vznikají určité vlastní produkty těchto genů (polypeptidy), kdežto expresí regulačních genů žádný vlastní produkt nevzniká. Vzhledem k tomu, že nukleotidy v řetězcích DNA (resp. RNA) jsou uspořádány lineárně, jsou též jednotlivé geny řazeny lineárně. Pořadí genů je, nebereme-li v úvahu mutační změny, konstantní a specifické pro každý druh. Jak víme, DNA jako nositelka genetické informace interaguje v eukaryotických buňkách s dalšími buněčnými komponentami. Mohou tak vznikat složitější struktury, které obsahují DNA s lineárně seřazenými geny; takové struktury se nazývají genofory. Genoforem RNA-virů je pouze vlastní RNA, genoforem DNA-virů nebo prokaryotické buňky je pouze vlastní DNA. V těchto případech se zpravidla jedná o jednu kružnicovou molekulu DNA, která je u virů obklopena kapsidem a u prokaryot lokalizovaná volně v prostředí cytoplazmy, neboť buněčné jádro v morfologickém slova smyslu se v buňkách těchto organizmů nevyskytuje; útvar jemu odpovídající se označuje jako nukleoid a sám genofor jako bakteriální (resp. prokaryotický) chromozom. Typickým genoforem eukaryotických buněk je chromozom, který představuje nukleohistonový komplex, lokalizovaný v morfologicky vyvinutém buněčném jádru. Každé jádro eukaryotické buňky obsahuje (za normálního stavu) konstantní počet morfologicky specificky individualizovaných chromozomů; to znamená, že celková genetická informace je v buněčném jádru rozdělena a to zcela striktně do několika (minimálně dvou) částí, reprezentovaných jednotlivými chromozomy (minimálně jedním párem chromozomů jako je tomu např. u škrkavky). V eukaryotických buňkách je genetická informace lokalizována nejen v buněčném jádru, ale též v dalších organelách: v mitochondriích buněk rostlin, hub i živočichů a v chloroplastech buněk rostlin. Ani u bakterií není jediným genoforem veškeré genetické informace bakteriální chromozom; kromě něho může být v jejich cytoplazmě přítomna jedna nebo více kružnicových molekul vytvářejících útvary, označované jako plazmidy. Společnou vlastností plazmidové, 22

23 chloroplastové a mitochondriální DNA je relativní nezávislost (autonomie) na buněčném jádru (jaderném genomu), resp. nukleoidu. Soubor veškeré genetické informace (všech genů) v buňce nebo ve virové částici se označuje jako genom. V eukaryotických buňkách je jeho převážná část umístěna v buněčném jádru a reprezentuje tzv. jaderný genom. Výrazně menší část genomu je umístěna jednak v mitochondriích a reprezentuje mitochondriální genom, jednak u rostlin ještě v chloroplastech, kde reprezentuje chloroplastový genom. Mitochondriální a chloroplastový genom bývají někdy označovány jako mimojaderný, extranukleární nebo cytoplazmatický genom. Analogicky u bakterií tvoří hlavní část genomu bakteriální chromozom (resp. nukleoid), kdežto menší část genomu tvoří plazmidová DNA. Mezi jednotlivými složkami genomu buňky existují vzájemné vztahy při současném zachování jejich relativní samostatnosti (autonomie). Genom buňky jako celek je tedy vnitřně strukturovaný, diferencovaný a organizovaný. Počet kopií jaderných genoforů v buňce vyjadřuje stupeň ploidie. Ve virových částicích a v prokaryotických (bakteriálních) buňkách funkci genoforu plní zpravidla pouze jedna molekula DNA (příp. RNA u RNA-virů); takové organizmy označujeme jako haploidní. Eukaryotické somatické buňky obsahují větší počet chromozomů v párovém uspořádání; takové buňky označujeme jako diploidní. Eukaryotické gametické buňky (gamety), vznikající jako produkt redukčního dělení (meiózy), obsahují poloviční počet chromozomů buněk somatických (diplodních), tj. po jednom členu od každého páru homologických chromozomů, a označujeme je jako haploidní. Každý jednotlivý genofor je charakterizován určitou uspořádanou množinou genů, která se označuje jako vazbová skupina. Chromozomy se shodnými vazbovými skupinami jsou nazývány homologické, chromozomy s odlišnými vazbovými skupinami se nazývají nehomologické. Homologické chromozomy v eukaryotických diplodních (somatických) buňkách vytvářejí homologické páry, tj. páry chromozomů se shodnou sadou genů uspořádaných ve shodném pořadí a shodně umístěných. U gonochoristů se vyskytují tzv. pohlavní chromozomy neboli gonozomy (též heterochromozomy či sex-chromozomy), přičemž pár homologických chromozomů primárně determinuje vznik jednoho pohlaví a pár nehomologických (resp. částečně homologických) chromozomů primárně determinuje vznik opačného pohlaví. Všechny ostatní chromozomy, kromě gonozomů, se vyskytují v diploidních buňkách důsledně jako páry homologických chromozomů. Počet vazbových skupin v diploidní eukaryotické buňce je obecně roven počtu párů homologických chromozomů. Místo, na kterém je daný gen na chromozomu lokalizován, se nazývá lokus. Každý gen se vyskytuje zpravidla alespoň ve dvou formách, které označujeme jako alely (Pozn.: Je třeba podotknout, že existují i geny, od kterých známe zatím pouze jednu variantu, tedy jednu alelu, avšak na druhé straně jsou známy celé alelové série u některých genů). Protože gen představuje určitý úsek molekuly DNA (resp. RNA u RNA-virů), je zřejmé, že jednotlivé alely se v tomto úseku liší sekvencí 23