MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2013 MARIE HAMRŠMÍDOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Expresní profily biosyntetických genů cytokininů a markerů buněčného dělení při iniciaci růstu laterálních pupenů hrachu Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Jozef Balla, Ph.D. Vypracovala: Bc. Marie Hamršmídová Brno 2013

3

4

5 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Expresní profily biosyntetických genů cytokininů a markerů buněčného dělení při iniciaci růstu laterálních pupenů hrachu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. Dne... Podpis diplomantky...

6 PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu mé diplomové práce Ing. Jozefu Ballovi, Ph.D. za odborné vedení při zpracování mé práce. Také děkuji Ing. Petrovi Kalouskovi, Ph.D. a Ing. Zuzaně Medveďové.

7 ABSTRAKT Hamršmídová M. Expresní profily biosyntetických genů cytokininů a markerů buněčného dělení při iniciaci růstu laterálních pupenů hrachu. Diplomová práce. Brno, Tato práce se zabývá sledováním exprese genu účastnícího se biosyntézy cytokininů (PsIPT1) a také genu kódujícího markery buněčného dělení (PsCDC2) v druhých axilárních pupenech hrachu setého (Pisum sativum L.) po uvolnění z jejich růstové inhibice (dormance) a sledováním inhibice a exprese těchto genů ve stonkových pletivech. Dále byla sledována i exprese genu PsDRM1, který je považován za marker dormantního stavu rostlinných struktur. V experimentech byly zahrnuty varianty s dekapitací vzrostného vrcholu stonku, v nichž byla identifikována snížená exprese PsDRM1, zvýšená exprese PsCDC2 a také mírně zvýšená exprese genu PsIPT1. Dekapitací vzrostného vrcholu byly axilární pupeny vymaněny z růstové inhibice. Po aplikaci 1% kyseliny indolyloctové (IAA) na dekapitovaný pahýl stonku došlo k mírnému navýšení genu PsIPT1, exprese genu PsCDC2 se výrazně neměnila, stejně jako exprese genu PsDRM1. Po aplikaci IAA pupeny druhého nodu zůstávají inhibovány, neboť efekt dekapitovaného vrcholu byl nahrazen exogenní aplikací IAA. Dále byla sledována exprese výše uvedených genů po aplikaci 1% benzyladeninu (BAP) na axilární pupeny intaktních rostlin. Po její aplikaci na druhý axilární pupen byla zaznamenána zvyšující se exprese genu PsCDC2 a zároveň pokles exprese genu PsDRM1. Exprese genu PsIPT1 se výrazně neměnila. Exogenní aplikace cytokininu na axilární pupen intaktních rostlin zajistí iniciaci jejich růstu a vymanění z růstové inhibice, i přes funkční apikální meristém stonku. U varianty stonkových segmentů odebraných z dekapitovaného stonku a stonku ošetřeného po dekapitaci IAA byla zaznamenána mírně se zvyšující se exprese genu PsIPT1 stejně jako genu PsCDC2 u obou variant experimentu. Klíčová slova: cytokininy, auxin-cytokininové interakce, IAA, BAP, PsCDC2, PsIPT1

8 ABSTRACT Hamršmídová M. Expression profiles of cytokinin biosynthetic genes and markers of cell division in the initiation of growth of lateral buds of pea. Thesis. Brno, The study deals with the examination of gene expression involved in cytokinin biosynthesis (PsIPT1) and the gene which encodes markers of cell division (PsCDC2) in the second axillary buds of pea (Pisum sativum L.) after the release of their growth inhibition (dormancy). The study also deals with the monitoring inhibition and expression these genes in stem tissues. The expression of gene PsDRM1 was also studied. This gene is considered the dormancy associated gene state of plant structures. The experiments included variants with decapitation of shoot apical meristem in which the expression of gene PsDRM1 was identified decrease, there was overexpression of gene PsCDC2 and slightly overexpression of gene PsIPT1. The axillary buds were broken of growth inhibition by decapitation of the top. After the application of 1% indoleacetic acid (IAA) on decapitated stump stem there was slight increase of gene PsIPT1, expression of gene PsCDC2 was not significantly changed, as well as expression of gene PsDRM1. Buds of second node remain inhibited after application of IAA because the effect of decapitated peak was replaced by an exogenous applications of IAA. There was also observed expression of genes mentioned above after the application of 1% benzyladenine (BAP) to the axillary buds of intact plants. This application of BAP indicated the expression of gene PsCDC2 and decrease in expression of gene PsDRM1. Gene expression of PsIPT1 did not change significantly. Exogenous application of cytokinin on the axillary bud of intact plants ensures initiation of their growth and breaking of growth inhibition, despite there is a functional apical meristem. In the variant of stem segments which was taken from decapitated stem and stem which was treated after decapitation by application of IAA we observed slightly increasing expression of gene PsIPT1 as well gene PsCDC2 in both variants of the experiment. Keywords: cytokinin, auxin-cytokinin interaction, IAA, BAP, PsCDC2, PsIPT1

9 OBSAH OBSAH... 8 ÚVOD CÍLE PRÁCE I. TEORETICKÁ ČÁST APIKÁLNÍ DOMINANCE TEORIE O APIKÁLNÍ DOMINANCI Nutritivní teorie Přímá auxinová inhibiční teorie Teorie nepřímé auxinové inhibice Teorie interakce auxinu a cytokininů Teorie o vaskulárních spojeních Autoinhibiční teorie vzniku apikální dominance Transitní hypotéza pupenů Kanalizační teorie a teorie kompetitivní kanalizace auxinu CYTOKININY BIOSYNTÉZA Biosyntéza izoprenoidních cytokininů Enzymy podílející se na biosyntéze Lokalizace biosyntézy Regulace biosyntézy cytokininů METABOLISMUS Konjugace a oxidace cytokininů TRANSPORT CYTOKININŮ SIGNALIZACE II. PRAKTICKÁ ČÁST EXPERIMENTÁLNÍ PROVEDENÍ POKUSU ROSTLINNÝ MATERIÁL METODY Odběr vzorků pro studium genové exprese Varianty experimentů Izolace rostlinné RNA... 35

10 3.2.4 Spektrofotometrické měření koncentrace RNA Potvrzení integrity vyizolovaných vzorků RNA Dvoukroková RT PCR Elektroforetické rozdělení v agarózovém gelu VÝSLEDKY A DISKUZE ROSTLINNÝ MATERIÁL (PISUM SATIVUM L.) EXPERIMENTÁLNÍ VÝSLEDKY: ČÁST I EXPERIMENTÁLNÍ VÝSLEDKY: ČÁST II EXPERIMENTÁLNÍ VÝSLEDKY: ČÁST III ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK... 79

11 ÚVOD Nadvláda lodyžního vrcholu nad laterálními pupeny se označuje jako apikální dominance. Studium apikální dominance lodyžního vrcholu je často prováděno na modelových rostlinách hrachu setého (Pisum sativum, L.). Polární transport auxinu směřující z lodyžního vrcholu přes buňky xylémového parenchymu ve stonku je kontrolním mechanizmem inhibice pupenů a zachování nadvlády apikálního vrcholu. V případě porušení vlivu apexu jeho odstraněním či oslabením dochází k vymanění postranních pupenů z této nadvlády, což umožní růst axilárních pupenů. Vyrůstající pupeny se pak pro rostlinu stávají novými zdroji auxinu. Vývoj rostliny je kontrolován prostřednictvím poměru hladin auxinů a cytokininů. Již mnoho let je studován mechanizmus kontroly auxinu nad cytokininy a opačně, stejně tak jako jejich vzájemný vliv na biosyntézu a transport. Práce se zaměřuje na sledování expresního profilu biosyntetického genu cytokininů PsIPT1, markerového genu buněčného dělení PsCDC2 a marekerového genu dormance PsDRM1 na různých modelech experimentu. 10

12 CÍLE PRÁCE 1. Na základě dostupných literárních zdrojů zhodnotit aktuální stav poznatků v tématice apikální dominance a rostlinných hormonů se zaměřením na cytokininy. 2. Seznámit se s problematikou studia genové exprese biosyntetických genů cytokininů a markerů buněčného dělení u hrachu setého. 3. Praktické provedení exprerimentů (izolace rostlinné RNA, RT PCR reakce, PCR agarózová ELFO). 4. Studium exprese vybraných genů v axilárních pupenech a stonkových internodiích po dekapitaci, dekapitaci a aplikaci auxinu na dekapitovaný stonkový pahýl a po aplikaci cytokininu na axilární pupeny intaktních rostlin. 5. Zpracování získaných dat a následné zhodnocení v závěrečné práci. 11

13 I. TEORETICKÁ ČÁST 12

14 1 APIKÁLNÍ DOMINANCE Apikální dominance je fyziologickým jevem kontroly lodyžního vrcholu nad růstem axilárních pupenů (Cline, 1997). Nejlépe je tato kontrola demonstrována při odstranění apexu. V případě odstranění či porušení intaktního vzrostného vrcholu dojde k uvolnění jednoho nebo více postranních pupenů z inhibice, jež začnou růst (Cline, 1997). Již dřívější studie (Thimann a Skoog, 1933) předpověděly, že vyvíjející se laterální pupeny u dekapitovaných rostlin produkují tehdy neznámou látku, kterou bez dekapitace neprodukovaly. Důkaz, že IAA je syntetizována v apikálním meristému lodyhy, napomohl objevu náhrady dekapitovaného vrcholu exogenně aplikovaným auxinem, po aplikaci kterého laterální pupeny zůstávají inhibovány (Thimann a Skoog, 1934). V regulaci apikální dominance hraje hlavní roli signální molekula auxinu, avšak její přesný způsob účinku není zcela objasněn (Ongaro a Leyser, 2008). Pro regulaci apikální dominance je klíčový auxin, protože geny zapojené do biosyntézy auxinu, transportu a signalizace jsou zapotřebí pro zahájení činnosti axilárních meristémů (McSteen, 2009). Auxin syntetizovaný ve stonkovém apikálním meristému je transportován bazipetálně polárním auxinovým transportem a přímo nebo nepřímo inhibuje růst axilárů (Durbak et al., 2012). Při overexpresi auxinových genů je zesílen vliv apikální dominance a značně potlačen růst laterálních pupenů (Cline, 1994). Silný vliv na větvení stonku mají také cytokininy, kdy mnoho studií potvrdilo jejich oslabující vliv na apikální dominanci (Ongaro a Leyser, 2008). Vzájemné spolupůsobení auxinů a cytokininů má vliv na celé množství centrálních procesů, jež se odehrávají v rostlinném těle, kdy nejvíce se jejich působení odráží na apikální dominanci stejně tak na vývoji stonku či kořenového systému. Už pokusy Millera a Skooga (1955) ukázaly důležitost rovnováhy těchto skupin fytohormonů při organogenezi in vitro, kdy zvýšení auxinové hladiny oproti cytokininům zapříčinilo zvýšenou tvorbu kořenů, přičemž opačný poměr měl za následek stonkový nárůst. 13

15 1.1 Teorie o apikální dominanci Nutritivní teorie Na přelomu 19. a 20. století se výzkum apikální dominance opíral o povědomí, že při apikální dominanci se u rostlin jedná o kompetici v oblasti výživy meristematických pletiv pupenů, a to postranních pupenů a pletiv apikálního vrcholu. Postranní pupeny jsou v tomto případě odděleny od přísunu živin, které jsou odčerpány vzrostným meristémem. Postranní pupeny jsou pak díky nadvládě apexu v růstové inhibici (Goebel, 1900) Přímá auxinová inhibiční teorie Korelačně inhibiční vliv apexu může být nahrazen látkou s inhibičními vlastnostmi, kterými disponuje auxin (Thimann a Skoog, 1933, 1934). Exogenní aplikace auxinu na místo dekapitovaného vzrostného vrcholu blokuje růst postranních pupenů. Vrcholový pupen, jenž rychle roste, stejně tak jako mladé listy s intenzivně se dělícím pletivem jsou hlavní zdrojové oblasti pro auxinovou biosyntézu. Na základě těchto poznatků byla vyslovena přímá auxinová inhibiční teorie, která za zdroj auxinu považuje vzrostný vrchol, z něhož auxin proudí ve stonku bazipetálně a vstupuje přímo do postranních pupenů, v nichž k syntéze IAA zřejmě nedochází (Thimann a Skoog, 1933; 1934) Teorie nepřímé auxinové inhibice Podle této teorie auxin, který je v lodyze stonku obsažen, pravděpodobně chrání lodyhu před inhibicí jinými látkami a díky tomu apex, jenž je bohatý na obsah auxinu, může růst. Laterální pupeny s nízkým obsahem auxinu se ale nachází v růstové inhibici a nejsou tedy před inhibitory chráněny auxinem (Snow, 1925). Teorie nepřímé auxinové inhibice využívá auxin ke kontrole nad sekundárními inhibitory ve stonku, jimiž by mohla být kyselina abscisová, etylen, či látky oligosacharidové povahy. 14

16 1.1.4 Teorie interakce auxinu a cytokininů Cytokininy mohou hrát roli sekundárního signálu, jenž interaguje s auxinem, kdy pokles auxinu při dekapitaci vyvolá následné zvýšení hladiny cytokininů, které jsou dopraveny z kořenového systému (Morris, 1977, Wareing a Phillips, 1981), nebo jejich autonomní syntézu v aktivovaných pupenech (Sachs a Thimann, 1967). Cytokininy mohou také posilovat zdroj živin a podpořit i transport těchto potřebných látek, jež zahajují růst laterálních pupenů (Yi et al. 1992). Stafstrom (1993) navrhl hypotézu auxin-cytokininové kontroly, která ovlivňuje apikální dominanci, přičemž auxiny pochází ze vzrostného vrcholu lodyhy a cytokininy jsou transportovány z kořenů. Po dekapitaci jsou cytokininy syntetizovány přímo ve stonku, protože dojde k narušení kontroly auxinu nad specifickými adenosinmonofosfát-izopentenyltransferázami, u hrachu se jedná o PsIPT1 a PsIPT2, které zahajují biosyntézu cytokininů (Tanaka et al., 2006). Auxiny a cytokininy antagonisticky kontrolují větvení stonku (Muller a Leyser, 2011, Shimizu-Sato et al., 2009). Auxin inhibuje expresi IPTs (ISOPENETENYL TRANSFERASES) a downreguluje CK biosyntézu (Nordström et al., 2004) navíc auxin zvyšuje expresi genu CKX2 (cytokinin OXIDASE2), zapojeného do degradace cytokininů (Shimizu-Sato et al., 2009). Na druhé straně bylo prokázáno, že zvýšená hladina cytokininů indukuje biosyntézu auxinů v mladých listech a rozvíjejících se pletivech kořenového a apikálního meristému u Arabidopsis, zatímco snížené hladiny cytokininů měly vliv opačný (Jones et al., 2010) Teorie o vaskulárních spojeních Teorie spojuje hypotézu přímé auxinové inhibice a nutričně diverzní teorii. Jedná se o úlohu auxinu jako korelačního inhibitoru, který blokuje tok růstových látek do laterálních pupenů. Inhibované pupeny nejsou také schopny vytvořit kompletní vaskulární napojení na stonkovou vaskulaturu, v případě že jsou pupeny inhibovány (Sorokin a Thimann, 1964). V laterálních pupenech modelové rostliny hrachu mladších než 9 dnů nebyla pozorována žádná plně vyvinutá vodivá pletiva, která by zajišťovala spojení pupenu k hlavnímu vaskulárnímu toku u rostlin. U rostlin 13-ti denních již vaskulární propojení xylému vytvořeno bylo, ale přesto laterální pupeny stále zůstávaly v růstové inhibici (Tepper, 1993). 15

17 1.1.6 Autoinhibiční teorie vzniku apikální dominance Autoinhibiční hypotézu auxinového transportu zveřejnili Bangerth (1989) a podle této teorie orgány, jako jsou laterální pupeny, zůstávají dormantní, protože nejsou schopny zajistit vlastní polární auxinový transport do stonku. U rostoucích axilárních pupenů, je však tento transport auxinu blokován a je plně zajištěn průtok auxinu hlavním stonkovým transportem, kdy přísun auxinů z axilárních pupenů je omezen Transitní hypotéza pupenů Tato hypotéza si zakládá na tom, že existují alespoň 3 vývojové fáze pupenu, a to fáze inhibičního růstu, tedy dormance, přechodová fáze a fáze trvalého růstu pupene (Stafstrom a Sussex, 1992, Devitt a Stafstrom, 1995, Cline, 1997, Napoli et al., 1999, Shimizu- Sato a Mori, 2001, Morris et al., 2005, Beveridge, 2006). Dormantní stav nastává při velmi nízké či zanedbatelném růstu axilárů, i přesto že v této fázi jsou pupeny metabolicky aktivní. Pravděpodobně existuje přechodná fáze, kdy axilární pupen je citlivější než klasický dormantní pupen a vnímá signály, jež podporují jejich iniciaci růstu. Přesto se však z této přechodné fáze mohou vrátit i do stavu inhibice (Madoka a Mori, 2000). Samotná ztráta auxinu, přímo nebo nepřímo, nezahajuje růst pupenů, avšak ostatní faktory mají schopnost zareagovat na změny v obsahu auxinu. Morris et al. (2005) zjistili, že dekapitace způsobuje rychlé šíření signálu, který aktivuje dormantní pupen pro vstup do transitní fáze. V této přechodové fázi začíná pupen předběžně růst, kdy je iniciován počáteční, ale ne trvalý růst, který se objevuje i v IAA ošetřených, dekapitovaných rostlinách hrachu Kanalizační teorie a teorie kompetitivní kanalizace auxinu Rostlinné buňky obecně jsou uzpůsobeny k transportu auxinu, ale masivní transport auxinu je kanalizován pouze do buněk k tomu určených. Auxin začne polarizovat buňky podle směru průtoku a nové cévní kanály se vytváří podél těchto buněk (Sachs, 1981). Vytvořené auxinové transportní kanály zpětnovazebně kontrolují výkonnosti auxinového 16

18 transportu a směr toku samotného auxinu může zapříčinit změny v polarizaci PIN proteinů (Sauer et al., 2006), stejně tak stabilizaci PIN proteinů v plasmatické membráně (Paciorek et al., 2005). V případě existence dvou zdrojů auxinu dochází k jejich kompetici, kdy jeden zdroj může inhibovat vytváření kanalizačního transportu z druhého sekundárního zdroje (Balla et al., 2011). Primární auxinový zdroj brání vývoji a kanalizaci auxinu ze sekundárního zdroje laterálního pupenu. Vytvoření kanalizačního transportu ze sekundárního zdroje je umožněno v případě odstranění nebo oslabení zdroje primárního. Primární zdroj auxinu může být mechanicky odstraněn dekapitací, kdy dochází k narušení polárního transportu auxinu ve stonku a vytváří se kanály pro transport auxinu z axilárních pupenů. Výrazný transport auxinu z axilárních pupenů je podle Balla et al., (2011) způsoben polarizací PIN1 proteinů, jež vytváří transportní kanály, které jsou nezbytné pro transport auxinu z axilárních pupenů. 17

19 2 CYTOKININY Přírodní cytokininy a jejich deriváty jsou vysoce rozmanité struktury. Již první objevitelé Skoog a Armstrong nazvali cytokininy, těmi strukturami, jež podporovaly buněčnou proliferaci a regulovaly i jiné růstové funkce podobně jako již známý kinetin (Skoog a Armstrong, 1970). Cytokininy jsou deriváty adeninu s izoprenoidním nebo aromatickým postranním řetězcem. V závislosti na hydroxylaci a redukci postranního řetězce izoprenoidních cytokininů, které jsou běžně rozšířeny v přírodě, se jedná o izopentenyladenin, trans-zeatin, cis-zeatin či dihydrozeatiny. Aromatické cytokininy jako N6-(metha-hydroxybenzyl)adenin se u rostlin vyskytují v menší míře (Strnad, 1997, Sakakibara, 2006). Cytokininy jsou pravděpodobně syntetizovány v kořenech, odkud jsou pak transportovány do ostatních nadzemních částí rostliny prostřednictvím xylémového transportu. Je však zřejmé, že v rostlině existuje řada orgánů s autonomní syntézou cytokininů, kdy vysoká intenzita cytokininové biosyntézy byla zachycena u dělících se buněk a rostoucích pletiv. První identifikovaný cytokinin byl kinetin, izolovaný z DNA spermií sledě (Miller a Skoog, 1955). Není to však přirozený fytohormon a nebyl identifikován v rostoucích rostlinách. Na rozdíl od něj se přirozeně vyskytuje trans-zeatin (tz), jehož první izolace proběhla z endospermu kukuřice (Letham, 1963). V následujících letech byla objevena celá řada cytokininových hormonů, přirozeně se vyskytující v různých rostlinných druzích (Mok a Mok, 2001, Strnad, 1997). Cis-cytokininy byly pozorovány v několika rostlinných druzích, ačkoli jejich aktivita není nijak výrazná a fyziologická funkce dosud nebyla potvrzena (Sakakibara, 2010). Jeden z návrhů jejich funkce je, že tvoří depozitní stav a tato přechodná forma je transportována do stonku, kde je struktura změněna na trans izomer cytokininu (Bassil et al., 1993). Cytokininy s aromatickým kruhem byly identifikovány jen v několika druzích rostlin topolu (Strnad, 1997) či Arabidopsis (Tarkowska et al., 2003). Mezi tyto cytokininy patří například methatopolin (mt) s jeho nejvyšší aktivitou. Byly objeveny jak volné báze, tak nukleotidy a nukleosidy, stejně tak glukosidy (Strnad, 1997), z čehož se usuzuje souvislost metabolické cesty spjaté s izoprenoidními cytokininy. Vzájemná přeměna methat, orthot a BA (benzyladeninu) ještě charakterizována zatím nebyla. Zda má na biosyntézu aroma- 18

20 tických cytokininů vliv AtIPT, která se podílí na biosyntéze izoprenoidních cytokininů, také není prozkoumáno (Sakakibara, 2010). Nukleosidy, nukleotidy a další cukerné konjugáty mohou být základem přeměn pro vznik cytokininů. Vyskytují se i jiné méně známé cytokininy, jejichž přítomnost v živých pletivech dosud nebyla potvrzena, přestože byly poprvé izolovány z kokosového mléka. Dnes víme, že se jedná o syntetické cytokininy fenylureového typu (Mok a Mok, 2001). Díky moderní vědě bylo charakterizováno i několik metabolických enzymů, které byly purifikovány a u nichž byly dokonce zjištěny příslušné geny podílející se na vzniku těchto syntetických cytokininů (Sakakibara, 2010). 2.1 Biosyntéza Cytokininy jsou přítomny ve dvou formách jako volné báze v konfiguraci trans a také jako vázané součásti molekul trna poblíž 3 - konce antikodonu. Cytokinin jako součást trna vzniká vnesením izopentenylového řetězce, kdy následuje hydroxylace a celá reakce vyústí za vzniku cis-zeatinu. Transferové RNA nejsou hlavním zdrojem aktivních cytokininů, neboť jejich obsah v buňkách je velmi malý (Akiyoshi et al., 1983). Zatímco je auxin rychlým regulátorem biosyntézy cytokininů, cytokininy samotné mají vliv pomalejší. Rozhodující je poměr mezi endogenní koncentrací těchto dvou skupin fytohormonů (Hopkins, 1995) Biosyntéza izoprenoidních cytokininů Pro tuto biosyntézu je předpokládáno vyžití dvou možných cest. První způsob je odvozen z degradace trna, druhá cesta se týká izopentenylace volného adeninnukleotidu. Cesta degradace trna byla objevena u hlenky (Dictyostelium discoideum) (Taya et al., 1978), u níž byl zjištěn původ prvních dvou cytokininů ipr (izopentenylribozidmonofosfát) a ip (izopentenylfosfát), jež vznikly z dimethylallyldifosfátu (edmapp) a adenosinmonofosfátu (AMP) za katalýzy uskutečněné pomocí IPT (izopentenyltransferáza) (Sakakibara, 2010). Izoprenoidní řetězec cis-zeatinu je pravděpodobně vázán na biosyntetickou dráhu lokalizovanou v cytoplasmě, avšak část cz může být vytvářena degradací již zmíněných (cishydroxy)izopentenyl trna. Cytokininové typy cz se vyskytují převážně u jednoděložných 19

21 rostlin (Miyawaki et al. 2006, Kakimoto, 2001), ale jejich fyziologická účast na vývoji rostliny není dosud pochopena, ale pravděpodobně by mohly regulovat růst při omezených růstových podmínkách (Gajdošová et al., 2011). Izopentenyladeninové ribozidfosfáty a trans-zeatin ribozidfosfáty jsou na aktivní cytokininy převáděny prostřednictvím odtržení fosfátové skupiny a následnou ribozylací zbytku či pouze jedním krokem pomocí lonely guy - LOG, což je ribozid-5 monofosfátfosforibohydroláza (Kurakawa et al., 2007, Kuroha et al., 2009). Trans-zeatin pak vzniká z izopentenyladeninu (ip) prostřednictvím katalýzy cytochromu P450 monooxygenázy (CYP735A1/A2), kdy dochází k hydroxylaci metylové skupiny na řetězci ip (Takei et al., 2004). Cytokininy typu ip a tz jsou biologicky aktivní a jsou vytvářeny přednostně v chloroplastech prostřednictvím IPT využívající jako substrát ATP nebo ADP. Projevy exprese těchto cytokininových genů pro ip a tz jsou závislé na přítomnosti IPT. tz se pravděpodobně pohybuje akropetálně přes xylémový parenchym a ip spíš bazipetálně nebo systematicky skrz lýko (Matsumoto-Kitano et al., 2008). U mutanta Arabidopsis s overexpresí genu LOG vedla tato exprese ke snížení ip ribozidmonofosfátu a zvýšení samotného ip, což se projevilo fenotypem s nadprodukcí cytokininů, který měl významně zpomalený proces stárnutí a zároveň snížen vliv apikální dominance. Mnohonásobné mutanty log AtLOG způsobily cytokininovou necitlivost při exogenní aplikaci ip ribozidů (Kuroha et al., 2009). Biosyntéza cytokininů byla důkladně prozkoumána u rostlin transformovaných půdní bakterií Agrobacterium tumefaciens, jež nese gen izopentenyltransferázu, přičemž volné cytokininy se syntetizují reakcí -2-izopentenylpyrofosfátu s 5 -AMP, kdy vzniká N 6 - ( 2 - izopentenyl)-adenozin-5 -fosfát (Akiyoshi et al., 1983). Izopentenyltransferáza Analýza u hlenky potvrdila, že její IPT může využít jako izoprenoidního příjemce AMP i ADP (Ihara et al., 1984). Kódující gen pro IPT byl však objeven u Agrobacterium tumefaciens, které je původcem crown gall disease (Akiyoshi et al., 1984, Barry et al., 1984). Dnešní poznatky vypovídají o dvou genech IPT a to tmr a tzs. V T-DNA Ti-plazmidu se vyskytuje gen trm a tzs je vázán na vir oblast Ti plazmidu. Poté, co Agrobacterium infikuje 20

22 rostlinu, se trm inkorporuje do hostitelského rostlinného genomu. Tzs zůstává funkční uvnitř samotných bakteriálních buněk (Sakakibara, 2010). Agrobakteriální IPT může katalyzovat přímou přeměnu AMP a derivátu DMAPP na tzrmp (Krall et al., 2002). IPT u Arabidopsis může alespoň částečně katalyzovat přeměnu na tz -cytokininové typy s využitím derivátu DMAPP (Takei et al., 2003). Hlavní enzym katalyzující biosyntézu cytokininů je tedy izopentenyltransferáza - IPT. Rostlinná IPT využívá jako substrát ADP či ATP a trna pro izopentenylaci adeninu (Kakimoto et al., 2003, Brugiere et al., 2008). V současnosti je známo 9 rostlinných homologních genů IPT u Arabidopsis, zahrnující AtIPT1- AtIPT9. 7 z těchto genů těsně souvisí s činností bakteriálního IPT genu (Takei et al., 2001, Kakimoto, 2001, Ha et al., 2012). Všechny tyto geny byly zachyceny u E. coli a mají schopnost vytvářet oba cytokininové typy izopentenyladenin (ip), stejně tak Z typ cytokininů. Dva z genů, AtIPT4 a AtIPT8 způsobují nezávislost na cytokininu, zatímco AtIPT2 zajišťuje autonomní cytokininový růst (Kakimoto, 2001, Sun et al. 2003). Bylo identifikováno několik míst exprese izopentenyltransferáz v kořenech, která jsou odlišná od exprese AtIPT3 a AtIPT5, jež jsou lokalizovány ve floému listů a stonku (Miyawaki et al., 2004). Rostlinné IPT se člení na dvě podskupiny. První obsahuje AtIPT2 a AtIPT9 a je podobná genu, jenž kóduje enzym modifikující transferovou RNA, tedy trnaisopententyltransferáze (trna-ipt; EC ). Druhá skupina zahrnuje členy AtIPT1, 3, 8, které jsou podobné enzymu modifikujícímu iprmp, tedy konkrétní IPT (EC ). Strukturně jsou si tyto dva enzymy podobné. Ze skupin však vyčnívá gen pro AtIPT6, který obsahuje posunovou mutaci (Kakimoto, 2001). Biochemická povaha IPT Jako rekombinantní enzymy byly vypurifikovány AtIPT1 a AtIPT4, u nichž byla stanovena jejich biosyntetická aktivita (Kakimoto, 2001, Takei et al., 2001). AtIPT1 je schopen tvořit ipmp z AMP a DMAPP in vitro. AtIPT1 může využít všechny tři adeninnukleotidy, ale upřednostňuje ADP a ATP, zatímco AtIPT4 dává přednost pouze ATP a ADP. Toto ukazuje, že rostliny se liší v preferenci nukleotidových substrátů, přičemž AtIPT geny mohou být exprimovány i v buňkách a pletivech, které nefotosyntetizují, např. v centrálním válci kořene, floémových buňkách či laterálním kořenovém primordiu (Takei et al., 2004). 21

23 IPT1,3 a IPT4-8 využívají ATP či ADP. IPT2 a IPT9 u Arabidopsis jsou geny pro kódování trna. Díky mutacím genů pro IPT2 a 9 nebo v jejich kombinaci bylo u dvojitého mutanta zjištěno snížení exprese izopentenyl- a (cis-hydroxy)izopentenyl trna (Sakakibara, 2006, Miyawaki et al., 2006). U tohoto mutanta byla pozorována i značná redukce v hladinách endogenních cytokininů cis-zeatinového typu. Při mutacích jiných IPT docházelo ke snížení obsahu cytokininů ip a trans-zeatinového typu, přičemž se projevilo i značné zhoršení růstu stonku, které mohlo být obnoveno exogenní aplikací trans-zeatinu (Miyawaki et al., 2006). Testy IPT u Arabidopsis byly prováděny in vitro i in vivo. Např. u hybridu petúnie byla identifikována IPT jako tzv. Sho gen (Zubko et al., 2002). Overexprese tohoto genu naznačila několik zajímavých fenotypů s nadměrným růstem nadzemních částí, fenotypy s oslabenou apikální dominancí, s oddáleným stárnutím či kvetením (Faiss et al., 1997). Velký pokrok ve studiu cytokininů u vyšších rostlin byl umožněn díky osekvenovanému genomu Arabidopsis thaliana (Sakakibara, 2010). Exprese IPT Transgenní rostliny s použitím zeleného fluorescenčního proteinu ukázaly expresi AtIPT1 převážně v cévním svazku, AtIPT3 ve floémových buňkách klíčních rostlin, AtIPT5 v primordiu bočných kořenů embrya, AtIPT7 v středním válci i buňkách kořenového lýka (Takei et al., 2004), což je důkazem rozlišné tvorby cytokininů na variabilních místech rostlinného těla. Tato biosyntéza na odlišných místech je nezbytná pro správný růst a vývoj každé rostliny (Sakakibara, 2010). Při biosyntéze dochází k vzájemným přeměnám forem cytokininů. Může to být buď: - reverzibilní přeměna bází na ribotidy a ribozidy, - reverzibilní O-glykozylace, případně acetylace postranního řetězce cytokininové molekuly, - N- glykozylace purinu či konjugace s alaninem v poloze N-9 nebo - reverzibilní redukce postranního řetězce molekuly cytokininu. 22

24 2.1.2 Enzymy podílející se na biosyntéze Hydroxyláza Tento enzym urychluje konverzi ip cytokininových typů na tz typ, avšak biochemická funkce enzymu je omezena. Hydroxyláza byla identifikována z mikrozomální frakce květáku, kde zajišťovala hydroxylaci ip i ipr na tz a tzr (Chen a Leisner, 1984). Hydroxyláza je závislá na přítomnosti NADPH a přitom její citlivost na inhibitor cytochromu P450 signalizuje, že reakce je řízena enzymem cytochromu P450 (Sakakibara, 2010). trna-isopentenyltransferáza Molekuly trna mohou obsahovat ipr nebo odvozený derivát na straně přiléhající k antikodónu. Enzym trna se podílí na isopentenylaci zbytku adeninu. Tento enzym byl zachycen ve všech živých organismech, od kvasinky až po člověka. V Arabidopsis jeho funkci plní AtIPT2. Při degradaci trna mohou vznikat aktivní cytokininy a trna je považována za zdroj těchto fytohormonů (Murai, 1994). 5 -ribonukleotidfosfohydroláza (5 -nukleotidáze, EC ) Tento enzym zajišťuje katalýzu defosforylace cytokininového nukleotidu na nukleosid a byl nalezen v klíčku pšenice (Chen a Kristopeit, 1981). Adenosin nukleosidáza Katalyzuje deribozylaci z cytokininového nukleosidu na volnou bázi, která je fyziologicky aktivní formou. Enzym byl purifikován z obilného klíčku i nalezen v jiných rostlinných druzích (Chen a Kristopeit, 1981). Purinová nukleosidfosforyláza Tento enzym se podílí na konverzi volné báze na nukleosid a byl opět izolován z pšeničného klíčku (Chen a Petschow, 1978). Adenosin kináza Tato kináza specificky katalyzuje reakci přeměny korespondujícího nukleosidu k vytvoření cytokininového nukleotidu (Sakakibara, 2010). Adeninfosforibozyltransferáza 23

25 Adeninfosforibozyltransferáza se podílí na převodu volné cytokininové báze do formy nukleotidu (Sakakibara, 2010) Lokalizace biosyntézy Místo syntézy je důležitou otázkou, která ovlivňuje vývojové spolupůsobení skupin fytohormonů. Dříve byl za hlavní místo syntézy cytokininů považován kořenový systém (Hopkins, 1995), přičemž auxinová centra tvorby se nacházející v nadzemních částech rostlin, ale současné experimenty ukazují, že značné množství auxinové produkce bylo zachyceno i v kořenech (Ljung et al., 2001). Cytokininová biosyntéza byla tedy rozsáhle potvrzena v kořenovém systému, avšak separovaně k ní dochází také i v nadzemních pletivech. Hlavní místa syntézy závislé na izopentenyladenosin-5 -monofosfátu jsou laterální kořenové meristémy a zároveň jsou cytokininovými zdroji i určité části stonku (Nordström et al., 2004). Obě tato pletiva mají schopnost syntetizovat cytokininy de novo, proto byly v pokusech inkubovány samostatně, aby se oddělila autonomní tvorba v nadzemních částech od stonkového transportu cytokininů, vytvořených v kořenech. Z-cytokininová biosyntéza byla velmi zřetelná u mladých vyvíjejících se listů, ve kterých stále docházelo k buněčným dělením (Nordström et al., 2004). Tyto experimenty potvrzují, že v nadzemních částech rostlin dochází k biosyntéze cytokininů, kdy vyvíjející se listy s aktivitou buněčného dělení jsou považovány za hlavní místa tvorby cytokininů typu Z (Nordström et al., 2004). Cytokininová syntéza v kořenech je závislá na vytvoření laterálního kořenového primordia, což bylo ověřeno pomocí dvojitého mutanta axr4-2 x aux1-7, jenž nevytváří téměř žádné laterální kořeny (Hobbie a Estelle, 1995). Z výsledků vyplývá, že v kořenech se ve zvýšené míře syntetizuje ipmp (Nordström et al., 2004). Stonkově lokalizovaná syntéza cytokininů a jejich kontrola zprostředkovaná auxiny naznačuje vzájemné interakce těchto fytohormonů a jejich vzájemné ovlivňování metabolických procesů v rostlinném těle. Nadzemní část je tedy uzpůsobena k zajištění vlastní syntézy cytokininů nezávislé na transportu cytokininů z kořenového zdroje (Nordström et al., 2004). 24

26 2.1.4 Regulace biosyntézy cytokininů Regulace cytokininové biosyntézy je zajištěna auxiny percepcí nebo samotným přenosem auxinového signálu, kdy již nepatrná aplikace auxinů potlačí syntézu cytokininů. To bylo ověřeno u dvou typů mutantních rostlin rezistentních k auxinu, axr1 (Hopkins, 1995) a axr4 (Hobbie a Estelle, 1995), jež obsahují zvýšené množství volně dostupné IAA. V případě použití mutanta axr1 se projevila pouze mírně snížená cytokininová biosyntéza po aplikaci kyseliny naftyloctové. Druhý mutant typu axr4, neměl na auxin reagovat, ale ve skutečnosti odpovídal na vliv auxinu, přičemž genotyp odrážel auxinovou ztrátu, což ukázala úroveň hladiny volné IAA a metabolitů, jako byla 2 - oxoiaa (Nordström et al., 2004). Auxinový podnět je tedy zpracován prostřednictvím percepce, kdy na těchto auxin senzitivních mutantech je znatelný stejný efekt redukce tvorby cytokininů po aplikaci auxinů, stejně jako je tomu u standardních rostlin. Z těchto dat bylo jasné, že vnímání i transdukce signálu je nezbytná pro auxinovou regulaci cytokininové biosyntézy, při níž dochází k jejímu celkovému potlačení (Nordström et al., 2004). Bylo zjištěno, že auxin negativně kontroluje cytokininový tok, kdy hlavně potlačuje biosyntézu cytokininů přes dráhu nevázanou na isopentenyladenosin-5 -monofosfát. Avšak v případě cytokininové nadprodukce je nárůst auxinové hladiny v rostlinném těle pomalejší, což naznačuje spojení s pozměněnou vývojovou dráhou (Nordström et al., 2004). Dříve se ukázalo, že vysoká hladina cytokininů v meristému je udržována pomocí represe dvou negativních regulátorů cytokininové signalizace, Arabidopsis RESPONSE REGULATORS, ARR7 a ARR15. Nedávné studie však potvrdily účast auxinu při udržení vysoké hladiny cytokininů v meristému. Auxinem aktivovaný AUXIN RESPONSE FAKTOR/monopterous (ARF5/MP), kdy se jedná o transkripční regulátor, který přímo blokuje expresi ARR7 a ARR15 (Zhao et al., 2010). Proto jsou vysoké hladiny cytokininů v lodyžním apikálním meristému udržovány nejen WUS ale i auxinovou signalizací (Durbak et al., 2012). Nová studie také objevila, že i cytokininy mohou naopak přímo kontrolovat transport auxinů prostřednictvím lokalizace PIN proteinů (Marhavy et al., 2011). Cytokininy pak snižují hladinu PIN prostřednictvím cílové degradace PIN1 proteinů ve vakuole. 25

27 2.2 Metabolismus Metabolické dráhy byly objasněny díky studiím s exogenní aplikací radioaktivně značeného cytokininu. Radioaktivně značený cytokinin je po aplikaci na rostlinné pletivo rozdělen na příslušné nukleotidy, nukleosidy a volné formy bází a ty jsou pak metabolizovány do degradovatelných produktů či uschovány ve formě cukerných konjugátů (Letham, 1994). Metabolické dráhy cytokininů mohou být roztříděny na dvě základní skupiny, kdy první zahrnuje modifikaci adeninu a enzymatické napadení postranního řetězce. Zatím však neexistuje důkaz o enzymu, který by měl absolutní specifitu k cytokininům, ale tyto enzymy jsou dostačující pro metabolickou aktivitu cytokininů. Naopak tomu je u enzymů postranního řetězce, které jsou pravděpodobně pro cytokininy specifické (Sakakibara, 2010) Konjugace a oxidace cytokininů Snížení hladiny aktivních cytokininů může být způsobeno redukcí jejich syntézy prostřednictvím oxidace nebo konjugace (Nordström et al., 2004). Mnoho studií uvažuje jako součást regulačních procesů i samotnou degradaci cytokininů (Ha et al., 2012). Degradace cytokininů Degradace cytokininů je řízena cytokinin oxidázou/dehydrogenázou (CKX). Degradace patří mezi důležité metabolické kroky, které kontrolují hromadění a distribuci cytokininových metabolitů v rostlinách. Hlavní enzym CKX, jehož aktivita byla pozorována již v roce 1970, ireverzibilně naruší postranní řetězec. CKX je 60 kda monomerní enzym, který inaktivuje volné báze a nukleosidové formy izoprenoidních cytokininů s izoprenoidním postranním řetězcem jako je ip, tz, ipr a tzr. Deriváty nukleotidů však nejsou náchylné k CKX. Dvojná delta vazba se objevuje u tz a ip je nezbytná pro rozpoznání substrátu, neboť redukce příslušné vazby přináší rezistenci k CKX. Odolnost vůči CKX se vyskytuje i u DZ-cytokininových typů, kde je rezistence zajištěna modifikací postranního řetězce jako je například O-glukozylace (Sakakibara, 2010). CKX byla charakterizována jako měď-obsahující amin oxidáza, která se podílí na oxidativní katalýze, při níž dochází ke konverzi primárních aminů na aldehydy, amoniak a peroxid vodíku přes iminové meziprodukty. Jedná se o FAD (flavinadenindinukleotid) obsahující flavoprotein, který byl purifikován z pšenice a který nepožaduje přítomnost kyslíku 26

28 během své degradace, nebo produkce peroxidu vodíku, v současnosti byl navržen spíše název cytokinin dehydrogenáza než oxidáza (Sakakibara, 2010). Oxidace poskytuje ireverzibilní degradaci cytokininových molekul. Této reakce se účastní cytokininoxidáza/dehydrogenáza, která zajistí odštěpení postranního izopentenylového řetězce, přičemž vzniká adenin. Cytokinindehydrogenázy se soustřeďují na degradaci volných bází typu ip a tz či jejich N-glukozidy a méně také na cytokininové ribozidy (Sakakibara, 2006, Werner et al., 2006). Avšak neumí degradovat O-glukozidy, cytokininy s nasyceným postranním řetězcem ani cytokininové aromáty (Motyka a Kamínek, 1992). Rostlinné geny pro cytokinin oxidázu/dehydrogenázu (CKX) Geny kódující CKX byly poprvé identifikovány u kukuřice (Houba-Herin et al., 1999, Morris et al., 1999), později i u Arabidopsis, u něhož bylo charakterizováno 7 genů kódující CKX. Cytokininy obecně podporují expresi CKX, což bylo prokázáno u Phaseolus vulgaris, u něhož zvýšení cytokininů vyvolalo indukci aktivity genů CKX (Chatfield, 1986). U Arabidopsis bylo tedy nalezeno 7 genů kódujících cytokinindehydrogenázy (CKX7) (Sakakibara, 2006, Werner et al., 2006, Kowalska et al., 2010) přičemž každý z nich je genem pro izoenzym odlišných biologických a chemických vlastností, stejně tak s rozdílným expresním profilem (Gajdošová et al., 2011, Kowalska et al., 2010, Galuszka et al., 2007). Tyto dehydrogenázy jsou umístěny převážně ve vakuolách, cytosolu i apoplastu (Smehilova et al., 2009, Kowalska et al., 2010). Při overexpresi těchto genů se projeví výrazný pokles cytokininů, zatímco auxin blokující vývoj apikálního meristému zajistí zvýšený rozvoj kořenového systému (Werner et al., 2001, 2003). Cytokininoxidáza může být aktivována auxiny, což bylo pozorováno u tabákových rostlin, v nichž byla oxidace sledována prostřednictvím radioaktivně značeného zeatin ribozidu (ZR) (Palni et al., 1988). Stejné výsledky zachytily i Zhang et al. (1995), jenž pozorovaly konverzi zeatinových typů cytokininů in vitro kulturách po aplikaci NAA. Důležité však bylo tuto aktivaci oxidázy prostřednictvím auxinů prokázat v živých organismech, o což se snažili Motyka a Kamínek (1992), kteří pozorovali změny v její aktivitě pod vlivem několika typů syntetických auxinů aplikovaných na povrch tabákové kalusové kultury (Nordströrm a et al., 2004). 27

29 Konjugace cytokininů U cytokininů může probíhat i glykozylace, přednostně napojením molekuly glukózy, což je dalším možným procesem deaktivace cytokininů, která napomáhá udržet homeostázu cytokininových hladin uvnitř rostlinného těla (Ha et al., 2012). Konjugace je formou nevratné fyziologické inaktivace, při níž dochází k vazbě glukózy na dusíkové atomy v polohách 7 a 9 purinové kostry, kdy výsledkem této konjugace je deaktivace cytokininové aktivity (Ha et al., 2012). Konjugace v poloze N3- nebo připojení glukózy na hydroxylovou skupinu postranního řetězce je reakce vratná, jež poskytuje zásobní formu cytokininových molekul (Sakakibara, 2006, Kudo et al., 2010, Frébort et al., 2011). Při inaktivaci cytokininových bází a ribozidů probíhající pomocí konjugace bylo zajímavým objevem, že nejen auxiny, ale i auxinové konjugáty mají vliv na inhibici cytokininů (Nordström et al., 2004). Pro tz-cytokininový typ jsou specifické O-glukozyltransferázy, jejichž geny byly izolovány poprvé z Phaseolus lunatus (Martin et al., 1999). Gen ZOG1, kódující tento enzym je přednostně exprimován v nezralých semenech, ale částečně i v kořenech a listech (Sakakibara, 2010). Důležitou modifikací je i N-glukosylace, která u cytokininů postihuje pozice 3-, 7- a 9- na purinové bázi a glukozylace v pozici 7- a 9- zajistí tvorbu inaktivních forem cytokininů. N- glukozylaci v polohách 7- a 9- katalyzuje enzym zvaný glukozyltransferáza s využitím UDP nebo TDP-glukózy jako substrátu.(entsch et al., 1979). Jako donor pro o-xylozylaci a vznik O-cukerných konjugátů může být využita i UDPglukóza a v některých rostlinných druzích také UDP-xylóza, přičemž je reakce zajištěna enzymatickou funkcí O-xylozyltransferázy (Sakakibara, 2010). 2.3 Transport cytokininů Protože jsou cytokininy převážně syntetizovány v kořenech, musí být z kořene transportovány i do jiných rostlinných částí. Transport do nadzemních oddílů rostliny se odehrává prostřednictvím xylému, kdy je transport veden převážně do listů, kde může vstupovat do 28

30 dráhy floémové. Xylémový i floémový transport cytokininových molekul je pak fotoperiodicky regulován (Macháčková et al., 1986). Cytokininový transport je také úzce propojen s polárním transportem IAA. Při dekapitaci intaktní rostliny dochází k velkému nárůstu hladiny cytokininů v xylému, jejíž snížení nastává po aplikaci NAA na dekapitovaný vrchol. Tyto dva protichůdné transporty cytokininů k vrcholu a IAA směrem k bázi hrají důležitou roli v regulačních procesech morfogeneze (Bangerth, 1994). Transport cytokininových molekul je pak řízen environmentálně i endogenně přes signály, které zajišťují přísun a přesun nutričních látek (Kudo et al., 2010). Také bylo potvrzeno, že cytokininový transport z kořenů není jediným mechanismem ustavujícím endogenní hladinu cytokininů, což bylo deklarováno i v dřívějších studiích (Faiss et al., 1997). 2.4 Signalizace Hormonální signalizace má různé podstatné role v rostlinném vývoji. Hormonální regulace se zejména podílejí na regulaci funkce meristému, a tím řídí funkci všech orgánů na rostlině. Nedávné pokroky rozčlenily podobnosti a rozdílnosti v interakci auxinu a cytokininů v regulaci stonkového a kořenového apikálního meristému a jeho funkci (Durbak et al., 2012). U rostlin dochází k autofosforylaci cytokininových receptorů v případě, že cytokininy jsou rozpoznány a fosfátová skupina je přenesena na akceptorové místo receptorové molekuly. Cytokininové receptory jsou pravděpodobně hybridy odvozené od histidinkináz (HK) (To a Kieber, 2008). Fosforylace způsobí přeměnu histidinu na asparagin a to umožní předat cytokininový signál. U cytokininů stejně jako u etylenové signalizace hraje hlavní roli fosforylace His-Asp, která má dvě dráhy podobné těm bakteriálním (Yamada et al., 2001, Schaller et al., 2011). První cytokininové systémy byly objeveny u mechu, avšak např. řasy postrádají cytokininové receptory a negativní response regulátory RR (Pils a Heyl, 2009). U Arabidopsis bylo nalezeno 6 histidin kináz typu (AHK1, AHK2, AHK3, AHK4, AHK5/CKI2 a CKI1 (Mizuno, 2005). U mutantů se ztrátou jejich funkce se projevilo, že AHK2,3,4 se primárně vyskytují v endoplasmatickém retikulu, což potvrzuje fakt, že je cytokininová signalizace z tohoto místa iniciována (Wulfetange et al., 2011, Lomin et al., 2011, Caesar et al., 2011). 29

31 Extracelulární doménou cytokininového receptoru je CHASE (Cyclases/Histidine kinases Associated Sensory Extracellular), jež je schopna přijmout a příslušně navázat cytokininový signál. Doména je obklopena dvěma transmembránovými doménami (Heyl et al., 2007). Kináza AHK4 je enzymem, jenž má kinázovou i fosfatázovou aktivitu. Specifičnost cytokininové signalizace je způsobena expresními projevy individuálních receptorových genů, stejně tak jejich odlišnými schopnostmi vázat jejich ligandy. AHK2 a AHK4 mají poměrně stejnou afinitu k ligandům (Romanov et al., 2006). AHK2, 3, 4 mají schopnost své aktivity ve stonkovém apikálním meristému, a stejně tak v kořenové čepičce, ale AHK2, AHK3 jsou umístěny převážně v listovém parenchymu (Mahonen et al., 2006), zatímco AHK4 se vyskytuje hlavně ve vaskulatuře kořene (Stolz et al., 2011). V současných studiích byla odhalena i krystalická struktura senzorické domény receptoru AHK4, která napomáhá cytokininové vazbě. Rozpoznání molekulární podstaty umožnilo rozpoznat přirozené a syntetické cytokininy a jejich receptory byly charakterizovány díky chemickým inhibitorům (Hothorn et al., 2011), jež blokují cytokininové receptory (Spichal et al., 2009, Arata et al., 2010). U Arabidopsis byla také popsána histidin fosfotransferáza (AHP), která je ubiquitinována a její exprese stejně jako lokalizace se mění v závislosti na cytokininové aplikaci, kdy mohou být rychle přesouvány do jádra k zprostředkování cytokininové odpovědi (Muller a Sheen, 2007). AHP1-5 jsou proteiny, které si zachovaly svá fosforylační místa a působí společně s AHK a u Arabidopsis také s response regulátory ARR (Schaller et al., 2008). AHP1-5 (Hutchison et al., 2006) se uplatňují v signalizaci cytokininů, zatímco AHP6 se podílí na vývoji dřevní části cévního svazku (Mahonen et al., 2006) AHP6 se také podílí na vývoji dřevní xylémové části a zároveň blokuje cytokininovou signalizaci, což podporuje myšlenku, že cytokininy negativně regulují xylémové utváření, přičemž podporují vývoj floému (Mahonen et al., 2006). U Arabidopsis bylo charakterizováno několik genů ARR typu B, a to ARR1, ARR10 a ARR12, jež jsou zahrnuty do cytokininové sygnalizace (Mason et al., 2005). Geny typu A ARR jsou též nazývány primary response genes, neboť jejich exprese je rapidně ovlivňována prostřednictvím cytokininů a negativně zpětnovazebnou cytokininovou smyčkou (Muller a Sheen, 2007). Mezi geny ARR typu A a B existuje vzájemná korelace. Typ A nepřímo 30

32 reguluje funkci genů ARR typů B prostřednictvím negativní zpětnovazebné interakce. Gen ARR typu B přímo zvyšuje expresi určitých genů ARR typu A, jež jsou zapojeny do signalizace závislé na cytokininech (Sakai et al., 2001). Prostřednictvím biochemické analýzy na mutantech bylo odhaleno, že ARR22 pracuje jako silný inhibitor cytokininové signalizace (Horak et al., 2008). Díky cytokininovému ošetření byla zvýšena i exprese transkripčních faktorů typu AP2-EREBP, které kódují tzv. cytokinin response factors (CRF), které jsou nahromaděny v jádře a fungují paralelně s geny ARR typu B, aby společně zajistily cytokininovou odpověď (Rashotte et al., 2006). Histidin fosfotransferový protein přijme fosfátovou skupinu od cytokininového receptoru a přenese ji na jaderný typ B molekuly response regulátoru (RR) (Imamura et al., 1998), což jsou pozitivní regulátory přenosu cytokininového signálu, které iniciují primární cytokininovou odpověď zapnutím genů response regulátorů typu A (Imamura et al., 1998). 31

33 II. PRAKTICKÁ ČÁST 32

34 3 EXPERIMENTÁLNÍ PROVEDENÍ POKUSU Provedení experimentů bylo realizováno podle níže uvedené metodiky. 3.1 Rostlinný materiál Jako rostlinný materiál byly použity rostliny hrachu setého (Pisum sativum L.), cv. Vladan, ze semenářské produkce firmy Semo Smržice a. s., ČR. Semena byla umístěna na 24 hodin do vody při laboratorní teplotě. Po jejich nabobtnání ve vodě byla semena přesazena do vlhkého perlitu, ve kterém po 3-4 dnech došlo k naklíčení. Po pěti dnech od vysetí byly naklíčené rostliny přesazeny do kultivačních nádob s perlitem, v nichž byly pěstovány v prostředí klimaboxu při teplotě 20/18 C, při fotoperiodě 16/8 hod. (den/noc) a při světelné intenzitě 150 µmol. m -2. s -1. Rostliny byly dopěstovány za využití Richterova živného roztoku (Richter, 1926). 3.2 Metody Odběr vzorků pro studium genové exprese 7- denní naklíčené rostliny hrachu setého (Pisum sativum, L.), jež byly dopěstovány v kultivačních nádobách v klimaboxu, byly následně využity k experimentům studia genové exprese Varianty experimentů 1. VARIANTY S DEKAPITACÍ STONKOVÉHO APIKÁLNÍHO MERISTÉMU: Dekapitace rostlin byla provedena cca 10 mm nad druhým axilárním pupenem. Na řeznou plochu po dekapitaci byla aplikována lanolinová pasta jednak proto, aby tuto pokusnou variantu bylo možné porovnat s variantou s aplikací auxinu v lanolinové pastě namísto dekapitovaného apexu, a jednak aby řezná plocha nevysychala. Po dekapitaci rostlin byl iniciován růst druhého axilárního pupenu, který byl vymaněn z vlivu dominance růstového apikálního vrcholu. Druhé axilární pupeny byly využity k izolaci RNA a odebrány v časových intervalech 0; 0,5; 1; 3; 6; 12; 24; 48 a 120 hodin po dekapitaci. 33

35 2. VARIANTY S APLIKACÍ 1% IAA PO DEKAPITACI STONKOVÉHO APIKÁLNÍHO MERISTÉMU: Dekapitace rostlin byla opět provedena cca 10 mm nad druhým axilárním pupenem. Aplikace auxinu byla prováděna nanesením lanolinové pasty s obsahem 1% IAA (Sigma- Aldrich, USA). Aplikace 1% IAA simulovala inhibiční efekt apexu pro růst axilárních pupenů. Druhé axilární pupeny byly opět využity pro izolaci RNA a odebrány v časových intervalech 0; 0,5; 1; 3; 6; 12; 24; 48 a 120 hodin po dekapitaci a následné aplikaci 1% IAA. 3. VARIANTY S APLIKACÍ CYTOKININU NA DRUHÝ AXILÁRNÍ PUPEN INTAKTNÍCH ROSTLIN: Na druhé axilární pupeny intaktních rostlin byla nanesena lanolinová pasta s obsahem 1% BAP (Sigma-Aldrich, USA). Po aplikaci 1% BAP byl iniciován růst takto ošetřeného pupenu, i když růstový vrchol nebyl odstraněn. Druhé axilární pupeny byly využity pro izolaci RNA odebrány v časových intervalech 1; 2; 4; 6; 8; 12 a 24 hodin po aplikaci 1% BAP. 4. VARIANTY STONKOVÝCH SEGMENTŮ (INTERNODIÍ): VARIANTA S DEKAPITACÍ STONKOVÉHO APIKÁLNÍHO MERISTÉMU A VARIANTA S DEKAPITACÍ A APLIKACÍ 1% IAA U experimentu s internodii byly použity dvě varianty. Varianta s dekapitací bez aplikace auxinu a varianta s aplikací lanolinové pasty s obsahem 1% IAA. Dekapitace rostlin byla provedena cca 10 mm nad druhým axilárním pupenem. Na řeznou plochu po dekapitaci byla aplikována lanolinová pasta jednak proto, aby tuto pokusnou variantu bylo možné porovnat s variantou s aplikací auxinu namísto dekapitovaného apexu, a jednak aby řezná plocha nevysychala. Aplikace auxinu byla prováděna nanesením lanolinové pasty s obsahem 1% IAA (Sigma-Aldrich, USA). Aplikace 1% IAA simulovala inhibiční efekt dekapitovaného apexu na růst axilárních pupenů. Jako materiál pro izolaci RNA byly odděleny stonkové segmenty 10 mm nad (A) a 10 mm pod (B) druhým pupenem. Vzorky byly odebírány v časových intervalech 1; 6; 12; 24; 48 a 120 hodin. 34

36 Stonkové segmenty a axilární pupeny byly zmrazeny v tekutém dusíku. V případě aplikace BAP byly axilární pupeny nejprve očištěny od lanolinové pasty a následně zmrazeny. Poté byly odebrané pupeny přemístěny do mikrozkumavek a uchovány v hlubokomrazícím boxu (MDF-U3286S Sanyo, Japonsko) při teplotě -77 C. V rámci jedné varianty pokusu byly odebrány druhé axilární pupeny z 30-ti rostlin nebo z 10-ti u stonkových segmentů. Pro každou variantu byly provedeny experimenty ve dvou biologických a dvou technických opakováních. Tab. č. 1: Zásobní Richterův roztok (pro přípravu 5 l roztoku je zapotřebí 10 ml zásobního roztoku) Chemikálie Penta (ČR) Chemické složení roztoku Koncentrace chemikálie [g/l], [g/50 ml] Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O 365,00 g.l -1 KNO 3 100,00 g.l -1 KH 2 PO 4 100,00 g.l -1 MgSO 4. 7H 2 O 125,00 g.l -1 FeCl 3. 6H 2 O 27,02 g.l -1 =1,351 g/50 ml Chelaton III. 37,22 g.l -1 =1,861 g/50 ml Izolace rostlinné RNA Před izolací RNA byl rostlinný materiál homogenizován pomocí umělohmotné tyčinky v mikrozkumavce v kapalném dusíku. Pro samotnou izolaci RNA byl využit izolační kit RNeasy Plant Mini Kit firmy Qiagen (Německo) u výše popsaných variant experimentů č. 1, 2 a 3. Při izolaci byly používány originální roztoky izolačního kitu a byl dodržen postup izolace podle návodu k tomuto kitu. Základem izolace RNA tohoto typu je lýze buněk způsobená reakcí denaturačního pufru obsahujícího guanidinisothiokyanát. Při izolaci se využívá vazbové schopnosti silikonových membrán v kolonách, které jsou schopny na svůj povrch absorbovat nukleové kyseliny. RNA je schopna se na membránu z oxidu křemičitého navázat pouze v přítomnosti ethanolu. Následně byla vyizolovaná RNA elulována do roztoku promytím 20 µl deionizované vody bez obsahu RNáz. 35

37 Práce byla prováděna v čistotě, za použití ochranných latexových rukavic, sterilních špiček a mikrozkumavek bez povrchové kontaminace RNázami. Pracovní plocha, nástroje i povrch rukavic byly ošetřeny přípravkem pro ochranu před degradací RNA, RNase Zap (Sigma, USA). Při izolaci byl využit také enzym DNáza k odbourání možné kontaminující DNA pro zajištění největší čistoty RNA. Vyizolovaná RNA byla uchovávána při teplotě -77 C v hlubokomrazícím boxu. RNA ze stonkových segmentů (pokus č. 4 stonková internodia) byla získána kitem RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, USA), který umožnil zpracovat rostlinný materiál až do 1 g. Při izolaci byly používány originální roztoky izolačního kitu a byl dodržen postup izolace podle návodu k tomuto kitu. Použití tohoto kitu bylo zvoleno po původní izolaci kitem Qiagen (Německo), který umožňoval zpracovat maximálně 100 mg rostlinného materiálu, což nebylo přínosné pro získání dostatečné množství RNA ze stonkových segmentů pro studium genové exprese Spektrofotometrické měření koncentrace RNA Nukleové kyseliny jsou schopny specificky absorbovat určitou hladinu UV záření, na spektrofotometru pak měříme tzv. absorbanci, tedy jaké množství světla bylo pohlceno daným vzorkem, z níž lze následně vypočítat koncentraci roztoku. Koncentrace vyizolované RNA byla změřena pomocí spektrofotometru Anthelie (Secomam, Francie) při vlnové délce 260 nm, kdy výsledná koncentrace vyizolované RNA byla získána ze vztahu, kde A při 260 nm = 1, a to odpovídá roztoku RNA o koncentraci 40 µg/ml. Pro měření na spektrofotometru byl vzorek připraven smícháním 198 µl deionizované vody bez obsahu RNáz a 2 µl vyizolované RNA Potvrzení integrity vyizolovaných vzorků RNA Za použití interkalačního značení prostřednictvím ethidium bromidu byla provedena elektroforéza RNA v 1% agarózovém gelu podle následujícího postupu: 5 ml 10x FA gelového pufru a 0,6 g agarózy (Sigma-Aldrich, USA) bylo smícháno s deionizovanou vodou. Celkový objem na přípravu 1% agarózového gelu činil 50 ml. Směs byla přivedena k varu ve varné kádince za stálého míchání magnetickým míchadlem. 36

38 Poté byla směs zchlazena na ledu pod teplotu 65 C. Do zchlazené směsi bylo připipetováno příslušné množství ethidium bromidu (0,6 µl, Sigma-Aldrich, USA) a 0,9 µl 37% formaldehydu (Penta, ČR). Následovala 30 minutová inkubace gelu v 1x FA gel running vyrovnávacího pufru. Tab. č. 2: Zásobní roztok pro přípravu agarózového gelu pro RNA Chemikálie Hmotnost [g], objem[µl, ml] Agaróza 0,30 g Ethidium bromid (10% vodný roztok) 0,25 µl 37% formaldehyd 0,45 ml 10xFA vyrovnávací pufr 2,50 ml Voda bez obsahu RNáz 22,50 ml Tab. č. 3: Složení 10x FA gel running vyrovnávacího pufru Chemikálie 200mM 3-[N-morfolino]- propansulfonová kyselina (MOPS) (Sigma-Aldrich, USA) Koncentrace [mg/l] 41860,0 50mM octan sodný (Penta, ČR) 6804,0 10mM EDTA (Sigma-Aldrich, USA) 3722,4 Deionizovaná voda Doplněno na celkový objem 1000 ml (roztok o hodnotě ph 7) V mikrozkumavce byl namíchán vzorek v poměru 4 : 1. Směs byla vytvořena smícháním vzorku RNA obsahující 1 µg s nanášecím pufrem 5x RNA, jenž byl připraven z originálních roztoků podle manuálu ke kitu firmy Qiagen (Německo) (viz tab. č. 4). Připravené vzorky byly inkubovány při teplotě 65 C po dobu 5-ti minut a následně bylo provedeno nanášení vzorků na agarózový gel. Elektroforéza byla prováděna za přítomnosti 1x FA pufru, který byl získán naředěním 10x pufru FA. 37

39 Pro průběh elektroforézy byla sestavena aparatura OMNI-BIO (ČR), která obsahuje nádobu pro průběh elektroforézy, formu pro odlévání elektroforetického gelu, hřebínek pro vytvoření 10-ti jamek o šířce 0,6 cm. Elektroforéza probíhala pod napětím V z elektrického zdroje. Rozdělené frakce RNA byly vizualizovány prostřednictvím UV záření v systému GDS 7500 (UVP, USA). Gely amplifikačních produktů byly vyhodnoceny pomocí programu GELWORKS (UVP, USA). Tab. č. 4: Nanášecí pufr 5x RNA (Qiagen, Německo), nanášecí pufr pro ELFO RNA (Sigma-Aldrich, USA) Chemikálie Objem [µl, ml] Bromfenolová modř 16 µl 500mM EDTA (ph 8,0) 80 µl 37% formaldehyd 720 µl 100% glycerol 2,000 ml Formamid 10xFA pufr Voda bez obsahu RNáz 3,084 ml 4,000 ml Doplněno na celkový objem 10 ml Dvoukroková RT PCR K přepisu izolované RNA byla využita metoda dvoukrokové semikvantitativní RT PCR za použití komerčního kitu Enhanced Avian HS RT-PCR Kit (Sigma, USA). V prvním kroku dochází k reverzní transkripci vyizolované RNA na cdna, po němž následuje samotná PCR reakce, jejímž výsledkem je amplifikace daného fragmentu cdna. Reverzní transkripce - krok 1: Proces reverzní transkripce RNA, tedy její přepis na komplementární úsek cdna, byl zajištěn enzymem reverzní transkriptázy, RNA-dependentní-DNA-polymerázy získané z viru 38

40 ptačí myeloblastózy AMV-RT. K reverzní transkripci bylo využito oligo (dt) 23 primeru, který se specificky váže na polyadenylovaný konec mrna. Směs pro reverzní transkripci byla namíchána v mikrozkumavkách, do nichž byl jako první napipetován objem vzorku, který obsahoval 1 µg RNA. Objem vzorku RNA byl vypočítán podle spektrofotometrického stanovení koncentrace RNA ve vzorku. Příslušný objem vzorku byl doplněn vodou do 8 µl (water, PCR reagent; Sigma, USA). Následně bylo připipetováno přesné množství deoxyribonukleotidového mixu a oligo (dt) 23 primeru. Celkový objem směsi v mikrozkumavce tvořil 10 µl. Směs v mikrozkumavkách byla jemně zvortexována a poté byly mikrozkumavky centrifugovány (MS2 Minishaker; IKA, USA) a následně inkubovány 10 min. v termocycleru (Techne Progene FPROG02D; Techne, UK) při teplotě 70 C, aby byly denaturovány nežádoucí sekundární struktury RNA a aby došlo k vyšší efektivnosti průběhu transkripce. Krok 2: Po inkubaci byly mikrozkumavky se směsí chlazeny na ledu a k vychladlé směsi bylo připipetováno 10 µl reakční směsi pro další průběh reverzní transkripce (Sigma, USA), při němž se aktivuje reverzní transkriptáza a navazování primeru typu oligo (dt) 23. Proces 2. fáze probíhal v termocycleru 50 min. při teplotě 42 C, kde docházelo k vlastnímu přepisu na molekuly cdna. Přepsaná cdna byla uchovávána v mrazničce při -20 C. Tab. č. 5: 1. Fáze; reakční směs pro RT-PCR Chemikálie Voda pro PCR (PCR reagent) Templátová RNA Objem [µl] individuální individuální dntpmix [ 10 mm/l] 1 Oligo (dt) 23 primer [0,5 µg/µl] 1 Celkový objem 1 mikrozkumavky 10 µl 39

41 Tab. č. 6: 2. Fáze; reakční směs pro RT-PCR Chemikálie Objem [µl] Voda pro PCR [PCR reagent] 6 10x Pufr pro AMV-RT 2 Iinhibitor RNáz [20 U/µl] 1 Reverzní transkriptáza (AMV-RT) [20 U/µl] 1 Celkový objem 1 mikrozkumavky 20 µl Vlastní polymerázová řetězová reakce Metoda polymerázové řetězové reakce PCR je systémem umožňujícím rychlou a snadnou amplifikaci úseku DNA. Jedná se o biochemickou reakci založenou na principu replikace nukleových kyselin. Skládá se ze tří základních procesů, a to denaturace, nasedání primerů tzv. annealingu a elongace, tedy prodlužování dosednutých primerů. Obvykle mívá kolem 35 cyklů. Jako templát bylo využito 0,5 µl cdna pro každý vzorek, která byla získána předchozí reverzní transkripcí. Reakční směs pro PCR byla připravena podle tabulky č. 7 s využitím GoTaq komerčního kitu firmy Promega (USA). Namíchaný mix reakční směsi byl ve sterilních mikrozkumavkách (Axygen, USA) jemně zvortexován a zcentrifugován na minicentrifuze (MS2 Minishaker; IKA, USA). Poté byly mikrozkumavky uloženy do termocycleru, kde probíhala specifická amplifikace vzorků cdna prostřednictvím zvolených primerů za podmínek uvedených v tab. č. 8. Sekvence zvolených primerů Primery sledovaných genů: PsDRM1 F: 5 - AAC TCA CCA CCA CCC TCA AAG ATG

42 PsDRM1 R: 5 - GAT GTA GAC ACG TGG CAG AAG ATG - 3 PsCDC2 F: 5 - AGA TGA TAA ACC AGC GAC CAC - 3 PsCDC2 R: 5 - TCT GAG CCA AAA ACC CAT AAC - 3 PsIPT1 F: 5 - ACC GTC TTG ATG CTA CGG AGG - 3 PsIPT1 R: 5 - TCT AAT GGG TTA CCC CTG CCA - 3 PsIPT2 F: 5 - TGG CAG CAA CAT CAT CCT CTG - 3 PsIPT2 R: 5 - ACC TGT GGC CCC CAT TAT CAC - 3 Primery použitých konstitutivních genů: PsDEADbox F: 5 -TTC TCG TCA TCA ACC TCA CC-3 PsDEADbox R: 5 -TTC CTA CCA AAC CTT CCA CTA-3 Transcription factor IIA F: 5 - GCAACCTCCTTCTCCTTGGAT -3 Transcription factor IIA R: 5 - GCAACCTCCTTCTCCTTGGAT -3 ß-Tubulin F: 5 - GCTCCCAGCAGTACAGGACTCT-3 ß-Tubulin R: 5 - GCTCCCAGCAGTACAGGACTCT-3 V průběhu přípravy experimentální části byly testovány primery pro geny IPT1 i IPT2. Primery pro gen IPT2 vytvářely dimery a nespecifické produkty, proto byly pro studium genové exprese použity pouze primery pro gen IPT1, které spolehlivě dávaly specifický produkt. Tab. č. 7: Složení reakční směsi pro polymerázovou řetězovou reakci Chemikálie Objem [µl] Voda pro PCR (PCR reagent) 35,75 5x Green GoTaq buffer 10,00 DMSO (dimethylsuloxid) 1,00 41

43 10mM mix dntp (Serva, Německo) 0,25 Primer F [50 pmol/µl] 1,00 Primer R [50 pmol/µl] 1,00 GoTaq [5 U/µl] DNA-polymeráza 0,50 Templátová cdna 0,50 výsledný objem v 1 mikrozkumavce 50 µl Před realizací vlastní PCR reakce probíhala optimalizace podmínek, během nichž se reakce odehrává. Nezbytnou součástí přípravy bylo i testování navrhnutých primerů. Jako nejvhodnější počet cyklů bylo vybráno 28 cyklů pro všechny PCR reakce. Primery ke specifickým reakcím byly syntetizovány firmou East Port a. s. (ČR). Specifické primery pro PCR rekace byly navrženy programem PRIMER 3 u genů PsDRM1 a PsCDC2, programem Oligo 7.0 u genů PsIPT1, PsIPT2 a sekvence primerů pro konstitutivní geny byly získány z publikací PsDEADbox, β-tubulin a Transcription factor II (Die a kol., 2010). Navrženým primerů odpovídala specifická velikost amplifikovaných fragmentů, pro gen PsDRM 352 pb, pro gen PsIPT1 171 pb, pro gen PsCDC2 365 pb. Gen PsDRM1 poukazuje na dormantní stav axilárních pupenů, přičemž při zvýšení růstu axilárních pupenů bylo zjištěno snížení exprese PsDRM1 (Stafstrom a kol., 1998, Kalousek a kol., 2010). Exprese genu PsDRM1 byla použita jako vnitřní kontrola pro ověření spolehlivosti provedení experimentů. Exprese genu PsDRM1 byla publikována v pracích Kalousek a kol., 2010, Balla a kol., Tab. č. 8: Použité reakční profily PCR Části PCR reakce Počet cyklů Teplota [ C] Čas [s] 42

44 Počáteční denaturace Vlastní denaturace Nasedání primerů Elongace Závěrečná elongace Vzniklé PCR produkty byly uchovávány v ledničce, pro dlouhodobé skladování v mrazničce při -20 C Elektroforetické rozdělení v agarózovém gelu K elektroforetickému rozdělení PCR produktů byla sestavena souprava OMNI-BIO (ČR) a frakce byly rozděleny v 1% agarózovém gelu 85x100 mm za přítomnosti interkalačního barviva ethidium bromidu. Pracovní postup přípravy gelu: Přesné množství navážené agarózy bylo rozpuštěno v 50 ml trisacetátového pufru (1x TAE), jenž byl připraven rozředěním zásobního 50x TAE pufru. Roztok ve varné kádince byl za stálého míchání magnetickou míchačkou přiveden k varu. Následně byla směs zchlazena pod teplotu 65 C a do zchlazené směsi bylo napipetováno 0,6 µl ethidium bromidu. Jako vzorek pro elektroforézu byla použita namíchaná směs z 18 µl PCR produktu a 2 µl nanášecího pufru (6x Loading Dye; Promega, USA). Připravené vzorky byly napipetovány do vzniklých jamek v gelu. Gel byl ponořen pod hladinu trisacetátového pufru (1x TAE, složení zásobního roztoku viz tab. č. 10 ) a elektroforéza probíhala při napětí 70 V asi min. Tab. č. 9: Složení 1% agarózového gelu Chemikálie Agaróza (Sigma-Aldrich, USA) Hmotnost [g], objem [µl,ml] 0,6 g 43

45 1xTAE pufr Ethidium bromid (10% vodný roztok) 50,0 ml 0,5 µl Tab. č. 10: Zásobní trisacetátového pufru, roztok 50x TAE Chemikálie TRIS báze (Sigma-Aldrich, USA) Ledová kyselina octová (Penta, ČR) 0,5M EDTA (Sigma-Aldrich, USA) (ph 8,0) Deionizovaná voda Hmotnost [g], objem [µl,ml] 242,0 g 57,1 ml 100,0 ml Doplněno na celkový objem 1000 ml Velikost vzniklých fragmentů byla ověřena prostřednictvím velikostního 100pb markeru, DNA ladder (Promega, USA). Vzniklé fragmenty byly vizualizovány a dokumentovány v systému GDS 7500 (UVP, USA). Gely amplifikačních produktů byly vyhodnoceny pomocí programu GELWORKS (UVP, USA). Získaná data pocházela ze dvou nezávislých biologických a dvou technických opakování, kdy hladiny konstitutivních genů byly využity jako vnitřní kontrola. Příslušná data pak odpovídala úrovni mrna příslušných genů vyjádřené jako relativní hodnota exprese konstitutivních genů. Následně byly hodnoty převedeny do grafů, kde jsou uvedeny i hodnoty rozptylu, jež jsou znázorněny chybovými úsečkami. 44

46 45

47 4 VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1 Rostlinný materiál (Pisum sativum L.) Hrách je vhodnou modelovou rostlinou i proto, že velké množství rostlin může být pěstováno na malém prostoru, aniž by si vzájemně překážely. Další výhodou je jednoduché provedení dekapitace či opakování variant experimentu. Jako biologický materiál se obvykle využívají mladé klíční rostliny. Nevýhodou však zůstává malá velikost axilárních pupenů, což vyžaduje dostatek času pro odběr dostatečného množství rostlinného materiálu. Přestože byl analýzám podroben i první pupen, stále se jako nejvhodnější experimentální systém jeví druhý axilární pupen hrachu (Stafstrom et al., 1998). Na rozdíl od prací Kalousek et al. (2010); Balla et al. (2011), ve kterých byl použit pouze jeden konstitutivní gen, v této diplomové práci byly pro dosáhnutí větší přesnosti použity tři referenční geny. Geny PsDEAD box, b-tubulin, Transkripční faktor II byly použity pro všechny uvedené varianty experimentů a exprese sledovaných genů byla přepočítána na expresi průměru těchto konstitutivních genů. 4.2 Experimentální výsledky: Část I VARIANTY S DEKAPITACÍ, DEKAPITACÍ A APLIKACÍ 1% IAA. Exprese genu PsDRM1 U sedmidenních rostlin hrachu byla provedena dekapitace stonkového vrcholu s ošetřením stonkového pahýlu lanolinovou pastou. V případě varianty s aplikací IAA byla po dekapitaci na dekapitovaný pahýl aplikována lanolinová pasta s obsahem 1 % IAA. Následně byly izolovány vzorky RNA z druhých axilárních pupenů. 46

48 Obrázek č. 1: Hladina exprese genu PsDRM1 ve 2. axilárním pupenu přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β-tubulin, transkripční faktor II. Ve 2. axilárních pupenech byla sledována exprese genu PsDRM1 při dekapitaci růstového vrcholu. Exprese genu se udržovala na konstantní hladině až do času 1. hodiny, kdy poklesla na 50 % původní úrovně. Exprese genu dále klesala a v době 24 hodin po dekapitaci dosáhla nulových hodnot. Opětovný nárůst exprese byl pozorován v době 120 hodin po dekapitaci. U varianty s aplikací 1% IAA počala exprese genu PsDRM1 od 1. hodiny narůstat a v průběhu hodin se vrátila k původním hladinám své exprese. Obrázek č. 2: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsDRM1, varianta exprerimentu s dekapitací apikálního stonkového vrcholu. Obrázek č. 3: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsDRM1, varianta exprerimentu s dekapitací apikálního stonkového vrcholu a následnou aplikací 1% IAA. 47

49 Dormance je obecně definována jako dočasné zastavení viditelného růstu rostlinných struktur a orgánů, jež jsou schopny za jiných podmínek normálního růstu. Tento fenomén se nazývá apikální paradormance nebo také apikální dominance (Lang, 1987). Apikální dominance způsobena stonkovým vrcholem inhibuje růst a laterálních meristémů pupenů. Odstraněním stonkového apexu lze docílit uvolnění axilárních pupenů z jejich růstové inhibice. Inhibiční účinek stonkového apexu při apikální dominanci může být nahrazen aplikací rostlinného hormonu auxinu (IAA) na dekapitovaný vrchol (Thimann a Skoog, 1934). Díky apikální dominanci je rostlině umožněno soustředit zdroje do hlavní růstové osy, zatímco aktivace dormantních pupenů zajistí obnovu rostlinné komplexity po poškození či ztrátě hlavního stonkového apexu (Marhavy et al., 2011). U rostlin, které mají geneticky silně podmíněnou kontrolu apikální dominance je přítomnost primárního zdroje auxinu nezbytná a brání exportu auxinu ze sekundárních zdrojů během celého vývoje rostlin (Balla et al., 2011). Bylo prokázáno, že po dekapitaci je export auxinu z původně inhibovaných pupenů hrachu rychle aktivován. Takovému exportu je zabráněno aplikací auxinu na dekapitovaný pahýl. Aplikace auxinu na dekapitovaný pahýl hrachu je dostačující, aby se zabránilo kanalizačnímu transportu auxinu z pupenu do hlavního stonku, stejně jako podpoří inhibici axilárního pupenu (Balla et al., 2011). Trvalý export auxinu z pupenů si pak vyžádá tvorbu kanalizačních struktur xylému pro svůj transport (Marhavy et al., 2011). Kanalizační hypotéza vysvětluje celou řadu jevů, zahrnujících stanovení transportních cest auxinu spojující zdroj auxinu a auxinový sink (Sachs, 1981). Počáteční tok auxinu mezi zdrojem a sinkem aktivuje transport auxinu prostřednictvím transportní dráhy, kdy dochází k tvorbě úzkých souborů buněk s vysokou schopností transportovat auxin od zdroje k sinku. Tyto soubory se později mohou diferencovat na vodivá pletiva transportující auxin (Sachs, 2000). Odstranění stonkového apexu vede k rychlému rozvoji a diferenciaci kambiální sekundární vaskulatury v inhibovaném pupenu. Polární transport auxinu je založen na aktivitě axilárních pupenů díky rychlé polarizace PIN proteinů a indukci jejich exprese ve stonku, což vede k následnému vytvoření transportního kanálu, jenž se napojí na hlavní stonek (Balla et al., 2011). Kanalizace auxinového transportu je možná však pouze v případě, že primární zdroj auxinu je odstraněn nebo oslaben (Balla et al., 2011). 48

50 Podle Bangertha (1989) je polární transport auxinu z dominantního orgánu stonkového apexu inhibitorem export auxinu z dormantních sekundárních axilárních pupenů do primárního stonku. Jedná se o autoinhibici polárního transportu auxinu v místech spojení dominantních a inhibovaných orgánů. Export auxinu z laterálního pupenu do hlavního stonku je tedy potřebný pro růst axilárních pupenů. Při aplikaci 1% IAA na dekapitovaný stonek nedochází k polarizaci PIN1 v axilárních pupenech a to i 48 hodin po dekapitaci a aplikaci auxinu. Za těchto podmínek je znemožněno uvolnění axilárních pupenů z růstové dormance, což bylo ověřeno expresí markeru dormantního stavu genu PsDRM1 v axilárních pupenech. Hladina exprese tohoto genu se po aplikaci 1% IAA výrazně neměnila (Balla et al., 2011). Přechod mezi dormantní a růstovou fází pupene nastává velmi rychle a je snadno detekována v axilárních pupenech hrachu. Patrný je růst prvního pupenu, jenž je identifikován již během 8 hodin od dekapitace u intaktních rostlin (Stafstrom a Sussex, 1992). Hladina proteinů související s procesem dormance, produkty genů PsDRM1 a PsDRM2, klesala během 3 hodin od dekapitace vzrostného vrcholu. Ve 2. axilárním pupenu byl pokles mrna PsDRM1sledován do 12 hodin od dekapitace (Stafstrom, 1993). U experimentálních rostlin hrachu s dekapitací bylo odhaleno, že dochází k rychlé stimulaci růstu zainhibovaných axilárních pupenů a během 6 hodin od dekapitace hladina mrna genu PsDRM1 klesá 20x. V případě simulace dekapitovaného vrcholu apikální aplikací exogenního auxinu, se hladiny exprese genu PsDRM1 navrací do původních hladin. Zvýšení exprese PsDRM1 byla také zachycena u ostatních rostoucích orgánů, jako jsou kořeny, kořenové špičky a prodlužující se stonky. Gen PsDRM1 je považován za vhodný marker dormantního stavu rostlinných struktur (Stafstrom et al., 1998). 49

51 Exprese genu PsCDC2 Obrázek č. 4: Hladina exprese genu PsCDC2 ve 2. axilárním pupenu přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β-tubulin, transkripční faktor II. U dekapitované varianty byla identifikována exprese genu PsCDC2 ve druhém axilárním pupenu. Od 3. hodiny po dekapitaci docházelo k postupnému nárůstu exprese genu PsCDC2 až na jeho dvojnásobnou hladinu. Varianta s aplikací 1% IAA se projevila konstantní expresí genu PsCDC2, která se výrazně neměnila. Druhý pupen zůstal inhibován a buněčné dělení se v něm nezvyšovalo. Obrázek č. 5: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsCDC2, varianta exprerimentu s dekapitací apikálního stonkového vrcholu. 50

52 Obrázek č. 6: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsCDC2, varianta exprerimentu s dekapitací apikálního stonkového vrcholu a následnou aplikací 1% IAA. Zvýšená exprese genů, které jsou spojovány s buněčnou proliferací, jako např. geny PsCDC2 kináza, Map kinázy a histony H2A a H4 a také další růstově asociované geny (ribozomální proteiny L27, L34), byla zjištěna v axilárních pupenech během 1. hodiny po dekapitaci (Devitt a Stafstrom, 1995). U pupenů rodu Populus exprese genu PsCDC2 kinázy a cyklinových genů korelovala s rostoucím stavem vymaněného pupenu (Rohde et al., 1997). Bylo prokázáno, že buňky v obou dormantních pupenech (1. i 2.) jsou inhibovány v G1 fázi buněčného cyklu (Devitt a Stafstrom, 1995). Po dekapitaci první pupen vstoupí do S fáze po 6 hodinách, ale druhý pupen vyžaduje alespoň 9 hodin pro aktivaci růstu (Stafstrom et al., 1998). Někteří autoři tvrdí, že první růst pupenu nastává až po 6 hodinách od dekapitace, kdy dochází i k prvnímu buněčnému dělení a maximálnímu výskytu mitotických struktur mezi 12 až 18 hodinou od dekapitace. Proto dřívější růst pupenu by mohl být vyvolán kyselým růstem buněčné stěny v důsledku působení auxinu (Balla et al., 2011). Exprese genu PsIPT1 Obrázek č. 7: Hladina exprese genu PsIPT1 ve 2. axilárním pupenu přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β-tubulin, transkripční faktor II. 51

53 U dekapitované varianty bez aplikace IAA docházelo k mírnému navýšení exprese genu IPT1, stejně tak jako u varianty s aplikací IAA. Obrázek č. 8: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsIPT1, varianta exprerimentu s dekapitací apikálního stonkového vrcholu. Obrázek č. 9: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsIPT1, varianta exprerimentu s dekapitací apikálního stonkového vrcholu a následnou aplikací 1% IAA. Bylo potvrzeno, že po dekapitaci stonku hladina endogenních cytokininů v axilárních pupenech výrazně narostla a korelovala s nástupem jejich růstu (Turnbull et al., 1997), z toho vyplývá, že docházelo i zvýšení exprese biosyntetických genů cytokininů v těchto axilárních pupenech, což potvrdily naše výsledky. Po dekapitaci jsou axilární pupeny zásobeny cytokininy ze dvou zdrojů, jednak z kořenů, hlavního místa biosyntézy, tak i z vlastních nadzemních orgánů (Tanaka a kol, 2006). Efekt dekapitace na hladiny cytokininů může být eliminován aplikací auxinu na dekapitovaný pahýl stonkového vrcholu. U rostlin hrachu auxin negativně reguluje lokální biosyntézu cytokininů ve stonku prostřednictvím kontroly exprese specifické izopentenyltransferázy PsIPT1 a PsIPT2, které mají klíčovou roli při tvorbě cytokininů po dekapitaci vzrostného vrcholu (Kalousek et al., 2010). 52

54 4.3 Experimentální výsledky: Část II VARIANTY S APLIKACÍ CYTOKININU NA DRUHÝ PUPEN INTAKTNÍCH ROSTLIN. U sedmidenních rostlin hrachu Pisum sativum, L. byla aplikována lanolinová pasta s obsahem cytokininu (1% BAP) na druhý axilárny pupen intaktních rostlin. Exprese genů byla stanovena ve vzorcích cdna získaných z těchto druhých axilárních pupenů. Experimentální postup našich pokusů byl prováděn obdobně, jako byl studován vliv cytokininů na transport auxinu v práci Kalousek et al. (2010). Velikost sledovaných pupenů byla porovnávána s růstovou křivkou uvedenou v práci Kalousek et al. (2010). Exprese genu PsDRM1 po aplikaci cytokininu na druhý axilárny pupen intaktních rostlin Obrázek č. 10: Hladina exprese genu PsDRM1 ve 2. axilárním pupenu po aplikaci 1% BAP, přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β- Tubulin, transkripční faktor II. 53

55 Obrázek č. 11: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsDRM1, varianta exprerimentu s aplikací 1% BAPu na 2. pupen intaktních rostlin. Po exogenní aplikaci cytokininu v průběhu 24 hodin došlo k prudkému poklesu exprese genu PsDRM1 až na nulové hodnoty. Řada experimentálních studií prokázala, že cytokininy zeslabují proces apikální dominance (Ongaro a Leyser, 2008). Přímou aplikací cytokininů na axilární pupeny bylo možné stimulovat jejich růst, i pokud nebyl apikální pupen porušen (Sachs a Thimann, 1967). Bylo také potvrzeno, že se po dekapitaci stonku hladina endogenních cytokininů v axilárních pupenech výrazně zvyšuje a koreluje s nástupem jejich růstu (Turnbull et al., 1997). Tvorba a charakter apikálního stonkového a kořenového meristému včetně jejich organogeneze i organogeneze laterálních meristémů je zajištěn vývojovými procesy řízenými antagonistickou činností auxinu a cytokininu. Přesná harmonie mezi hladinou auxinu a cytokininů má zásadní význam pro vlastní vývoj rostliny (Marhavy et al., 2011). Exprese genu CDC2 po aplikaci cytokininu na druhý axilárny pupen intaktních rostlin 54

56 Obrázek č. 12: Hladina exprese genu PsCDC2 ve 2. axilárním pupenu po aplikaci 1% BAP, přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β- Tubulin, transkripční faktor II. Obrázek č. 13: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsCDC2, varianta exprerimentu s aplikací 1% BAP na 2. pupen intaktních rostlin. Po aplikaci cytokininu na druhý axilární pupen intaktních rostlin byla v průběhu 24 hodin zaznamenána zvyšující se exprese genu PsCDC2. Tato odpověď axilárních pupenů na exogenní aplikaci BAP byla podobná jako expresní profil PsCDC2 v pupenech dekapitovaných rostlin (Obrázek č. 4). Je známo, že cytokininy mohou aktivovat pupeny, když se na ně aplikují přímo. Sachs a Thimann (1964) uvádějí, že dva až tři dny po působení aplikace kinetinu byl vyvolán růst axilárních pupenů srovnatelný s růstem pupenů po dekapitaci, nicméně pozdější prodlužovací růst axilárních pupenů dekapitovaných rostlin byl znatelně rychlejší. Jsou také známy role cytokininů v podpoře buněčného dělení meristému. Ve stavu dormance jsou buňky pupenu většinou zadržovány v G1 fázi a také na hranici G1/S a S/G2 (Shimizu a Mori, 1998). Po dekapitaci buňky pupenu hrachu začnou vstupovat do S fáze po 6-9 hodinách. Exprese histonu H2A, histonu H4, MAP (mitogen-activated protein) kinázy, ribozomálního proteinu genu L27 (rpl27), ribozomálního proteinu L34 (rpl34) a CDC2 je zvýšena během 1 hodiny od dekapitace (Marhavy et al., 2011). Po vytvoření kanalizační cesty pro transport auxinu z laterálních meristémů se tyto laterální meristémy stávají metabolicky aktivní, rostou, protože v nich dochází k buněčnému dělení. Tuto skutečnost dokládá i zvýšování exprese genu PsCDC2. Získané výsledky také potvrzují, že inhibovaný pupen byl vymaněn z dormance a v jeho pletivech docházelo k buněčnému dělení. Upregulace syntézy cytokininů je dostatečná k aktivaci pupenů., Tyto údaje naznačují, že jednoduše aktivovaný buněčný cyklus, není dostatečný k aktivaci pupenů, a že cytokininy musí dělat více než upregulovat buněčný cyklus. Cytokinin pozitivně reguluje meristémovou funkci a je nezbytný pro jeho udržování (Muller a Leyser, 2011). 55

57 Exprese genu IPT po aplikaci cytokininu na druhý pupen intaktních rostlin Obrázek č. 14: Hladina exprese genu PsIPT1 ve 2. axilárním pupenu po aplikaci 1% BAP, přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β- Tubulin, transkripční faktor II. Obrázek č. 15: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsIPT1, varianta exprerimentu s aplikací 1% BAP na 2. pupen intaktních rostlin. Exprese genu PsIPT1 v průběhu 24 hodin kolísala mezi 25 a 35 %, kdy aplikace cytokininů výrazně nezvyšovala. Cytokininy jsou syntetizovány v celé rostlině (Nordstrom et al., 2004). Adenosin-fosfát isopentenyltransferáza (IPT), která katalyzuje první krok biosyntézy cytokininů je exprimována v celé rostlině (Miyawaki et al., 2004). Experimenty u hrachu setého prokázaly, že biosyntetické geny cytokininů PsIPT1 a PsIPT2 jsou exprimovány v uzlových oblastech stonků, a jsou rozdílně exprimovány před a po dekapitaci (Tanaka et al., 2006). 56

58 Experimenty u Pisum sativum prokázaly, že cytokininové biosyntetické geny ISOPENTENYLTRANSFERASE1 a ISOPENTENYLTRANSFERASE2 (PsIPT1 a PsIPT2) jsou exprimovány v uzlových oblastech stonků, a jsou rozdílně exprimovány před a po dekapitaci. PsIPT1 a PsIPT2 byly přechodně indukovány 3 h po dekapitaci (Tanaka et al., 2006). Cytokininy jsou tedy syntetizovány v pupenech nebo jsou do těchto pletiv dopraveny z kořenového systému či stonku, což je možným vysvětlením neměnící se exprese genu PsCDC Experimentální výsledky: Část III VARIANTY STONKOVÝCH SEGMENTŮ: VARIANTA S DEKAPITACÍ STONKOVÉHO APIKÁLNÍHO MERISTÉMU A VARIANTA S DEKAPITACÍ A APLIKACÍ 1 % IAA. U experimentu s internodii podobně jako v experimentální části I byly použity dvě varianty. Varianta s dekapitací a varianta s dekapitací a aplikací 1% IAA. Vzorky RNA byly izolovány ze stonkových pletiv 10 mm nad (A) a 10 mm pod (B) druhým pupenem. Expresní profily sledovaných genů u obou variant stonkových segmentů (A a B) měla obdobný charakter. Obrázek č. 16: Hladina exprese genu PsCDC2 ve stonkovém pletivu (A odběr vzorku 10 mm nad 2. axilárním pupenem; B odběr vzorku 10 mm pod 2. axilárním pupenem) přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β- Tubulin, transkripční faktor II. 57

59 Obrázek č. 17: Hladina exprese genu PsCDC2 ve stonkovém pletivu (A odběr vzorku 10 mm nad 2. axilárním pupenem; B odběr vzorku 10 mm pod 2. axilárním pupenem) přepočítána na hladinu zprůměrňované exprese konstitutivních genů PsDEADbox, β- Tubulin, transkripční faktor II. Obrázek č. 18: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsCDC2, varianta exprerimentu s dekapitací stonkového apikálního meristému. Obrázek č. 19: Agarózová elektroforéza PCR produktů genu PsCDC2, varianta exprerimentu s dekapitací stonkového apikálního meristému a následnou aplikací 1% IAA na dekapitovaný pahýl stonku. U vzorků odebraných z varianty po dekapitaci docházelo u genu PsCDC2 nejprve k poklesu. Ve 24. hodině se exprese navracela k původním hodnotám a poté opět klesala. Po 120 hodinách od dekapitace byl pozorován rozdíl mezi vzorky A a B, kdy u vzorku A docházelo k nárůstu exprese genu PsCDC2 a u vzorku B naopak ke snížení exprese genu. 58