Analýza exprese biosyntetických genů auxinu při iniciaci růstu laterálních pupenů hrachu

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Analýza exprese biosyntetických genů auxinu při iniciaci růstu laterálních pupenů hrachu Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Jozef Balla, Ph.D. Vypracovala: Bc. Lenka Procházková Brno 2013

2 Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucímu mé diplomové práce Ing. Jozefu Ballovi, Ph.D. za čas a trpělivost věnovanou vedením mé diplomové práce, za odborné vedení a pomoc při vypracování této práce. Dále také děkuji Ing. Petrovi Kalouskovi, Ph.D. za poskytnutí cenných rad a informací, které přispěly ke zvýšení kvality této práce

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Analýza exprese biosyntetických genů auxinu při iniciaci růstu laterálních pupenů hrachu vypracovala samostatně a za použití literárních pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně dne 30. dubna 2013

4 Abstract The goal of this thesis was to follow the expression of the PsYUC1 gene participating in the auxin biosynthesis and also the expression of the PsDRM1 gene that is connected to the dormant state of plant membranes. The expression of these genes was followed in second axillary buds of the garden pea after the decapitation of the stalk tip, as well as of the decapitated plants that were consequently treated with the IAA paste. In the buds of the decapitated plants an increase of the PsYUC1 was recognized, which indicates an increase of the de novo auxin and the release of the bud from the apical dominance. This bud s release from the inhibition lead also to a decrease of the PsDRM1 gene s expression. After the IAA application on the decapitated stalk there was no growth of the second axillary bud as it was not able to export its own auxin into the main stalk. This inhibition did not lead to the increase of the gene PsYUC1 expression, while the PsDRM1 gene did show a slight expression increase. Further, the gen PsYUC1 expression was followed in case of intact plants after the BAP application onto the second axillary bud. The exogenously applied cytokine caused a rapid increase of the PsYUC1 gene after four hours since the application. On the contrary, the PsDRM1 expression was sinking rapidly to zero values. Keywords auxin, apical dominance, PsYUC1, PsDRM1, Pisum sativum

5 Abstrakt Cílem této diplomové práce bylo sledovat expresi genu PsYUC1 účastnící se biosyntézy auxinu a také expresi genu PsDRM1, který je spojován s dormantním stavem rostlinných pletiv. Exprese těchto genů byla sledována ve druhých axilárních pupenech rostlin hrachu setého (Pisum sativum L.) po dekapitaci lodyžního vrcholu a také u dekapitovaných rostlin, které byly následně ošetřeny IAA pastou. V pupenech dekapitovaných rostlin byl zaznamenán nárůst exprese PsYUC1, což naznačuje zvýšení de novo syntézy auxinu a vymanění pupenu z apikální dominance. Toto uvolnění pupenu z inhibice vedlo také k poklesu exprese genu PsDRM1. Po aplikaci IAA na dekapitovaný stonek nedocházelo k růstu druhého axilárního pupenu, protože nebyl schopen exportovat vlastní auxin do hlavního stonku. Tato inhibice nevedla k nárůstu exprese genu PsYUC1, zatímco gen PsDRM1 vykazoval mírný nárůst exprese. Dále byla sledována exprese genu PsYUC1 u intaktních rostlin po aplikaci BAP na druhý axilární pupen. Exogenně aplikovaný cytokinin vyvolal prudké zvýšení exprese genu PsYUC1 po 4 hodinách od aplikace. Naopak exprese genu PsDRM1 rychle klesala až k nulovým hodnotám. Klíčová slova auxin, apikální dominance, PsYUC1, PsDRM1, Pisum sativum

6 Obsah 6 Obsah 1 Úvod práce 10 2 Cíle práce 11 3 Literární rešerše Auxiny Přirozené auxiny Syntetické auxiny Hladina auxinu v rostlinách Biosyntéza auxinu Konjugace IAA Katabolismus auxinu Transport auxinu Auxinové transportéry Inhibitory polárního transportu auxinu Hlavní účinky auxinů Stimulace prodlužovacího růstu Apikální dominance Role exogenně aplikovaného auxinu v apikální dominanci Role cytokininů v apikální dominanci Role jiných fytohormonů v apikální dominanci Role faktorů vnějšího prostředí v apikální dominanci Hormonální interakce při vývoji rostlin MATERIÁL A METODY Rostlinný materiál Založení experimentu a odběr vzorků Provedení experimentů... 38

7 Obsah Varianty s dekapitací stonkového apikálního meristému Varianty s aplikací 1%IAA po dekapitaci stonkového apikálního meristému Varianty s aplikací cytokininu na 2. axilární pupen intaktních rostlin Izolace RNA Spektrofotometrické měření koncentrace RNA Ověření integrity RNA pomocí elektroforézy Dvoukroková RT-PCR Reverzní transkripce Vlastní PCR reakce Sekvence specifických primerů pro následující geny Elektroforetická separace Výsledky a diskuze Hrách setý (Pisum sativum L.) Genová exprese biosyntetických genů auxinu a genů dormance v axilárních pupenech Exprese genu PsYUC1 v axilárních pupenech Exprese genu PsDRM1 v axilárních pupenech po aplikaci cytokininu Exprese genu PsYUC1 v axilárních pupenech po aplikaci cytokininu Závěr 62 7 Literatura 64

8 Seznam obrázků 8 Seznam obrázků Obr. 1 Chemiosmotický model (upraveno podle: Vieten et al., 2005) 23 Obr. 2 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsDRM1 (dekapitace) 52 Obr. 3 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsDRM1 (dekapitace + IAA) 53 Obr. 4 Exprese genu PsDMR1 ve 2. axilárním pupenu 53 Obr. 5 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsYUC1 (dekapitace) 55 Obr. 6 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsYUC1 (dekapitace + IAA) 55 Obr. 7 Exprese PsYUC1 v axilárních pupenech hrachu setého 55 Obr. 8 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsDRM1 57 Obr. 9 Exprese genu PsDRM1 ve 2. axilárním pupenu po aplikaci BAP 58 Obr. 10 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsYUC1 59 Obr. 11 Exprese genu PsYUC1 ve 2. axilárním pupenu po aplikaci BAP 59

9 Seznam tabulek 9 Seznam tabulek Tab. 1 Zásobní Richterův roztok (pro přípravu roztoku o objemu 5 l je potřeba 10 ml zásobního roztoku). Chemikálie Penta (ČR) 40 Tab. 2 Složení 1% agarózového gelu 42 Tab. 3 Složení 10xFA gel running vyrovnávacího pufru 42 Tab. 4 Složení nanášecího pufru 5xRNA loading buffer 43 Tab. 5 Složení reakční směsi RT-PCR 44 Tab. 6 Složení reakční směsi RT-PCR 44 Tab. 7 Složení reakční směsi pro PCR reakci 47 Tab. 8 chemikálie a roztoky 47 Tab. 9 objem v µl 47 Tab. 10 Reakční podmínky PCR reakce 48 Tab. 11 Složení 1% agarózového gelu 49 Tab. 12 Složení trisacetátového pufru (zásobní roztok 50xTAE) 49

10 Úvod práce 10 1 Úvod práce Apikální dominance je fyziologický jev, při kterém stonkový apex inhibuje růst a vývoj axilárních pupenů. V regulaci apikální dominance hraje významnou roli auxin, který může potlačit růst laterálních pupenů tím, že inhibuje export auxinu z těchto pupenů. Pro studium apikální dominance je hrách setý (Pisum sativum L.) velmi vhodnou modelovou rostlinou. Po dekapitaci jejího lodyžního vrcholu vyrůstají axilární pupeny. Tímto odstraněním primárního zdroje auxinu (lodyžní vrchol) jsou z inhibice uvolněné pupeny schopny exportovat vlastní auxin a tím iniciovat tvorbu vaskulárního spojení pupenu a hlavního stonku. Následně vyrůstající postranní výhony pak nahrazují dominantní vrchol. Podobně i cytokininy dokážou navodit růst axilárních pupenů intaktních rostlin tím, že stimulují expresi genů auxinových membránových přenašečů a polarizaci PIN1 proteinů, což umožní i export auxinu z takto ošetřených pupenů. Méně je však známo o změnách v biosyntéze auxinu v pupenech po jejich uvolnění z inhibice a iniciaci růstu. Biosyntetické dráhy vedoucí k IAA nejsou doposud zcela přesně objasněny. V poslední době se do popředí zájmů dostává tryptaminová dráha, a to nejen z hlediska nejlépe charakterizované genové regulace, ale i díky identifikaci YUCCA genů. YUCCA geny se zúčastňují na hydroxylaci aminové skupiny tryptaminu za vzniku N-hydroxyl- tryptaminu, kde dále další modifikací vzniká konečný produkt, IAA. Tato diplomová práce se soustředila na to, zda růst axilárních pupenů po vymanění z apikální dominance, nebo po aplikaci cytokininu na axilární pupen a dále naopak inhibice jejich růstu navozené aplikací auxinu na dekapitovaný pahýl, ovlivňuje expresi genů PsYUC1 a PsDRM1.

11 Cíle práce 11 2 Cíle práce 1. Seznámení s problematikou studia genové exprese u rostlin hrachu setého (Pisum sativum L.), 2. zpracování literárního přehledu na téma apikální dominance, 3. praktické provedení experimentů s porušením apikální dominance dekapitací, aplikací cytokininu na druhý axilární pupen, a dále inhibice růstu pupenů aplikací IAA na stonkový pahýl pro studium exprese genu pro biosyntézu auxinu (PsYUC1) a genu spojovaného s dormantním stavem rostlinných pletiv (PsDRM1) v druhých axilárních pupenech, 4. zpracování získaných výsledků do závěrečné práce.

12 Literární rešerše 12 3 Literární rešerše 3.1 Auxiny Prvním objeveným hormonem v rostlinách byl auxin. Existence tohoto hormonu byla prokázána ve 20. letech 20. století a jeho objev je spojován se studiem fototropizmu a gravitropizmu, které započal Charles Darvin. Samotnou podstatu tropizmů vysvětlil F. W. Went, když prokázal, že špičky koleoptile ovsa produkují látku, která difunduje do agaru a zprostředkovává prodlužovací růst (Went, 1936). Chemická struktura látky byla objevena o něco později Köglem. Auxin je považován za morfogen, neboť reguluje vývoj v závislosti na její dávce (Bhalerao et Bennett, 2003), působí již v nízkých koncentracích a vyvolávají biochemickou, fyziologickou nebo morfologickou reakci buď přímo v místě svého vzniku nebo v místech, kam je transportován (Normanly et al., 2010). Dnes je auxin považován za klíčový fytohormon v regulaci růstu a vývoje rostlin a také v odpovědích na environmentální změny (Tromas et Rechenmann, 2010). Na buněčné úrovni auxin kontroluje buněčné dělení, elongaci a diferenciaci buněk (Mashiguchi et al., 2011) Přirozené auxiny Hlavním přirozeným auxinem je indolyl-3-octová kyselina (IAA), která se nachází v celé rostlinné říši, včetně hub a řas (Tromas et Rechenmann, 2010). Nové citlivé metody umožnily nalézt v rostlinách další látky s regulační aktivitou, a to kyselinu indolyl-3-máselnou (IBA) a 4-chlor-IAA. Dalším přirozeným auxinem je také kyselina fenyloctová (PAA). PAA má mnohem nižší aktivitu než IAA, ale vyskytuje se v pletivech ve vyšších koncentracích (Wightman et Lighty, 1982).

13 Literární rešerše 13 Všechny přirozené auxiny se v rostlinách vyskytují jako volné kyseliny a konjugované formy. Například v rostlinách hrachu byl nalezen halogenovaný derivát 4-Cl-IAA a u několika dalších členů rodu Fabaceae taktéž (Normanly et al., 2010) Syntetické auxiny Při hledání látek s regulační aktivitou bylo nalezeno mnoho syntetických látek mající podobné účinky jako IAA. Lze je rozdělit do čtyř skupin. První skupina zahrnuje naftalenové kyseliny, kam patří naftylocotvá kyselina (NAA). Další skupinu tvoří chlorfenoxykyseliny s nejznámějším zástupcem, 2,4- dichlorfenoxyoctovou kyselinou (2,4-D) a také 2,4,5-trichlorfenoxyoctová kyselina spolu s 2-metyl-4-chlorfenoxyoctovou kyselinou. Třetí skupina je reprezentována benzoovými kyselinami, 2,3,6- a 2,4,5-trichlorbenzoovou kyselinou a dicambou. Deriváty kyseliny pikolinové, picloram, se řadí k poslední, tedy čtvrté skupině (Procházka et al., 1998). 3.2 Hladina auxinu v rostlinách Hladiny auxinu dramaticky kolísají v rámci rostlinného těla a s odhledem na životní cyklus. Jednotlivá pletiva a orgány vykazují odlišnou citlivost k auxinu (Tromas et Rechenmann, 2010). IAA je syntetizována především v apikální oblasti a transportována bazipetálně. Z toho vyplývá, že hladina IAA se snižuje od vrcholu k bázi. Auxin však není syntetizován pouze v apexu, ale rovněž v mladých listech, květních orgánech a vyvíjejících se plodech, zejména v semenech. Obsah IAA koreluje s růstovou intenzitou rostliny, ale také závisí na stáří orgánů. Je taktéž ovlivňován vnějšími faktory (Normanly et al., 2010).

14 Literární rešerše 14 Stabilní vnitřní rovnováha auxinu (homeostaze) je zajišťována průběžnými regulačními mechanismy rostlin. Tato rovnováha přispívá k normálnímu růstu a vývoji rostlin a také zajišťuje adaptaci rostlin na širokou škálu environmentálních stimulů. Mezi mechanismy zajišťující homeostázu patří biosyntéza, katabolismus, konjugace a transport auxinu. Existence několika paralelních biosyntetických drah auxinu zajišťuje dobrou produkci rostlin a obnovu auxinu za jakýchkoli podmínek. Aktivní transport auxinu je zodpovědný za ustanovení auxinových gradientů v rostlinných pletivech a přirozené narušení lokální homeostázy vyvolá různé reakce na buněčné úrovni, které jsou nezbytné k udržení správného růstu a vývoje rostlin a také k rychlému reagování na měnící se environmentální podmínky (Tromas et Rechenmann, 2010) Biosyntéza auxinu IAA je syntetizována většinou v apexu a mladých listech a posléze je transportována po celé rostlině (Ljung et al., 2001), důležitá je i lokální biosyntéza IAA, která zajišťuje správný vývoj rostlin (Tromas et Rechenmann, 2010). Je známo, že biosyntéza auxinu není omezena pouze na mladé listy, ale že k ní může docházet za určitých okolností ve většině pletiv, a to i v kořenech (Marchant et al., 2002). Bylo například zjištěno, že poranění nebo stres může mít zásadní vliv na biosyntézu IAA (Quittenden et al., 2009). Biosyntetické dráhy vedoucí k IAA nejsou doposud zcela přesně objasněny. Veškeré znalosti o těchto drahách vychází ze studií založených na radioaktivním a izotopovém značení. Jsou klasifikovány jako dráhy závislé na tryptofanu, pokud je tedy IAA odvozena přes metabolismus tryptofanu nebo jako cesty na tryptofanu nezávislé a to v případě, pokud je IAA odvozena z časných

15 Literární rešerše 15 indolových prekurzorů tryptofanu, např. indol-3-glycerolfosfátu (Normanly et al., 2010) nebo indolu (Ljung et al., 2002). Dráhy závislé na tryptofanu Mnoho důkazů naznačuje, že rostliny jsou schopny konvertovat tryptofan na IAA prostřednictvím několika možných cest (Yamamoto et al., 2007). Byly identifikovány čtyři cesty vedoucí k biosyntéze IAA. Tyto dráhy zahrnují různé meziprodukty, nejsou paralelní a často se prolínají (Tromas et Rechenmann, 2010). Patří sem tryptaminová dráha, indolyl-3-pyruvátová dráha, indolyl-3-acetamidová dráha a indolyl-3-acetaldoximová dráha (Zhao, 2010; Sugawara et al., 2009). Indolyl-3-acetaldoximová dráha je velice rozporná Glukobrassicin je enzymem myrozinázou štěpen na indolyl-3-acetaldoxim (IAOx) za účasti dvou cytochromů (CYP 79B2, CYP 79B3). Následně je indolyl-3-acetaldoxim konvertován na indolyl-3-acetonitril (IAN), který je nakonec přeměněn pomocí nitriláz (NIT) na IAA (Bartel et Fink, 1994). Indolyl-3-acetaldoxim může být přeměněn také na 3-indolylmetylglukosinolát (IG), který odrazuje herbivory požírat rostliny. Tato dráha je známa u relativně malého množství rostlinných druhů, například u Arabidopsis thaliana (Bak et al., 1998). Naopak indolyl-3-acetamidová dráha se vyskytuje u mnoha rostlin, ale doposud není známo, jak přesně vzniká indolyl-3-acetamid (IAM). Je prokázáno, že ke konverzi IAM na IAA dochází prostřednictvím amidázy 1 (AMI1) (Lehmann et al., 2010). Indol-3-acetamidová dráha biosyntézy IAA byla také popsána u fytopatogenních bakterií. u Agrobacterium tumefaciens, nebo Pseudomonas syringae je tryptofan konvertován tryptofan-2-monooxygenázou (IaaM) na indol-3-acetamid, který je hydrolyzován specifickou amidhydrolázou (IaaH) na konečný produkt IAA (Patten et Glick, 1996).

16 Literární rešerše 16 U vyšších rostlin se nejčastěji setkáváme s dráhou indolylpyruvátovou, ve které je tryptofan transformován na indolyl-3-pyrohroznovou kyselinu (IPA) pomocí aminotransferázy (TAA1). TAA1 tvoří spolu s geny TAR1 (TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE RELATED1) a TAR2 malou genovou rodinu. Exprese těchto genů je indukována etylénem a je významná při lokální biosyntéze auxinu, která řídí řadu vývojových procesů. Následně je kyselina indolyl-3- pyrohroznová dekarboxylována na indolyl-3-acetaldehyd (IAAld), který je oxidován na IAA. Nedávné experimenty prokázaly, že také YUC geny u Arabidopsis se s největší pravděpodobností podílí na konverzi IPA na IAA (Quittenden et al., 2009; Mashiguchi et al., 2011). V poslední době se do popředí zájmů dostává tryptaminová dráha, a to nejen z hlediska nejlépe charakterizované genové regulace, ale i díky identifikaci YUCCA genů (Woodward et Bartel, 2005; Zhao et al., 2001). Byla charakterizována na základě YUCCA genů u Arabidopsis a jejich homologů u jiných rostlinných druhů (Quittenden et al., 2009). Tato dráha zahrnuje dekarboxylaci tryptofanu na tryptamin (TAM) prostřednictvím tryptofandekarboxylázy, dalšího kroku přeměny se účastní YUCCA geny, které hydroxylují aminovou skupinu tryptaminu (TAM) za vzniku N-hydroxyl-TAM. Další modifikací vzniká konečný produkt, IAA (Woodward et Bartel, 2005). Zhao et al. (2002) definovaly pořadí jednotlivých kroků takto: tryptofan, tryptamin, N-hydroxytryptamin, indolyl-3-acetaldoxim, indolyl-3-acetaldehyd a indolyl-3-octová kyselina. Sugawara et al. (2009) nezahrnují indolyl-3-acetaldehyd do této dráhy a podle jejich modelu je N-hydroxytryptamin konvertován přímo na IAA. Výsledky Quittenden et al. (2009) naznačují, že indolyl-3-acetaldehyd se může u hrachu tvořit z tryptaminu.

17 Literární rešerše 17 YUCCA geny kódují proteiny homologické s flavinovými monooxygenázami. Protože jsou YUCCA geny schopné konvertovat tryptamin na N- hydroxytryptamin in vitro, Zhao et al. (2001) navrhl, že YUCCA katalyzují N- oxygenaci TAM u mnoha rostlin. Účast YUCAA v syntéze IAA je také podporována molekulárními analýzami mutantů u petunie, floozy. Tento mutant byl poprvé izolován jako domnělý květní mutant. FZY kóduje flavinmonooxygenázový homolog YUCCA u Arabidopsis a jeho exprese vede ke zvýšení hladin IAA (Tobena-Santamaria et al., 2002). U Arabidopsis existuje 11 YUC genů (Zhao et al, 2001), z nichž YUC1, YUC2, YUC4 a YUC6 hrají důležitou roli při biosyntéze auxinu a tím vývoji rostlin. YUCCA geny nejsou exprimovány všude, jejich exprese se navzájem překrývá a je spíše omezena časově a prostorově, což naznačuje, že normální funkce auxinu je striktně závislá na místě a době syntézy auxinu. Jsou exprimovány především v meristémech, mladých primordiích, vaskulárních pletivech a reproduktivních orgánech. Overexprese každého YUC genu vede k nadprodukci auxinu (Zhao et al., 2001). Mutanti ve dvou, třech či čtyřech genech YUCCA vykazují závažné defekty ve vývoji květních orgánů, tvorbě vaskulatury a dalších vývojových procesech, kromě toho vykazují sníženou expresi reportérového genu pro auxin DR5-GUS v pletivech, v nichž jsou YUC geny exprimovány. Tento fakt ukazuje na to, že geny jsou vzájemně redundantní (Cheng et al., 2006). Defekty u těchto mutantů mohou být eliminovány expresí bakteriálního genu iaam, což vede k názoru, že tyto geny jsou bezpodmínečně nutné pro biosyntézu auxinu u Arabidopsis. Narušení jediného genu YUCCA nevede ke zřejmým vývojovým defektům (Cheng et al., 2006). u Arabidopsis byl charakterizován mutant yucca, který vykazoval zvýšené hladiny endogenního auxinu během všech vývojových stádií. Kořeny tohoto mu-

18 Literární rešerše 18 tantu jsou mnohem kratší a kořenové vlásky naopak delší a bohatší než u standardních rostlin. Dospělé listy byly užší než u standardního typu, celkově rostliny vykazovaly zesílenou apikální dominanci. Tyto zvláštnosti jsou důsledkem zvýšených hladin volného auxinu (Romano et al., 1995). Kromě Arabidopsis thaliana byly identifikovány a studovány homologické geny u rýže (OsYUCCA1-7), kukuřice (ZmYUCCA), topolu Populus trichocarpa (PtYUCCA1-12), petunie (FZY) a rajčete (ToFZY) (Tobena-Syntamaria et al., 2002). U hrachu byly doposud popsány dva geny PsYUC1 a PsYUC2 s částečně odlišnými expresními profily ve stonkovém apexu, dospělých listech a vyvíjejících se semenech (Tivendale et al., 2010). Bylo prokázáno, že v kořenech hrachu probíhá biosyntéza auxinu tryptaminovou dráhou, avšak s určitými rozdíly oproti Arabidopsis thaliana. u hrachu nebyla detekována přítomnost N-hydroxytryptaminu, indol-3-acetaldoximu ani indol-3-acetonitrilu, a biosyntéza zde zřejmě probíhá v pořadí: tryptofan - tryptamin - indol-3- acetaldehyd - IAA, přičemž jako vedlejší produkt může z indol-3-acetaldehydu vznikat indol-3-ethanol (Quittenden et al., 2009). Naopak ve vyvíjejících se semenech hrachu není tryptamin, na rozdíl od tryptofanu, metabolizován na IAA, což ukazuje, že zde biosyntéza auxinu probíhá jiným, dosud nezjištěným způsobem (Tivendale et al., 2010). u semen hrachu bylo prokázáno, že TAM není metabolizován na IAA i v případě silné exprese PsYUC, naopak u kořenů tomu tak je (Tivendale et al., 2010). U rýže je známo 7 YUCCA genů. Nejvýznamnější z nich OsYUCCA1, jehož exprese je omezena na vrcholky listů a špičky kořenů (Yamamoto et al., 2007), hraje významnou roli v biosyntéze IAA. Overexprese tohoto genu vede k projevům, které jsou typické pro rostliny overexprimující IAA. OsYUCCA se

19 Literární rešerše 19 přednostně exprimuje ve špičkách koleoptile, které jsou považovány za jedny z nejaktivnějších míst syntézy IAA (Koshiba et Matsuyama, 1993). Tryptaminová a indolylpyruvátová dráhy byly navrženy sice jako samostatné cesty pro produkci IAA. Avšak fenotypová podobnost mezi TAAdeficientními a YUC-deficientními mutanty naznačuje, že TAA a YUC genové rodiny fungují v téže biosyntetické dráze (Zhao, 2010). Jiné experimenty rovněž prokázaly synergické působení TAA1 a YUC k posílení biosyntézy IAA u rostlin Arabidopsis (Mashiguchi et al., 2011). Dráha nezávislá na tryptofanu Tato dráha bývá pravidelně zpochybňována. Jsou však zjevné důkazy o existenci této biosyntetické dráhy a to díky Trp-deficientním mutantům. Konkrétně u Arabidopsis jsou známí dva mutanti, trp 3-1 a trp 2-1, kteří mají defektní Trp-syntázu α a β. Oba mutanti mohou akumulovat konjugáty IAA navzdory minimálnímu obsahu tryptofanu (Normanly et al., 1993). u těchto mutantů může být IAA transformována z prekurzorů Trp, jako je indolyl-3- glycerolfosfát nebo indol (Woodward et Bartel, 2005) Konjugace IAA Biosyntéza není jediným zdrojem volné IAA. S ohledem na evoluci lze říci, že nižší rostliny využívají pro udržení homeostázy IAA de novo syntézu spolu s degradací tohoto hormonu. Postupem evoluce se rostliny vyvíjely, stávaly se komplexnějšími a i jejich strategie pro regulaci hladiny volné IAA byly také složitější. v současné době je všeobecně známo, že vyšší rostliny jsou schopny ukládat IAA ve formě konjugátů (Normanly et al, 2010). Konjugací označujeme reakci hormonu většinou s nízkomolekulární látkou. Jde o reverzibilní proces, při kterém může být IAA spojována s cukry, AMK (alanin nebo leucin) nebo

20 Literární rešerše 20 peptidy. Rostliny mohou vytvářet konjugáty i z aplikovaných auxinů, ale pouze v menším rozsahu (Bialek et Cohen, 1986). Konjugáty mají funkci zásobní, transportní, dále pak zajišťují detoxikaci nadměrné IAA a chrání před degradací peroxidázami (Cohen et Bandurski, 1982). Například konjugace volné IAA ve zrajících semenech je nutná pro ukládání IAA v takové formě, která je snadno hydrolyzovatelná a je schopná poskytnout hormon k růstu stonku po vyklíčení (Normanly et al., 2010). Dalším příkladem je obnovení tvorby konjugátů u kukuřice či borovice, jakmile je rostlina schopna de novo syntézy. Pomocí konjugace je rostlina schopna regulovat množství aktivního hormonu, který je nutný pro růst rostliny (Cohen et Bandurski, 1982). Ireverzibilní konjugace U Arabidopsis jsou přítomny konjugáty IAA-Glutamát a IAA-Aspartát. Aktivní auxin však nelze uvolnit hydrolýzou těchto sloučenin, které jsou tedy součástí katabolických procesů (Ostin et al., 1998) Katabolismus auxinu Oxidativní katabolismus IAA je považován za chemickou modifikaci indolového kruhu nebo postranního řetězce vedoucí ke ztrátě aktivity. Jedná se o ireverzibilní proces regulující hladinu auxinu. Existují dva způsoby odbourání IAA, dekarboxylační a nedekarboxylační. První je katalyzován peroxidázou/iaa-oxidázou. Cesta nedekarboxylační zahrnuje oxidaci indolového jádra bez současné dekarboxylace. Oxidační cesta byla předmětem detailních studií mnoha rostlinných durhů včetně rýže, kukuřice a bobu (Normanly et al., 2010). Tato oxidace je katalyzována IAA-oxygenázou. Nejčastěji se IAA oxiduje na kyselinu oxindol-3-octovou (Bandurski et al., 1988). Další oxidací benzoového

21 Literární rešerše 21 kruhu může vznikat velmi nestabilní dioxindol-3-octová kyselina (Bandurski et al., 1995). 3.3 Transport auxinu Auxin je především syntetizován v apexu a mladých listech, a odtud transportován po celé rostlině. Existují dva typy transportu auxinu, transport na dlouhé vzdálenosti a transport vedený z buňky do buňky. Většina auxinu je na dlouhé vzdálenosti transportována nepolárně vodivým pletivem, floémem. Tento transport je efektivní, ale není nijak regulovatelný ve srovnání s vysoce regulovaným polárním transportem auxinu (PAT) mezi buňkami (Tromas et Rechenmann, 2010). V případě transportu na krátké vzdálenosti jde o velice specifický aktivní proces, který je většinou polární a vyžaduje energii (Zažímalová et al., 2010). Je zajišťován specifickými přenašeči umístěnými v cytoplazmatické membráně (Jacobs et Gilbert, 1983). Pro pochopení mechanismu transportu z buňky do buňky je třeba znát fyzikálně-chemické vlastnosti auxinu. Vzhledem k jeho malé velikosti a jeho lipofilnímu charakteru, může auxin snadno difundovat přes buněčnou stěnu a plazmatickou membránu. Jedná se o slabou kyselinu (disociované či nedisociované formy), takže jeho schopnost prostoupit membránou je striktně závislá na hodnotách ph. v apoplastu se hodnota ph pohybuje v rozmezí 5,5 5,7 jako výsledek činnosti H+-ATPázy (Zažímalová et al., 2010). To zajišťuje, že IAA je asi z 16% ve formě nedisociované (IAA), a zbývajících 84% ve formě disociované (IAA-) (Tromas et Rechenmann, 2010). Ačkoliv hydrofilní charakter indolové skupiny v molekule IAA umožňuje spojení s povrchem plazmatické membrány, negativní náboj disociované karboxylové skupiny brání průchodu membránou. Proto pouze nedisociovaná IAA je

22 Literární rešerše 22 schopna do buňky vstoupit pasivně (difúzí) bez účasti proteinových přenašečů (Zažímalová et al., 2010). i přesto, že auxin může vstoupit pasivně do buňky, je aktivní transport prostřednictvím specifických transportérů velmi důležitý (Pickett et al., 1990). Auxinové přenašeče zajišťující vstup auxinu do buňky byly identifikovány na základě analýz aux1 mutantů u Arabidopsis (Pickett et al., 1990). Mezi tyto přenašeče se řadí AUX/LAX rodina permeáz (Bennett et al., 1996). Tyto přenašeče mají specifické role v různých procesech, např. při kořenovém gravitropismu či formování laterálních kořenů (Tromas et Rechenmann, 2010). Prostředí cytosolu má poměrně stabilní ph pohybující se kolem hodnoty 7,4. v tomto prostředí se IAA nachází ve formě aniontu IAA- (Tromas et Rechenmann, 2010). Jakmile auxin vstoupí do cytosolu, tak ve formě IAA- není schopen opustit vnitřní prostředí buňky, buňka v tuto chvíli funguje jako tzv. aniontová past slabých kyselin. Export auxinu je zajišťován specifickými transportéry (PIN a PGP proteiny) a asymetrickou lokalizací těchto transportérů (Zažímalová et al., 2010).

23 Literární rešerše 23 Obr. 1 Chemiosmotický model (upraveno podle: Vieten et al., 2005) Auxinové transportéry Polární transport auxinu z buňky do buňky je realizován v xylémovém parenchymu, kambiu a prokambiu (Gälweiler et al., 1998). Tento transport je zprostředkován specifickými přenašeči. Tyto přenašeče lze rozdělit na influx a efflux přenašeče. Zatímco první typ přenašečů, kam patří AUX1/LAX proteiny, zajišťují transport auxinu do buňky (Bennett et al., 1996), druhý typ zprostředková-

24 Literární rešerše 24 vá transport auxinu z buňky. Neexistuje pouze jeden nebo několik málo eflux přenašečů, ale nejméně dvě proteinové rodiny. Sem patří proteiny z rodiny PIN (Vieten et al., 2005) a ABC, převážně její skupiny B, tzv. ABCB proteiny (Zažímalová et al., 2010). Vstup i výstup auxinu z buněk je nezbytný pro normální vývoj rostliny. Vstupní přenašeče auxinu - AUX/LAX proteiny Genom Arabidopsis thaliana kóduje např. AUX1, LAX1, LAX2 a LAX3 proteiny (Zažímalová et al., 2010) patřící do subrodiny aminokyselinových permeáz. Tyto proteiny sdílí 80 % sekvenční homologii (Parry et al., 2001) a působí jako symporty umožňující vstup IAA do buňky za pomocí protonového gradientu (Yang et al., 2006). Tyto přenašeče mají specifické role v různých procesech, např. v kořenovém gravitropizmu a formování laterálních kořenů (Swarup et al., 2008). Výstupní přenašeče auxinu - PIN proteiny a ABC proteiny PIN proteiny jsou integrální membránové proteiny. Byly identifikovány na základě pin1 mutantních rostlin, které vykazovaly defekty v květech a listech (Okada et al., 1991). U Arabidopsis je známo 8 členů z PIN rodiny, které se dále dělí do dvou dalších podskupin ( dlouhé a krátké ) podle délky hydrofilní smyčky nacházející se uprostřed polypeptidového řetězce. PIN proteiny jsou exprimovány v pletivech a buňkách transportující auxin a jsou asymetricky lokalizovány na plazmatické membráně (Tromas et Rechenmann, 2010). Mezi proteiny označované jako dlouhé patří PIN1, PIN4 a PIN7 (Zažímalová et al., 2007, Petrášek et al., 2006). Polární lokalizace těchto PIN proteinů určuje směr toku auxinu (Wisniewska et al., 2006). Tyto proteiny jsou po-

25 Literární rešerše 25 drobovány cyklování, a to mezi plazmatickou membránou a endosomálními kompartmenty v reakci na enviromentální signály (Geldner et al., 2001). Druhá skupina proteinů krátké má hydrofilní smyčku částečně (PIN6) nebo značně (PIN5, PIN8) redukovanou. Tyto PIN proteiny nejsou lokalizovány na plazmatické membráně, ale na endoplazmatickém retikulu. Umístění na endoplazmatickém retikulu je určující pro intracelulární distribuci auxinu a regulaci homeostáze auxinu (Zažímalová et al., 2010). ABC proteiny patří do rodiny ATP-binding katetových transportních proteinů, které jsou někdy označovány jako P-glykoproteiny (označované MDR-PGP). Tyto transportéry jsou spojovány s pohyby nejrůznějších malých molekul, živin a xenobiotik. Vykazují vysoký stupeň strukturní konzervativnosti. Nejreprezentovanější zástupci této rodiny, ABCB1 a ABCB19, působí jako influx přenašeče, zatímco ABCB4 vykazuje komplexnější charakteristiky transportu (Geisler et Murphy, 2006). Je pro něj typické, že při nízkých koncentracích auxinu fungují jako influx přenašeč, zatímco při vysokých koncentracích působí jako eflux přenašeč (Yang et Murphy, 2009). ABCB1, 4 a 19 vykazují stabilní nepolární lokalizaci na plazmatické membráně Inhibitory polárního transportu auxinu Polární transport auxinu může být specificky blokován kyselinou 2,3,5-trijodbenzoovou (TIBA), N-(1-naftyl)ftalamovou (NPA) či fluorenolem, dále pak také 1-pyrenoylbenzoovou (Rubery, 1990). 3.4 Hlavní účinky auxinů Mezi hlavní účinky auxinů patří stimulace prodlužovacího růstu a apikální dominance.

26 Literární rešerše Stimulace prodlužovacího růstu Tento efekt je pouze výjimečně pozorovatelný u intaktních rostlin, je však patrný na segmetech koleoptilí a stonků. Z tohoto pohledu má auxin významnou roli v regulaci tropizmů, ať už gravitropizmu nebo fototropizmu. Vlivem gravitace (osvětlení) dochází k asymetrické distribuci auxinu, což vede k nerovnoměrnému růstu a ohybu. (Procházka et al, 1998) Apikální dominance Apikální dominance je popisována jako jev, při kterém stonkový apex inhibuje růst a vývoj axilárních pupenů (Cline, 1991). Někdy je apikální dominance označována jako paradormance (Lang, 1990). Apikální dominance a její uvolnění může být rozděleno do čtyř vývojových stádií: formování laterálního pupenu (1), vliv apikální dominance (2), iniciace růstu laterálního pupenu po dekapitaci (3) a následná elongace a vývoj laterálního výhonu (4). Všechny tyto stádia se prolínají, ale protože každá fáze zahrnuje různé procesy a je ovlivňována odlišnými rostlinnými hormony, jsou považovány za samostatné. Zvláštní důraz je kladen na třetí stádium, ve kterém může být růst pupenu podpořen cytokininy a naopak inhibován auxiny. Důležité je také čtvrté stádium ovlivňované auxiny spolu s gibereliny (Cline, 1997). Tato vývojová stádia jsou za určitých podmínek reverzibilní (Stafstrom et al., 1995). Klíčovou roli v apikální dominanci hrají molekuly auxinu. Auxin produkovaný v apexu rostliny může potlačit růst laterálních pupenů tím, že inhibuje export auxinu z těchto pupenů (Cline, 1991). Stonkový vrchol spolu s mladými listy jsou známými zdroji auxinu, který je transportován bazipetálně stonkovou vaskulaturou do kořenů (Balla et al., 2011). Tento transport je velice důležitý pro regulaci apikální dominance (Kalousek et al., 2010; Balla et al., 2011). Celá

27 Literární rešerše 27 řada experimentů naznačuje, že apikálně odvozený auxin nevstupuje přímo do inhibovaných pupenů (Booker et al., 2003). Po uvolnění z apikální dominance u některých druhů zůstávají hladiny auxinu v pupenech konstantní nebo dokonce zvýšeny a je možné, že místo působení auxinu je vzdáleno od těchto pupenů (Hillman et al., 1977). Proto se zvažuje, že jako indikátor stupně inhibice by se mohlo použít množství endogenního auxinu v systému polárního transportu auxinu (Booker et al., 2003). Dekapitace stonkového vrcholu spočívá v odstranění zdroje auxinu a proto vyčerpání auxinu v laterálním pupeni (Cline, 1991). Odstraněním apexu jsou proto uvolněny axilární pupeny z inhibice a následně vyrůstají postranní výhony nahrazující dominantní vrchol (Kalousek et al., 2010; Balla et al., 2011). Poškozením vrcholu stonku větrem nebo požerem zvířat se uvolní apikální dominance, která funguje i jako mechanismus pro přežití a regeneraci rostlin (Cline, 1991). Během několika hodin po odstranění apexu dochází ke zřetelnému prodlužování axilárních pupenů. Počáteční růst je zřejmě způsoben tzv. kyselým růstem buněčné stěny, vyvolaným zvýšenou hladinou auxinu. Endogenní hladiny IAA v pupenech dosahují maxima během 4 až 8 hodin po dekapitaci (Cline, 1997). Uvolnění z apikální dominance může být podpořeno přímou aplikací cytokininů na laterální pupen (Sachs et Thimann, 1967). Vyvíjející se laterální výhony mohou vytvářet vlastní auxin, který podpoří jejich následné prodlužování. Naopak inhibiční účinek stonkového apexu může být simulován aplikací auxinu na dekapitovaný pahýl (Thimann et Skoog, 1934). v tomto případě jsou sice axilární pupeny inhibovány, ale zůstávají stále metabolicky aktivní (Stafstrom et al., 1995).

28 Literární rešerše 28 Teorie o mechanizmu apikální dominance Na počátku 20. století se vědci domnívali, že stěžejním faktorem v AD je soutěžení o výživu mezi meristémem vrcholového a postranního pupene. Věřilo se, že do vrcholového pupenu se živiny dostávají přednostně a ochuzují o ně postranní pupeny a tím brzdí jejich růst (Loeb, 1918). Další zkoumání vedla k názoru, že se v rostlině vyskytují inhibiční látky brzdící růst axilárních pupenů. Dostál (1909) zjistil, že listy a dělohy jsou nejen zdrojem živin, ale také inhibičních látek, která brání růstu pupenů. v roce 1933 Thimann a Skoog dokázali, že inhibiční vliv stonkového apexu na růst axilárních výhonů je podmíněn hormonálně prostřednictvím auxinu. Také zjistili, že hlavním místem syntézy auxinu jsou rychle rostoucí vrcholový pupen a mladé listy, nikoliv zainhibované pupeny. Auxin, který proudí bazipetálně ve stonku je odpovědný za inhibici růstu postranních pupen, protože po vstupu do tohoto pupenu zde inhibuje syntézu IAA (Thimann, 1937). Snow (1937) se snažil prokázat vliv specifických inhibitorů na apikální dominanci. Podle jeho teorie vysoká hladina IAA v apexu umožňuje jeho růst, zatímco postranní pupeny chudší na auxin nejsou před inhibicí ochráněny, podléhají jejímu vlivu a proto nerostou. Teorie o vaskulárních spojeních teorie byla odvozena od teorie přímé auxinové inhibice a nutričně diverzní teorie (Sorokin et Thimann, 1964). Podle ní auxin, resp. korelační inhibitor brání toku látek, které jsou důležité pro růst, do laterálních pupenů tím, že ovlivňuje spojení vodivého pletiva mezi stonkem a laterálním pupenem (Overbeek, 1938). Jacobs et al. (1959) prokázal, že IAA indukuje regeneraci xylému. Sorokin et Thimann (1964) prokázali, že auxin má vliv na diferenciaci vodivého pletiva.

29 Literární rešerše 29 Podle Bangertha (1989) polární transport auxinu z dominujícího orgánu (stonkový apex) blokuje export auxinu z inhibovaných orgánů (axilární pupeny) do primárního stonku. Tento tzv. autoinhibiční polární transport auxinu nastává v místech spojení dominantních a zainhibovaných orgánů. Bylo zjištěno, že inhibování růstu pupenů je dáno bazipetálním transportem IAA ve stonku nikoliv akumulací IAA v axilárním pupeni. Tato myšlenka naznačuje, že auxin může působit nepřímo prostřednictvím druhých poslů, jako je etylén či kyselina abscisová, které inhibují růst laterálních pupenů (Cline, 1991). Teorie kompetitivní kanalizace vychází z kanalizační teorie (Sachs et Thimann, 1967), která byla vyslovena na základě pozorování regenerace vaskulárních pletiv narušených mechanickým poškozením stonku. Tato regenerace je spojena s procesem kanalizace auxinového toku. Ze začátku jsou všechny buňky v místě narušení vaskulárního systému transportními buňkami pro auxin. Posléze se některé buňky začínají specializovat na transport auxinu. Tyto buňky transportující auxin se diferencují na provaskulární pletiva, a tím se stávají prioritními auxinovými kanály (Sauer et al., 2006). Pokud jsou založeny dva zdroje auxinu, jeden zdroj je schopen inhibovat tvorbu kanálu z druhého zdroje, tzn. dochází mezi nimi ke kompetici (Sachs, 1968). Tok auxinu repolarizuje buňky v závislosti na jeho směru a nové vaskularní kanály se vytváří podél těchto buněk. Pokud byl auxin aplikován nejprve laterálně na stonek hrachu, je tato aplikace dostačující pro tvorbu nového auxinového kanálu. Auxin produkovaný v pupenu a transportovaný z tohoto aktivovaného pupenu je jasným signálem pro tvorbu vaskulárního spojení z laterálního stonku. v opačném případě pokud je auxin aplikován nejprve na

30 Literární rešerše 30 apex, tak nedochází k založení nových auxinových kanálů, ani ke tvorbě vaskulatury z laterálního zdroje auxinu (Balla et al., 2011). Rostliny mající geneticky podmíněnou silnou apikální dominanci, v přítomnosti primárního zdroje auxinu brání exportu auxinu a kanalizaci ze sekundárního zdroje během vývoje rostliny. Export auxinu z axilárních pupenů a následná kanalizace nebo kanalizace z laterálního zdroje auxinu je možná pouze po odstranění nebo oslabení primárního zdroje auxinu. Primární a sekundární transport auxinu mezi sebou soutěží. Pokud je odstraněn apex, dojde k narušení polární toku auxinu v hlavním stonku, což vyvolá export auxinu z axilárních pupenů. Masivní distribuce auxinu, která je vyvolaná polarizací PIN přenašečů formuje auxinové transportní kanály a posléze vaskulaturu, která je nezbytná pro růst pupenu (Balla et al., 2011) Role exogenně aplikovaného auxinu v apikální dominanci Exogenně aplikovaný auxin výrazně inhibuje růst laterálních pupenů po dekapitaci, tzn. obnovuje apikální dominanci u mnoha rostlin. Inhibiční účinek auxinu se projevuje v koncentracích 10-5 a 10-4 M ve vodném roztoku nebo 0,1 1 % auxin v lanolinu (Kelly et Bradford, 1986). Z hlediska typu auxinu, byl obecně účinnější v inhibování růstu laterálních pupenů α-naa nežli IAA. β-naa vykazoval vždy malý nebo žádný efekt na apikální dominanci (Cline, 1996). Auxin přítomný ve vodném roztoku neměl takový účinek jako v lanolinu, v důsledku neznámého penetračního nebo metabolického problému. U rostlin se slabou apikální dominancí jako je například rod Coleus nebo Arabidopsis, aplikovaný auxin neměl žádný nebo velmi malý vliv na potlačení růstu laterálních u dekapitovaných rostlin (Cline, 1996).

31 Literární rešerše Role cytokininů v apikální dominanci Řada hypotéz uvažuje o možné existenci sekundárního mobilního signálu, který je schopen vstoupit do axilárních pupenů přímo a jehož hladiny jsou regulovány auxinem přítomným v primárním stonku (McSteen et Leyser, 2005). k nejčastěji zmiňovaným potenciálním sekundárním poslům auxinu se řadí cytokininy, jejichž biosyntéza a transport z kořenů je kontrolována auxinem a které mohou vstoupit přímo do pupenů a stimulovat jejich růst (Li et al., 1995). Hladina endogenních cytokininů v kořeni není podle nejnovějších poznatků kontrolním faktorem pro regulaci větvení. Naproti tomu cytokininy syntetizované lokálně nodu mohou hrát důležitou roli při zakládání laterálních výhonů (Bangerth, 1994). Mnohé experimenty dokazují, že cytokininy zeslabují apikální dominanci (Ongaro et Leyser, 2008). Přímá aplikace cytokininů na inaktivovaný axilární pupen stimuluje jeho růst i v případě intaktního apexu (Sachs et Thimann, 1967). Kalousek et al. (2010) pozorovali, že po exogenní aplikaci cytokininu na axilární pupen se zvýšila exprese PsAUX1 a PSPIN1 genů, jejichž exprese je indukována auxinem, a současně poklesla exprese genů PsDRM1 a PsAD1. Poslední dva zmiňované geny jsou spojovány s dormancí pupenů. Tyto výsledky naznačují, že endogenní cytokininy mohou v axilárech stimulovat biosyntézu nebo transport auxinu. Podle Turnubull et al. (1997) pouze cytokininy nemusí být primárním signálem pro růst pupenů. Tato myšlenka byla ověřována experimentálně na rms1 mutantních rostlinách hrachu, které vykazují zvýšené větvení. Fenotyp těchto mutantů není výsledkem zvýšeného transportu cytokininů z kořenů, protože exudáty xylému obsahují mnohem nižší hladiny cytokininů nežli exudáty kontrolních rostlin (Turnbull et al., 1997). Také odlišné cytokininy

32 Literární rešerše 32 mohou mohou vykazovat rozdílné efekty při uvolnění apikální dominance (Cline, 1991). Obdobné změny v expresi výše zmíněných genů byly pozorovány po dekapitaci stonkového vrcholu, ale byly výrazně pomalejší. Dekapitace a tím následné odstranění zdroje auxinu umožní přesměrovat tok cytokininů do laterálních pupenů, dochází k nárůstu hladiny endogenních cytokininů, což má vliv na růst axilárních pupenů. Převážná část cytokininů je produkována v kořenech, ale i stonky jsou schopny vytvářet cytokininy a mohou tak být zdrojem cytokininů pro růst pupenu (Carmi et Van Staden, 1983). Existuje také možnost, že dekapitace spojená s odstraněním zdroje auxinu z apikální oblasti může vést ke konverzi inaktivního cytokininu na aktivní formu (Cline, 1991). Efekt dekapitace na hladiny cytokininů je možné eliminovat aplikací auxinu na stonkové pahýly dekapitovaných rostlin (Turnbull et al., 1997). Axilární pupeny jsou po dekapitaci zásobovány cytokininy ze dvou zdrojů. Cytokininy jsou transportovány z kořenů do stonku k axilárním pupenům prostřednictvím xylému (Wareing et Phillips, 1981). Dále bylo prokázáno, že po dekapitaci dochází k biosyntéze cytokininů přímo ve stonku (Procházka et Jacobs, 1984). Auxinové transportéry z rodiny PIN proteinů byly v inhibovaných axilárních pupenech lokalizovány nepolárním způsobem, a až následná aplikace cytokininů způsobila postupnou polarizaci těchto proteinů. Konkrétně relokalizace již nasyntetizovaných PsPIN1 proteinů byly velice významná pro polární transport auxinu na rozdníl od de novo syntézy těchto proteinů, která není natolik klíčová, ale jak relokalizace tak i syntéza de novo přispívají k rychlejší reakci axilárních pupenů na aplikaci cytokininů (Friml et al., 2003). Na modelové rostlině Pisum sativum bylo zjištěno, že auxin reguluje negativně lokální biosyntézu cytokininů ve stonku tak, že kontroluje expresi

33 Literární rešerše 33 PsIPT1 a PsIPT2, které hrají klíčovou roli v biosyntéze cytokininů (Tanaka et al., 2006). Z některých studií vyplývá, že cytokininy přímo ovlivňují expresi PIN genů. Růžička et al. (2009) pozorovali v kořenech Arabidopsis negativní efekt cytokininů na expresi AtPIN1 a AtPIN4, dále pak pozitivní efekt na expresi At- PIN7 a nepatrný negativní efekt na expresi AtPIN2. v rozporu s tím, Pernisová et al. (2009) uvedla, že u explantátů hypokotylu Arabidopsis thaliana dochází k nárůstu exprese AtPIN6 a poklesu exprese AtPIN2. Z těchto výsledků jasně vyplývá, že vliv cytokininů na expresi PIN genů je pro jednotlivé geny v různých pletivech specifický Role jiných fytohormonů v apikální dominanci Kyselina abscisová (ABA) spolu s etylénem byly navrženy jako přenašeče auxinu. Důkaz o roli těchto fytohormonů v kontrole růstu pupenů vychází z fyziologických studií. Ovšem jejich role nebyla prokázána u všech rostlinných druhů či za všech enviromentálních podmínek. Např. u Arabidopsis nehraje etylén žádnou roli v potlačení větvení, protože mutace v biosyntéze etylénu či transgenní rostliny nevedou k pozměněnému fenotypu (Romano et al., 1993). Obdobný případ je patrný u mutantů abi1, které nevykazují pozměněné reakce k auxinu, ale pupeny jsou rezistentní k ABA. i když výše uvedené hormony mohou regulovat aktivitu pupenů, zřejmě nejsou zapojeny do auxinem zprostředkované apikální dominance (Booker et al., 2003). Přímá aplikace syntetického analogu strigolaktonu, GR-24, inhibuje růst axilárních pupenů u ccd8 mutantů (Gomez-Roldan et al, 2008), stejně jako u dekapitovaných standardních rostlin (Brewer et al,. 2009). Přesný mechanismus strigolaktonem zpro-

34 Literární rešerše 34 středkované inhibice růstu axilárních pupenů je doposud nejasný, ale některé práce naznačují možný vliv strigolaktonu na polární transport auxinu (Ruyter-Spira et al., 2011) Role faktorů vnějšího prostředí v apikální dominanci Všechny rostliny jsou ovlivňovány vnějším prostředím a jsou schopny se přizpůsobit jeho změnám. Mezi faktory, které ovlivňují apikální dominanci patří voda, minerální látky, teplota, obsah a tenze par v atmosféře, bioelektrické pole, gravitace a v neposlední řadě světlo. Pokud nejsou rostliny vystaveny vodnímu stresu, dochází k uvolnění apikální dominance (Cline, 1991). McIntyre (1987) vyslovil hypotézu, podle které laterální pupeny nejsou schopny úspěšně soutěžit o vodu v xylému. Dekapitace vede ke bezprostřednímu zvýšení vodního potenciálu v xylému, který je předáván apoplasticky po celé rostlině. Zajistí tak trvalou příjem vody a živin do laterálních pupenů a tím jejich růst (Cline, 1991). Apikální dominance je velmi citlivá ke změnám v intenzitě ozáření a kvality slunečního spektra. Zvýšené hladiny ozáření mohou výrazně oslabit AD u mnoha druhů rostlin (s výjimkou těch s velmi silnou AD) a tím je zajištěn růst laterálních pupenů (Gregory et Veal, 1957). Zastínění rostlin potlačuje růst a větvení laterálních pupenů (kromě těch rostlin s velmi slabou AD) (Cline, 1996). Rostliny v otevřeném prostoru mají husté koruny, zatímco rostliny obklopené hustou vegetací jsou vysoké a nevětví se. Mimo jiné i kvalita světla je důležitým faktorem v apikální dominanci. Červené (R) světlo oslabuje apikální dominanci, zatímco dlouhovlnné červené (FR) posiluje AD (Casal et al., 1985). FR světlo nejen že inhibuje růst pupenů, ale také zesiluje elongaci již vzniklých pupenů (Morgan et Smith, 1986). Mnohými experimenty bylo zjištěno, že i fotoperioda může mít vliv na větvení stonků (Healy et al., 1980). Existují hypo-

35 Literární rešerše 35 tézy, že světelné podmínky mohou ovlivňovat hladiny endogenních cytokininův některých pletivech rostlin a proto mohou ovlivnit růst pupenů (Thimann et al., 1971). Důkaz o tom, že je apikální dominance citlivá ke gravitaci, lze jednoduše dokázat orientováním stonku pod různými úhly od svislé osy. Pokud stonek umístíme horizontálně nebo opačně, dojde k následnému růstu několika inaktivních pupenů. v souvislostí s gravitací byla zvažována možná role auxinu a to z toho důvodu, že transport auxinu je velmi citlivý na gravitaci a také že dochází ke zvýšené akumulaci auxinu na spodní straně horizontálně orientovaných stonků, ale tato tvrzení však nebyla jednoznačně prokázána (Prakash et al., 1985). Existují důkazy, že také etanol hraje významnou roli v gravitačních efektech při ovlivňování apikální dominance. Protože horizontální umístění roslin zvyšuje produkci etanolu, je možné, že etylénem indukovaný gravitační stres může přímo nebo nepřímo podporovat růst laterálních pupen (Abeles et Gahagan, 1968). Také velká rychlost větru či změny ve směru gravitace mohou uvolnit AD (Prasad et Cline, 1985).Je možné, že na oslabení AD mají vliv další faktory venkovního prostředí. 3.5 Hormonální interakce při vývoji rostlin Interakce mezi hormony regulují funkce meristémů a tudíž kontrolují utváření všech orgánů rostliny. Nejvýznamnějšími hormony při vývoji rostliny, tj. od embryogeneze po senescenci, jsou auxiny, cytokininy, brasinosteroidy, gibereliny a strigolakton (Durbak et al., 2012). Tyto hormony působí nejen samostatně, ale také ovlivňují funkce stonkového apikálního meristémů (SAM) vzájem-

36 Literární rešerše 36 nou interakcí (Depuydt et Hardtke, 2011). v nedávné době bylo prokázáno, že auxin hraje významnou roli při udržování vysokých hladin cytokininů v meristémech (Zhao et al., 2010), dále pak že auxin spolu s cytokininem regulují organogenezi. Auxin je také důležitý pro iniciaci orgánů v periferní zóně, zatímco cytokinin reguluje distribuci auxinu prostřednictvím transkripční regulace PIN proteinů v kořeni a stonku (Pernisova et al., 2009). Místem iniciace orgánů a jejich následného růstu jsou oblasti s vysokou hladinou auxinu. Lokalizace auxinu je dána právě jeho transportem prostřednictvím PIN proteinů (Reinhardt et al., 2003). Vysoké hladiny cytokininů indukují expresi PIN3 a PIN6 proteinů, ale zároveň inhibují expresi PIN2. Mimo jiné mají cytokininy odlišné účinky na expresi PIN proteinů v kořeni (Pernisova et al., 2009). V kořenovém apikálním meristému působí auxiny a cytokininy antagonisticky, což má vliv na regulaci transportu a signalizace auxinu. Vysoké hladiny auxinu jsou zodpovědné za degradaci represoru (SHY2)/IAA3, což vede k aktivaci exprese PIN prostřednictvím ARF proteinů. Tím dochází k akumulaci auxinu v kořenové špičce. Naopak vysoké hladiny cytokininů indukují expresi ARR1 a ARR2, které aktivují SHY2 potlačující auxinovou signalizaci (Dello Ioio et al., 2008). Cytokininy redukují hladiny PIN1 proteinů pomocí lytické degradace ve vakuole (Marhavy et al., 2011). Je známo, že i jiné hormony, např. brasinosteroidy mohou působit v kořenovém apikálním meristému (Gonzalez-Garcia, 2011). Mutace v receptoru těchto hormonů BRI1 vede k aberantnímu průběhu buněčného cyklu. Ačkoliv je známo, že auxin stimuluje biosyntézu brasinosteroidů, aktivita těchto hormonů nemá vliv na expresi PIN genů (Hacham et al., 2011) a působí tak nezávisle na auxinu (Durbak et al., 2012).

37 Literární rešerše 37 Větvení laterálních výhonů je také ovlivňováno působením rostlinných hormonů (McSteen, 2009). Hormonální regulace vývoje laterálního pupenu zahrnuje antagonistické působení auxinu, cytokininu a strigolaktonu. Auxin syntetizovaný v apexu a transportovaný bazipetálně, nepřímo inhibuje růst axilárních pupenů. Naopak cytokininy, které putují akropetálně prostřednictvím xylému směrem do axilárních pupenů, podporují jejich růst. Strigolaktony syntetizované v kořenech a transportované akropetálně přímo potlačují vývoj axilárních pupenů (Durbak et al., 2012). Nedávno bylo zjištěno, že zvýšená hladina cytokininů indukuje biosyntézu auxinu v mladých kořenech a stoncích, zatímco snížené hladiny mají opačný účinek. Správná hladina auxinu a cytokininu je udržována zpětnou vazbou (Jones et al., 2010). Tato zpětná vazba je také patrná i mezi auxinem a strigolaktonem (Domagalska et Leyser, 2011).

38 MATERIÁL A METODY 38 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Rostlinný materiál Pro účely experimentu byly použity rostliny hrachu setého (Pisum sativum L.), odrůda Vladan (Semo a. s., Smržice, ČR). Semena hrachu se nejdříve nechala nabobtnat po dobu 24 hodin ve vodě při laboratorní teplotě. Po uplynutí této doby byla vyseta do vlhkého perlitu. Po 3-4 dnech bylo patrné vyklíčení semen. Poté byly naklíčené rostliny přesazeny do kultivačních nádob s perlitem, ve kterých byly pěstovány v podmínkách klimaboxu při teplotě 20/18 C a fotoperiodě 16/8 hod. (den/noc) a při světelné intenzitě 150 μmol. m -2. s -1. Rostliny byly dále dopěstovány za využití Richterova živného roztoku (Richter, 1926), viz tabulka č Založení experimentu a odběr vzorků V samotném experimentu se používaly 7-denní rostliny hrachu setého (Pisum sativum), které byly dopěstovány v kultivačních nádobách v klimaboxu. Následně byly použity k experimentům studia genové exprese. 4.3 Provedení experimentů Varianty s dekapitací stonkového apikálního meristému Dekapitace rostlin byla provedena cca 10 mm nad 2. axilárním pupenem. Na řeznou plochu byla po dekapitaci aplikována lanolinová pasta z toho důvodu, aby tuto pokusnou variantu bylo možno srovnat s variantou s aplikací auxinu v lanolinové pastě namísto dekapitovaného apexu, a také proto aby řezná plocha nevysychala. Po dekapitaci rostlin byl iniciován růst 2. axilárního pupenu, jež byl vymaněn z vlivu dominance apikálního vrcholu. Druhé axilární pupeny

39 MATERIÁL A METODY 39 sloužily k izolaci RNA. Byly odebrány v časových intervalech 0; 0,5; 1; 3; 6; 12; 24; 48 a 120 hodiny od dekapitace Varianty s aplikací 1%IAA po dekapitaci stonkového apikálního meristému Dekapitace rostlin byla provedena obdobně jako u první varianty, tedy cca 10 mm nad 2. axilárním pupenem. Následovala aplikace auxinu ve formě lanolinové pasty s obsahem 1% IAA (Sigma-Aldrich, USA). Ošetření 1% IAA simulovalo inhibiční efekt apikálního vrcholu na růst axilárních pupenů. Druhé axilární pupeny byly opět využity k účelům izolace RNA a odebrány v časových intervalech 0; 0,5; 1; 3; 6; 12; 24; 48 a 120 hodin od dekapitace a následné aplikace 1% IAA Varianty s aplikací cytokininu na 2. axilární pupen intaktních rostlin Na 2. axilární pupen intaktních rostlin byla aplikována lanolinová pasta s obsahem 1% BAP (Sigma-Aldrich, USA). Po nanesení 1 % BAP byl iniciován růst pupenu, i pokud nebyl odstraněn růstový vrchol. Druhé axilární pupeny byly využity k izolaci RNA a odebrány v časových intervalech 0; 0,5; 1; 3; 6; 12; 24; 48 a 120 hodin od aplikace 1 % BAP. V rámci jedné varianty pokusu byly vždy odebrány 2. axilární pupeny ze 30-ti rostliny. Pro každou variantu byly provedeny experimenty ve dvou biologických a dvou technických opakováních.

40 MATERIÁL A METODY 40 Tab. 1 Zásobní Richterův roztok (pro přípravu roztoku o objemu 5 l je potřeba 10 ml zásobního roztoku). Chemikálie Penta (ČR) Chemické složení roztoku Koncentrace chemikálie [g/l], [g/50 ml] Ca(NO3)2. 4H2O 365,00 g.l -1 KNO3 100, 00 g.l -1 KH2PO4 100, 00 g.l -1 MgSO4. 7H2O 125,00 g.l -1 FeCl3. 6H2O 27,02 g.l -1 = 1,351 g/50 ml Chelaton III. 37,22 g.l -1 = 1,861 g/50 ml 4.4 Izolace RNA Při izolaci RNA se postupovalo podle návodu RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Německo). ( Tento typ izolace využívá selektivních vazebných vlastností silikonové membrány spolu s centrifugací. Použitý biologický materiál je nejprve lyzován a homogenizován v přítomnosti vysoce denaturujícího pufru s obsahem guanidin thiokyanátu. Přidáním etanolu se zajistí potřebné podmínky pro navázání RNA na membránu a vymytí kontaminantů. Potřebnou čistotu izolované RNA docílíme použitím DNázy při izolaci. Při provádění izolace RNA je nutná čistota nejen nástrojů a přístrojů, ale i pracovní plochy. A také je nutné používat sterilní latexové rukavice, sterilní špičky a mikrozkumavky. Je to z toho důvodu, aby se zamezilo degradaci RNA ribonukleázami. Izolovaná RNA byla rozpuštěna v konečném objemu 20 μl RNase-free vody. Vzorky byly uchovány v hlubokomrazícím boxu (- 77 C).

41 MATERIÁL A METODY Spektrofotometrické měření koncentrace RNA Koncentrace vyizolované RNA byla změřena spektrofotometrem Anthelie (Secomam, Francie), tzn. měřením absorbancí jednotlivých vzorků při vlnové délce 260 nm. Výsledná koncentrace vyizolované RNA byla vypočítána ze vztahu A260nm = 1. Hodnotě jedna odpovídá roztok RNA o koncentraci 40 μg/ml. Pro účely měření na spektrofotometru byly vzorky připraveny smícháním 198 μl deionizované vody bez obsahu RNáz a 2 μl vyizolované RNA. 4.6 Ověření integrity RNA pomocí elektroforézy Pro elektroforézu byl použit 1 % agarózový gel. Jeho složení je uvedeno níže v Tabulce č. 1. Navážka agarózy byla rozpuštěna v daném objemu 10x FA pufru dle manuálu RNeasy Mini Handbook (Qiagen, Německo), viz Tabulka č. 2 a doplněna RNase-free vodou. Za neustálého míchání byl roztok přiveden k varu ve varné kádince a následně byl ochlazen na ledu pod teplotu 65 C. Při této teplotě byl k roztoku přidán ethidium bromidu a formaldehyd. Pro účely elektroforézy byl agarózový gel inkubován po dobu 30 minut v 1x FA gel running vyrovnávacím pufru. Množství vzorku obsahující 1 μg RNA bylo následně smícháno v mikrozkumavce s nanášecím pufrem 5xRNA loading buffer (viz Tabulka č. 4) v poměru 4:1. Posléze se vzorky inkubovaly 5 minut při teplotě 65 C a nanesly se do nanášecích jamek v agarózovém gelu. Samotná elektroforéza probíhala v 1xFA, který se připravil naředěním 10xFA pufru a to za využití soupravy pro elektroforézu OMNI-BIO (ČR). Tato souprava obsahuje nádobu na elektroforézu, formu na gel, hřebínek pro vytvoření 10-ti jamek o šířce 0,6 cm a zdroj stejnosměrného napětí. Separace vzorků probíhala při napětí V. Po separaci byly fragmenty vizualizovaný pod UV zářením v systému GDS 7500 (UVP,

42 MATERIÁL A METODY 42 USA). Gely amplifikačních produktů byly dále vyhodnoceny za použití programu GELWORKS (UVP, USA). Tab. 2 Složení 1% agarózového gelu chemikálie a roztoky Objem Agaróza (Sigma-Aldrich, USA) 0,30 g 10x FA vyrovnávací pufr (Sigma-Aldrich, USA) RNase-free voda 2,50 ml 22,50 ml 37% formaldehyd (Penta, ČR) 0,45 ml ethidium bromid (10 % vodný roztok) (Sigma-Aldrich, USA) 0,25 μl Tab. 3 Složení 10xFA gel running vyrovnávacího pufru koncentrace chemikálie a roztoky v mg/l 200mM 3-[N-morfolino]-propansulfonová kyselina (MOPS)(Sigma-Aldrich, USA) mM octan sodný (Penta, ČR) mM EDTA (Sigma-Aldrich, USA) 3722,40 doplnit na celkový objem ml (ph Deionizovaná voda 7)

43 MATERIÁL A METODY 43 Tab. 4 Složení nanášecího pufru 5xRNA loading buffer chemikálie a roztoky množství bromfenolová modř 16,000 μl 37% formaldehyd 720,000 μl 500 mm EDTA (ph 8,0) 80,000 μl 100% glycerol 2,000 ml 10xFA pufr formamid 4,000 ml 3,084 ml doplnit na celkový RNase-free voda objem 10 ml 4.7 Dvoukroková RT-PCR Metodou dvoukrokové RT-PCR pomocí kitu Ehnanced Avian HS RT-PCR Kit (Sigma-Aldrich, USA) byla z rostlinného materiálu izolovaná RNA přepsána na cdna a provedena následná amplifikace PCR produktu Reverzní transkripce U RT-PCR se k amplifikaci používá RNA, která je převedena na DNA (cdna) a další pokračování je analogické s klasickou PCR. Reverzní transkripce využívá enzym RNA-dependentní-DNA-polymerázu získanou z viru ptačí myeloblastózy AMV-RT. K reverzní transkripci se použil oligo (dt)23 primer specificky se vážící na polyadenylovaný konec mrna. Reakční směs se připraví pipetováním komponent do mikrozkumavek dle rozpisu v Tabulce č. 5. Objem templátové RNA byl stanoven z koncentrace RNA v roztoku. Pro RT-PCR byla vždy používána hmotnost 1 μg RNA (platí pro každý vzorek). Výsledná reakční směs byla zvortexována (MS2 Minishaker,

44 MATERIÁL A METODY 44 IKA, USA), následně centrifugována a nakonec inkubována v termocycleru (Techne Progene FPROG02D, Techne, UK) při 70 C po dobu 10 minut. Poté byly vzorky zchlazeny na ledu a přidány další komponenty (Sigma-Aldrich, USA, viz Tabulka č. 6). Poté byly mikrozkumavky s reakční směsí přeneseny do termocycleru na 50 minut (teplota 42 C) a podrobeny reverzní transkripci. Získaná cdna byla uchována v mrazničce při teplotě 20 C. Tab. 5 Složení reakční směsi RT-PCR (I) chemikálie a roztoky objem v µl voda pro PCR (PCR reagent) individuální templátová RNA individuální mix dntp [10 mm/l] 1 oligo(dt)23 primer [0,5 μg/μl] 1 celkový objem 10 Tab. 6 Složení reakční směsi RT-PCR (II) chemikálie a roztoky množství v µl voda pro PCR [PCR reagent] 6 10x pufr pro AMV-RT 2 RNázový inhibitor [20 U/μl] 1 reverzní transkriptáza (AMV-RT)[20 U/μl] 1 celkový objem Vlastní PCR reakce PCR (Polymerázová řetězová reakce) je metoda molekulární biologie, která slouží k rychlému a snadnému zmnožení úseku DNA. PCR je díky své citlivos-

45 MATERIÁL A METODY 45 ti, specifičnosti a rychlosti, zřejmě nejpoužívanější technikou. Základním principem je opakovaná řízená denaturace dvouřetězcové DNA a následná renaturace osamocených řetězců se specifickými oligonukleotidy. Jako templát se používá malé množství DNA (cdna). Amplifikace DNA probíhá v opakujících se cyklech, které mají tři kroky: Denaturace templátové cdna (94 98 C) po dobu 1 až 10 minut. Cílem tohoto kroku je degradace vodíkových můstků mezi vlákny DNA a její rozdělení na jednovláknovou DNA (ssdna). Hybridizace probíhá nejčastěji při teplotách kolem C, kdy molekuly ssdna denaturují. Teplota, při níž hybridizace probíhá, je pro výsledek PCR kritická a musí být vhodně nastavena pro použitý pár primerů. Tento krok se opakuje přibližně 20-35x. Elongace zajišťuje syntézu nového řetězce komplementárního s templářem a následně také ukončuje PCR reakci. Pro účely diplomové práce byla použita cdna, která byla získána reverzní transkriptázou. Pracovalo se s objemem 0,5 μl pro každý vzorek. K tomuto objemu DNA se napipetovala reakční směs podle Tabulky č. 7. Reakční směs pro PCR byla připravena dle Tabulky č. 6 za použití GoTaq komerčního kitu firmy Promega (USA). Směs byla zvortexována a krátce centrifugována na minicentrifuze (MS2 Minishaker; IKA, USA). Mikrozkumavky se přenesly do termocycleru a spustila se PCR reakce. Reakční podmínky byly nastaveny podle Tabulky č. 8. Po ukončení se PCR produkty uchovaly v chladničce při 6-8 C.

46 MATERIÁL A METODY Sekvence specifických primerů pro následující geny Specifické primery pro PCR reakce byly navrženy programem PRIMER 3 u genů PsDRM1 a, programem Oligo 7.0 u genů PsYUC1 a PsYUC2. Sekvence primerů pro konstitutivní geny (PsDEADbox, β-tubulin a Transcription factor II) byly získány z publikace (Die et al., 2010). Ostatní sekvence primerů byly originálně navrženy. Primery ke specifickým reakcím byly syntetizovány firmou East Port a. s. (ČR). Velikost specifických produktů byla PsYUC1 558 bp, PsY- UC2 318 bp a PsDRM1 352 bp. Primery sledovaných genů: 1) PsDRM1 R: 5 - GAT GTA GAC ACG TGG CAG AAG ATG - 3 PsDRM1 F: 5 - AAC TCA CCA CCA CCC TCA AAG ATG - 3 2) PsYUC2 R: 5 - CAC ACC CAA CAA CCA AA 3 PsYUC2 F: 5 - AAA GGC GAT GTT ACG AC 3 3) PsYUC1 R: 5 - AGA ATT ACC GCA ACC AAT G 3 PsYUC1 F: 5 - AAG GTG TTC CGA GTC TTA T 3 4) PsYUC2 R:5 - TTC CTT GAG CCA ATA GGG T 3 PsYUC2 F:5 - CAT TAA GGT AAG GCC AAG CAT 3 5)PsYUC1 R:5 - TCA CTT CCC TTA AGC CAA C 3 PsYUC1 F:5 - ATG GTG CAA AAT TTA TGG AT 3 Primery použitých konstitutivních genů: 6) PsDEADbox F: 5 -TTC TCG TCA TCA ACC TCA CC-3 PsDEADbox R: 5 -TTC CTA CCA AAC CTT CCA CTA-3 7) Transcription factor IIA F: 5 - GCAACCTCCTTCTCCTTGGAT -3 Transcription factor IIA R: 5 - GCAACCTCCTTCTCCTTGGAT -3

47 MATERIÁL A METODY 47 8) ß-Tubulin F: 5 - GCTCCCAGCAGTACAGGACTCT-3 ß-Tubulin R: 5 - GCTCCCAGCAGTACAGGACTCT-3 V průběhu experimentů byly testovány obě dvě dvojice primerů pro geny YUC1 i YUC2. Primery pro gen YUC1 i YUC2 (označeny 2) a 3)) vytvářely dimery a nespecifické produkty, proto byly pro další studium genové exprese využívány jen primery YUC1 (označeny 5)), které spolehlivě poskytovaly specifické produkty. Tab. 7 Složení reakční směsi pro PCR reakci Tab. 8 chemikálie a roztoky Tab. 9 v μl objem Voda pro PCR (PCR reagent) 35,75 5x pufr Green Go Taq 10,00 DMSO (dimethylsulfoxid) 1,00 10 mm dntp mix (Serva, Německo) 0,25 primer F [50 pmol/μl] 1,00 primer R [50 pmol/μl] 1,00 GoTaq DNA-polymeráza [5U/μl] 0,50 templátová cdna 0,50 celkový objem 50,00 Před uskutečněním vlastní PCR reakce byla nutná optimalizace reakčních podmínek, během kterých reakce probíhá. Nutnou součástí přípravy bylo také

48 MATERIÁL A METODY 48 testování navrhnutých primerových kombinací. Jako nejvhodnější počet cyklů bylo zvoleno 28 cyklů pro všechny PCR reakce. Gen PsDRM1 je excelentním markerem dormantního stavu axilárních pupenů. Exprese genu PsDRM1 byla použita jako vnitřní kontrola pro ověření spolehlivosti provedených experimentů. Tab. 10 Reakční podmínky PCR reakce fáze PCR počet cyklů teplota ve C čas (s) počáteční denaturace denaturace annealing elongace závěrečná elongace Elektroforetická separace Po PCR reakci následovala elektroforetická separace amplifikovaných fragmentů. Byla použita souprava OMNI-BIO (ČR). Pro tyto účely byl použit 1 % agarózový gel o rozměrech 85x100 mm, viz Tabulka č. 9. Navážka agarózy byla rozpuštěna v daném objemu 1xTAE pufru, který se připravil naředěním 5xTAE pufru (viz Tabulka č. 10). Tato směs byla za stálého míchání přivedena k varu ve varné kádince a následně ochlazena na ledu na teplotu kolem 65 C. Do takto vychlazené směsi byl přidán etidium bromid (Sigma-Aldrich, USA). Vzorky o objemu 18 μl PCR produktu a 2 μl nanášecího pufru (6x Loading Dye; Promega, USA) byly napipetovány do jamek v gelu a zapojeny ke zdroji stejnosměrného

49 MATERIÁL A METODY 49 napětí. Elektroforéza probíhala v prostředí 1xTAE pufru po dobu asi 40 minut a při napětí 70 V. Tab. 11 Složení 1% agarózového gelu chemikálie a roztoky agaróza 1xTAE pufr množství 0,60 g 50,00 ml etidium bromid (10% vodný roztok) 0,50 μl Velikost separovaných fragmentů byla ověřena použitím velikostního 100 pb markeru, DNA ladder (Promega, USA). Vzniklé fragmenty byly vizualizovány a zdokumentovány pomocí systému GDS 7500 (UVP, USA). Gely amplifikačních produktů byly dále vyhodnocovány programem GELWORKS (UVP, USA). Tab. 12 Složení trisacetátového pufru (zásobní roztok 50xTAE) chemikálie a roztoky množství TRIS báze (Sigma- Aldrich, USA) 242,0 g ledová kyselina octová (Penta, ČR) 57,1 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) (Sigma-Aldrich, USA) deionizovaná voda 100,0 ml doplnit do ml

50 MATERIÁL A METODY 50 Velikost separovaných fragmentů byla ověřena použitím velikostního 100 pb markeru, DNA ladder (Promega, USA). Vzniklé fragmenty byly vizualizovány a zdokumentovány pomocí systému GDS 7500 (UVP, USA). Gely amplifikačních produktů byly dále vyhodnocovány programem GELWORKS (UVP, USA). Takto získaná data pocházela ze dvou biologických a dvou technických opakování. Hladiny konstitutivních genů měly funkci vnitřní kontroly. Příslušná data poté odpovídala úrovním mrna příslušných genů vyjádřené jako relativní hodnota exprese konstitutivních genů. Dále byly hodnoty převedeny do výsledných grafů, kde jsou uvedeny i hodnoty rozptylu znázorňované chybovými úsečkami

51 Výsledky a diskuze 51 5 Výsledky a diskuze 5.1 Hrách setý (Pisum sativum L.) Pro studium přechodu mezi dormantním a aktivním stavem axilárního pupenu je vhodným materiálem hrách setý, který je považován za rostlinu se silnou apikální dominancí. K pokusům se často používají mladé klíční rostliny. Velkou výhodou tohoto modelu je potřeba malého prostoru pro pěstování velkého množství rostlin. Další výhodou je snadná manipulace s těmito rostlinami při provádění experimentů. Na druhé straně malá velikost axilárních pupenů vyžaduje dostatek času pro odběr a další analýzy rostlinného materiálu. Podle Stafstroma et al. (1998) je za nejvhodnější experimentální systém považován druhý axilární pupen. 5.2 Genová exprese biosyntetických genů auxinu a genů dormance v axilárních pupenech Z druhých axilárních pupenů hrachu setého byla izolována RNA pro účely stanovení exprese genů PsYUC1 a PsDRM1. Pomocí dvoukrokové semikvantitativní RT-PCR byla nejprve RNA přepsána metodou reverzní transkripce na cdna a poté následovala samotná PCR reakce. PCR reakce byly opakovány s různými specificky navrženými primerovými kombinacemi výše uvedených genů. Dále byla provedena elektroforetická separace všech PCR produktů, které byly dále vyhodnocovány počítačovým programem GelWorks (UVP, USA). Všechny pokusy byly provedeny vždy ve dvou biologických a dvou technických opakováních. Průměrné hodnoty exprese genů PsYUC1 a PsDRM1 v jednotlivých časových intervalech byly vztaženy na průměrné hodnoty expresi konstitutivních genů DEAD-box, β-tubulin a Transkripční faktor II. Získané hodnoty byly přepočítány na procenta a vyjádřeny jako relativní genová exprese.

52 Výsledky a diskuze 52 Konstitutivní geny v našem případě nevykazovaly vyrovnanou expresi. Na rozdíl od prací Kalousek et al., 2010 a Balla et al., 2011, ve kterých byl použit pouze jeden konstitutivní gen, v této diplomové práci byly použity tři konstitutivní geny (DEAD box, Transkripční faktor II a β-tubulin), aby bylo dosáhnuto přesnějších výsledků.exprese genu PsDRM1 v axilárních pupenech U sedmidenních rostlin hrachu byla provedena dekapitace stonkového vrcholu a dekapitovaný vrchol byl ošetřen lanolinovou pastou. U varianty s aplikací auxinu byla po dekapitaci aplikována lanolinová pasta s obsahem 1 % IAA. Po dekapitaci růstového vrcholu se nejprve exprese genu PsDRM1 udržovala na konstantní hodnotě (0,5 hod.). V čase 1 hodiny poklesla na 60% oproti začátku (0 hod), a pak od 6. hodiny prudce snižovala až k nulovým hodnotám v čase 24 hodin. Opětovný mírný nárůst exprese v době 120 hodin byl zřejmě způsoben skutečností, že vyrůstající pupeny už vytvořily výhon, a sice byla k izolaci RNA odebrána pouze apikální část tohoto výhonu, některé časti odebraného materiálu už ale mohly být ve stavu slabší růstové dormance. Naopak exprese u varianty s aplikací IAA počala od 1 hodiny stoupat a od 3 hodiny se vrátila k původním hodnotám. Obr. 2 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsDRM1 (dekapitace)

53 Výsledky a diskuze 53 Obr. 3 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsDRM1 (dekapitace + IAA) 250 Exprese PsDRM1 ve 2. axilárním pupenu exprese [%] dekapitace dekapitace + IAA , čas [hod] Obr. 4 Exprese genu PsDMR1 ve 2. axilárním pupenu Přechod mezi dormancí a růstem nastává rychle a je snadno detekovatelný v axilárních pupenech hrachu. Růst pupenů hrachu je možné detekovat během 8 hodin od dekapitace u intaktních rostlin (Stafstrom et Sussex, 1992). Turnbull (1998) sledoval růst kamerou, a zaznamenal iniciaci růstu už 2-3 hodiny po dekapitaci, ale nepracoval s rostlinami hrachu. Podobně i Stafstrom uvádí (1993), že po dekapitaci stonkového vrcholu dochází k rychlé stimulaci růstu zainhibovaných axilárních pupenů a hladina PsDRM1 mrna začíná klesat již během 3 hodin a do 6 hodin klesá 20x. Ve druhém axilárním pupenu mrna PsDRM1 klesla na nulovou hodnotu do 12 hodin od dekapitace.

54 Výsledky a diskuze 54 Odstranění dominantního stonkového vrcholu vede k rychlému rozvoji a diferenciaci kambia a vaskulatury v inhibovaném pupenu. Je známé, že tok auxinu hraje klíčovou roli při diferenciaci vaskulatury. Předpokládá se, že nastartování polárního exportu auxinu z pupenu je umožněno rychlou polarizací PIN1 proteinů a jejích expresí v aktivovaném pupenu, což vede k vytvoření transportního napojení na systém polárního transportu auxinu v hlavním stonku a rovněž k vytvoření funkčního vaskulárního napojení pupene na stonek (Balla et al., 2011). Mimo jiné Balla et al. (2011) popisují, že při aplikaci 1 % IAA na dekapitovaný stonek nedochází k polarizaci PIN1 v axilárních pupenech a to i 48 hodin po dekapitaci a aplikaci auxinu. Za těchto podmínek je znemožněno uvolnění axilárních pupenů z růstové inhibice, což bylo ověřeno prostřednictvím exprese dvou markerů dormantního stavu, genů PsAD1 a PsDRM1 v axilárních pupenech, jejichž expresní hladina se výrazně neměnila a pohybovala se v konstantních hodnotách Exprese genu PsYUC1 v axilárních pupenech Obdobně jako u genu PsDRM1 byla i u genu PsYUC1 sledována jeho exprese u rostlin po dekapitaci stonkového vrcholu a také u rostlin, jejichž dekapitovaný vrchol byl ošetřen lanolinovou pastou s obsahem 1% IAA. Při srovnání dekapitovaných rostlin, kde byl pozorován 7-násobný nárůst exprese genu PsYUC1 s maximem ve 12 hodině, naopak aplikace IAA u druhé varianty nezpůsobila významné změny v expresi PsYUC1 genu. V důsledku aplikace IAA na dekapitovaný stonkový pahýl byl inhibován růst axilárního pupene a tím i export auxinu z pupene do hlavního stonku.

55 Výsledky a diskuze 55 Obr. 5 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsYUC1 (dekapitace) Obr. 6 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsYUC1 (dekapitace + IAA) Exprese PsYUC1 ve 2. axilárním pupenu exprese [%] dekapitace dekapitace + IAA 0 0 0, čas [hod] Obr. 7 Exprese PsYUC1 v axilárních pupenech hrachu setého Po dekapitaci rostlin dochází k navýšení množství IAA v pupenech (Gocal et al., 1991; Balla et al., 2011) prostřednictvím biosyntézy auxinu v pupenech, což koreluje se zvýšenou expresí genu PsYUC1, kterou potvrzují naše výsledky. Při zvýšeném množství IAA v pupenech je podpořeno vytvoření

56 Výsledky a diskuze 56 kanálů pro polární tok auxinu, a to díky polarizaci PIN1 proteinů (Balla et al., 2011). Přibývá stále více důkazů pro ústřední roli auxinového transportu při kontrole aktivity pupenu. Existuje úzký vztah mezi růstem pupenů a exportem auxinu z těchto pupenu (Morris, 1977; Balla et al., 2011). Li et Bangerth (1991) uvádí, že při dekapitaci je rychle detekován export auxinu z dříve dormantních pupenů hrachu. Takovému exportu se zabrání aplikací auxinu na dekapitovaný pahýl. Trvalý export auxinu z pupenů vyžaduje vytvoření kanálů pro transport auxinu. Kanalizační hypotéza podle Sachse (1981) vysvětluje celou řadu jevů, zahrnující vytvoření transportních cest auxinu spojujících zdroj auxinu a auxinový sink. Podstatou kanalizace je pozitivní zpětná vazba mezi tokem auxinu, polarizací a upregulací aktivního transportu auxinu. Počáteční tok auxinu mezi zdrojem a sinkem upreguluje transport auxinu prostřednictvím transportní dráhy, která vyvrcholí vytvořením úzkých souborů buněk s vysokou transportní aktivitou pro auxin od zdroje k sinku. Tyto soubory později mohou diferencovat na vodivá pletiva (Sachs, 2000). Romano et al. (1991) zkoumali, zda typický fenotyp pro mutanta yucca je způsoben zvýšenou hladinou auxinu. Pro tento experiment využili bakteriální gen iaal kódující enzym, který konjuguje volnou IAA. Zjistili, že overexprese iaal vede k redukci IAA, čímž se zeslabuje efekt apikální dominance. Doposud není zcela známo, zda zvýšená hladina auxinu u mutantu yucca je způsobena nepřímými vlivy na biosyntézu auxinu nebo defekty v konjugaci auxinu. Zhao et al. (2001) však prokázali, že zvýšená hladina IAA je způsobena expresí genu YUC1 pod kontrolou 35S promotoru. Schopnost mutantního pletiva proliferovat a diferencovat na médiu bez obsahu auxinu naznačuje, že mutanti yucca produkují více auxinu než kontrolní rostliny.

57 Výsledky a diskuze 57 Gen YUCCA byl také overexprimován u rostlin tabáku, aby se zjistilo, zda YUCCA dráha vedoucí k syntéze auxinu je využívána i jinými rostlinami. Transgenní rostliny tabáku měli pozměněný fenotyp podobný fenotypu Arabidopsis, což naznačuje účast YUCCA genu v biosyntéze auxinu i u těchto rostlin. Účast YUCCA v syntéze IAA je také podporována molekulárními analýzami mutantů petúnie, floozy. FZY kóduje flavin-monooxygenázový homolog YUCCA u Arabidopsis a jeho overexprse vede ke zvýšeným hladinám IAA (Tobena-Santamaria et al., 2002). Cheng et al. (2006) zkonstruovali transgenní rostliny Arabidopsis, které overexprimovali cdna YUC genu pod kontrolou 35S promotoru. Overexprese tohoto genu vedla ke stejným fenotypům jako u linií mutantů yuc1d a iaam, což naznačuje, že overexprese genu YUC vedla k nadprodukci auxinu Exprese genu PsDRM1 v axilárních pupenech po aplikaci cytokininu U sedmidenních rostlin hrachu byla aplikována lanolinová pasta s obsahem cytokininu (BAP) na 2. axilární pupen intaktních rostlin. Exprese genů PsDRM1 a PsYUC1 byla měřena ve vzorcích cdna získaných přepisem RNA vyizolované z 2. axilárního pupenu. Po exogenní aplikaci cytokininu na druhý axilární pupen došlo v průběhu 24 hodin k prudkému poklesu exprese genu PsDMR1 až na nulové hodnoty. Z těchto výsledků vyplývá, že aplikace cytokininu vymanila inhibovaný pupen z dormantního stavu a tento pupen začal růst. Obr. 8 Snímek z elektroforetické separace PCR produktů genu PsDRM1