Role fyziologicky aktivních metabolitů 6-benzylaminopurinu v morfogenezi a vývoji rostlin

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Role fyziologicky aktivních metabolitů 6-benzylaminopurinu v morfogenezi a vývoji rostlin Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. RNDr. Marek Klemš, Phd. Brno 2010 Vypracovala: Lucie Dundálková

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Role fyziologicky aktivních metabolitů 6-benzylaminopurinu v morfogenezi a vývoji rostlin vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. Dne. Podpis diplomanta.

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji svému školiteli diplomové práce Ing. RNDr. Marku Klemšovi Phd. za odborné vedení, pomoc a cenné rady poskytnuté během řešení diplomové práce. Dále bych chtěla velmi poděkovat své kolegyni Anničce Bradáčové za pomoc při laboratorní práci a Svenovi Hönigovi za podporu během celého studia.

4 ABSTRACT The aim of final thesis was study of morphological effect of 6-benzyladenine derivatives in induction of shoot organogenesis on petunia leaf explants in relation to dynamics of promoting regenerants. It was determineted the changes in the level of endogenous cytokinins during cultivation too. The explants were cultivated on induction medium (IM) with 3 µm BA, BAR, BAR5 MP, BA7G and 0,5 µm NAA. Shoot regeneration frequncy was observed in intervals of 0, 5, 15, 20, 25, 30 and 35 days. The explants were cultivated for whole time (35 days) on IM or the expants were subcultivated on a new IM after 5 and 7 days from the beginning of experiment. The assessment of endogenous cytokinin was proceeded during inetrvals of 2 hours, 5 and 20 days. Content of endogenous cytokinins was determined by ELISA after purification and HPLC separation. The shoot regeneration on the petunia leaf segments was noticeable on every type of IM exept IM with BA7G from 15 th day of propagation. Highest frequncy levels of shoot regeneration were observed identically on IM with BAR5 MP without subcultivation and with subsequent subcultivation after 5 days on new IM. The explants cultivated on IM with BA7G indicated only root regeneration. Highest number of regenerants on explants were observed on IM with BA with subseqent subcultivation after 5 days. Increased level of endogenous cytokinin was testified after 2 hours of propagation. High level of endogenous cytokinin was authenticated for BA, BAR, ip and ipr on every type of IM with and without subsequnt subcultivation too. The low concentrations of mt (on medium with BA7G) Z and DHZ (on medium with BA) were observed after 2 hours cultivation. The low concentrations of Z, DHZ (on medium with BA) and ZR (on medium with BAR5 MP) were observed after 5 days cultivation. After 20 days cultivation was observed only low conctration of Z on medium with BA7G. Microscopical analasis of organogenesis induction indicated the presence of organised meristem on explants cultivated on IM content BA, BAR and BA5 MP. The results shows that only BA, BAR and BAR5 MP are physiological active in proces of regeneration. Key words: organogenesis, BA, BAR, BAR5 MP, BA7G, petunia

5 ABSTRAKT Hlavním cílem diplomové práce bylo sledovat morfogenní účinky derivátů 6-benzyladeninu (BA) na regeneraci prýtů listových explantátů Petunia hybrida, výtěžnost tvorby prýtů a byly stanoveny hladiny endogenních cytokininů. Explantáty byly kultivovány na indukčním médiu (IM) obohaceném o 3 µm BA, BAR, BAR5 MP, BA7G a o 0,5 µm NAA. Frekvence regenerace prýtů in vitro byla hodnocena v intervalech 0, 5, 15, 20, 25, 30 a 35 dní, kdy explantáty byly na IM ponechány po celou dobu kultivace (35 dní), a nebo byly pasážovány na nové IM v 5 a 7 dnech po založení. Kultivace za účelem odběru vzorků pro stanovení obsahu endogenních cytokininů probíhala v intervalech 2 hodiny, 5 a 20 dnů. Obsah endogenních cytokininů byl stanoven po purifikaci a HPLC separaci pomocí metody ELISA. Viditelná organogeneze byla zaznamenána v 15 dni kultivace a to na všech typech médií, kromě média obohaceného o BA7G. Nejvyšší počet regenerantů byl shodně zaznamenán jak na kultivaci bez výměny IM obsahujícím BAR5 MP, tak i u varianty s pasáží po 5 dnech od založení. U segmentů kultivovaných na IM s BA7G nebyla sledována indukce prýtů, ale byla sledována indukce organogeneze kořenů. Nejvyšší počet regenrantů na explantát byl na IM obsahujícím BA s následnou pasáží po 5 dnech. Zvýšená hladina endogenních cytokininů byla prokázána už po 2 hodinách kultivace. Vysoké hladiny endogenních cytokininů byly detekovány pro BA, BAR, ip a ipr na všech typech IM ve všech variantách (kultivace: 2 hod., 5 a 7 dní). Po 2 hodinách kultivace segmentů byly stanoveny i nízké hladiny mt na médiu obsahujícím BA7G dále Z a DHZ na médiu obsahujícím BA. U segmentů kultivovaných podobu 5 dnů byly stanoveny velmi nízké koncentraci i pro Z a DHZ kultivovaných na médiu s BA a pro ZR, který byl kultivován na médiu s BAR5 MP. Segmenty kultivované po dobu 20 dnů vykazovaly nízkou hladinu pouze pro Z na médiu s BA7G. Mikroskopická analýza indukce organogeneze indikovala přítomnost meristématických center u segmentů kultivovaných na IM s BA, BAR a BAR5 MP. Z výsledků plyne, že fyziologicky aktivní byly BA, BAR a BAR5 MP. Klíčová slova: oranogeneze, BA, BAR, BA7G, BAR5 MP, petúnie

6 SEZNAM ZKRATEK 2,4-D 4-Cl-IAA AAO1 Ade Ado AHP AMP APC APCI ARF ARR Asp AtENT AtIPT ATP AUX/IAA AUX/LAX AUX1 AuxRE BA BA3G BA7G BA7G BA9Ala BA9G BA9RG kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová 4-chlorindolyl-3-octová specifická aldehyd oxidáza adenin adenosin přenašeč fosfátové skupiny v Arabidopsis thaliana adenosinmomofosfát anafázi vyvolávající komplex chemická ionizace za účasti atmosférického tlaku transkripční faktor (Auxin Response Factor) regulátor odpovědi (Arabidopsis Response Regulator) kyselina asparagová protein pro transport nukleosidů u A. thaliana izopentenyltransferáza A. thaliana adenosintrifosfát influxový přenašeč auxinu homolog AUX1 permeáza auxinů regulační sekvence (Auxin-Responsive Element) 6-benzyladenin 6-benzyladenin-3-glukosid 6-benzyladenin-7-glukosid 6-benzyladenin-7-glukosid 6-benzyladenin-9-alanin 6-benzyladenin-9-glukosid 6-benzyladenin-9-(glukopyranosyl-1,3- ribosyl)

7 BAR BARMP CDK cdna CKI CKI1 CKX CKX CRE CYP735A1, CYP735A2 CYP79B2, CYP79B3 cz DHZ DMAPP ELISA ENT ESI FAB GC GC/MS GMP His HMBDP HPLC HPLC/MS CHASE doména IAA IAAld 6-benzyladeninribosid 6-benzyladeninribosid-5 -monofosfát cyklin-dependentní kináza komplementární DNA histidinkináza receptorová histidinkináza cytokinin oxidása/dehydrogenása cytokininoxidáza/dehydrogenáza cytokininový receptor u A. thaliana cytochrom P450 monooxygenázy, katalyzující biosyntézu t-z cytochrom P450 monooxygenázy, katalyzující konverzi Trp na IAOx cis-zeatin dihydrozeatin dimethylallylpyrofosfát enzymová imunosorbentní analýza protein pro transport nukleosidů (Equilibrative Nucleoside Transporter) ionizace elektrosprejem ionizace rychlými atomy plynová chromatografie metoda plynové chromatografie s hmotnostní detekcí guanozinmonofosfát histidin hydroxymethylbutenyl diphosfát vysokoúčinná kapalinová chromatografie kombinace kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie extracelulární doména pro vazbu cytokininových derivátů indolyl-3-octová kyselina indolyl-3-acetaldehyd

8 IAM IAOx IBA ip IPA ipmp IPT KRP LOG MEP mt MVA NAA NPA ot PAA PGP PID PIN PUP RIA S fáze SCF SPE TAM TIBA TIR TLC indolyl-3-acetamid indolyl-3-acetaldoxim kyselina indolyl-3-máselná izopentenyladenin indolyl-3-pyrohroznová kyselina isopentenyladenosin-5-monofosfát isopentenyltransferáza inhibitor CDK (tzv. Kip-Related Proteins) cytokininnukleosid-5 monofosfát fosforibohydroláza ( lonely guy ) methylerythritolfosfátová cesta meta-topolin mevalonová cesta 1-naftyloctová kyselina kyselina 1-naftylftalamová orto-topolin kyselina fenyloctová fosfoglykoprotein protein kináza PINOID auxinový přenašeč, protein z rodiny PINFORMED purinová permeáza radioimunoizotopová analýza syntetická fáze buněčného cyklu (syntéza DNA) Skp1-cullin-F-box komplex extrakce tuhou fází využívající hybridní sorbenty tryptamin kyselina 2,3,5-trijodbenzoová funkční auxinový receptor (Transport Inhibitor Response) tenkovrstvá rozdělovací chromatografie

9 TRH1 protein sloužící k přenosu draslíku (tiny root hair) trna transferová ribonukleová kyselina Trp tryptofan TSI ionizace termosprejem tz trans-zeatin tzr trans-zeatinribosid WOL wooden leg YUCCA enzym katalyzující konverzi TAM na N- hydroxyl-tam ZmCKX 1 gen kódující CKX u kukuřice

10 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Strukturní vzorce cytokininů Obr. 2: Schematické znázornění biosyntézy cytokininů Obr. 3: Schéma metabolismu cytokininů Obr. 4: Reakční mechanismus degradace ip účinkem CKX Obr. 5: Signální dráha CK pomocí His-Asp fosforylace Obr. 6: Strukturní vzorce auxinů Obr. 7: Biosyntetická cesta IAA z tryptofanu Obr. 8: Schéma přímé ELISA pro stanovení cytokininů Obr. 9: Počátek nepřímé organogeneze u segmentu kultivovaném na IM s BA. Tvorba kalusu (A) a apikálního meristému (B) Obr. 10: Počátek nepřímé organogeneze u segmentu kultivovaném na IM s BAR. Tvorba tracheálních elementů (A). Obr. 11: Remeristematizace v diferencovaném pletivu u segmentů kultivovaných na IM s BAR5 MP Obr. 12: Prozenchymatické a vakuolizovné buňky u segmentů kultivovaných na IM s BA7G SEZNAM GRAFŮ Graf 1: Frekvence regenerace prýtů při 5 denní kultivaci na IM a následné kultivaci na novém IM obsahujícím BA, BAR, BA5 MP, BA7G Graf 2: Frekvence regenerace prýtů při 7 denní kultivaci na IM a následné kultivaci na novém IM obsahujícím BA, BAR, BA5 MP, BA7G Graf 3: Frekvence regenerace prýtů bez pasážování na nové IM obsahujícím BA, BAR, BA5 MP, BA7G Graf 4: Indukce tvorby kořenů na IM obsahujícím BA7G Graf 5: Počet regenerantů na explantát listu petúnie při kultivaci na IM s BA, BAR, BA5 MP a BA7G s následnou pasáží v 5 a 7 dni po založení Graf 6: Změny obsahu endogenních CK segmentů kultivovaných na IM po dobu 2 hodin Graf 7: Změny obsahu endogenních CK segmentů kultivovaných na IM po dobu 5

11 dnů Graf 8: Změny obsahu endogenních CK segmentů kultivovaných na IM po dobu 20 dnů Graf 9: Obsah BA v segmentech listů petúnie kultivovaných na IM s BA, BAR, BA7G a BAR5 MP po dobu 2 hodin, 5dní a 20 dní Graf 10: Obsah BAR v segmentech listů petúnie kultivovaných na IM s BA, BAR, BA7G a BAR5 MP po dobu 2 hodin, 5dní a 20 dní Graf 11: Obsah ip v segmentech listů petúnie kultivovaných na IM s BA, BAR, BA7G a BAR5 MP po dobu 2 hodin, 5dní a 20 dní

12 OBSAH Abstrakty Použité zkratky Seznam obrázků Seznam grafů 1. Úvod Literární přehled Růst a vývoj rostlin Význam rostlinných hormonů Interakce mezi fytohormony a prostředím Cytokininy Význam cytokininů v rostlinách Biologická aktivita cytokininů Význam cytokininů v buněčném dělení Biosyntéza cytokininů Regulace biosyntézy cytokininů Metabolismus cytokininů Degradace cytokininů Transport cytokininů Signální dráhy a reakční mechanismus cytokininů Aromatické cytokininy Metody stanovení cytokininů Auxiny Význam auxinů v rostlinách Biosyntéza a metabolismus IAA Transport auxinů Mechanismus účinku auxinů Inaktivace auxinů Materiál a metody

13 3.1 Rostlinný materiál Experimentální kultivační podmínky Hodnocení indukce organogeneze Odběry vzorků pro analýzy Stanovení endogennách cytokininů Zhotovení mikroskopických preparátů parafínovou technikou Fotodokumentace Výsledky Screening morfogenního účinku derivátů BA na regeneraci in-vitro Výtěžnost tvorby prýtů Obsah hladiny endogenních cytokininů Histologie nepřímé organogeneze na segmentech listů petúnie Diskuze Závěr Použitá literatura Přílohy...82

14 1. ÚVOD Po staletí jsou lidé závislí na rostlinách, které jsou cenným zdrojem organické hmoty, kyslíku, proteinů, potravin. V průmyslu jsou rostliny nenahraditelným zdrojem fosilních paliv a sekundárních metabolitů, které mohou být využity jako pesticidy, fytofarmaka, nebo bioplasty. Rostliny se dále využívají v nově vzniklých oblastech biotechnologie a šlechtění. Počátek 20. století přinesl velký pokrok ve studiích o kultivaci buněk. Průkopníkem se stal Holanďan Haberland, který vyvinul koncept in vitro kultivace. Jako první izoloval plně diferencované buňky v médiu obsahujícím glukózu, pepton a knopovu sůl (GAUTHERET 1946). Další rozvoj nastal v roce 1922, kdy vznikla domněnka, že pravé in vitro kultury mohou být prováděny mnohem jednodušeji za použití meristematických buněk, vyskytujících se v kořenech či pupenu. In vitro kultury by nebyly kompletní bez objevení role rostlinných hormonů, kdy jako první byl objeven auxin kyselina indol-3-octová (IAA) a následně byla zjištěna přírodní látka v kokosovém mléce, která zvyšovala proliferaci buněk, ale nebyla auxinového původu. Objev cytokininů na počátku minulého století jako samostatné skupiny rostlinných hormonů byl podnětem pro izolaci kinetinu (6-furfurylaminopurin) z autoklávované DNA sledího spermatu (AMASINO 2005), ten se stal prvním používaným cytokininem. Doposud se ho ale nepodařilo identifikovat jako nativní fytohormon. Na základě výsledků testování biologické aktivity kinetinu byly cytokininy definovány jako látky, které v přítomnosti auxinů stimulují buněčné dělení. Cytokininy hrají také rozhodující roli v regulaci růstu a morfogenezi rostlin (GAN a AMASINO 1995). Indukce regenerace závisí na koncentracích a vzájemném poměru auxinů a cytokininů (MURRASHIGE a SKOOG 1962). Rostlinné hormony vykazují různou fyziologickou aktivitu, záleží na intenzitě jejich biosyntézy a degradaci v místě jejich vzniku. Na rostlinné hormony působí i ostatní metabolity v rostlině a to inhibičně nebo stimulačně. Chemická struktura fytohormonu je dalším ukazatelem jeho aktivity (WENT 1926). Např. u cytokininů jsou jejich nukleotidy považovány za prekurzory transportních forem a vlastních aktivních cytokinů, zatímco jejich glukosidy deaktivují metabolické dráhy. Fyziologická aktivita látek je velmi důležitá pro celkový chod životních procesů v rostlině. Pro hodnocení aktivity a hladiny fytohormonů byly 1

15 vytvořeny biotesty, ve kterých se hodnotí aktivita studovaného chemického individua v konkrétním biologickém procesu. Např. kalusovým biotestem se zjišťuje schopnost cytokininu stimulovat buněčné dělení za přítomnosti stálé koncentrace auxinu; senescenčním biotestem se zjišťuje schopnost cytokininu zpomalit degradaci chlorofylu. Takto získané hodnoty jsou poté porovnávány s hodnotami známých vysoce aktivních derivátů (6-benzyladenin, trans-zeatin). Jednotlivé cytokininy vykazují různou aktivitu v různých biotestech. Tyto charakteristiky vypovídají o tom, že i v rámci jedné skupiny rostlinných hormonů mohou různé deriváty ovlivňovat jednotlivé fyziologické procesy odlišným způsobem. Chemickou analýzou kalusu tabáku z in vitro kultury bylo odvozeno dodnes nejpoužívanější kultivační medium (MURASHIGE a SKOOG 1962). U rostlin, na rozdíl od živočichů, byla prokázána schopnost rostlinných pletiv a orgánů se za vhodných kultivačních podmínek diferencovat z kterékoli části rostliny. Tato schopnost rostlin se nazývá totipotence (REINERT a BACKS 1968). Regulace diferenciačních procesů in vitro přešla během posledních dvaceti let z úrovně empirického poznání na cílené studium úlohy konkrétních fytohormonů: auxinů a cytokininů, jejichž interakce jsou základem regeneračních procesů. Pro docílení regenerace, je nutno vytvořit pro tento proces příznivé podmínky, zvolit optimální délku kultivace explantátů na indukčním médiu (optimální délku indukce organogeneze), vhodné složení média (především poměr fytohormonů) a vybrat vhodný - morfogeneticky kompetentní primární explantát. Morfogeneze rostlin in vitro se v dnešní době stala nedílnou součástí šlechtitelské praxe, zahradnických a zemědělských podniků, kde se znalost explantátových kultur využívá k tvorbě geneticky modifikovaných rostlin. Komerční výzkumná pracoviště využívají in vitro kultury v mnoha podobách od mikropropagace (množení materiálů in vitro) za účelem produkce sadbového materiálu až po záchranu genofondu a ke studiu diferenciačních pochodů. Velkou výhodou kultivace in vitro je produkce homogenních, uniformních a bezvirózních regenerantů rostlin, které nejsou ovlivňovány změnami klimatu a pěstebními podmínkami (nadmořská výška, typ půdy, choroby atd.). 2

16 Cílem mé diplomové práce bylo studovat fyziologickou aktivitu derivátů 6-benzyladeninu (BA), jejich vliv na morfogenezi a vývoj rostlin. Prvním atributem bylo stanovit časovou závislost změn endogenních cytokininů při kultivaci na jednotlivých derivátech BA jak při krátkodobé, tak i při dlouhodobé kultivaci na indukčním médiu. Tyto změny endogenních hladin cytokininů jsou ukazatelem tzv. habituace, která určuje (ne)závislost rostlinných buněk na exogenní cytokininy z média. Má tak významný vztah k fyziologické (in)aktivitě použitého derivátu BA. Dalším cílem bylo stanovit v explantátech petunie podíl volných bazí a ribosidů cytokininů jednotlivých typů (trans-zeatin, dihydrozeatin, izopentyladenin, benzyldeninu a metatopolin). Cílem práce bylo dále sledovat frekvenci regenerace na explantátech kultivovaných na jednotlivých derivátech BA. Byly předpokládány rozdíly nejen v tvorbě kořenů a prýtů, ale také ve výtěžnosti regenerantů. V neposlední řadě byl sledován počátek regenerace (a to ještě v období vizuálně nedetekovatelné organogeneze) pomocí mikroskopických preparátů. 3

17 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Růst a vývoj rostlin Růst je jedním z nejobecnějších projevů života rostlin. Rozumíme jím nevratné přibývání hmoty či velikosti rostliny, spojené s fyziologickými pochody v buňkách. Růst každého rostlinného orgánu je tak důsledkem růstu jeho buněk. Růstový proces začíná tvorbou nových meristematických buněk, pokračuje zvětšováním jejich objemu a hmotnosti a je završen jejich diferenciací v buňky specializované pro různé orgány (například kořen, lodyhu, listy a květy) a funkce (pletiva asimilační, vodivá, krycí a zásobní). Tyto fáze růstového procesu nejsou však v rostlinách přesně odděleny a mohou v různých pletivech probíhat současně nebo se mohou překrývat. Dělící se buňka už může začít růst, rostoucí diferencovat. Obecně lze říct, že diferenciace je rozlišování původních meristematických buněk v buňky specializované. Buňky diferenciované mají rozdílnou strukturu a funkci. U rostlin mluvíme o tzv. plastickém charakteru vývoje (plasticita rostlin), kdy orgány vznikají v průběhu celého vývoje rostliny na základě genetické informace za spolupůsobení podmínek vnějšího prostředí. Signály prostředí určují rychlost vývoje rostlin, což umožňuje rostlinám adaptovat se na aktuální podmínky - na typ stanoviště, teplotní podmínky, dostupnost vody, intenzitu slunečního záření atd. Předpokladem plastického vývoje je existence meristémů, vysoká regenerační schopnost a citlivost na teplotu a světlo. Vysoká regenerační schopnost rostlin je projevem tzv. totipotence rostlinných buněk (REINERT a BACKS 1968), kterou lze charakterizovat jako totožnost genetické výbavy somatické buňky s genetickou výbavou zygoty a tedy schopnost izolované rostlinné buňky tvořit jakýkoli typ diferencované buňky nebo regenerovat v kompletní rostlinu (McPHEETERS a SKIRVIN 1983). Totipotence se v in vivo podmínkách projevuje vytvářením hojivých pletiv po poranění rostliny či širokou škálou způsobů vegetativního množení. V in vitro podmínkách umožňuje pěstování kultur rostlinných explantátů, tedy pěstování částí rostlin oddělených od mateřské rostliny za speciálních kultivačních podmínek. Všechny dospělé rostliny vznikly z jediné zygotické buňky, která se vyznačuje svým bazálním (základním) a apikálním (vrcholovým) pólem. Polarita jednotlivých 4

18 buněk udává funkční a tvarové rozlišení orgánů a polaritu celých rostlin. U vyšších rostlin je polarita buněk koordinována celistvou rostlinou, důležitým faktorem polarity je auxin. Polární transport fytohormonu auxinu reguluje širokou škálu vývojových procesů rostlin. Směr mezibuněčného auxinového toku je podmíněn dynamickou polární lokalizací PIN proteinů (BENKOVÁ a kol. 2003), které fungují jako katalytické komponenty transportu auxinu z buněk. Současné poznatky ukazují, že polární lokalizace PIN proteinů zásadním způsobem ovlivňuje řadu vývojových procesů v rostlinách včetně vývoje embryí, tvorby nových orgánů a tropizmů. Buněčná polarita je u rostlin mimo jiné řízena pomocí signálních bílkovin, mezi které patří i bílkovinný komplex exocyst tvořený z osmi různých bílkovinných podjednotek (HÁLA 2008). Růst a vývoj rostlin je ovlivňován vnějšími i vnitřními faktory prostředí (MACHÁČKOVÁ 1998). Mezi důležité faktory vnějšího prostředí řadíme teplotu, intenzitu a vlnovou délku denního světla a také složení vody, vzduchu a půdy. Mezi vnitřní faktory ovlivňující růst rostlin řadíme především látky s růstově regulačními vlastnostmi. Pro správný vývoj rostlin je zapotřebí, aby všechny faktory prostředí byly v optimu a nenastávaly extrémní podmínky. 2.2 Význam rostlinných hormonů Základem růstu a morfogeneze rostlin jsou striktně časově a prostorově regulované procesy buněčného dělení, růstu, tvarových změn (buněčná morfogeneze) a posléze proces diferenciace. Tyto procesy podléhají složitému systému vzájemně koordinovaných regulací, jejichž základem je příjem a přenos signálů, kde klíčovou roli hrají signály hormonální povahy. Rostlinné hormony byly objeveny na počátku 20. století, jako skupina přirozeně se vyskytujících organických látek, které ovlivňují fyziologické procesy v rostlinách již v malých koncentracích. Rostlinné hormony jsou spojeny i s termínem fytohormony. V roce 1937 tento termín poprvé definovali WENT a THIMANN, kdy označili fytohormony za látky, které jsou transportovány z jednoho místa rostliny (obvykle místa biosyntézy) na jiné, kde plní svou funkci. Syntéza hormonů může být lokalizována v jednom orgánu, nebo může být i široce rozšířená v pletivech či jednotlivých buňkách. Fytohormony jsou transportovány na krátké vzdálenosti buněčným transportem, na dlouhé vzdálenosti pomocí vodivých pletiv. Známe případy 5

19 hormonů, které jsou transportovány z kořenů do listů, kde zabraňují senescenci a udržují metabolickou aktivitu a na straně druhé je znám hormon, který působí v pletivu či buňce, ve které byl syntetizován. Mezi rostlinné hormony řadíme auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselinu abscisovou, ethylen a brassinosteroidy (KAMÍNEK 1992). Zatímco polyaminy, kyselinu jasmonovou, kyselinu salicylovou a oligosachariny řadíme mezi látky s růstově regulační aktivitou, neboť jejich působení je spojeno s vyššími koncentracemi. Mechanizmus působení fytohormonů je velmi blízký mechanizmu působení živočišných hormonů. Účinku hormonu musí vždy předcházet vazba na receptor umístěný na membráně a signál je pak dále přenášen do buňky pomocí mediátorů, nebo fytohormon proniká přímo do jádra, kde může ve velmi krátké době vyvolat či zastavit expresi genů (TREWAVAS a MALHO 1997). Schopnost buňky reagovat na signál je dána jejím stupněm diferenciace a také aktuálními trofickými poměry buňky. Koncentrace fytohormonu je řízena intenzitou jeho biosyntézy a degradace v místě jeho vzniku, rychlostí transportu a intenzitou odbourávání nebo reverzibilní inaktivací v místě působení. U rostlin je popsáno mnoho bílkovin schopných vázat fytohormony, ať už jsou to bílkoviny membránové či cytoplazmatické. Rostlinné hormony se vyznačují rozmanitostí svého efektu (pleiotropické), některé jevy jsou ovlivňovány více skupinami fytohormonů (např. auxiny a cytokininy zároveň), které působí buď synergisticky (buněčné dělení) nebo antagonisticky. Tak např. tvorbu postranních pupenů nadzemní části rostliny podporují cytokininy, zatímco auxiny jejich tvorbu potlačují a vedou k tzv. apikální dominanci. Komplexnost působení hormonů přináší často problémy v experimentální praxi, protože nepracujeme pouze s jedním izolovaným hormonem, ale s celou řadou chemických, genetických a enviromentálních faktorů. Vedle nativních fytohormonů se dnes již vyrábějí i syntetické fytohormony, které mají podobnou strukturu jako fytohormony a po příjmu rostlinnými pletivy se váží na receptory fytohormonů a stimulují jejich signál. Tyto synteticky vyrobené látky způsobují růstové i vývojové efekty a spolu s fytohormony se označují za růstové regulátory či morforegulátory. 6

20 2.3 Interakce mezi fytohormony a prostředím Pro regulaci morfogeneze má zásadní význam vzájemné působení dvou fytohormonů, auxinů a cytokininů. Na poměru jejich koncentrací závisí identita nově vznikajícího orgánu. Vzájemná koncentrace mezi těmito dvěma fytohormony reguluje tvorbu kořenů, prýtů a tvorbu kalusu in vitro, růst axilárních pupenů a tvorbu postranních kořenů. Již SKOOG a MILLER (1957) popsali vzájemné působení cytokininů a auxinů jako důležitý faktor při regulaci a vývoji rostlinných explantátů. NORDSTRÖM a kol. (2004) studovali zda-li auxiny regulují biosyntézu cytokininů v Arabidopsis thaliana. Autoři potvrdili, že auxiny rapidně regulují rychlost biosyntézy cytokininů po ošetření 25 μm kyselinou 1-naftyloctovou (NAA) po dobu 24 hodin. Názorně dokázali, že auxiny působí na biosyntézu cytokininů a objasnili, že se tyto dva hormony vzájemně ovlivňují na metabolické úrovni. Též prokázali, že nadzemní části rostlin mají schopnost syntetizovat svoje vlastní cytokininy nezávisle na dálkovém transportu z kořenů. Dle PETRÁŠKA a kol. (2006) změna hladiny exogenních i endogenních cytokininů a jejich signální dráhy vedou ke specifickým změnám v transkripci PIN genů, které mají odpovědnost za snižování odtoku auxinů z kultivovaných buněk a za distribuci auxinů v apexu. PERNISOVÁ a kol. (2008) v pokusu studovali mechanismy organogeneze de novo na systému hypokotylových explantátů Arabidopsis thaliana in vitro. Dokázali, že auxiny, ne cytokininy, jsou schopné být spouštěcím mechanizmem pro organogenezi v explantátu hypokotylu. Dále prokázali, že auxinem indukovaná organogeneze je doprovázená tvorbou endogenních cytokininů a regulací odtoku auxinů závislém na intracelulární distribuci. Fytohormony zprostředkovávají jak rychlé odezvy rostlin, např. uzavírání průduchů při nedostatku vody, tak dlouhodobé reakce spojené s modulací růstu a vývoje. Pozitivními regulátory buněčného dělení jsou především cytokininy a auxiny. Negativním regulátorem buněčného dělení (YOUNG a kol. 2002), který hraje významnou roli jak při vývoji semen, tak i při odezvě na stresy je kyselina abscisová (ABA). Hladiny fyziologicky aktivních hormonů jsou velmi přesně časově i prostorově regulovány (DOBREV a kol. 2002) jak v příslušném pletivu (např. vyvíjejícím se meristému), tak i v jednotlivých buněčných částech. Rostliny tabáku reagují na nedostatek vody tvorbou gradientu cytokininů ve prospěch horních listů. Zvýšená hladina cytokininů zvyšuje sílu sinku horních listů a podílí se na jejich preferenční ochraně. Během sucha koreluje akumulace 7

21 cytokininů a auxinu v kořenech s jejich dlouživým růstem, důležitým pro dosažení případné spodní hladiny vody (HAVLOVÁ a kol. 2008). Úloha cytokininů při vývoji květů byla sledována v kukuřici se zvýšenou expresí genu pro zeatin O-glukosyltransferázu. Konstitutivní exprese tohoto genu vedla k potlačení vývoje samčích květů a současně ke zpomalení stárnutí listů (RODÓ a kol. 2008). Korelace mezi zvýšenou hladinou cytokininů a zpomalením senescence listů i květů petúnií a chryzantém naznačila potenciální praktické využití regulace hormonálních hladin (KHODAKOVSKAYA a kol. 2005). 2.4 Cytokininy Cytokininy tvoří jednu z pěti hlavních skupin rostlinných hormonů. Byly definovány jako látky, které v přítomnosti auxinů regulující buněčné dělení. V padesátých letech MILLER a jeho kolegové izolovali velmi aktivní látku z autoklávované DNA sledího spermatu, kterou identifikovali jako adeninový derivát N6-furfurylaminopurin (MILLER a kol. 1955), a protože látka vyvolávala v in vitro kulturách buněčné dělení (cytokinezi) nazvali látku kinetin. Přesto, že kinetin je stále biologicky nejaktivnějším objeveným cytokininem doposud se ho nepodařilo identifikovat jako nativní fytohormon. Synteticky připravené cytokininy zahrnují jak deriváty kinetinu, tak i látky strukturně odlišné od přirozeně se vyskytujících cytokininů, jsou to deriváty močoviny (SHAW 1994). Mechanismus jejich účinku spočívá v inhibici degradace cytokininů a neschopnosti vazby k cytokininovým receptorům (SPÍCHAL a kol. 2004). Přirozeně vyskytující se cytokininy byly objeveny na počátku šedesátých let minulého století, kdy nezávisle na sobě MILLER (USA) i LETHAM (Nový Zéland) identifikovali látku s aktivitou podobnou kinetinu z endospermu nedozrálých obilek kukuřice (Zea mais) a z mladých plodů švestek (LETHAM 1963). Tato látka byla charakterizovaná jako 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylamino) purin, triviálně nazývaná trans-zeatin (tz). Trans- zeatin a jeho deriváty byly později identifikovány i v nezralých nažkách slunečnice, kokosovém mléce a kořenu čekanky. Základní struktura cytokininů je adeninová a vychází z purinu substituovaného na aminoskupině v poloze N-6. Podle chemické struktury můžeme cytokininy rozdělit do dvou hlavních skupin: deriváty adeninu, deriváty močoviny a thiomočoviny. 8

22 Cytokininy adeninového typu můžeme dále rozdělit na dvě podskupiny dle charakteru postranního řetězce na izoprenoidní a aromatické viz obr.1. Uvnitř těchto skupin se vyskytuje řada derivátů, volných bazí, ribosidů a nukleotidů. Strukturní odlišnost těchto metabolitů má za následek různou biologickou aktivitu (MOK a MOK 2001). Mezi nejpoužívanější izoprenoidní cytokininy v kulturách in vitro patří tz (SHAW a WILSON 1964). SHAW a kol. (1966) v minulých letech potvrdili chemickou syntézou trans konfiguraci jeho hydroxylové skupiny. Mezi aromatické cytokininy řadíme 6-benzyladenin (BA) a jeho deriváty s hydroxylovaným benzenovým jádrem v orto a meta poloze. Jako nativní sloučeniny byly potvrzeny před 20 lety (HORGAN a kol. 1975). PARKER a LETHAM (1973) popsali jako první derivát purinu benzyladenin-7-glukosid (BA7G). Tato látka byla izolována z děloh ředkviček. Role BA7G v řízení aktivity zůstává doposud nevyjasněná, podle dosavadních výsledků se předpokládá, že BA7G je aktivní nebo zásobní formou cytokininů. Ve formě ribosidu byl popsán benzyladeninribosid (BAR) (ERNST a kol. 1983). Hydroxybenzyladeniny byly detekovány a identifikovány v listech topolu Populus x canadensis Moench. cv. Robusta a byl pro ně navrhnut český název topoliny (STRNAD 1997). Mezi deriváty s hydroxylovaným benzenovým jádrem patří meta-topolin (mt) a orto-topolin (ot) (STRNAD a kol. 1992). BA patří mezi nepoužívanější cytokininy v kulturách in vitro. Aromatické cytokininy se vyskytují ve vyšším množství pouze u některých rostlinných druhů, v menším množství jsou však zastoupeny u většiny rostlin (TARKOWSKÁ a kol. 2003). V současné době je známo přes 40 přirozených cytokininů a spolu se syntetickými představuje celá skupina cytokininů více než 200 sloučenin. 9

23 Izoprenoidní cytokoniny OH CH 3 CH 3 CH 3 N N NH N H N CH 3 N N NH N H izopentenyladenin trans-zeatin cis-zeatin N OH N HN N N N H Aromatické cytokininy OH O N NH N NH N NH N NH N N NH N N N H N benzyladenin meta-topolin kinetin Obr.1: Strukturní vzorce cytokininů Význam cytokininů v rostlinách Vývoj rostliny je závislý na vyváženosti lokálních koncentrací jednotlivých forem cytokininů i dalších rostlinných hormonů v rostlinných pletivech. Během specifických období vývoje obsahují rostlinná pletiva přechodně zvýšené hladiny cytokininů (JONES a SCHREIBER 1997). Rychlé změny hormonálních hladin působí při iniciaci důležitých vývojových procesů, zatímco pro další vývoj započatých procesů je nutná hormonální homeostáze (KAMÍNEK a kol. 1997). Hladina aktivních cytokininů v rostlině je dána rovnováhou mezi de novo syntézou, metabolickými přeměnami a degradací cytokininů. 10

24 Cytokininy ovlivňují celkový habitus rostliny, stimulují vývoj axilárních pupenů a výrazně snižují apikální dominanci (KAMÍNEK 1992). Regulují plochu listu tím, že stimulují objemový růst jeho buněk, naopak inhibují prodlužování buněk internodií a kořenů. Cytokininy významně působí na transportní procesy v rostlině a mobilizaci živin. Ovlivňují diferenciaci vodivých pletiv kořenu, především floému. Urychlují diferenciaci chloroplastů při deetiolaci (MOK 1994). Cytokininy současně prodlužují období fotosyntetické produktivity rostlin a zvyšují tak celkovou produkci biomasy (TRČKOVÁ a kol. 1992). Oddalují senecsenci listu, zpomalují odbourávání chlorofylu, inhibují tvorbu superoxidu a hydroxylových radikálů, čímž snižují oxidaci membránových lipidů a stabilizují thylakoidy. Orgány se zvýšeným obsahem cytokininů jsou přednostně zásobovány metabolity rozváděnými v lýku, což má význam nejen pro zpomalení stárnutí některých orgánů, ale zejména pro preferenční zásobení rostoucích částí rostliny. Také rychlost toku asimilátů do zásobních orgánů může být řízena cytokininy. Z praktických využití cytokininů je nejvýznamnější jejich využití v rostlinných biotechnologiích jako složek kultivačních medií při odvozování a udržování rostlinných explantátových kultur a dále při regeneraci rostlin in vitro. Exogenní aplikace cytokininů bylo využito pro stimulaci větvení okrasných rostlin za účelem zvýšené tvorby květů (např. u chryzantém), semen (řepka olejná) či produkce řízků matečními rostlinami Biologická aktivita cytokininů Biologická aktivita N6-alkyladeninových cytokininů závisí zejména na délce postranního řetězce (optimum C5-C6), přítomnosti dvojné vazby mezi C2-C3, polohově specifické hydroxylaci a metylaci postranního řetězce a prostorové konfiguraci této skupiny (KAMÍNEK a kol. 1987). Biologická aktivita cytokininů s cyklickou funkční skupinou v poloze N6 závisí na charakteru a velikosti cyklu a klesá v pořadí benzyl>furfuryl=thenyl>fenyl. Nasycení cykloalkylového substituentu je doprovázeno poklesem biologické aktivity (SKOOG a kol. 1967). Hydroxylace, halogenace a metylace postranního aromatického cyklu má polohově specifický účinek, přičemž aktivita polohových izomerů většinou klesá v pořadí meta>nesubstituovaná látka>ortho>para (HOLUB a kol. 1998). PALNI 11

25 a kol stanovil aktivitu zeatinu a jeho derivátů v sóji (Glycine max) takto: tzr> tz >O-glukosidy Z, tzr a jejich dihydroderiváty, kdy 7- a 9-glukosid byli téměř neaktivní. Významnou skupinou biologicky aktivních purinových derivátů jsou N- (fosfonomethoxyalkyl)puriny, tzv. acyklické analogy nukleotidů (De CLERCQ 1998), tyto látky se vyznačují protivirovou, cytostatickou a imunomodulační aktivitou. Strukturálně aktivní studie těchto látek ukázala (HOLÝ 1999), že pro zachování biologické aktivity je nutná přítomnost aminoskupiny v poloze C2 nebo C6. Trans konfigurace podmiňuje vysokou fyziologickou aktivitu, zvláště účinnou při stimulaci buněčného dělení (SKOOG 1973). Ještě poměrně vysokou cytokininovou aktivitu má izopentenyladenin (ip), podstatně nižší ji má dihydrozeatin (DHZ) s nasyceným postranním řetězcem. cz byl objeven v kukuřici (VEACH a kol. 2003), rýži (JOHN a AMASINO 1988) a v cizrně (FAISS a kol. 1997), ale jeho biologická aktivita v rostlinách je výrazně nižší nebo nemá vůbec žádnou aktivitu oproti tz. Názory na rozdílnost aktivity těchto dvou látek jsou v biologických stanoveních rozporuplné (LETHAM a kol. 1983). Taktéž ribosidy, ribotidy a glukosidy vykazují slabší nebo žádnou cytokininovou aktivitu. Vedle přirozeně se vyskytujících N9-alkyl cytokininů byla připravena i řada syntetických derivátů (LETHAM a ZHANG 1989). Nejaktivnějšími dosud vyvinutými deriváty jsou 9-(2-tetrahydropyranyl)-BA a 9-(2-tetrahydrofuranyl)-BA (ZHANG a kol. 1989), které v řadě biotestů vykazovaly mnohem vyšší aktivitu než BA. Vysoká biologická aktivita 9-(2-tetrahydropyranyl)-N6-alkyladeninu byla vysvětlena pozvolnou eliminací N9-substituentu, neboť tetrahydropyranylová skupina je obecně málo odolná kyselé hydrolýze (YOUNG 1969). To bylo posléze potvrzeno FOXEM a kol. (1973) při studiu metabolismu méně aktivního 9-methyl-BA v tabákovém a sójovém kalusu, kde byla prokázána rychlá konverze na několik meziproduktů. Metabolické produkty nebyly bohužel přesně určeny Význam cytokininů v buněčném dělení Buněčný cyklus je jedním z nejvíce evolučně konzervovaných procesů všech eukaryotických buněk. Většina objevů vedoucích k pochopení mechanismu kontroly buněčného cyklu byla učiněna docela nedávno. Význam těchto objevů byl pro celou oblast medicíny tak obrovský, že zanedlouho po odhalení klíčových regulátorů 12

26 buněčného cyklu byla LELANDU HARTWELLOVI, TIMU HUNTOVI a PAULU NURSEMU udělena Nobelova cena za medicínu (2001). HARTWELL a kol. (1999) objasnili, že u buněk je koordinace soustrojí buněčného cyklu řízena zvláštním systémem regulace buněčného cyklu. Tento systém zabezpečuje průchod jednotlivými fázemi buněčného cyklu a reguluje klíčové procesy, jakými jsou replikace DNA, mitóza a cytokineze. Systém má dva důležité kontrolní body a to v G1-fázi, kdy se rozhoduje o tom, zda buňka vstoupí do S-fáze, a druhý v G2-fázi, rozhodující o vstupu do mitózy. Kontrolní body i vstup do jednotlivých fází cyklu je řízen dvěma proteiny v komplexu. NURSE a kol. (1990) objevili cyklin-dependentní kinázy (CDK), enzymy, které fosforylují podřízené proteiny cyklu, zatímco HUNT popsal první cyklin jako regulační protein, který je potřebný pro enzymovou aktivaci CDK. Objev CDK před více než deseti lety započal novou éru nahlížení na buněčnou proliferaci a především na její kontrolu. Spouštění jednotlivých fází bylo shledáno závislým na aktivitě CDK, což umožnilo vytvořit první jednoduchý model kontroly buněčného cyklu (MALLER a kol. 1989). Aktivita CDK závisí na vazbě s regulačními proteiny-cykliny. Dalším způsobem ovlivnění aktivity CDK je její fosforylace/defosforylace na specifických místech. Na aktivitu CDK má také vliv vazba CDK inhibitorů (u rostlin tzv. Kip- Related Proteins (KRP) (DEWITTE a MURRAY 2003). Holoenzym CDK se skládá z proteinu s katalytickou funkcí (proteinkináza) a pozitivního regulátoru (cyklin). Asociace cyklinu s CDK podjednotkou dává vzniknout aktivnímu komplexu řídícímu určitou fázi cyklu. Odtud také pochází název cyklinu, jenž odráží jeho oscilující přítomnost v buňce. Komplex CDK cyklin pak katalyzuje přenos fosfátové skupiny z adenosintrifosfátu (ATP) na serinový nebo threoninový zbytek v polypeptidovém řetězci určité sekvence. Aktivita CDK kriticky závisí na vazbě s cyklinem, přičemž některé CDK mohou poutat více typů cyklinů a fosforylovat různé substráty. Těmi bývají transkripční faktory, proteiny cytoskeletu, proteiny biosyntézy purinu, jaderné membrány a další (MUELLER a kol. 1995). Na regulaci CDK se významně podílí skupina proteinů nazývaných inhibitory CDK, které mají schopnost inaktivovat cyklin/cdk komplexy a navodit zastavení buněčného cyklu v G1/S nebo G2/M kontrolním bodě. Tyto inhibitory CDK hrají klíčovou roli nejen v regulaci buněčného cyklu, ale i v mnoha dalších procesech v buňce, jako je diferenciace, stárnutí pletiv nebo apoptóza. Používání specifických inhibitoru CDK započal objev butyrolaktonu (KITAGAWA a kol. 1993) a látka 13

27 6-benzylamino-2-[(2-hydroxyethyl)amino]-9-methylpurin, u které se prokázala specifická inhibice některých CDK v mikromolární koncentraci. Tato sloučenina byla pojmenována olomoucin (VESELÝ a kol. 1994). Autoři prokázali, že olomoucin in vitro inhibuje M-fázový komplex, interfázní DNA syntézu vajíček Xenopus a přechod G2/M u vaječných zárodečných buněk hvězdice. V souladu s inhibičním efektem na interfázní a mitotické kinázy, olomoucin zastavuje buněčný cyklus jak na G1/S tak G2/M rozhraní a spouští apoptózu v nádorových buňkách (ALESSI a kol. 1998). Za zmínku stojí, že olomoucin inhibuje apoptózu v diferencovaných nervových buňkách po odstranění nervového růstového faktoru a naznačuje tak rozdílnou aktivitu na diferencované versus maligní tkáně. Ačkoliv je olomoucin relativně slabý CDK inhibitor, byla prokázána dostatečná účinnost tohoto léčiva na indukci apoptózy (SCHUTTE a kol. 1997) a dále regresi tumoru po jeho in vivo aplikaci v případě spontánního maligního melanomu psa (HAJDÚCH a kol. 1997) Biosyntéza cytokininů V intaktních rostlinách jsou cytokininy nejčastěji syntetizovány v mladých, aktivně se dělících pletivech. Nejvíce prací svědčí o biosyntéze v kořenech, respektive v kořenových špičkách. SHORT a TORREY (1972) uvádějí, že v 1 μm apikálního segmentu kořene hrachu je až čtyřicetkrát více volných cytokininů než ve stejně dlouhých segmentech ze subapikálních a dalších částí kořene. Biosyntéza izoprenoidních cytokininů je demonstrována tzv. mevalonovou cestou (MVA) nebo methylerythritolfosfátovou cestou (MEP). Prvním krokem pro biosyntézu izoprenoidních cytokininů je přeměna adenosin-5 -monofosfátu na dimethylallyldifosfát (DMAPP) nebo na hydroxymethylbutenyldifosfát (HMBDP). HMBDP je metabolickým meziproduktem v MEP a vyskytuje se v bakteriích a plastidech (HECHT a kol. 2001). SAKAKIBARA a kol. (2005) ukázali, že u Arabidopsis thaliana vzniká většina cytokininů trans-zeatinového typu z DMAPP a že HMBDP není prekurzorem tz. DMAPP je syntetizován oběma cestami a obvykle se vyskytuje v cytosolu rostlin. Pokud vezmeme DMAPP jako substrát pro biosyntézu cytokininů, primárním produktem bude izopentenyladenin. Enzymatická aktivita přeměňující adenosinmomofosfát (AMP) a DMAPP na aktivní cytokinin 14

28 izopentenyladenosin-5-monofosfát (ipmp) je považována za přímou cestu biosyntézy cytokininů. Enzym izopentenyltransferáza (IPT), katalyzující tuto přeměnu, byl izolován ze slizu hlenky Dictyostelium discoideum (TAYA a kol. 1978) a následně i z kalusu tabáku (NOMURA a TANAKA 1977). Geny kódující IPT byly identifikovány v bakteriích např. Agrobacterium tumefacience (AKIYOSHI a kol. 1984), ale i ve vyšších rostlinách (KAKIMOTO 2001, SAKAMOTO a kol. 2006, ZUBKO a kol. 2002). TAKEI 2001 u Arabidopsis thaliana identifikoval devět genů kódujících IPT, AtIPT1-AtIPT9. Analýzy prokázaly, že geny AtIPT2 a AtIPT9 kódují jen domněle trna-ipt, zatímco zbylých sedm genů vykazuje tkáňově i orgánově specifickou expresi (MYAWAKI a kol. 2004). ip nukleotidy jsou u Arabidopsis přeměňovány na tz nukleotidy hydroxylací cytochrom P450 monooxygenázami CYP735A1 a CYP731A2 (TAKEI a kol. 2004). Při aktivaci cytokininových nukleotidů za účasti IPT a CYP735A1 vznikají jejich volné báze. Enzym katalyzující přímou přeměnu nukleotidů na aktivní volné báze byl identifikován v rýži a pojmenován lonely gay (LOG) (KURAKAWA a kol. 2007). Název LOG pochází z jeho fenotypových mutantů, které vykazují malformaci v meristematických pletivech a jeho květy mají pouze část nebo vůbec žádný pestík, proto lonely gay. Krystalová struktura IPT enzymů je určujícím prvním krokem v biosyntéze cytokininů a její znalost umožňuje identifikovat kritickou hodnotu aminoacidních residují, které určují substrátovou specifitu enzymu mezi rostlinami a bakteriemi (SUGAWARA a kol. 2008). Rozdílnost mezi aminoacidní strukturou Arabidopsis a Agrobacterium poskytuje genům IPT Agrobacterium použití HMBDP jako prekurzor pro přímou cestu biosyntézy vysoce aktivního tz. Cytokininy se i v malém množství vyskytují v trna, kde probíhá jejich biosyntéza degradací trna, kdy méně aktivní cz může být katalyzován na aktivní formu tz. Enzymem katalyzujícím tuto přeměnu je cis-trans izomeráza (MOK a MOK 2001). U aromatických cytokininů, BA a topolinů, které byly identifikovány v mnoha rostlinných druzích, není doposud známa jejich biosyntetická cesta. 15

29 ATP ATP ADP CYP735A iprtp tzrtp iprdp tzrdp DMAPP + trna trna-ipt prenyl-trna cis-prenyl-trna AMP iprtp tzrtp DHZRMP czrmp LOG LOG LOG LOG ipr tzr DHZR czr aktivní forma ip tz DHZ cz Obr. 2: Schematické znázornění biosyntézy cytokininů (HIROSE a kol. 2007) Regulace biosyntézy cytokininů Stálá hladina cytokininových bází, která je zodpovědná za jejich aktivitu, je regulována expresí klíčových genů pro jejich biosyntézu a metabolizmus. Určujícími enzymy pro biosyntézu jsou: IPT, CYP735A, adenosin nukleáza, adenin fosforibosyltransferáza, cytokinin oxidáza/dehydrogenáza (CKX) a cytokinin glykosiltransferáza. Adenosin nukleáza a adenin fosforibosyltransferáza katalyzují přeměnu nukleosidů na nukleotidy, které mají menší nebo žádnou aktivitu, CKX katalyzují degradaci cytokininů (mimo DHZ) a glykosyltransferáza iniciuje konjugaci cytokininů. Bylo prokázáno, že exprese genů pro IPT, CKX a CYP735A je společně nebo odlišně regulována cytokininy, auxiny a kyselinou abscisovou. V Arabidopsis je hladina AtIPT5 a AtIPT7 v kořenech indukovaná auxinem, zatímco AtIPT1, AtIPT3, AtIPT5 a AtIPT7 je redukována cytokininy (MIYAWAKI a kol. 2004). TAKEI a kol. (2002), stanovili cytokininy jako klíčovou látku v komunikaci mezi kořenem a stonkem při dusíkaté výživě. Studie prokázaly vztah mezi NO 3- a biosyntézou cytokininů. Exprese AtIPT3 AtITP5 je regulována různě podle dostupnosti a doby působení dusíku (MIYAWAKI 2004, TAKEI a kol. 2004a.) NO 3- indukuje akumulaci cytokininů 16

30 v kořenech a stoncích, schopnost indukce se redukuje při ztrátě mutace AtIPT3. Předpokládá se, že AtIPT3 je jedním z hlavních genů regulujících biosyntézu cytokininů v závislosti na změně obsahu dusíku Metabolismus cytokininů Většina cytokininů se vyskytuje v rostlinách ve formě volných bází, či jejich odpovídajících nukleosidů a nukleotidů. Jejich přeměna vychází ze struktury jejich molekul a je realizována buď modifikací adeninové struktury nebo změnami v uspořádání postranního řetězce. U adeninové struktury cytokininů se jedná především o glukosylaci v polohách 3-, 7- nebo 9- a konjugaci alaninu v poloze 9-3-glukosidy, N- glukosidy a alanyl konjugáty vykazují velmi malou nebo žádnou biologickou aktivitu (LETHAM 1983). Předpokládá se, že modifikace 7- a 9- nevratně inaktivují cytokininy, přesto konkrétní funkce těchto N-glukosidů v kulturách in vitro není doposud objasněna (MOK a MOK 2001). Metabolické přeměny cytokininů jsou katalyzovány specifickými enzymy purinového metabolismu. Tyto enzymy mají vyšší afinitu pro adenin, adenosin a AMP než pro cytokininy. Přeměna nukleotidů na nukleosidy může být katalyzována adenosinkinázou, kódující gen pro adenosinkinázu byl izolován z mechu Physcomitrella (VON SCHWARTZENBERG a kol. 1998). Nebo je možná přímá přeměna cytokininových bází na nukleotidy pomocí adeninfosforibosyltransferázy. Enzym byl izolován z Arabidopsis (MOFFATT a SOMERVILLE 1988) a jeho dva kódující geny APT1 a APT2 byly též klonovány. APT1 vykazuje vyšší afinitu pro adenin než pro BA, zatímco APT2 vykazuje třikrát vyšší afinitu pro BA (SCHNORR a kol. 1996). Enzym glukosyltransferáza katalyzuje tvorbu N7- a N9- glukosidů cytokininů a byl izolován z děloh ředkviček (ENTSCH a LETHAM 1979). Enzym rozeznává množství adeninových derivátů, nejvyšší stupeň přeměny vykazuje u cytokininů s nenasyceným izoprenoidním řetězcem. Geny kódující enzymy s N-glukosylační aktivitou byly nalezeny u Arabidopsis (HOU 2004). Izoprenoidní cytokininy s nenasyceným postranním řetězcem podléhají oxidativní degradaci. U tz (i jeho ribosidu) může být nasycen postranní řetězec redukcí dvojné vazby za vzniku DHZ (a jeho ribosidu). Produkt oxidace nenasyceného adeninového postranního řetězce byl identifikován jako 3-methyl-2-butenal 17

31 (BROWNLEE 1975) a byl izolován z kalusu tabáku. Doposud se tento enzym podařilo identifikovat v řadě rostlin (kukuřice, fazole, topol, pšenice, aj.). Většina oxidativních enzymů jsou glykoproteiny s optimálním ph od 6,0 do 9,0 (ARMSTRONG 1994). Glukosylace probíhá na hydroxylové skupině postranního řetězce, a to jak u zeatinu, tak u topolinů. O-glukosyltransferázy byly nalezeny u řady rostlin (MOK a MOK 2001). Geny kódující cytokinin O-glukosyltransferázy byly klonovány z fazole a kukuřice (VEACH a kol. 2003). Z a DHZ podléhají O-glukosylaci a acetylaci postranního řetězce, N-glukosylaci a vzájemné konverzi bází, ribosidů a nukleotidů. Tvorba ribosidů a nukleotidů představuje nejdůležitější metabolické reakce cytokininů. Ribosidy a nukleotidy jsou velmi často majoritní metabolity, neboť se předpokládá, že hrají významnou roli při regulaci koncentrace fyziologicky aktivních cytokininů v buňce (HWANG a SAKAKIBARA 2006). Tvorba O-glukosidů, které jsou fyziologicky aktivními konjugáty, je možná pouze u tz, DHZ a topolinů (McGAW a kol. 1984). I bez hydrolytického štěpení jsou tyto konjugáty vysoce aktivní. Cis izomer zeatinu je často mnohem méně aktivní než jeho trans izomer snadněji podléhá oxidaci (BILYEU a kol. 2001). Cis-trans-zeatinisomeráza katalyzující přeměnu mezi cis- a trans-zeatinem byla částečně přečištěna z fazole (BASSIL 1993). Předpokládá se, že enzym může plnit funkci při přeměně málo aktivního cis-izomeru, vznikajícího rozpadem trna, na aktivní trans-izomer. Z fazole a hrachu byla izolována zeatinreduktáza, která redukuje Z na DHZ. Enzym může hrát významnou roli v homeaostázi cytokininů, neboť produkt reakce DHZ, je aktivním cytokininem a není odbouráván cytokinindehydrogenázou (GAUDINOVÁ a kol. 2005). O-glukosyl deriváty mohou být substrátem pro O-glukosidázu. Ta byla izolována z kořenového meristému Zea mays (BRZOBOHATÝ a kol. 1993). N-glukosylace poskytuje stabilní, fyziologicky inaktivní konjugáty cytokininů. 18

32 4 5 CKR-5 P 3 CKR 2 CK 6 1 Konjugace Degradace N7 a N9 glukosidy Ade a Ado Obr. 3: Schéma metabolismu cytokininů (KLEMŠ M PhD thesis) enzymy: 1 - cytokinindehydrogenáza 2 - adenosinnukleosidáza 3-5 nukleotiodáza 4 - adeninfosforibosyl(pyrofosfát)transferáza 5 - adenosinkináza 6 - glukosyltransferáza Degradace cytokininů Existují dvě různé metabolické cesty, které vedou k úplné ztrátě aktivity cytokininů v buňce: tvorba N-konjugátů nebo rozštěpení postranního řetězce cytokininů. Ireverisiblní deaktivace cytokininů je katalyzována enzymem CKX. Aktivita enzymu byla poprvé sledována v tabákové kultuře (PAČES a kol. 1971) a následně stanovena v mnoha rostlinných druzích, kukuřici (BURCH a HORGAN 1989), pšenici (FRÉBORT a kol. 1999), cukrové řepě (KEVERS a kol. 1997), fazoli (KAMÍNEK a ARMSTRONG 1990), petúnii (AUER a kol. 1999), ječmeni (GALUSZKA a kol. 2001) a v mnoha dalších. CKX katalyzuje odštěpení postranního 19

33 řetězce cytokininových bází a ribosidů za přítomnosti kyslíku za vzniku adeninu či adenosinu (WHITTY a HAL 1974) a aldehydu 3-methyl-2-buthenalu. CKX byla klasifikována jako aminoxidáza obsahující měď (HARE a VAN STADEN 1994), která katalyzuje oxidativní deaminaci aminů na aldehydy, amoniak a peroxid vodíku přes iminový meziprodukt (McINTIRE a HARTMANN 1992). FRÉBORT a kol. (1999), prokázali, že reakční rychlost CKX je mnohonásobně zvyšována v přítomnosti syntetických elektronových akceptorů (2,6-dichlorfenol, metylénová modř) a že reakce s elektronovými akceptory běží za anaerobních podmínek (GALUSZKA a kol. 2001). Gen kódující CKX byl poprvé izolován z kukuřice (ZmCKX1) dvěma různými týmy nezávisle na sobě (MORRIS a kol. 1999, HOUBA-HERIN a kol. 1999). Celý gen byl potom získán cestou in silico genomové knihovny (MORRIS a kol. 1999) nebo klonováním cdna z cdna knihovny. Gen byl naklonován do kvasinky Pichia pastoris (MORRIS a kol. 1999) a do protoplastů mechu Physcomitrella patens (HOUBA- HERIN a kol. 1999) a v obou případech byl v médiu nalezen aktivní protein. Protein byl později získán z kultivačního média Pichia pastoris (BILYEU a kol. 2001) přečištěním a gelovou chromatografií a také z kvasinky Yarrowia lipolytica dvoufázově pomocí gelové a iontové chromatografie (KOPEČNÝ 2005). ZmCKX1 je dosud nejaktivnějším, nejsnáze izolovatelným a nejlépe charakterizovaným CKX proteinem. V Arabidopsis bylo identifikováno sedm genů kódujících CKX, AtCKX-AtCKX7, (SCHMŰLLING a kol. 2003). Další rodiny o různém počtu genů byly doposud popsány u kukuřice (MASSONEAU 2004), rýže (POPELKOVÁ 2004), ječmene a pšenice (GALUSZKA 2004). WERNER a kol. (2001) transformovali rostlinu tabáku (Nicotina tabacum) s expresí čtyř homologních genů ZmCKX s podobností CKX a byla poprvé dokázána redukce endogenních cytokininů. Transgenní linie vykazovala vyšší aktivitu CKX a značně redukovala množství ip a Z metabolitů. Koncentrace CKX je obecně vyšší v kořenech než nadzemních částech rostliny (JONES a SCHREIBER 1997) a exprese genu nastává převážně v zónách aktivního růstu, což potvrzuje předpoklad, že CKX hraje významnou roli ve vývoji rostlin a homeostázi cytokininů. 20

34 H 3 C CH 3 CH 3 N NH H N N CH 3 N NH N N N H N isopentenyladenin A(ox) isopentenyladenin AH 2 (red) CH 3 N NH 2 + C H 3 O H N N CH 3 N N H N CH 3 adenine 3-methyl-2-buthenal aklimine H N N H N Obr. 3: Reakční mechanismus degradace ip účinkem CKX. (GALUSZKA 2000) Transport cytokininů Cytokininy se v rostlinách vyskytují jako integrální složka některých trna, je tudíž pravděpodobné, že mohou být, byť v omezeném množství, syntetizovány v každé buňce. Hlavním místem biosyntézy cytokininů jsou plastidy (KASAHARA a kol. 2004). Je doposud neznámé, zda mezibuněčný transport CK probíhá podobně jako transport pro strukturně podobné látky. Nejvyšší obsah cytokininů i jejich biosyntéza byla zjištěna v kořenových vrcholech, odkud jsou translokovány symplasticky floémem i xylémem (TAKEI a kol. 2001) do lodyh. Transport CK může probíhat za předpokladu, že buňky jsou schopné absorbovat cytokininové nukleobáze (BÜRKLE 2003), nukleotidy (SINGH 1988) a cytokininy izopentenylového a trans-zeatinového typu akumulované ve floému a xylému (CORBËSIER 2003). U Arabidopsis byly identifikovány přenašeče adeninu a nukleotidů, jejichž dva geny patřící do purinových permeás (PUP) se vyznačují nízkou afinitou k cytokininovým bázím. Byly klonovány dva homology PUP1a PUP2 jejich exprese probíhala v kvasinkách. PUP2 je schopný 21

35 zprostředkovat absorpci adeninu a také rozpoznat tz a cz, ip, kinetin a BA jako substráty. Exprese PUP1 v epitémových buňkách hydatod a průduchů naznačuje jeho významnou roli při zamezení ztrát při gutaci (BURKLE 2003). Ve vyšších rostlinách jsou hlavní translokační formou cytokininů jejich nukleotidy, které jsou pomocí ENT (Equilibrative Nucleoside Transporter) translokovány. Genom rýže obsahuje čtyři ENT geny (OsENT1-OsENT4). OsENT2, jejíž exprese probíhá v cévních svazcích listů a floému, zprostředkovává transport adenosinu a dalších nukleosidů, včetně ipr a má vyšší afinitu k ipr než k tzr (HIROSE a kol. 2005). U Arabidopsis bylo identifikováno osm ENT genů. Geny AtENT3, AtENT6 a AtENT7 zprostředkovávají transport nukleotidů, jako je adenosinu a uridinu (WORMIT a kol. 2004). Tyto biochemické údaje naznačují, že AtENT6 by se mohl podílet na transportu ipr, a že vyšší afinita ipr než tzr může hrát roli v rozdělení lokalizace ip a tz typů cytokininů. Protože PUP a ENT mají oba vysokou afinitu k adeninu a adenosinu (WORMIT a kol. 2004), předpokládá se, že by tyto přenašeče mohly zprostředkovávat transport purinů a nukleosidů Signální dráhy a reakční mechanismus cytokininů Signalizace v buňkách je součástí procesů sloužících rostlině k reakci na změny vnějšího i vnitřního prostředí a zajišťuje koordinaci všech procesů vedoucích ke správnému vývoji a funkci. Signální dráhy využívají přenos fosfátové skupiny z histidinu (His) na kyselinu asparágovou (Asp). Tento systém se zkráceně nazývá His- Asp fosforylace (HORÁK 2003) a doposud byl objeven u bakterií, kvasinek a rostlin. Signál je přenášen pomocí vícestupňového dvoukomponentního systému, který má tři základní členy: hybridní histidinkinázu, přenašeče fosfátové skupiny, který nese přenašečovou HPt doménu a regulátor odpovědi. První identifikovanou histidinkinázou byla CKI (KAKIMOTO 1996). Receptorem signálu je hybridní histidinkináza lokalizovaná v membráně, která se aktivuje autofosforylací zbytků histidinu a signál se přenese na zbytek kyseliny asparagové v cytosolu, z níž je fosfátová skupina přenesena na histidinový zbytek AHP (Arabidopsis HPt). AHP proteiny po přijetí signálu přechází do jádra, kde předávají fosfátovou skupinu regulátorům odpovědi-arr (Arabidopsis Response Regulators) proteinů (STOCK a kol. 2000). Za specifických podmínek můžou AHP pronikat do 22

36 jádra, kde předají signál ARR regulátorům (TANAKA a kol. 2004). Model signálních drah byl studován u Arabidopsis, kde jsou cytokininy v buňkách rozpoznány tzv. CHASE doménou (Cyclase/Histidine kinase-associated Sensing Extracellular domain), u které byly identifikovány tři cytokininové receptory z CRE-rodiny histidinových kináz AHK2, AHK3 s CRE1/AHK4 (HEYL a SCHMŰLLING 2003). Zdá se pravděpodobné, že tyto histidinkinázy jsou jedinými cytokininovými receptory u Arabidopsis, neboť trojnásobný mutant v genech CRE1, AHK2 a AHK3 nereaguje žádným způsobem na cytokininy (HIGUCHI a kol. 2004). Doposud nejlépe prozkoumaným cytokininovým receptorem je CRE1, jehož exprese je nejsilnější v kořenech (INOUE a kol. 2001). MÄHÖNEN a kol. (2000), poukázali na alelickou mutaci zvanou wooden leg (wol), která redukuje počet buněk ve vaskulárním cylindru kořene a u wol mutantů se nevyskytují floémové ani parenchymatické buňky. Pro CRE1/WOL/AHK4 byla prokázána vysoce specifická schopnost aktivace přírodními i syntetickými cytokininy (YAMADA a kol. 2001). Kromě cytokininových receptorů byly u Arabidopsis identifikovány další histidinkinázy. Mezi důležité patří pět etylénových receptorů (ETR1, ERS, ETR2, EIN4, ERS2) lokalizovaných v membráně endoplazmatického retikula a pět fytochromálních receptorů (A-E). Dalšími významnými histidinkinázami jsou AtHK1, která může sloužit jako potencionální osmosensor (URAO a kol. 1999) a CKI1, který hraje významnou úlohu při vývoji samičího gametofytu (HEJÁTKO a kol. 2003). U Arabidopsis bylo identifikováno pět genů, pro HPT proteiny AHPT1-AHPT5 (SUZUKI a kol. 2000), které tvoří poměrně homologní skupinu. Regulátory odpovědi se dělí na základě jejich aminokyselinové sekvence a struktury domén na dvě třídy- třída A a třída B. U Arabidopsis bylo popsáno 22 regulátorů odpovědí, kdy 11 jich náleží do třídy A (Arabidopsis Response Regulator-A ARR) a 11 do třídy B (B ARR) (SHEEN 2002). Regulátory odpovědi třídy A obsahují pouze přijímačovou doménu a mohou se vyskytovat v jádře i cytoplazmě (SWEERE a kol. 2001). Všechny testované regulátory odpovědi třídy A jsou v rostlinách regulovány dusíkatou výživou (NO 3-, NH 4+ ), díky nedostatku dusíku se sníží hladina cytokininů a následné dodání NO 3- nebo NH 4+ má za následek zvýšení hladiny cytokininů (TAKEI 2002). AAR třídy A jsou považovány za negativní regulátory signálních drah cytokininů, neboť se předpokládá, že soutěží o fosfátovou skupinu od AHP faktorů s ARR třídy (TO a kol. 2004). Regulátory 23

37 odpovědi třídy B se skládají z přijímačové domény, domény pro vazbu na DNA (tzv. GARP doména) na C-konci a z domény pro lokalizaci v buněčném jádře. Transkripční aktivita byla prokázána u B ARR1 a B ARR2 (SAKAI 2000). Jejich exprese je velmi konstantní, nebylo prokázáno její ovlivnění žádným z doposud testovaných podnětů a to ani exogenními cytokininy (GREFEN a HARTER 2004). Obr. 4: Signální dráha CK pomocí His-Asp fosforylace (HEYL 2003) Aromatické cytokininy Prvním izolovaným aromatickým cytokininem byla látka identifikovaná v listech topolu jako 6-(2-hydroxybenzyl-amino)-9-β-D-ribofuranosylpurine (HORGAN a kol. 1973). O deset let později byl identifikován a izolován BA i s jeho deriváty v různých rostlinných pletivech (ERNEST a kol. 1983). Dodnes je BA nejpoužívanějším cytokininem v procesu mikropropagace, protože na rozdíl od zeatinu či kinetinu mnohem lépe indukuje proliferaci je snadněji dostupný a levnější. BA 24

38 ovlivňuje metabolické a fyziologické děje v rostlině. Vedle oddálení senescence (GILBERT a kol. 1980), ovlivňuje degradaci i tvorbu chlorofylů (RUSHING 1990), zvyšuje fotosyntetickou aktivitu rostlin (LEOPOLD a KAWASE 1964) a snižuje rychlost respirace. Exogenní aplikace BA zvyšuje produkci etylénu, snižuje průduchovou odolnost a stimuluje syntézu proteinů (SZWEYKOWSKA 1981). Nicméně vyšší koncentrace a dlouhá doba inkubace explantátů v přítomnosti BA může vést k inhibici prodlužování stonků a zvětšování listů a ke zvýšení hyperhydricity (DUNSTAN a kol. 1985). STRNAD a kol. (1992), potvrdili hypotézu, že hydroxybenzyladeniny a jim chemicky podobné, rostlinou derivované látky se stejným typem biologické aktivity jsou přirozeně se vyskytující analogy BA. Prvními identifikovanými deriváty BA se staly meta-topolin (mt), který vykazuje vysokou aktivitu a méně aktivní ortho-topolin (ot). Dalšími BA metabolity, které byly jednoznačně identifikovány jsou: BAR, BAR5 MP, BA3G, BA7G a BA9G, BA9RG, BA9Ala a adenin. Ado, AMP, GMP, hypoxanthin a ureidy byly také identifikovány jako metabolity (STRNAD 1997). Metabolismus BA v rostlinách je klasifikován do čtyř skupin, které zahrnují vzájemnou přeměnu, hydroxylaci, glukosylace a oxidaci. Vzájemná přeměna cytokininových bazí, ribosidů a ribotidů je hlavním znakem metabolismu cytokininů (McGAW a BURCH 1995). Zdá se, že volné báze BA jsou biologicky aktivnější než ribosidy a ribotidy cytokininů, přičemž úroveň jejich přeměny na volné báze může ovlivňovat aktivitu cytokininů v rostlině (BURCH a HORGAN 1992). KAMÍNEK a kol. (1987), předpokládali, že hydroxylace reguluje aktivitu aromatických cytokininů, přičemž hydroxylace meta-polohy zvyšuje cytokininovou aktivitu, zatímco v ortopoloze ji snižuje. Při exogenní aplikaci aromatických cytokininů se hojně vyskytuje jak N-glukosylace na purinovém kruhu tak i O-glukosylace na N6-bočním řetězci. (DOLEŽAL a kol. 1995). N-glukosylace byla detailně studována na pletivech ředkvičky, kde enzym 7-glukosytransferáza katalyzuje tvorbu 7- a 9-glukosidů, přičemž upřednostňuje pozici 7- (ENTSCH a LETHAM 1979). Tyto glukosidy jsou extrémně stálé v rostlinných pletivech (HORGAN 1992), jejich biologická aktivita je značně nižší než aktivita jejich volných bází (LETHAM a PALNI 1983) a jsou produktem ireversibilní inaktivace cytokininů, které regulují hladinu a aktivitu volných bází (LETHAM a kol. 1982). O-glukosidy jsou v rostlinách přítomny v hojném množství (STRNAD a kol. 1997) a jsou hlavními metabolity orto- a meta-topolinu v pletivech 25

39 (WERBROUCK a kol. 1996). Tyto látky jsou biologicky aktivní samy o sobě nebo jsou produktem aktivity ß-glukosidázy (LETHAM a PALNI 1983). O-glukosidy nejsou substráty pro CKX (HORGAN 1992) a jsou zásobní formou, za určitých okolností jsou stabilní a v případě potřeby konvertují na volné báze (McGAW a kol. 1984). To bylo prokázáno vyšší akumulací a následnou rychlou hydrolýzou O-glukosidů během některých stádií rostlinného růstu, např. během klíčení kukuřičných semen (SMITH a VAN STADEN 1978), vývoje laterárních pupenů u fazole (PALMER a kol. 1981). Klíčovým enzymem katalyzující degradaci cytokininů v pletivech je CKX. N- glukosylace může zvýšit afinitu CKX k daným cytokininům ale nemusí jednoznačně eliminovat substrátovou aktivitu. Na druhé straně jak O-glukosylace postranního řetězce, tak i fosforibosylace volných bází chrání cytokininy proti in vitro degradaci CKX Metody stanovení cytokininů Analytické metody pro stanovení cytokininů zaznamenaly v průběhu posledních dvou desetiletí významný rozvoj. Dříve byla většina stanovení prováděna především pomocí biotestů, dnes se převážně používají vysoce specifické a citlivé metody fyzikálně-chemické, jako jsou vysoko účinná kapalinová chromatografie v kombinaci s hmotovou spektrometrií a imunochemické metody. Rostlinné hormony jsou organické látky snadno rozpustné v polárních rozpouštědlech. Vyskytují se však v pletivech ve velmi nízkých koncentracích a před vlastním stanovením se musí extrakt zkoncentrovat a zbavit interferujících látek (barviv, fenolických látek, apod.). Je tedy nutné zvolit vhodné analytické metody, která vyžaduje efektivní čistící postup a citlivou a dostatečně selektivní analytickou koncovku. Hlavní úlohou extrakce je převedení požadovaných látek do extrakčního činidla tak, aby v jejím průběhu nedošlo k degradaci látek a aby byl extrakční výtěžek přijatelně vysoký pro sledované spektrum metabolitů (CK nukleotidy, volné báze, ribosidy, N-glukosidy a O-glukosidy). Z těchto důvodů jsou obvykle volena pro extrakci rozpouštědla jako je methanol, ethanol či vícesložková extrakční směs, podle Bielského je to směs methanolu, chloroformu, kyseliny mravenčí a vody v poměru 12:3:1:4 (BIELSKI 1964). Preventivním opatřením proti degradaci CK je extrakce za 26

40 snížené teploty, obvykle v rozmezí -4 C až -20 C. Běžná doba účinné extrakce se podle druhu extrakce a rostlinného pletiva pohybuje mezi 4 a 24 hodinami. Po extrakci a odstranění tuhých podílů centrifugací či filtrací následuje samotný čistící proces. Ten se dle různých typů analytické koncovky může měnit, avšak tento proces spojuje několik základních požadavků. Nejprve musí být vzorek zkoncentrován na rotační vakuové odpařovače nebo lyofilizován a převeden do roztoku jiného složení. Nejnovějším přístupem je extrakce tuhou fází (SPE), využívající hybridní sorbenty, které mají vlastnosti reverzní fáze a iontoměniče současně. Takto lze výrazně zjednodušit celý čistící postup, neboť jedinou náplňovou kolonkou lze odstranit interferující látky z rostlinného extraktu a současně frakcionovat jednotlivé skupiny CK metabolitů, ale i jiných fytohormonů. Levnou, rychlou a účinnou alternativou je užití extrakce kapalina-kapalina (PACÁKOVÁ a kol. 1997). Metoda je založena na rozdílné rozpustnosti CK ve vodě a v butanolu při různém ph. Umožňuje oddělení balastních látek a současně frakcionaci bází a nukleotidů, přičemž návratnost je relativně vysoká a stupeň pročištění uspokojivý. Málokteré metody koncové analýzy (RIA, ELISA, GC/MS, HPLC/MS) jsou schopny pracovat s intaktními nukleotidy a O-glukosidy. Proto je často nezbytné přeměnit nukleotidy na ribosidy alkalickou fosfatázou a O- glukosidy pak na odpovídající ribosidy či volné báze β-glukosidázou. Tak získáme nukleotidovou a O-glukosidovou frakci, která obsahuje příslušné volné báze a ribosidy. Imunoafinitní chromatografie bývá často posledním čistícím stupněm. Pro oddělení jednotlivých frakcí cytokininů se používají různé separační techniky. Prvními používanými metodami ke stanovení CK v rostlinách byly biotesty. Vzhledem k tomu, že poskytují jen orientační hodnoty přirozených hladin hormonů, jejich hlavní význam spočívá v ověřování biologické aktivity studovaných derivátů cytokininů. Např. kalusovým biotestem se zjišťuje schopnost cytokininu stimulovat buněčné dělení za přítomnosti stálé koncentrace auxinu; senescenčním biotestem se zjišťuje schopnost cytokininu zpomalit degradaci chlorofylu (HOLUB a kol. 1998). Takto získané hodnoty jsou poté porovnávány s hodnotami známých vysoce aktivních derivátů (např. benzyladenin, zeatin). Testování biologické aktivity se uplatňuje jak při vývoji nových látek, tak i při hledání dosud nepopsaných přirozeně se vyskytujících hormonů. Biotesty (ve spojení s HPLC) jsou bezpochyby nejlevnějším přístupem k analýze cytokininů. 27

41 Dnes nejpoužívanější technikou v oblasti kvantitativní a kvalitativní analýzy cytokininů je HPLC. Její výhodou je rychlost, vysoká separační účinnost a možnost spojení s celou řadou technik finální analýzy (RIA, ELISA, hmotnostní spektrometrie, aj.). Princip metody spočívá v rozdílné distribuci analytů mezi mobilní a stacionární fázi, dle jejich polarity. Jednotlivé analyty protékají kolonu v různých retenčních časech a dochází tak k jejich dělení. Bez ohledu na analytickou koncovku jsou na účinnost separace kladeny vysoké nároky. Nedokonalá separace může způsobit nadhodnocení koncentrací při stanovení, nadhodnocení biologické aktivity v biotestu či znemožnit přesnou identifikaci. Další metodou, která hraje nezastupitelnou roli v kvantitativní analýze CK je kombinace plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC/MS). CK nepatří mezi těkavé látky a pro analýzu plynovou chromatografií musí být derivatizovány. To je časově náročné a většinou ještě komplikované potřebou znovu vzorky po derivatizaci přečistit. Celkově tato metoda vykazuje nižší citlivost. Nutnost derivatizace a složitější čištění vedou k potřebě většího množství výchozího biologického materiálu. Podle typu studovaného pletiva, počtu a typu sledovaných CK (báze, ribosidy, glukosidy) se výchozí množství materiálu pohybuje v jednotkách až desítkách gramů čerstvé hmoty. Přes všechny tyto nevýhody se však GC/MS dlouhodobě používá k identifikaci a stanovení CK. Od počátku devadesátých let bylo spektrum metod používaných k analýze CK rozšířeno o kombinaci kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (HPLC/MS). HPLC/MS umožňuje kvantifikovat CK ve velmi malém množství výchozího materiálu (stovky miligramů čerstvé hmoty). Metoda doposud využívá různých typů ionizace, počínaje ionizací rychlými atomy (FAB), termosprejem (TSI), či chemickou ionizaci za atmosférického tlaku (APCI) až po ionizaci elektrosprejem (ESI). Široké uplatnění v oblasti analýzy CK si nalezly imunochemické metody, které jsou vysoce citlivé i při nižších nárocích na přístrojové vybavení a nižších provozních nákladech v porovnání s HPLC/MS a GC/MS. Základním principem těchto metod je vytvoření imunokomplexního páru antigen-protilátka, který pak může být různým způsobem detekován a stanoven. Pro detekci vzniklého imunokomplexu je důležité označení jednoho z reaktantů radioaktivním prvkem, enzymem, fluorescenční nebo chemiluminiscenční látkou. Testy jsou založeny na kompetitivním uspořádání, tj. 28

42 definované množství značeného indikátoru soutěží s různými koncentracemi neznačeného standardu o omezený počet volných vazebných míst protilátek. CK jsou nízkomolekulární organické sloučeniny a jako takové nevyvolávají v organismu imunitní odpověď. Nejsou pravými antigeny, jsou tzv. hapteny. Vlastnosti antigenů nabývají až po navázání na vhodný makromolekulární nosič. Syntetické postupy používané při přípravě cytokininových konjugátů jsou založeny na reakci ribosidů oxidovaných jodistanem s aminoskupinami nosičové bílkoviny a následné redukci borohydridem (PRICE a NEWMANN 1997). Používané protilátky jsou dvojího typu: plyklonální a monoklonální. Důležitou vlastností připravených protilátek je jejich křížová reaktivita. Protilátky se obvykle neváží jen antigen, proti němuž byly připraveny, ale i látky strukturně podobné. Je tedy nutné použít některé chromatografické metody pro frakcionaci vzorku, např. TLC nebo HPLC (McDONALD a kol. 1981). Frakcionací dojde k oddělení jednotlivých křížově reagujících látek, které mohou být následně stanoveny samostatně. V některých případech je křížová reaktivita žádoucí, a to tehdy, chceme-li docílit použití jedné protilátky proti více metabolitům. Je to možné např. u protilátek proti cytokininovému ribosidu, ty vykazují křížovou aktivitu i vůči příslušným volným bázím či N9- glukosidům. Další technikou, která naopak vhodně využila vyšších křížových reaktivit připravených protilátek, byla imunoafinitní chromatografie (IAC). Imunoafinitní chromatografie je afinitní chromatografická metoda, ve které stacionární fázi tvoří protilátka nebo protilátce příbuzné činidlo. Jejím principem je tedy interakce mezi protilátkou a antigenem/haptenem. Tato technika se používá jako vysoce specifická čistící metoda ve spojení s dalšími analytickými technikami (HAGE 1999). Kvantitativní hodnocení se pak provádí na základě měření absorbance produktu enzymatické reakce po dodání substrátu ke komplexům protilátky s ligandem (ELISA test) či na základě měření radioaktivity komplexů protilátky s ligandem (RIA analýza). 2.5 Auxiny Auxiny jsou jedny z hlavních fytohormonů, podílejí se na mnoha vývojových a morfogenetických procesech založených na diferenciaci a prodlužování buněk, jako jsou vývoj embrya, diferenciace cévního pletiva či růstové odpovědi na vnější podněty 29

43 (FLEMING 2006). Tento pleiotropní účinek auxinu je umožněn mimo jiné jeho polárním transportem, který má za následek lokální akumulace auxinu v určitých pletivech a buňkách. Patří také k nejdéle známým fytohormonům, jeho existence byla prokázána ve dvacátých letech minulého století, kdy byla objasněna podstata účinku auxinu v práci s koleoptilemi ovsa, u nichž bylo prokázáno, že jejich špičky produkují látku, která difunduje do agaru a stimuluje růst (WENT 1926). Jeden z nejdůležitějších auxinů byl později identifikován jako kyselina indolyl-3-octová (IAA). Existují auxiny přirozené i synteticky vyráběné. Nejvíce zastoupeným přirozeným auxinem v rostlinách je IAA, jež má také asi nejvýznamnější účinek. Dalšími přirozenými auxiny jsou kyselina 4-chlorindolyl-3-octová (4-Cl-IAA), kyselina fenyloctová (PAA) a kyselina indolyl-3-máselná (IBA). Mezi syntetické auxiny patří např. kyselina 1-naftyloctová (NAA) či kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D) (WOODWARD a BARTEL 2005). Tyto auxiny se v nižších koncentracích používají do různých přípravků na podporu zakořeňování a růstu rostlin, popřípadě ve vyšších koncentracích jako součást herbicidních přípravků. HO NH O O O O OH OH Cl IAA NAA 2,4 D Obr. 5: Strukturní vzorce auxinů Cl Význam auxinů v rostlinách První zmínka o aktivitě auxinů byla zaznamenána v knize Charlese Darwina The power of movement in plants (DARWIN 1880), kdy v důsledku jednostranného osvětlení koleoptile docházelo k nerovnoměrné distribuci auxinů a v důsledku toho k nerovnoměrnému růstu a ohybu (tzv. fototropismus). Auxiny mají v rostlinách nezastupitelný význam, neboť se účastní hlavních procesů při růstu a vývoji rostlin, jako je buněčné dělení, prodlužování buněk, organogeneze, vývoj kořene, distribuce 30

44 látek, polarita, apikální dominance dále stimulují produkci etylénu a účastní se dějů regulovaných prostředím (tropismy) (BERLETH a SACHS 2001). Současné poznatky o aktivitě auxinů vychází z modelové rostliny Arabidopsis thaliana kultivované na médiu obohaceném o auxiny. Auxiny zásadně ovlivňují morfologii kořene, inhibují jeho dlouživý růst, indukují růst laterálních a adventních kořenů (ZIMMERMAN a HITCHCOCK 1942). ZHAO a kol. (2001) podpořili tyto studie pozorováním rostlin, které produkují nadměrné množství auxinů a hojně tvořily laterální a adventivní kořeny. Tyto rostliny měly také dlouhé hypokotyly, řapíky, dělohy a epinastické listy. Zatímco rostliny kultivované na médiu bez obsahu auxinů jsou charakteristické dlouhým primárním kořenem, tvoří málo laterálních kořenů a krátký hypokotyl (MONREO-AUGUSTUS a kol. 2003). Auxiny způsobují prodlužovací růst. Účinné koncentrace pro buňky stonkových internodií jsou 10 5 až 10 6 M. Prodlužování buněk kořene auxin v těchto koncentracích inhibuje, dlouživý růst buněk kořene vyvolá auxin v koncentracích o několik řádů nižších. Na auxin však reagují jen buňky schopné elongace, které ještě nenabyly konečné velikosti. Předpokládá se, že auxin v těchto buňkách stimuluje aktivitu protonové pumpy, které působí snížení ph v buněčné stěně a následnou aktivaci mechanizmů, které působí rozvolnění buněčné stěny tzv. kyselý růst (CLELAND a RAYLE.1978). Vliv auxinu na prodlužování buněk hraje významnou úlohu v pohybových reakcích, které odrážejí pozici zdroje vnějšího podnětu. Světelný signál pro fototropickou reakci je přijímán v pletivech prodlužovací zóny koleoptile, hypokotylu nebo internodia. Vyšší koncentrace auxinu na neosvětlené straně způsobí v této oblasti rychlejší prodlužování buněk a ohyb orgánu ke zdroji světla. Tato teorie se poprvé potvrdila na studiu kukuřičné koleoptile (IINO a BRIGGS 1984). Auxin inhibuje vývoj axilárních meristémů v pupeny a postranní stonky. Tento vztah mezi apikálním pupenem a pupeny axilárními se označuje jako apikální dominance. Dekapitace, tj. mechanické odstranění apikálního pupenu, vede k uvolnění axilárních meristémů a pupenů z inhibice a k jejich aktivaci. Nahrazení apikálního pupenu auxinem, aplikovaným např. v agarovém bločku (SACHS a THIMANN 1964), však obvykle inhibici revertuje jen částečně. Inhibice axilárních pupenů je velmi komplexní proces, zahrnující působení dalších signálů přicházejících z jiných částí rostliny, např. z listu i kořenů. V ontogenezi se apikální dominance mění, se zvětšující 31

45 se vzdáleností mezi apikálním a axilárním pupenem inhibiční vliv apikálního pupenu klesá, apikální dominance se snižuje obvykle také při nástupu kvetení. Auxinový signál, vycházející z apikálního pupenu, inhibuje biosyntézu cytokininů v axilárních pupenech. Apikální dominanci ovlivňují také faktory trofické. Auxin ovlivňuje růst plodů (GILLASPY a kol. 1983). Zdrojem auxinu je nejprve vyvíjející se oplodí, potom endosperm a posléze embryo. Auxin je v embryích tvořen již ve velmi časných vývojových stádiích a je nezbytný pro polaritu embryí. Při růstu plodů je úloha auxinů velmi komplexní. Spočívá ve stimulaci dělení buněk vznikajícího oplodí, v jejich prodlužování i v diferenciaci vodivých pletiv, která zajišťují transport asimilátů a dalších látek k pletivům vznikajících semen a oplodí. Auxiny se podílejí i na řízení buněčného cyklu. Působí na expresi řady klíčových proteinů, a tak stimulují průchodnost buňky přes kritické body buněčného cyklu. Jsou potřebné v regulaci přechodu G1/S i pro vstup do M fáze (Del POZO a kol. 2005). V expresi genů buněčného cyklu, které jsou regulovány auxinem, hrají důležitou roli specifické komplexy, a to SCF (Skp1-cullin-F-box komplex) a APC (anafázi vyvolávající komplex). Oba tyto komplexy pravděpodobně degradují proteiny blokující expresi těchto genů (BLILOU a kol. 2002). Stejně jako cytokininy, tak i auxiny regulují hladiny CDK, cyklinů a KRP. Aktivita účinku auxinů je kontrolována sníženou, nebo zvýšenou hladinou cytokininů a naopak Biosyntéza a metabolismus IAA V semenech Arabidopsis je IAA syntetizována v listech, kotyledonu i v kořenech, přičemž největší biosyntéza probíhá v nejmladších listech vyšších rostlin (LJUNG a kol. 2001). Rostliny využívají k syntéze IAA dvě metabolické cesty, první z nich je závislá na tryptofanu, zatímco druhá probíhá nezávisle na něm. Biosyntéza závislá na tryptofanu byla rozdělena podle svých meziproduktů na idolylpuruvátovou (IPA), indolylacetamidovou (IAM), tryptaminovou (TAM) a indolylyacetaldoximovou (IAOx) cestu. IPA je důležitá pro některé mikroorganismy, které syntetizují IAA. IPA byla taktéž nalezena u Arabidopsis (TAM a NORMANLY 1998), ale geny kódující Trp aminotransferázu, která oxiduje Trp na IPA nebo IPA dekarboxylázu, která přeměňuje IPA na indolyl-3-acetaldehyd (IAAld) zatím identifikovány nebyly. Konečným 32

46 enzymem katalyzujícím tuto cestu je IAAld specifická aldehyd oxidáza (AAO1), její zvýšená aktivita byla pozorována u mutantů se zvýšenou produkcí IAA (superroot1 sur1) (SEO a kol. 1998). IAM se také vyskytuje u mikroorganismů. Bakterie Agrobacterium tumefaciens vnáší geny, kódující enzymy pro tuto cestu do hostitelské rostliny. Tento jev se využívá k transformaci, při které exprimovaný gen a jeho produkty se účastní regulace růstu a vývoje v transgenní rostlině. TAM může být konvertován pomocí YUCCA genu na N-hydroxyl-TAM in vitro. YUCCA gen, který kóduje enzym flavin-monooxygenázu byl identifikován z dominantního mutanta se zvýšenou hladinou IAA (ZHAO a kol. 2001). ZHAO a kol. (2001), odvodili, že YUCCA katalyzuje N-oxygenaci TAM, která je limitujícím krokem v biosyntéze auxinu mnoha rostlin. O rok později ZHAO a kol. (2002), prokázali, že cytochrom P450 enzymy CYP79B2 a CYP79B3, které byly identifikovány jako enzymy, které katalyzují konverzi Trp na indolyl-3-acetaldoxim (IAOx) in vitro, jsou kritickými enzymy biosyntézy také in vivo. N-hydroxyl TAM produkovaný YUCCA enzymem může být dehydrogenován na IAOx nebo dehydrogenována hydrolyzován na IAAld. Enzymy katalyzující tyto přeměny nebyly dosud identifikovány (WOODWARD a BARTEL 2005). IAOx byla nalezena i u rostlin z čeledi Brassicaceae. Meziproduktem je indolyl- 3-acetaldoxim a má v rostlinách specifický význam. U Arabidopsis dochází pomocí této cesty k tvorbě indolyl-glukosinolátů, sekundárních metabolitů (FAHEY a kol. 2001), protože IAOx je prekurzorem pro vznik indolyl-3-methylglukosinolátu a biosyntézu IAA. Pomocí cytochrom P450 monooxygenáz CYP79B2 a CYP79B3 dochází k oxidaci Trp na IAOx in vitro. Biosyntetická cesta, která je nezávislá na tryptofanu byla prokázána u mutantních rostlin, kde výchozími látkami pro IAA je indol-3-glycerolfosfát nebo indol. Jelikož mohou explantátové techniky poškodit pletiva, určité poznatky předpokládají, že biosyntéza vycházející z Trp může být indukována poškozením, a to jak u Arabidopsis, tak i u fazole (SZTEIN a kol. 2002). Rostliny mohou přepnout ze základní, na Trp nezávislé cesty na Trp závislou cestu, během stresu, když je potřeba větší přísun IAA (RIBNICKY a kol. 2002). 33

47 N H HO PH 2 H N OH indol-3glycerolfosfát O indol NH 2 O HO indol N H CYP79B2 CYP79B3 N H tryptofan NH 2 N H IAOx O HO N N YUCCA tryptamin N H N H N-hydroxytryptamin NH OH N H indol-3-acetaldehyd IAN N H NIT 1 O OH IAA N H Obr. 6: Biosyntetická cesta IAA z tryptofanu (COHEN 2003) Transport auxinu Transport auxinu probíhá v rostlině jak na krátké vzdálenosti, tzn. z buňky do buňky tak i na dlouhé vzdálenosti. Transport na dlouhé vzdálenosti probíhá prostřednictvím floému je rychlejší a striktně polární. Mechanismus tohoto tzv. 34

48 polárního transportu auxinu vychází z fyzikálně-chemických vlastností auxinových molekul a jejich molekulárních forem uvnitř a vně buněk. Jde o velmi komplexní a dynamický proces, regulovaný na více úrovních. Hlavní proud směrovaného polárního transportu auxinu směřuje z vrcholu směrem ke kořeni a kořenové špičce, kde se jeho proud otáčí a vrací se buňkami epidermis do elongační zóny kořene (FRIML a PALME 2002). V polovině sedmdesátých let byl pro polární transport auxinů navržen chemiosmotický model (RUBERY a SHELDRAKE 1974). V cytosolu je většina auxinů disociována, a proto nemůžou pasivně procházet plazmatickou membránou. Přenos auxinů se tedy odehrává pomocí aktivních přenašečů, ty mohou být rozmístěny na plazmatické membráně asymetricky a ve shlucích, čímž je způsoben polarizovaný transport auxinů mezi buňkami (BENJAMINS a kol. 2005). Z toho vyplývá, že při transportu auxinu z buňky do buňky záleží především na množství a lokalizaci vynašečů auxinu. Při zakládání nových listů, květů či postranních vrcholů vznikají nové osy polarity, musí se tedy polarizovat jak rostlinná pletiva, tak jednotlivé buňky, k čemuž je zapotřebí mezibuněčný polarizační signál auxin (REINHARDT a kol. 2000). Auxiny jako slabé kyseliny v nízkém ph apoplastu částečně disociují. Disociované polární molekuly auxinu nemohou procházet přes membránu do buňky prostou difúzí, musí být tedy transportovány specifickým přenašečem. Jako specifický přenašeč auxinů slouží protein AUX1 a jeho homology z rodiny AUX/LAX (Auxin-Resistant/Like Aux) (SWARUP a kol. 2004). AUX1 se vyskytuje na plazmatické membráně, v membráně Golgiho aparátu a v endozomech. Jeho množství na membráně je regulované dynamickým cyklováním mezi plazmatickou membránou a endozomálními kompartmenty (KLEINE-VEHN a kol. 2006). Polární lokalizace AUX1 je zprostředkována pomocí proteinu AXR4, který je asociován s endoplazmatickým retikulem a pravděpodobně se účastní post-translačních modifikací proteinu AUX1 (DHARMASIRI a kol. 2006). Auxiny mohou být dále přenášeny pomocí fosfoglykoprotienů tzv. PGP přenašečů, nebo PIN proteinů patřících do skupiny sekundárních přenašečů, které přenášejí chemické látky přes membránu na úkor energie elektrochemického gradientu na membráně (GÄLWEILER a kol. 1998). PIN1 patří do proteinové rodiny o osmi členech, jejichž exprese je tkáňově specifická. I když mají všechny proteiny PIN funkci v transportu auxinu, ukazuje se, že různé proteiny PIN se 35

49 také účastní různých vývojových procesů. Proteiny PGP mohou fungovat jak v roli přenašeče auxinu z buňky, tak i do buňky. Buď působí na plazmatické membráně samostatně a tím přispívají spolu s proteiny PIN k transportu auxinu, nebo s proteiny PIN interagují a tím je na plazmatické membráně stabilizují. Účastní se tedy i polarizovaného transportu. Vedle přenašečů PGP a PIN hraje v přenosu auxinu z buňky roli ještě jeden protein, Tiny Root Hair1 (TRH1), sloužící k přenosu draslíku v kořenech (VINCENTE-AGULLO a kol. 2004). Protein TRH1 je exprimován hlavně v kořenové čepičce, kde zřejmě vytvářením gradientu iontů přes membránu slouží k reorientaci proudu auxinu proudícího ze stélé do buněk epidermis a kortexu. Stejně jako mnoho jiných proteinů lze i proteiny PIN a PGP regulovat na více úrovních. První představuje možnost regulace množství vznikajících proteinů prostřednictvím aktivace či inhibice jejich transkripce a teoretické ovlivnění proteosyntézy a maturace proteinu. Cílem dalších regulačních mechanismů je transport proteinů do membrány a jejich lokalizace v buňce. Může být také přímo ovlivněna funkce již maturovaných proteinů prostřednictvím kompetitivní a nekompetitivní inhibice, fosforylace, defosforylace a řízené degradace (ZAŽÍMALOVÁ a kol. 2007). Auxin může zvyšovat svůj odtok z buněk pomocí indukce exprese svých vlastních transportních proteinů rodiny PIN (PAPONOV a kol. 2008). Míra indukce závisí na délce působení auxinu, na jeho koncentraci a je specifická pro určitý buněčný typ a pro určitý typ proteinu PIN jinak rychlá. Každý typ přenašeče PIN potřebuje pro indukci své transkripce jinou koncentraci auxinu. Regulace genové exprese je zprostředkována AUX/IAA-závislou dráhou. Auxin způsobí rychlou degradaci represorů AUX/IAA, transkripční faktory ARF jsou tedy uvolněny z jejich inhibice a mohou aktivovat transkripci proteinů PIN, možná ve spolupráci s dráhou aktivovanou dalšími transkripčními faktory PLETHORA (BLILOU a kol. 2005). Auxiny mohou být regulovány i post-translační modifikací různých proteinů reverzibilní fosforylace a je jednou z nejčastějších regulací řídících aktivitu proteinů. Reversibilní fosforylace je zprostředkována enzymy kináz a fosfatáz. BENNET a kol. (1995), objevili serinthreoninovou kinázu PINOID (PID), účastnící se přenosu a šíření auxinového signálu. Zvýšení exprese genu PID po působení auxinu naznačuje, že tento gen patří mezi auxinem indukovanou skupinu genů (BENJAMINS a kol. 2001). Funkce a aktivita již maturovaných a na membráně umístěných přenašečů auxinu PIN mohou být regulovány i kompetitivní či nekompetitivní inhibicí pomocí takzvaných inhibitorů 36

50 polárního transportu auxinu. Jejich působením dochází k omezení transportu auxinu ven z buněk a jeho následné zvýšené akumulaci v buňkách (KATEKAR a GEISSLER 1980). Mezi tyto inhibitory patří například kyselina 2,3,5-trijodbenzoová (TIBA), působící též jako slabý auxin. Asi nejvýznamnějšími inhibitory jsou tzv. fytotropiny s nejčastěji používaným představitelem, kyselinou 1-naftylftalamovou (NPA) Mechanismus účinku auxinů Auxin vyvolává v buňkách rychlou expresi transkripčních regulátorů rodiny AUXIN/INDOL-3-ACETIC ACID (AUX/IAA), V Arabidopsis je doposud známo 29 proteinů z rodiny AUX/IAA (LISCUM a REED 2002). Všechny tyto proteiny jsou velmi nestálé a obsahují čtyři vysoce konzervované domény: doména I je represorem transkripce, domény III a IV zprostředkovávají homodimerizaci a heterodimerizaci s dalšími AUX/IAA proteiny a také s takzvanými Auxin Response Factors (ARFs). Doména II je důležitá pro interakci AUX/IAA s proteinem TIR1 (Transport Inhibitor Response), který je součástí komplexu ubiquitinační ligázy SCFTIR1. Tento komplex označuje cílové proteiny včetně AUX/IAA ubiquitinem a poté dochází k jejich degradaci v proteasomu. V přítomnosti auxinu, který se váže na receptorový protein TIR1 (DHARMASIRI a kol. 2005) se zvyšuje interakce mezi TIR1 a AUX/IAA a dochází k řízené degradaci transkripčních regulátorů AUX/IAA (GRAY a kol. 2001). Mnoho genů, jejichž exprese je regulována auxinem, obsahuje v promotorové oblasti regulační sekvenci, tzv. Auxin-Responsive Element (AuxRE). Na tyto sekvence se váží ARF proteiny jako monomery, homodimery či heterodimery s jinými ARF proteiny nebo s AUX/IAA proteiny, inhibujícími transkripci. Samotné ARF proteiny mohou působit jako inhibitory i aktivátory transkripce, to závisí na povaze jejich centrální domény. AUX/IAA interagují s ARF proteiny přes C-terminální domény III a IV, které jsou konzervované u většiny AUX/IAA i ARFs (WOODWART a BARTEL 2005). Systém indukce exprese proteinů AUX/IAA auxinem je negativní zpětnou vazbou. Okamžitě po působení auxinu a jeho navázání na receptor v buňce dojde k poklesu hladiny AUX/IAA proteinů, díky jejich ubiquitinaci a následné degradaci v proteasomu a následně k zesílení transkripce genu AUX/IAA zprostředkované nasednutím ARF proteinů na AuxRE v promotorové oblasti genu AUX/IAA. Tím dojde 37

51 k akumulaci AUX/IAA proteinů v buňce a k vypnutí auxinového signálu. Tento systém tedy umožňuje krátkodobou a přechodnou signalizaci (GRAY a kol Inaktivace auxinů IAA může být inaktivována oxidací na oxiaa a následnou konjugována. IAA tvoří dvě základní skupiny konjugátů (IAA-Asp a IAA-Glu). U jednoděložných rostlin převládají estery IAA s glukosou a myo-inositolem, zatímco u dvouděložných rostlin jsou to amidy různých aminokyselin (COHEN a BANDURSKI 1982). Katabolický konjugační systém se běžně vyskytuje v rostlinách, jelikož výskyt IAA-Asp a IAA-Glu byl zaznamenán v malém množství u klíčních rostlin Arabidopsis (RAMPEY a kol. 2004). Enzymy, které konjugují IAA na aminokyseliny, jsou kódovány geny z GH3 rodiny auxin indukujících genů. Enzym, který metyluje boční karboxylový řetězec byl popsal ZUBIETA a kol Tento enzym je z rodiny karboxylmetyltransferáz. Metylace způsobí zvýšenou nestabilitu IAA, ale není zatím zřejmé, zda tato modifikace aktivuje nebo inaktivuje hormon. 38

52 3. MATERIÁL A METODY 3.1 Rostlinný materiál Jako experimentální rostlinný materiál byly použity segmenty ze středních částí čepelí listů petúnie (Petunia hybrida) cv. Lady blue. Pro založení donorové, periodicky pasážované kultury ze vzrostných vrcholů byly vypěstovány ze semen rostliny. Nejprve byla semena povrchově sterilizována ve flow-boxu a ponechána jednu minutu ve směsi 50 ml sterilní vody, 50 ml etanolu a 20 ml peroxidu vodíku. Poté byla semena 3x opláchnuta ve sterilní vodě. Následovala sterilizace semen 8 minut ve směsi 15 ml přípravku Savo a 85 ml sterilní vody. Poté byla semena opět třikrát opláchnuta sterilní vodou, osušena a vyseta na šikmé agarové MS médium (MURASHIGE a SKOOG 1962) s 5 g.l -1 sacharózy. Větší rostliny byly kultivovány v in vitro podmínkách na B5 Gamborg médiu (GAMBORG 1968) s 10 g.l -1 sacharózy a 0,5 g.l -1 aktivního uhlí, při laboratorní teplotě 25 ± 1 ºC po celou dobu na světle při intenzitě 150 μmol.m -2.s -1. Segmenty ze střední části listových čepelí byly odebírány z mediánní až apikální části rostlin. Vzrostné vrcholy byly použity pro založení nové kultury rostlin. 3.2 Experimentální kultivační podmínky Kultivace segmentů listů ze středních části čepelí probíhala na Petriho miskách na světle při intenzitě 150 μmol.m -2.s -1 při laboratorní teplotě 21 C. Každá Petriho miska obsahovala deset segmentů. Segmenty byly kultivovány na čtyřech typech indukčních MS medií. Složení indukčního média odpovídalo MS médiu (MURASHIGE a SKOOG 1962) obohaceného o 3μM cytokininy (BA, BAR, BAR5 MP nebo BA7G) a 0,5 μm auxin (NAA). 39

53 Kultivace za účelem odběru vzorků pro stanovení endogenní hladiny cytokininů probíhala krátkodobě po dobu 2 hodin, nebo dlouhodobě po dobu 5 a 20 dnů. Pro hodnocení indukce organogeneze byly segmenty kultivovány na indukčním médiu a to buď dlouhodobě bez pasážování na nové indukční médium po dobu 35 dnů, nebo byly segmenty pasážovány po 5 nebo 7 dnech od začátku kultivace na nové indukční médium. 3.3 Hodnocení indukce organogeneze Pro stanovení účinku cytokininů na indukci organogeneze byla provedena dlouhodobá kultivace (35 dní). Byl sledován proces indukce organogeneze na segmentech listů z kultivace na médiu s obsahem BA, BAR, BA7G a BAR5 MP, kde byly explantáty celou dobu kultivace, nebo pasážovány po pěti a sedmi dnech od začátku kultivace na nové indukční médium. Během této doby byla hodnocena frekvence regenerace prýtů tj. podíl regenerujících segmentů z celkového počtu segmentů, vyjádřen v %, v intervalech 0, 5, 15, 20, 25, 30 a 35. Pro stanovení frekvence regenerace prýtů byly segmenty kultivovány v 5-ti opakováních v počtu 10 segmentů na Petriho misku a statisticky vyhodnoceny pomocí Studentova t-testu. 3.4 Odběry vzorků pro analýzy Pro stanovení endogenních hladin cytokininů byly odebírány vzorky z kultivace po 2 hodinách, 5 a 20 dnech. Všechny vzorky pro stanovení endogenních hladin cytokininů byly očištěny od zbytků média, osušeny a zváženy a po zmražení lyofilizovány. 3.5 Stanovení endogenních cytokininů 40

54 Pro stanovení obsahu endogenních cytokininů byly vždy odebírány 2 vzorky rostlinného materiálu od každé varianty. Po purifikaci, extrakci a HPLC separaci byly stanoveny hladiny endogenních cytokininů pomocí metody ELISA. Postup stanovení cytokyninů: Extrakce a purifikace Po homogenizaci rostlinného materiálu v tekutém dusíku byly odstraněny lipidy a lipofilní barviva (chlorofyl), za pomoci modifikovaného Bieleskiho činidla (metanol: chloroform:voda = 13:5:2). Materiál byl extrahován přes noc při teplotě 20 C. Poté byl vytřepán na třepačce při 3500 rpm po dobu 1 hodiny při + 4 C a extrakt byl doplněn o poloviční objem vodou s nízkou vodivostí. Centrifugací při 4 C při 3000 g bylo tak dosaženo oddělení supernatantu obsahujícího cytokininy (vodný metanol) od chloroformu. Po rehomogenozaci sedimentu nad frakcí s chloroformem byla provedena druhá centrifugace. Spojené supernatanty byly odpařeny do vodného zbytku. K tomu byl přidán acetátamonný pufr o ph 6,5. Následovalo štěpení ribotidů cytokininů kyselou fosfatázou (1 mg/vzorek) po dobu 1 hodiny při 300 rpm a okyselení na ph 3,00 kys. octovou. Cytokininy a jejich ribosidy s kladným parciálním nábojem byly zachyceny na P-celulóze. Eluovány byly 0,2 M amoniakem. Po úpravě ph na 6,5 pokračovala purifikace na DEAE-celulóze spojené s C18 kolonkou (Sep Pak). Cytokininy byly v tomto kroku čištění zachyceny na C18 sorbentu. Po eluci přečištěné cytokininové frakce metanolem bylo provedeno odpaření do sucha na rotační vakuové odparce (následovalo HPLC separace cytokininů). Separace cytokininů pomocí HPLC HPLC separace cytokininů byla provedena na přístroji firmy Ecom na koloně Luna C18 Phenomenex s C18 sorbentem s 250 x 4,6 μm I. D. s velikostí pórů 5 μm a průtokem mobilní fáze 1000 μl/min. Složení mobilní fáze A:metanol, B: 0,15 % TFA. Gradient mobilní fáze byl: 0-1 min...15 % A 3-11 min...40 % A min...60% A UV signál byl detekován při 260 nm a jednotlivé frakce po sobě následujících cytokininů byly sbírány dle příslušných retenčních časů. Frakce byly odpařeny do sucha a rozpuštěny do TBS pufru 800 μl. 41

55 Kvantifikace cytokininů metodou ELISA Ke stanovení cytokininů byly použity polyklonální protilátky vůči jednotlivým frakcím cytokininů (STRNAD 1996). Do jamek mikrotitrační destičky bylo na pipetováno 150 μl protilátky (5 μl MAb v 15 ml uhličitanového pufru ph 9,6 na 1 desku) a uzavřená destička byla inkubována při teplotě +4 C přes noc. Další den byla destička vyprázdněna a 3x promyta redestilovanou vodou o teplotě cca 4 C. Poté byla každá jamka potáhnuta 200 l BSA (20ml na desku) a znovu inkubována po dobu 1 hodiny při 25 C. Po hodinové inkubaci se destička vyprázdnila a 2x promyla redestilovanou vodou. Do každé jamky bylo naneseno 50 µl TBS, 50 µl vzorku nebo 50 µl standardů (v TBS) a napipetováno 50 µl traceru (konjugát alkalické fosfatázy a cytokininu, ředěním 2,5 µl / 5 ml BSA na 1 desku) s výjimkou jamek ponechaných pro blank. Do jamek blanku bylo napipetováno 100 µl BSA a 50 µl TBS, do jamek pro maximální vazbu 100 µl TBS a 50 ml konjugátu alkalické fosfatázy a cytokininu. Poté se destička 1 minutu míchala a 1 hodinu inkubovala při laboratorní teplotě. Po 1 hodině byla destička opět vyprázdněna a 4x promyta pufrem TSB. Do všech jamek bylo napipetováno 150 µl substrátu (paranitrofenylfosfát v uhličitanovém pufru - 1 mg/ml) a destička se nechala inkubovat 1 hodinu při laboratorní teplotě. Po hodinové inkubaci se barevná reakce zastaví 5M KOH. ELISA se vyhodnocuje spektrofotometricky při vlnové délce 405 nm: obsah cytokininů je nepřímo úměrný absorbanci naměřené v roztocích jednotlivých jamek mikrotitrační destičky v porovnání s řadou standardů, minimální a maximální vazbou protilátky, příslušné absorbance vzorků byla odečtena z kalibrační křivky. 42

56 E podmínky precipitační E E inkuba ce E E E kompetice imunoprecipitace E specifická protilátka cytokinin inkubace promytí cytokinin značený enzymem reakční podmínky E E enzymová reakce Obr. 7: Schéma přímé ELISA pro stanovení cytokininů 3.6 Zhotovení mikroskopických preparátů parafínovou technikou Vzorky pro mikroskopická pozorování procesu morfogeneze byly odebrány po 5 denní kultivaci na IM. Explantáty byly zbaveny zbytků média, omyty vodou a osušeny. Fixace explantátů (objektů) byla provedena Navašinovým roztokem (formaldehyd, Cr 2 O 3 a ledová kyselina octová), po dobu 24 hodin ve vzduchotěsně uzavřených nádobách. Po skončení fixace byly objekty vypírány po dobu 24 hodin tekoucí vodou. Vzestupnou alkoholickou řadou byly objekty dehydratovány. Následovalo sycení xylenem ve směsích etanol:xylen v poměru 3:1, 1:1 a 1:3, vždy po 15 minutách v čistém xylenu. Převádění objektů do parafínu bylo provedeno v 43

57 kádinkách s jemně nastrouhaným parafínem, zalitým xylenem, v termostatu při 65 C. Prosycování probíhalo 3 dny za občasného přisypávání jemně nastrouhaného parafínu. Třetí den byly objekty zality do parafínových bločků. Z připravených parafínových bločků byly na sáňkovém mikrotomu řezány 10 μm silné řezy, které byly v páskách umístěny do kapky vody na podložní skla natřená směsí glycerinu a lysinu 1:1. Poté byly parafínové desky narovnány na topné desce a osušeny. Další den byly preparáty odparafinovány sestupnou etanolovou řadou a barveny dvojitým barvením dle CAJAL a BROŽKA (NĚMEC a kol. 1962). Tímto diferenciálním barvením jsou jádra a chromozomy barveny červeně a cytoplazma modře. Po té byly preparáty znovu odvodněny vzestupnou etanolovou řadou a prosyceny xylenem. K uchování v trvalém stavu byly preparáty uzavírány do solakrylu. Pomocí mikroskopu OLYMPUS PROVIS byly zhotoveny mikrofotografie. 3.7 Fotofokumentace Fotografická dokumentace byla provedena na materiál Nicon COOLTIX Odkazy na fotografickou dokumentaci jsou uvedeny ve výsledcích. Detailnější popis snímků je uveden jako text k jednotlivým fotografiím v příloze. 44

58 4. VÝSLEDKY 4.1 Screening morfogenního účinku derivátů BA na regeneraci in-vitro Segmenty listů petúnie byly kultivovány na čtyřech typech indukčního média (IM) a byla sledována kumulativní četnost regenerace (%) v průběhu kultivace. Segmenty listů petúnie byly pasážovány po 5 a 7 dnech na nové IM, nebo byly ponechány po dobu 35 dnů na stejném IM bez pasáže. K regeneraci docházelo pouze na třech typech IM, kdy segmenty listů petúnií regenerovaly pouze na médiu obohaceném o BA, BAR a BAR5 MP. Na médiu s BA7G nedocházelo k tvorbě prýtů, ale byla zde indukována tvorba kořenů. Viditelná organogeneze byla zaznamenána po patnácti dnech kultivace na indukčním médiu a četnost regenerantů rostla do třicátého dne kultivace (viz grafy 1, 2 a 3). Pokud byly segmenty po pěti dnech od založení pasážovány na nové indukční médium, byla regenerace sledována již v pátém dni po založení a největší počet regenerantů byl na médiu obsahujícím BAR5 MP, kdy regenerace po 30 dnech dosahovala 90 % (viz graf 1). Mezi hodnotami BAR5 MP frekvence regenerace a frekvencí organogeneze na ostatních IM médiích je statisticky průkazný rozdíl. 45

59 Graf 1: Frekvence regenerace prýtů při 5 denní kultivaci na IM a následné kultivaci na novém IM obsahujícím BA, BAR, BA5 MP, BA7G Podobné výsledky byly stanoveny i u kultivace, kdy pasážování probíhalo po sedmi dnech od založení na nové IM. Statisticky průkazné rozdíly byly typické jen zpočátku kultivace. Nejvyšší ferkvence regenerace byla na médiu obsahujícím BA, kdy regenerace do dvacátého dne dosáhla 65 % (graf 2). Graf 2: Frekvence regenerace prýtů při 7 denní kultivaci na IM a následné kultivaci na novém IM obsahujícím BA, BAR, BA5 MP, BA7G U kultivace bez pasážování na nové IM byla nejvyšší regenerace segmentů zaznamenána opět u média obsahujícím BAR5 MP, kdy počet regenerantů po 35 dnech 46

60 dosahoval 92 % (graf 3). Segmenty bez pasáže na nové IM měly nejvyšší počet regenerantů oproti variantám s následnou pasáží. Graf 3: Frekvence regenerace prýtů bez pasážování na nové IM obsahujícím BA, BAR, BA5 MP, BA7G U segmentů kultivovaných na IM s BA7G byla sledována indukce rhizogeneze, viditelná organogeneze nastala již v pátém dni kultivace na všech typech médií (bez pasáže, 5 dní IM/IM, 7 dní IM/IM). Nejvíce regenerovaly kořeny na médiu bez pasáže, kdy hodnoty indukce dosahovaly 60 % (graf 4). 47 Graf 4: Indukce tvorby kořenů na IM obsahujícím BA7G

61 4.2 Výtěžnost tvorby prýtů Z grafu 5 je zřejmé, že největší výtěžnost byla sledována na médiu obsahujícím BA. Nejvyšší výtěžnost tvorby prýtů byla v jednotlivých explantátech dosažena v kultivaci s pasáží explantátů po 5 dnech od založení na stejné IM, obsahujícím BA, BAR nebo BAR5 MP. Poměrně vysoký byl počet prýtů na jednotlivý explantát i u kultivace na IM obsahujícím BAR, kdy byl sledován nejvyšší počet prýtů u kultivace s pasáží po 5 dnech od založení. Výtěžnost tvorby prýtů byla zjištěna i na IM obsahujícím BA5 MP, ale početnost nedosahovala takových hodnot jako na kultivacích s obsahem BA a BAR. Na médiu obsahujícím BA7G nebyl sledován žádný nárůst prýtů na jednotlivých explantátech. Graf 5: Počet regenerantů na explantát listu petúnie při kultivaci na IM s BA, BAR, BA5 MP a BA7G s následnou pasáží v 5 a 7 dni po založení 4.3 Obsah hladiny endogenních cytokininů Analýzy obsahu cytokininů ve vzorcích z kultivace in vitro ukázaly, že v segmentech listů petúnie dochází ke zvýšení hladiny endogenních CK již po 2 hodinách kultivace, kdy nejvyšší hladiny byly detekovány pro BA a BAR a to i na IM 48

62 obsahujícím BA7G a BA5 MP. Dále byly stanoveny hladiny pro BA, ip a jeho ribosidu na všech typech IM a u mt byla detekována jeho hladina pouze na médiu s BA7G. U dalších cytokininů (mtr, DHZR, DHZ, Z a ZR) bylo množství zanedbatelné (graf 6). Graf 6: Změny obsahu endogenních CK segmentů kultivovaných na IM po dobu 2 hodin U segmentů listů petúnie byl po 5 dnech kultivace nejvyšší obsah opět sledován u BAR, kdy jeho obsah na IM s obsahem BA a BAR5 MP dosahoval 8 ng/g čerstvé hmotnosti. Dále byly obsahy stanoveny u BA, kdy jeho nejvyšší hladina byla stanovena na IM obsahujícím BA. Dále byly stanoveny ip a jeho ribosid na všech typech IM (graf 7). Oproti kultivaci po 2 hodinách nebyl po 5 dnech kultivace detekován obsah mtr, mt ani DHZR. Velmi nízká hladina byla stanovena pro ZR na médiu obsahujícím BAR5 MP a pro Z a DHZ na médiu s BA. (graf 7). 49 Graf 7: Změny obsahu endogenních CK segmentů kultivovaných na IM po dobu 5 dnů

63 Segmenty listů kultivované na IM po dobu 20 dnů vykazovaly nejnižší obsahy endogenních CK na všech typech IM. Nejvyšší obsah byl detekován u BA na médiu obsahujícím BA. Dále byly stanoveny obsahy u BAR, ip a jeho ribosidu. Obsahy dalších CK nebyly detekovány (graf 8). Graf 8: Změny obsahu endogenních CK segmentů kultivovaných na IM po dobu 20 dnů Obsah BA v segmentech listů petúnie se během kultivace výrazně neměnil je patrný pouze slabý pokles obsahu BA na variantě kultivované po dobu 20 dnů na IM obsahujícím BAR a BAR5 MP, jen u BA7G je viditelná vyšší hladina BA oproti ostatním variantám (graf 9). Nejvyšší hladina BA byla detekována na médiu obsahujícím BA7G, kdy byly segmenty kultivovány 20 dní (graf 9). Obsah jeho ribosidu BAR je prokazatelně vyšší ve všech variantách na všech typech IM (graf 10). Nejvyšší obsah BAR byl detekován u segmentů kultivovaných na IM po dobu 5 dnů. 50

64 Graf 9: Obsah BA v segmentech listů petúnie kultivovaných na IM s BA, BAR, BA7G a BAR5 MP po dobu 2 hodin, 5dní a 20 dní Graf 10: Obsah BAR v segmentech listů petúnie kultivovaných na IM s BA, BAR, BA7G a BAR5 MP po dobu 2 hodin, 5dní a 20 dní Z dalších CK byl v segmentech listů petúnie detekován ip a jeho ribosid, které byly stanoveny na všech typech IM (graf 11,12). Hladina ip byla nejvyšší při 5 denní kultivaci na IM s BA, kdy dosahovala 4 ng/g čerstvé hmoty (graf 11). U ipr byly nejvyšší hladiny stanoveny na všech variantách kultivace na médiu obsahujícím BAR5 MP (graf 12). 51

65 Graf 11: Obsah ip v segmentech listů petúnie kultivovaných na IM s BA, BAR, BA7G a BAR5 MP po dobu 2 hodin, 5dní a 20 dní Graf 12: Obsah ipr v segmentech listů petúnie kultivovaných na IM s BA, BAR, BA7G a BAR5 MP po dobu 2 hodin, 5dní a 20 dní 4.4 Histologie nepřímé organogeneze na segmentech listů petúnie V období před viditelnou organogenezím byly na explantátech patrné morfologické změny. Ty byly detekovány po pěti dnech kultivace na IM. Segmenty listů měly pevnou konzistenci (ukládání škrobu) a měly změněnou pigmentaci. U segmentů kultivovaných na IM s BA se tvořil kalus, ve kterém byla znatelná přítomnost apikálního meristému 52

66 s listovými primordii a s tvorbou prokambiálních svazků uvnitř kalusu (obr. 9). U segmentů kultivovaných na IM s BAR je viditelná struktura meristématických center s výskytem vakuolizovaných buněk a tracheálních elementů (obr. 10). U segmentů kultivovaných na IM s BAR5 MP jsou viditelné základy meristématických center v diferencovaném pletivu (obr. 11). V případě kultivace segmentů na IM s BA7G byly detekovány pouze vakuolizované a prozenchymatické buňky, nebyly však nalezeny meristématická centra (obr. 12). Obr. 9: Počátek nepřímé organogeneze u segmentu kultivovaném na IM s BA. Tvorba kalusu (A) a apikálního meristému (B) 53

67 Obr. 10: Počátek nepřímé organogeneze u segmentu kultivovaném na IM s BAR. Tvorba tracheálních elementů (A) Obr. 11: Remeristematizace v diferencovaném pletivu u segmentů kultivovaných na IM s BAR5 MP 54

68 Obr. 12: Prozenchymatické a vakuolizované buňky u segmentů kultivovaných na IM s BA7G 55

69 5. DISKUSE Biologická (fyziologická) aktivita látek představuje účinnost organické molekuly v biologickém procesu tj. přenos signálu k cílové buňce, resp. receptoru. Vyjádření této aktivity se uvádí na různých úrovních, dle experimentálního záměru a sledovaného efektu, ale vždy má vztah k citlivosti pletiv na danou molekulu. U růstových regulátorů rostlin a konkrétně jejich nativních látek fytohormonů má popis fyziologické aktivity důležitý význam při fyziologické charakteristice životního děje (TREWAVAS 1982). Vzhledem k tomu, že každá buňka přijímá a zpracovává velké množství signálů různého typu, je cílem koordinace reakcí na ně. Cytokininy jako velmi významné fytohormony ovlivňují růst a vývoj rostlin řadou složitých molekulárních mechanismů v přenosu signálu. Prostřednictvím podílu jejich fyziologicky aktivních a inaktivních metabolitů a interakcemi s dalšími fytohormony realizují indukci mnoha fyziologických procesů. Jednou z možností jak vyjádřit fyziologickou aktivitu cytokininů, je odezva izolovaných pletiv v regeneraci, protože cytokininy společně s auxiny regulují dělení buněk. Proto bylo cílem mojí diplomové práce sledovat reakci explantátů z listů petunie na deriváty komerčně využívaného cytokininu BA. Konkrétně k tomuto účelu byl vybrán ribosid, ribosid-5 -monofosfát a 7-glukosid. Již dříve byla fyziologická aktivita cytokininů, respektive extraktů látek z rostlin a jejich částí, analyzována prostřednictvím biotestů. Ty spolehlivě určují fyziologickou aktivitu (nikoliv kvantitu dané látky). Biotestů na cytokininy byla odvozena celá řada (kalusový, senescenční, amarantový aj., HOLUB a kol. 1998) v citlivosti jednotek až desítek pmol. V případě identifikace nových, přirozených látek s růstově regulační aktivitou jsou považovány za nezbytnou součást analýz, zvláště pak jako doplněk přesných kvantifikačních metod (TARKOWSKÁ a kol. 2003). Některé poznatky vycházející z kalusového biotestu v němž byla analyzována citlivost parenchymatického pletiva tabáku, napomohly v odvození a optimalizaci regeneračních protokolů in vitro mnoha druhů hospodářsky významných rostlin. Použití regenerace in vitro pomocí BA a jeho výše uvedených derivátů ve stejných koncentracích v indukčních médiích bylo zvoleno jako optimální přístup srovnání fyziologické aktivity těchto fytohormonů. Frekvence regenerace prýtů in vitro zjištěná v mém experimentu naznačuje, že ve všech variantách (sub)kultivace segmentů 56

70 listů petunií (pasáž na nové indukční médium) je nejaktivnější 6-benzyladeninu. Vysokou aktivitu měly také deriváty 6-benzyladenin ribosid-5 -monofosfát a nepatrně nižší fyziologickou aktivitu 6-benzyladenin ribosid a vůbec žádná regenerace prýtů nebyla indukována pomocí 6-benzyladenin-7-glukosidu. Že právě volné báze cytokininů jsou aktivními formami těchto fytohormonů uvádějí už LALOUE a PETHE (1982). Ribosidy a fosfáty cytokininů jako fyziologicky aktivní cytokininy uvádí DOBREV (2002) spíše jako transportní formy. Kromě benzyladenin-7-glukosidu jsou všechny tři látky vysoce aktivní i v případě sledování výtěžnosti regenerantů na explantát. Vždy po pasáži explantátů na stejné indukční médium a to po pěti i sedmi dnech od založení kultury in vitro je tato výtěžnost vyšší než v prosté kultivaci bez výměny média. Při kultivaci explantátů na médiu obsahujícím 7-glukosid BA nedocházelo k regeneraci prýtů, ale explantáty tvořily kořeny. To poukazuje na 7- glukosid BA jako na fyziologicky inaktivní látku z hlediska indukce tvorby prýtů. BA7G však nepotlačuje tvorbu kořenů indukovanou přítomností NAA v médiu. Ke tvorbě kořenů však nedošlo ve variantách kultivace, kde byly v médiu fyziologicky aktivní cytokininy. Typickým efektem fyziologicky aktivních cytokininů a to především benzyladeninu použitého v in vitro kulturách je inhibice růstu kořenů. V mé práci byly koncentrace cytokininu a auxinu (3 µm : 0,5 µm) voleny ve prospěch regenerace prýtu. Je tedy zřetelné, že pokud jsou aktivní cytokininy v médiu v nadbytku inhibují tvorbu kořenů, tak jak to uvádí (WERBROUCK a kol. 1996). Dalším možným pohledem na fyziologickou aktivitu jednotlivých derivátů BA použitých k indukci regenerace in vitro bylo sledování výskytu meristematických center v explantátech. Anatomická studie naznačuje zřetelně, že v případě kultivace explantátů na indukčním médiu s BA dochází ke tvorbě organizovaných meristémů a primordií listů. Tyto struktury jsou zřetelně ohraničeny vakuolizovanými buňkami. Přítomnost meristematických center, resp. remeristematizace v diferencovaném pletivu byly nalezena v případě kultivace explantátů na indukčním médiu s BAR a BAR5 MP. Pouze v případě kultivace explantátů na médiu s BA7G byly nalezeny vakuolizované buňky a také prozenchymatické buňky, nikoli však meristematické. Tracheální elementy a sítkovice v explantátech mého experimentu byly organizovány do vodivého pletiva. Diferenciaci vodivých elementů popsali již dříve (DALESSAN a ROBERTS 1971), kteří dosáhli tohoto stupně diferenciace obdobně jako v mojí práci za použití syntetického auxinu. Právě syntetické auxiny stimulují xylogenezi a vývoj vodivých 57

71 pletiv in vitro. Z anatomického pohledu je tedy možné konstatovat, že fyziologická aktivita cytokininů spočívá více na regulaci buněčného dělení a následná diferenciace aktivovaná pravděpodobně NAA přijatou z média nebyla negativně ovlivněna či inhibována přítomností inaktivního BA7G. Navíc fyziologicky aktivní cytokininy tvorbu vodivých pletiv nestimulují, proto nebyly tyto struktury v preparátech nalezeny ve vysokém stupni organizace tohoto pletiva. V in vitro regeneračních postupech je často nenahraditelné použití cytokininů při regeneraci izolovaných částí rostlin. Segmenty listů petunie v mnou použitém systému se jevily jako vysoce organogenní a kladně reagovaly na exogenní, avšak fyziologicky aktivní cytokininy. U řady druhů rostlin je dokonale zvládnutý regenerační postup in vitro, včetně multiplikace, často však není známo jakým způsobem cytokininy aplikované do kultivačního média organogenezi způsobí. Proto je nezbytné hledat hladiny endogenních cytokininů a délku indukce organogeneze a často i vhodnou odrůdu druhu kulturní rostliny pro úspěšné odvození tak složitého procesu, jakým organogeneze je. Ze změn obsahu endogenních cytokininů je zřejmé, že při kultivaci segmentů listů na médiích obsahujících deriváty BA, obsahují explantáty právě velká množství BA a jeho ribosidu po příjmu z kultivačního média. Byly však detekovány srovnatelné hladiny ip a ipr. Jiné typy CK byly zastoupeny pouze nepatrně, např. zeatin. Je však známo, že exogenní aplikace cytokininů aktivují cytokininoxidázu/dehydrogenázu (CKX), která štěpí izoprenoidní cytokininy (MOTYKA a kol. 1996). Aromatické cytokininy jako je BA a jeho deriváty nejsou však substrátem CKX. Jsou tudíž metabolizovány jinými cestami. BA může být metabolizován pouze na 3 typy metabolitů zachovávajících strukturu cytokininů. Tvořit se mohou ribosid, ribosid-5 -monofosfát a tři glukosidy (N3, N7 nebo N9). Na petuniích tyto metabolity v procesu organogeneze in vitro byly prokázány již AUEROVOU (1990). Při organogenezi prýtů na listech tabáku in vitro popisují vznik všech těchto metabolitů z 3 H-BA KLEMŠ a kol. (2000). Uvádějí intenzivní tvorbu 3 H-BA7G a s tím spojenou inaktivaci v procesu organogeneze. VLASÁKOVÁ a kol. (1998) sice uvádějí, že z BAR může vznikat BA a že příjem BAR je pomalejší než BA. To může korespondovat s nižší organogenní aktivitou ribosidu oproti volnému BA. Biologickou aktivitu BA7G dokládá pouze starší práce autorů FOX a kol. (1973). Aktivitu metabolitů BA a změny endogenních CK ve vztahu k morfogenním efektům uvádějí 58

72 ZHANG a kol. (2010). Ve své práci popisují inhibiční efekt BA na vývoj sekundárních primordií listových jehlic Pinus radiata in vitro. Bez BA v médiu docházelo k vývoji jehlic. Současně pozorovali snížení hladin endogenních CK i metabolismus BA. Je tudíž možné, že fyziologická aktivita BA souvisí právě s dělením buněk, se zakládáním organogenních primordií a ne už s jejich dalším růstem a vývojem. Z výsledků dlouhodobé kultivace segmentů listů petunie na indukčním médiu obsahujícím různé deriváty BA je možné vizuálně odhadnou jejich fyziologickou aktivitu. Detailní anatomická studie pak potvrdila ve srovnání s údaji v literatuře morfogenní účinky BA, o morfogenních účincích derivátů či metabolitů BA údaje scházejí. Hladiny stanovených cytokininů potvrzují možnost příjmu BA a také metabolismus na BAR. Nebyl však sledován metabolismus pomocí 3 H-BA a také ani metabolismus BAR, BAR5 MP a BA7G. Nicméně i v explantátech z těchto kultivací byly detekovány fyziologicky aktivní cytokininy. Jejich množství je pravděpodobně udržováno jinými než zmíněnými homeostatickými mechanismy. 59

73 6. ZÁVĚR V diplomové práci jsem studovala problematiku fyziologické aktivity metabolitů BA v indukci organogeneze prýtů in vitro. Cílem bylo sledovat fyziologickou aktivitu derivátů BA v indukci organogeneze in vitro a to látek, které vznikají jako metabolity přímo v rostlinných pletivech, kde jsou často akumulovány. Dále byly stanoveny hladiny endogenních cytokininů, kde mezi sledované patřil BA, BAR, ip, ipr, Z, ZR, DHZ, mt a mtr. Byly připraveny mikroskopické preparáty a sledován výskyt meristematických center v segmentech explantátů. Segmenty listových čepelí byly kultivovány na čtyřech typech indukčních MS médiích. Každé indukční médium bylo obohaceno o cytokininy (3 μm BA, BAR, BAR5 MP a BA7G) a o 0,05 μm auxinu (NAA). Pro hodnocení indukce organogeneze byly segmenty kultivovány po dobu 35 dní a to buď bez pasáže na nové indukční médium, a nebo s pasáží v pátém a sedmém dni od založení kultury. Kultivace za účelem odběru vzorků pro stanovení hladiny endogenních cytokininů probíhala krátkodobě po dobu dvou hodin, nebo dlouhodobě po dobu pěti a dvaceti dnů. Pro mikroskopická pozorování anatomických změn při procesu morfogeneze probíhala kultivace explantátů po dobu 5 dnů na IM. V případě hodnocení indukce organogeneze byla hodnocena frekvence regenerace prýtů v intervalech 0, 5, 15, 20, 25, 30 a 35 dní. Obsah hladin endogenních cytokininů byl stanoven pomocí ELISA, po předcházející extrakci, purifikaci a HPLC separaci. Pro stanovení frekvence regenerace prýtů byly segmenty statisticky vyhodnoceny pomocí Studentova t-testu. Počet regenerovaných prýtů byl převeden na %. Mikrofotografie sledující indukci organogeneze byly zhotoveny pomocí mikroskopu OLYMPUS PROVIS a fotoaparátu OLYMPUS E410. Viditelná organogeneze byla zaznamenána od patnáctého dne kultivace a to na všech typech médií, kromě média obohaceného o BA7G. Nejvyšší počet regenerantů byl shodně zaznamenán jak na kultivaci bez výměny indukčního média obsahujícím BAR5 MP, tak i u varianty s pasáží po pěti dnech od založení. Přenesení segmentů tedy nehrálo významnou roli na tvorbu prýtů u média obsahující BAR5 MP. Tvorba prýtů na médiu obsahujícím BA a BAR byla srovnatelná ve variantách s následnou pasáží, ale u varianty bez pasáže dosahovaly větší tvorby prýtů segmenty na BA médiu. U segmentů 60

74 kultivovaných na indukčním médiu s BA7G nebyla sledována indukce prýtů, ale byla sledována indukce organogeneze kořenů. Nejvíce regenerovaly kořeny na indukčním médiu bez následné pasáže. Segmenty listů regenerovaly na médiích obohacených o BA, BAR a BA5 MP, segmenty neregenerovaly na médiu s BA7G. Nejvyšší počet regenerantů na explantát vykazovaly segmenty kultivované na médiu obsahujícím BA, přičemž ve variantě s následnou pasáží po pěti dnech po založení byl jejich počet nejvyšší. U segmentů kultivovaných na médiu s BAR a BAR5 MP počet regenerantů dosahoval srovnatelných počtů všech variantách. Analýzy obsahu cytokininů ve vzorcích z kultivace in vitro ukázaly, že v segmentech listů petúnie dochází ke zvýšení hladiny endogenních CK již po 2 hodinách kultivace. Vysoké hladiny endogenních cytokininů byly detekovány pro BA, BAR, ip a ipr na všech typech IM ve všech variantách (kultivace: 2 hod., 5 a 7 dní). Po 2 hodinách kultivace segmentů byly kromě těchto CK stanoveny i nízké hladiny mt na médiu obsahujícím BA7G dále Z a DHZ na médiu obsahujícím BA. U segmentů kultivovaných 5 dnů byly stanoveny velmi nízké koncentraci i pro Z a DHZ kultivovaných na médiu s BA a pro ZR, který byl kultivován na médiu s BAR5 MP. Segmenty kultivované 20 dnů vykazovaly nízkou hladinu pouze pro Z na médiu s BA7G. Endogenní hladina BA se v průběhu kultivace nějak výrazně neměnila. Nejvyšší obsah BA v segmentech byl detekován u explantátů kultivovaných po dobu 5 dnů na médiu s BA a u kultivovaných po dobu 20 dnů na médiu s BA7G. Nejvyšší hladina BAR byla stanovena u kultivace po 2 hodinách na médiu s BA7G a u explantátů kultivovaných po dobu 5 dnů, kdy vysoká koncentrace byla stanovena na médiích s BA a BAR5 MP, kdy hodnoty dosahovaly 7 ng/g čerstvé hmoty. Nejvyšší hladina ipr byla sledována u expantátů kultivovaných po dobu 20 dnů na médiu s BAR5 MP, zatímco hladina byla ip nejvyšší u explantátů kultivovaných po dobu 5 dnů. Mikroskopické studie prokázaly, že u kultivace explantátů na IM s BA docházelo ke tvorbě organizovaných meristémů a primordií listů. Přítomnost meristematických center byla prokázána i v případě kultivace explantátů na IM s BAR a BAR5 MP. Pouze v případě kultivace explantátů na médiu s BA7G byly nalezeny vakuolizované buňky a také prozenchymatické buňky, nikoli však meristematické. 61

75 7. POUŽITÁ LITERATURA AKIYOSHI D.E., KLEE H., AMASINO R.M., NESTER E.W., GORDON M.P. (1984): T-DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: ALESSI F., QUARTA S., SAVIO M., RIVA F., ROSSI L., STIVALA L.A., SCOVASSI A.I., MEIJER L., PROSPERI E. (1998): The cyclin-dependent kinase inhibitors olomoucine and roscovitine arrest human fibroblasts in G1 phase by specific inhibition of Cdk2 kinase activity. Exp. Cell Research 245: AMASINO R.M. (2005): 1955: kinetin arrives. The 50th anniversary of a new plant hormone. Plant Physiol. 138: ARMSTRONG D.J. (1994): Cytokinin oxidase and regulation of cytokinin degradation. MOK D.W.S., MOK M.C.: Cytokinins-Chemistry, activity,and function. Boca Raton, FL: CRC Press: AUER C., MOTYKA V., BŘEZINOVÁ A. a KAMÍNEK M. (1999): Endogenous cytokinin accumulation and cytokinin oxidase aktivity during shoot organogenesis of Petunia hybrida. Physiol. Plant. 105: AUEROVÁ C. A. (1990): The role of benzyladenine in shoot organogenesis of petunia leaf explants. Ph.D thesis, University of Maryland. BASSIL N.V., MOK D., MOK M.C. (1993): Partial purification of a cis-transisomerase of zeatin from immature seed of Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol. 102: BENJAMINS R., MALENICA L., LUSCHING CH. (2005): Regulating the regulator: the control of auxin transport. Bioassays 27: BENJAMINS R., QUINT A., WEIJERS D., HOOYKAAS P., OFFRINGA R. (2001): The PINOID protein kinase regulates organ development in Arabidopsis by enhancing polar auxin transport. Development 128: BENKOVÁ E., MICHNIEWICZ M., SAUER M., TEICHMANN T., SEIFERTOVÁ D., JÜRGENS G., FRIML J. (2003): Local efflux-dependent auxin gradient as a common module for plant organ formation. Cell 115:

76 BENNETT S.R.M., ALVAREZ J., BOSSINGER G., SMYTH D.R. (1995): Morphogenesis in PINOID mutants of Arabidopsis thaliana. Plant J. 8: BERKLE L., CEDZICH A., DOPKE C., STRANSKY H., OKUMOTO S. (2003): Transport of cytokinins mediated by purine transporters of the PUP family expressed in phloem, hydathodes, and pollen of Arabidopsis. Plant J. 34: BERLETH T. a SACHS T. (2001): Plant morphogenesis: long-distance coordination and local patterning. Curr. Opin. Plant Biol. 4: BIELESKI R.L. (1964): Problem of halting enzyme action when extracting plant tissues. Anal. Biochem. 9: BILYEU K.D., COLE J.L., LASKEY J.G., RIEKHOF W.R., ESPARZA TJ. (2001): Molecular and biochemical characterization of a cytokinin oxidase from Zea mays.plant Physiol. 125: BLILOU I., FRUGIER F., FOLMER S., SERRABLO O., WILLEMSEN V., WOLKENFELT H., ELOY N.B., FERREIRA P.C., WEISBEEK P., SCHERES B. (2002): The Arabidopsis HOBBIT gene encodes a CDC27 homolog that links the plant cell cycle to progression of cell differentiaton. Genes Dev. 16: BLILOU I., XU J., WILDWATER M., WILLEMSEN W., PAPONOV I., FRIML J., HEIDSTRA R., AIDA M., PALME K., SCHERES B. (2005): The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature 433: BROWNLEE B.G., HALL R.H., WHITTY C.D. (1975): 3-methyl-2-butenal: an enzymatic degradation product of the cytokinin N 6 -( 2 -isopentenyl)adenin. Can. J. Biochem. 53: BRZOBOHATÝ B., MOORE I., KRISTOFFERSEN P., BAKO L., CAMPOS N., SCHELL J. a PALMET K. (1993): Release of active cytokinin by a β-glucosidase localized to the maize root meristem. Science 262: BURCH L.R. a HORGAN R. (1989): The purification of cytokinin oxidase from Zea mays kemels. Phytochemistry 28: BURCH L.R. a HORGAN R. (1992): Cytokinin oxidase and the degradative metabolism of cytokinins. In Physiology and Biochemistry of cytokinin in 63

77 plants, KAMÍNEK M., MOK D.W.S., ZAŽÍMALOVÁ E., SPB Academic Publishing, The Hague, The Netherlads BÜRKLE L., CEDZICH A., DÖPKE C., STRÁNSKÝ H., OKUMOTO S.,GILLISSEN B., KÜHN K., FROMMER W.B. (2003): Transport of cytokinins mediated by purine transporters of the PUP family expressed in phloem, hydathodes, and pollen of Arabidopsis. Plant J. 34, CLELAND R.E. a RAYLE D.L. (1978): Auxin, H + excretion and cell elongation. Bot. Mag. Tokyo (Special Issue) 1: COHEN J.D., BANDURSKI R.S. (1982): Chemistry and physiology of the bound auxin. Annu. Rev. Plant Physiol. 33: 403. COHEN J.D., SLOVIN J.P., HENDRICKSON A.M. (2003): Two genetically discrete pathways convert tryptophan to auxin: more redundancy in auxin biosynthesis. Trends in Plant Science. 8: CORBËSIER L., PRINSEN E., JACQMARD A., LEJEUNE P., VAN ONCKELEN H., PERILLEUX C., BERNIER G. (2003): Cytokinin levels in leaves, leaf exudate and shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana during floral transition. J. Exp. Bot. 54: DALESSAN G. a ROBERTS L.W. (1973): Induction of xylogenesis in pith parenchyma explants of lactuca. Am. J. Bot. 58: DARWIN C. (1880): The power of movement in plants. London: John Murray. De CLERCQ E.(1998): New perspectives for the treatment of HIV infections.collect. Czech. Chem. Commun. 63: 449. Del POZO J.C., LOPEZ-MATAS M.A., RAMIREZ-PARA E., GUTIERREZ C. (2005): Hormonal control of the plant cell cycle. Physiol. Plant. 123: DEWITTE W., MURRAY J.A.H. (2003): The plant cell cycle. Annu. Rev. Plant Biol. 54: DHARMASIRI N., DHARMASIRI S., ESTELLE M. (2005): The F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature 26: DHARMASIRI S., SWARUP R., MOCKAITIS K., DHARMASIRI N., SINGH S.K., KOWALCHYK M., MARCHANT A., MILLS S., SANDBERG G., BENNETT J., ESTELLE M. (2006): AXR4 is required for localization of the auxin influx facilitator AUX1. Science 312:

78 DOBREV P., MOTYKA V., GAUDINOVÁ A., MALBECK J., TRÁVNÍČKOVÁ A, KAMÍNEK M., VAŇKOVÁ R. (2002): Transient accumulation of cis- and trans-zeatin type cytokinins and its relation to cytokinin oxidase activity during cell cycle of synchronized tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. Biochem. 40: DOLEŽAL K., HANUŠ J., STRNAD M., HANKE D.E. (1995): The effect of light on metabolism of topolins. Biologia 51: 92. DUNSTAN D.I., TURNER K.E., LAZAROFF W.R. (1985): Propagation in vitro of the apple rootstock M4: effect of phytohormones on shoot quality. Plant Cell Tiss. Org. Cull. 4: ENTSCH B. a LETHAM D.S. (1979): Enzymatic glycosylation of the cytokinin, 6- benzylaminopurine, Plant Sci. Lett. 14: ERNST D., SCHÄFER W., OESTERHELT D. (1983): Isolation of a new naturely occuring cytokinin 6-benzylaminopurin riboside from an anise cell culture Pimpinella visum L. Planta 195: FAHEY J.W., ZALCMANN A.T., TALALAY P. (2001): The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocynanates among plants. Phytochemistry 56: FAISS M., ZALUBILOVÁ J., STRNAD M., SCHMÜLLING T. (1997): Conditional transgenic expression of the itp gene indicates a function for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants. Plant J. 12: FLEMING A. J. (2006): Plant signalling: the inexorable rise of auxin. Trends Cell Biol. 16: FOX J.E., CORNETTE J., DELEUZE G., DYSON W., GIERSAK C., NIU P., ZAPATA J. McCHESNEY J. (1973): The formation, isolation, and biological activity of a cytokinin-7-glucosid. Plant Physiol. 52: FRÉBORT I., GALUSZKA P., ŠEBELA M., PEČ P. (1999): Cytokinin oxidase (or cytokinin dehydrogenase?) from wheat: purification, characterization and evidence for dehydrogenation mechanism of the enzyme reaction. Biol Plant. 42: 119. FRIML J. a PALME K. (2002): Polar auxin transport - old questions and new concepts? Plant Mol. Biol. 49:

79 GALUSZKA P., FRÉBORT I., ŠEBELA M., PAČES P. (2000): Degradation of cytokinins by cytokinin oxidases in plants. Plant Growth Reg. 32: GALUSZKA P., FRÉBORT I., ŠEBELA M., SAUER P., JACOBSEN S., PEČ P. (2001): Cytokinin oxidase or dehydrogenase? Mechanism of cytokinin degradation in cereals. Eur. J. Biochem GALUZSKA P., FRÉBORTOVÁ J., WERNER T., YAMADA M., STRNAD M., SCHMÜLLING T., FRÉBORT I. (2004): Cytokinin oxidase/dehydrogenase genes in barley and beat. Cloning and heterologous expression. Eur. J. Biochem. 271: GÄLWEILER L., GUAN CH., MŰLLER A., WISMAN E., MENDGEN K., YPHREMOV A., PALME K. (1998): Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: GAMBORG, O. L., MILLER, R. A., OJIMA, K. (1968): Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: GAN S. a AMASINO R.M. (1995): Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270: GAUDINOVÁ A., DOBREV P.I., ŠOLCOVÁ B., NOVÁK O., STRNAD M., FRIDECKÝ D., MOTYKA V. (2005): The involvement of cytokinin oxidase/dehydrogenase and zeatin reductase in regulation of cytokinin levels in pea (Pisum sativum L.) leaves. J. Plant Growth Regul. 24: GAUTHERET R.J. (1946): Plant tissue culture. Growth 10: GILBERT M.L. THOMPSON J.E., DUMBROFF B.E. (1980): Delayed kotyledon senescence following treatment with a cytokinin: an effect at the level of membranes. Can. J. Bot. 58: GILLAPSY G.H., BEN-DAVID H., GRUISSEM W. (1993): Friuts: a developmental perspective. Plant Cell 5: GRAY W.M., KEPINSKI S., ROUSE D., LEYSER O., ESTELLE M. (2001): Auxin regulates SCFTIR1-dependent degradation of Aux/IAA proteins. Nature 414: GREFEN C. a HARTER K. (2004): Plant two-component systems: principles, functions, complexity and cross talk. Planta 219: HAGE D.S. (1999): Affinity chromatography: A review of clinical applications. Clin. Chem. 45:

80 HAJDÚCH M., KOLÁŘ Z., NOVOTNÝ R., HANUŠ J., MIHÁL V., HLOBÍLKOVÁ A., NOSKOVÁ V., STRNAD M. (1997): Induction of apoptosis and regression of spontaneous dog melanoma following in vivo application of synthetic cyclin dependent kinase inhibitor olomoucine. Anti-Cancer Drugs 8: HÁLA M., COLE R., SYNEK L., DRDOVÁ E., PEČENKOVÁ T., NORDHEIM A., LAMKEMEYER T., MADLUNG J., HOCHHOLDINGER F., FOWLER J.E., ŽÁRSKÝ V. (2008): An exocyst complex functions in plant cell growth in Arabidopsis and tobacco. Plant Cell.20: HARE P.D. a VAN STADEN J. (1994): Cytokinin oxidase: Biochemical features and physiological significance. Physiol. Plant. 91: HARTWELL L.H., HOPFIELD J.J., LEIBLER S., MURRAY A.W. (1999): From molecular to modular cell biology. Nature Suppl. 402: HAVLOVÁ M., DOBREV P., MOTYKA V., ŠTORCHOVÁ H., LIBUS J., DOBRÁ J., MALBECK J., GAUDINOVÁ A., VAŇKOVÁ R. (2008): The role of cytokinins in responses to water deficit in tobacco plants over-expressing trans-zeatin O-glucosyltransferase gene under 35S or SAG12 promoters. Plant Cell Environ. 31: HECHT S., EISENREICH W., ADAM P., AMSLINGER S., KIS K., BACHER A., ARIGONI D., ROHDICH F. (2001): Studies on the nonmevalonate pathway to terpenes: The role of the GcpE (IspG) protein. Proc. Natl. Acad. Sci. (26): HEJÁTKO J., PERNISOVÁ M., ENEVA T., PALME K., BRZOBOHATÝ B. (2003): The putative sensor histidine kinase CKI1 is involved in female gametophyte development in Arabidopsis. Mol. Gen. Genomics 269: HEYL A. a SCHMŰLLING T. (2003): Cytokinin signal perception and transduction. Curr. Opin. Plant. Biol. 6: HIGUCHI M., PISCHKE M.S., MAHONEN A.P., MIYAWAKI K., HASHIMOTO Y., SEKI M., KOBAYASHI M., SHINOZAKI K., KATO T.,TABATA S., HELARIUTTA Y., SUSSMAN M.R., KAKIMOTO T. (2004): Planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 269:

81 HIROSE N., MAKITA N., YAMAYA T., SAKAKIBARA H. (2005): Functional characterization and expression analysis of a gene, OsENT2, encoding an equilibrative nucleoside transporter in rice suggest a function in cytokinin transport. Plant Physiol. 138: HIROSE, N., TAKEI, K., KUROHA, T., KAMADA-NOBUSADA, T., HAYASHI, H., SAKAKIBARA, H. (2007): Regulation of cytokinin biosynthesis, compartmentalization and translocation. J. Exp. Bot. 59: HOLUB J., HANUŠ J., HANKE D., E., STRNAD M. (1998): Biological activity of cytokinins derived from ortho- and meta-hydroxybenzyladenine. Plant Growth Regul. 26: HOLÝ A., GUNTER J., DVOŘÁKOVÁ H., MASOJÍDKOVÁ M., ANDREI G., SNOECK R., BALZARINI J., De CLERCQ E. (1999): Structure-antiviral activity relationship in the series of pyrimidine and purine N-[2-(2- phosphonomethoxy)ethyl] nucleotide analogues. 1. Derivatives substituted at the carbon atoms of the base. J. Med. Chem. 42: HORÁK J., BRZOBOHATÝ B., LEXA M. (2003): Molecular and physiological characterization of an insertion mutant in the ARR21 putative response regulator gene from Arabidopsis thaliana. Plant Biol. 5: HORGAN R. (1992): Present and future prospect for cytokinin research. In: KAMÍNEK, M., MOK, D.W.S., ZAŽÍMALOVÁ, E. (ed.): Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants. SPB Acad. Publishing, The Hague, HORGAN R., HEWETT E.W., HORGAN J.M., PURSE J.G., WAREING P.F. (1975): A new cytokinin from Populus x Robusta. Phytochemistry. 14: HORGAN R., HEWETT E.W., PURSE J.G., WAREING P.F. (1973): A new cytokinin from Populus robusta. Tetrahedron Lett. 14: HOU B., LIM E.K., HIGGINS G.S., BOWLES D.J. (2004): N-Glukosylation of cytokinins by glycosyltransferases of Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 279: HOUBA-HERIN N., PETHE C., D ALAYER J. a LALOUE M. (1999): Cytokinin oxidase from Zea mays: purification, cdna cloning and expression in moss protoplasts. Plant J. 17: HWANG I. a SAKAKIBARA H. (2006): Cytokinin biosynthesis and perception, Physiol. Plant. 126:

82 IINO M. a BRIGGS W.R. (1984): Growth distribution during first positive phototropic curvature of maize coleoptils. Plant Cell Envirom. 7: INOUE T., HIGUCHI M., HASHIMOTO Y., SEKI M., KOBAYASHI M., TABATA S., SHINOZAKI K., KAKIMOTO T. (2001): Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. Nature 409: JOHN M.C. a AMASINO R.M. (1988): Expression of an Agrobacterium Ti plasmid gene involved in cytokinin biosynthesis is regulated by virulence loci and induced by plant phenlic compounds. J. Bacteriol. 170: JONES R.J. a SCHREIBER B.M.N. (1997): Role and function of cytokinin oxidase in plants. Plant Growth Regul. 23: KAKIMOTO T. (1996): CKI1 in histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. Science 214: KAKIMOTO T. (2001): Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate:atp/adp isopentenyltransferases. Plant Cell Physiol. 42: KAMÍNEK M. (1992): Progress in cytokinin research. Trends Biotechnol. 10: KAMÍNEK M. a ARMSTRONG D.J. (1990): Genotypic variation in cytokinin oxidase from Phaseolus callus cultures. Plant Physiol.93: KAMÍNEK M., MOTYKA V., VAŇKOVÁ R. (1997): Regulation of cytokinin content in plant cells. Physiol. Plant.101: KAMÍNEK M., VANĚK T. a MOTYKA V. (1987): Cytokinins activities of N6-benzyladenosin derivates hydroxylated on the side-chaine phenyl ring. J. Planth Growt Regul. 6: KASAHARA H., TAKEI K., UEDA N., HISHIYAMA S., YAMAYA T., KAMIYA Y., YAMAGUCHI S., SAKAKIBARA H. (2004): Distinct isoprenoid origins of cis- and trans-zeatin biosynthesis in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 279: KATEKAR G. F. a GEISSLER A. E. (1980): Auxin transport inhibitors. Evidence of a common-mode of action for a propossed class of auxin transport inhibitors the phytotropins. Plant Physiology 66: KEVERS C., MOTYKA V., KAMÍNEK M., GASPAR T. (1997): Cytokinin content and its relation to cytokinin oxidase activity in normal and habituated sugar beet tissues. Arch. Physiol. Biochem. 105:

83 KHODAKOVSKAYA M., YI LI, LI J., VAŇKOVÁ R., MALBECK J., McAVOY R. (2005): Effects of cor15a-ipt gene expression on leaf senescence in transgenic Petunia hybrida and Dendranthema grandiflorum. J. Exp. Bot. 56: KITAGAWA M., OKABA T., OGINO H., MATSUMOTO H., SUZUKI- TAKAHASHI I., KOKUBO T., KIHASHI H., SAITOH S., TAYA Y., YASUDA H., OHBA Y., NISHIMURA S., TANAKA N., OKUYAMA A. (1993): Butyrolactone I, selective inhibibtor of Cdk2 and Cdc2 kinase. Oncogene 8: KLEINE-VEHN J., DHONUKSHE P., SWARUP R., BENNETT M., FRIML J. (2006): Subcellular trafficking of the Arabidopsis auxin influx carrier AUX1 uses a novel pathway distinct from PIN1. Plant Cell 18: KLEMŠ M., BALLA J., MACHÁČKOVÁ I., EDER J., PROCHÁZKA S. (2000). The uptake and metabolism of 3 H-benzylaminopurine in tobacco (Nicotiana tabacum L.) and cucumber (Cucumis sativum L.) explants. Plant. Growth Regul. 31: KOPEČNÝ D., PETHE C., ŠEBELA M., HOUBA-HERIN N., MADZAK C., MAJIRA A., LALOUE M. (2005): High-level expression and characterization of Zea mays cytokinin oxidase/dehydrogenase in Yarrowia lipolytica. Biochimie 87: KURAKAWA T., UEDA N., MAEKAWA M., KOBAYASHI K., KOJIMA M., NAGATO Y., SAKAKIBARA H., KYOZUKA J. (2007): Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme. Nature 445: LALOUE, M. and PETHE, C. (1982): Dynamics of cytokinin metabolismin tobacco cells. In: Plant Growth Substances WAREING, P.F. (ed), Academic Press, London. LEOPOLD A.C. a KAWASE M. (1964): Benzyladenine effect on leaf growth and senscence. Am. J. Bot. 51: LETHAM D. S. a ZHANG R. (1989): Cytokinin translocation and metabolism in lupulin species II. New nucleotid metabolites of cytokinin. Plant Sci. 64:

84 LETHAM D. S., PALNI L. M. S., TAO G-Q., GOLLNOW B. I., BATES C. M. (1983): Regulators of cell division in plant tissues XXIX. The activities of cytokinin glucosides and alanine conjugates in cytokinin bioassays. J. Plant Growth Regul. 2: LETHAM D.S. (1963): Regulators of cell division in plant tissue. 1.Inhibitors and stimulans of cell division in developing fruits: their properties and activity in relation to the cell division period. N.Z. J. Bot. 1 : LETHAM D.S. a PALINI L.M.S. (1983): The biosynthesis and metabolism of cytokinins. Annu. Rev. Plant. Physiol. 34: LETHAM D.S., PALINI L.M.S., TAO G-Q., GOLLNOW B.I., BATES C.M. (1983): Regulators of cell division in plant tissue XXIX. The activities of cytokinin glucosides and alanine conjugates in cytokinin bioassays. J. Plant Growth Regul. 2: LETHAM D.S., TAO G.Q., PARKER C.W. (1982): An overview of cytokinin metabolism. In: WAREING, P.F. (ed.): Plant Growth Substances. Academic Press, New York, LISCUM E. a REED J.W. 2002: Genetics of Aux/IAA and ARF action in plant growth and development. Plant Mol. Biol. 49: LJUNG K., BHALERAO R.P., SANDBERG G. (2001): Sites and homeostatic control of auxin biosynthesis in Arabidopsis during vegetative growth. Plant J. 28: MÄHÖNEN A.P., BONKE M., KAUPPINEN L., RIIKONEN M., BENFEY P.N., HELARIUTTA Y. (2000): A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis roots. Genes Dev. 14: MACHÁČKOVÁ I. (1998): Růst a vývoj: Růstové regulátory. In PROCHÁZKA S., MACHÁČKOVÁ I., KREKULE J., ŠEBÁNEK J., a kol., Fyziiologie rostlin. Academia Praha , MALLER J.L., GAUTIER J., LANGAN T.A., LOHKA M.J., SHENOY S., SHALLOWAY D., NURSE P. (1989): Maturation-promoting factor and the regulation of the cell cycle. J. Cell. Sci. (Suppl.) 12: MASSONNEAU A., HOUBA-HERIN N., PETHE C., MADZAK C., FALQUE M., MERCY M., KOPEČNÝ D., MAJIRA A., LALOUE M. (2004): Maize 71

85 cytokinin oxidase genes: differential expression and cloning of two new cdnas. J. Exp. Bot. 55: McDONALD E.M.S., AKIYOSHI D.E., MORRIS R.O. (1981): Combined highperformance liquid chromatography-radioimmunoassay for cytokinins. J. Chromatogr. 214: McGAW B.A., BURCH L.R. (1995): Cytokinin biosynthesis and metabolism. In PJ Davies, ed, Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Kluwer Academic Press: McGAW B.A., SCOTT I. M. a HORGAN R. (1984): The biosynthesis and metabolism of plant hormones. Cambridge, Cambridge University Press pp.: McINTIRE W.S., a HARTMANN C. (1992): Copper-containing amine oxidases. In: DAVIDSON V.L. (ed.), Principles and applications of quinoproteins. Marcel Dekker, New York, USA.: McPHEETERS K. a SKIRVIN R.M. (1983): Histogenic layer manipulation in chimeral thornless evergreen trailing blackberry. Euphytica 32: MILLER C.O., SKOOG F., SALTZA V.N.H., STRONG M. (1955): Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc. 77: MIYAWAKI K., MATSUMOTO-KITANO M., KAKIMOTO T. (2004): Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. Plant J. 37: MIYAWAKI K., TARKOWSKI P., MATSUMOTO-KITANO M., KATO T., SATO S., TARKOWSKA D., TABATA S., SANDBERG G., KAKIMOTO T. (2006): Roles of Arabidopsis ATP/ADP isopentenyltransferases and trna isopentenyltransferases in cytokinin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: MOFFAT B.A, SOMERVILLE C.R. (1988): Positive selection for male sterile mutants of Arabidopsis lacking adenine phosphoribosyltransferase activity. Plant Physiol. 86: MOK D.W. a MOK M.C. (2001): Cytokinin metabolism and action. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52:

86 MOK M.C. (1994): Cytokinins and plant development-an overview. Mok D.W.S., Mok M.C.: Cytokinins chemistry, activity and function. Boca Raton, FL: CRC Press MONREO-AUGUSTUS M., ZOLMAN B.K., BARTEL B. (2003): IBR5, a dualspecificity phosphatase-like protein modulating auxin and abscisic acid responsiveness in Arabidopsis. The Plant Cell 15: MORRIS R.O., BILYEU K.D., LASKEY J.G., CHEIKH N. (1999): Isolation of gene enconding a glycosylated cytokinin oxidase from maize. Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: MOTYKA V., FAISS M., STRNAD M., KAMÍNEK M., SCHMÜLLING T. (1996): Changes in cytokinin content and cytokininoxidase activity in response to derepression of ipt gene transcription in transgenic tobacco calli nad plants. Plant Physiol. 112: MUELLER P.R., COLEMAN T.R., KUMAGAI A., DUNPHY W.G. (1995): Myt1: a membrane-associated inhibitory kinase that phosphoryletes Cdc2 on both threonine-14 and tyrosine-15. Science 260: MURASHIGE T. a SKOOG F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: NOMURA T. a TANAKA Y. (1977): Cytokinin activity of discadenine: a spore germination inhibitor of Dictyostelium discoideum. Phytochemistry 16: NORDSTRÖM A., TARKOWSKI P., NORBEAK R., ǺSTOT C. (2004): Auxin regulation of cytokinin biosynthesis in Arabidopsis thaliana: A factor of potential importance for auxin-cytokinin-regulated development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: NURSE P., MORENO S. a RUSSELL P. (1990): regulation of mitosis by cyclic accumulation of p80 cdc25 mitotic inducer in fission feast. Nature 344: PACÁKOVÁ V., ŠTULÍK K., VLASÁKOVÁ V., BŘEZINOVÁ A. (1997): Capillary electrophoresis of cytokinins and cytokinin ribosides. J. Chromatogr. A 764: PAČES V., WERSTIUK E., HALL R.H. (1971): Conversion of N6- isopentenyladenosine to adenosine by enzyme activity in tobacco tissue. Plant Physiol. 48:

87 PALMER M.V., HORGAN R., WAREING P.F. (1981): Cytokinin metabolism in Phaseolus vulgarit L. I. Variations in cytokinin levels in leaves of decapitated plants in relation to lateral bud outgrowth. J. Exp. Bot. 32: PALNI L. M. S.M., PALMER V., LETHAM D. S. (1990): The biological activity of cytokinin derivatives in the soybean callus bioassay. Plant Growth Regul. 10 : PAPONOV A. I., PAPONOV M., TEALE W., MENGES M., CHAKRABORTEE S., MURRAY A.H., PALME K. (2008): Comprehensive transcriptome analysis of auxin responses in Arabidopsis. Mol. Plant 1(2): PARKER a LATHAM D.S. (1973): Regulators of cell division in plant tissues. Planta 114: PERNISOVÁ M., KLÍMA P., HORÁK J., VÁLKOVÁ M., MALBECK J., SOUČEK P., REICHMAN P., HOYEROVÁ K., DUBOVÁ J., FRIML J.,ZAŽÍMALOVÁ E., HEJÁTKO J. (2008): Cytokinins modulate auxin induced organogenesis in plants via regulation of the auxin efflux. Proc. Natl.Acad. Sci. 106: PETRÁŠEK J., MRAVEC J., BOUCHARD R., BLAKESLEE J.J., ABAS M., SEIFERTOVÁ D., WIŚNIEWSKA J., TADELE Z., KUBEŠ M.,ČOVANOVÁ M., DHONUKSHE P., SKŮPA P., BENKOVÁ E., PERRY L., KŘEČEK P., LEE O.R., FINK G.R., GEISLER M., MURPHY A.S.,LUSCHNIG C., ZAŽÍMALOVÁ E., FRIML J. (2006): PIN proteins perform a rate-limiting function in cellular auxin efflux. Science 312: POPELKOVÁ H., GALUZSKA P., FRÉBORTOVÁ J., BILYEU K.D., FRÉBORT I. (2004): Cytokinin dehydrogenace: characterizatiion and structure homology modeling of the flavoprotein catabolizingplant hormones cytokinin. In Recent researcg Development in Proteins, Pandalai SG 2: PRICE C.P. a NEWMANN D.J. (1997): Principles and practice of immunoassay. Stockton Press RAMPEY R.A., LECLERE S., KOWALCZYK M., LJUNG K., SANDBERG G., BARTEL B. (2004): A family of auxin-conjugate hydrolases that contributes to free indole-3-acetic acid levels during Arabidopsis germination. Plant Physiol. 135:

88 REINERT J. a BACKS D. (1968): Control of totipotency in plant cells growing in vitro. Nature 220: REINHARDT D., MANDEL T., KUHLEMEIER C. (2000): Auxin regulates the initiation and radial position of plant lateral organs. Plant Cell 12: RIBNICKY D.M., COHEN J.D., HU W.S., COOKE T.J. (2002): An auxin surge following fertilization in carrots: a mechanism for regulating plant totipotency. Planta 214: RODÓ A.P., BRUGIÈRE N., VAŇKOVÁ R., MALBECKJ., OLSONJ.M., HAINES S.C., MARTIN R.C., HABBEN J.E., MOK D.W.S., MOK M.C. (2008): Overexpression of a zeatin O-glucosylation gene in maize leads to growth retardation and tasselseed formation. J. Exp. Bot.: 59: RUBERY P. H. a SHELDRAKE (1974): Carrier-mediated auxin transport. Planta 118: RUSHING J.W. (1990): Cytokinins affect respiration, ethylene production, and chlorophyll retention of package broccoli florets. Hort. Sci. 25: SACHS T., THIMANN K.V. (1964): Release of lateral buds from apical dominance. Planta 201: SAKAI S., AYOAMA T., OKA A. (2000): Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate aas transcriptional activators.plant J. 24: SAKAKIBARA H. (2004): Cytokinin biosynthesis and metabolism. In: DAVIES, P.J. (Ed.),Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action. Springer, Dordrecht: SAKAKIBARA H. a KYOZUKA J. (2007): Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme. Nature 445: SAKAKIBARA H., KASAHARA H., UEDA N., KOJIMA M., TAKEI K., HISHIYAMA S., ASAMI T., OKADA K., KAMIYA Y.,YAMAYA T., YAMAGUCHI S. (2005): Agrobacterium tumefaciens increases cytokinin production in plastids by modifying the biosynthetic pathway in the host plant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: SAKAMOTO T., SAKAKIBARA H., KOJIMA M., YAMAMOTO Y., NAGASAKI H., INUKAI Y., SATO Y., MATSUOKA M. (2006): Ectopic expression of KNOTTED1-like homeobox protein induces expression of cytokinin biosynthesis genes in rice. Plant Physiol. 142:

89 SEO M., AKABA S., ORITANI T., DELARUE M., BELLINI C., CABOCHE M., KOSHIBA T. (1998): Higher activity of an aldehyde oxidase in the auxinoverproducing superroot1 mutant of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116: SHAW G. (1994): Chemistry of adenin cytokinins. CRC Press 35: 42. SHAW G. a WILSON D.V. (1964): A synthesis of zeatin. Proc. Chem. Soc.: 231 SHAW G., SMALLWOOD B.M. a WILLSON D.V. (1966): Purines, Pyrimidines and imidazoles, XXIV. Synthese of zeatin, a naturally occuring edenine derivate with plant cell promoting activity and its 9-β-D ribofuranoside. J. Chem. Soc.(C): SHEEN J. (2002): Phosphorelay and transcription control in cytokinin signal transduction. Science 296: SHORT K.C. a TORREY J.G. (1972): Cytokinin production in relation to growth of pea-root callus tissue. J. Exp. Bot. 23: SCHMÜLLING T., WERNER T., RIEFLERM., KRUPKOVÁ E., BARTRINA Y. MANNS I. (2003): Structure and function of cytokinin oxidase/dehydrogenase genes of maize, rice, Arabidopsis and other species. J. Plant Res. 116: SCHNORR K.M., GAILLARD C., BIGET E., NYGAARD P., LALOUE M. (1996): A second form of adenosin phosphoribosyltransferase in Arabidopsis thaliana with relative specifity towards cytokinin. Plant J. 9: SCHUTTE B., NIELAND L., VAN ENGELAND M., HENFLING M.E.R., MEIJER L., RAMAEKERS F.C.S. (1997): The effect of the cyclin-dependent kinase inhibitor olomoucine on cell cycle kinetics. Exp. Cell Res. 236: SINGH S., LETHAM D.S., JAMESON P.E., ZHANG R., PARKER C.W. (1988): Cytokinin biochemistry in relation to leaf senescence. IV. Cytokinin metabolism in soybean explants. Plant Physiol. 88: SKOOG F. (1973): A survey of cytokinins and cytokinin antagonist with reference to nucleotic acid and protein metabolism. Biochem. Soc. Symp. 38: SKOOG F. a MILLER C.O. (1957): Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultures in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11:

90 SKOOG F., HAMZI H., SZWEYKOWSKA A., LEONARD N., CARRAWAY K., FUJII T., HELEGSON J., LOEPPKY R.N. (1967): Cytokinins: structure/activity relationships. Phytochemistry 6: SMITH A.R. a VAN STADEN J. (1978): Changes in endogenous cytokinin levels in kernels of Zea mays L. during inhibition and germination. J. Exp. Bot. 29: SPÍCHAL L., RAKOVA N.Y., RIEFLER M., MIZUNO T., ROMANOV G.A., STRNAD M., SCHMÜLLING T. (2004): Two cytokininreceptors of Arabidopsis thaliana, CRE1/AHK4 and Td AHK3, differ in their ligand specificity in a bacterial assay. Plant Cell Physiol. 45: STOCK A.M., ROBINSON V.L., GOUDREAU P.N. (2000): Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69: STRNAD M. (1997): The aromatic cytokinins. Physiol. Plant. 101: STRNAD M., HANUŠ J., VANĚK T., KAMÍNEK M., BALLANTINE J., FUSSELL B., HANKE D.E. (1997): meta-topolin a highly active aromatic cytokinin from poplar leaves (Populus canadensis, cv. Robusta). Phytochemistry 45: STRNAD M., PETERS W., BECK E., KAMÍNEK M. (1992): Immunodetection and identification of N6-(o-hydroxybenzylamino)purine as naturally occurring cytokinin in Populus x canadensis cv. Robusta leaves. Plant Physiol. 99: SUGAWARA H., UEDA N., KOJIMA M., MAKITA N., YAMAYA T., SAKAKIBARA H. (2008): Structural insight into the reaction mechanism and evolution of cytokinin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: SUZUKI T., SAKURAI K., IMAMURA A., NAKAMURA A., UEGUCHI C., MIZUNO T. (2000): Compilation and characterization of histidine-containing phosphotransmitters implicated in His-to-Asp phosphorelay in plants: AHP signal transducers of Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: SWARUP R., KARGUL J., MARCHANT A., ZADIK E., RAHMAN A., MILLS R., YEMM A., MAY S., WILLIAMS L., MILLNER P., TSURUMI S., MOORE I., NAPIER R., KERR I.D., BENNETT M.J. (2004): Structure-function 77

91 analysis of the presumptive Arabidopsis auxin permease AUX1. Plant Cell 16: SWEERE U., EICHENBERG K., LOHRMANN J., MIRA RODADO V., BAURLE I., KUDLA J., NAGY F., SCHAFER E., HARTER K. (2001): Interaction of the response regulator ARR4 with phytochrome B in modulating red light signaling. Science 294: SZTEIN A.E., ILIC N., COHEN J.D., COOKE T.J. (2002): Indole-3-acetic acid biosynthesis in isolated axes from germinating bean seeds: the effect of wounding on the biosynthetic pathway. Plant Growth Regul SZWEYKOVSKA A., GWOZDZ E., SPYCHALA M. (1981): The cytokinin kontrol of protein synthesis in plant. In: Guern J. and Peaud-Lenoël D., Metabolism and molecular activities of cytokinin. Germany: TAKEI K., SAKAKIBARA H., SUGIYAMA T. (2001a): Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 276: TAKEI K., SAKAKIBARA H., TANIGUCHI M., SUGIYAMA T. (2001b): Nitrogendependent accumulation of cytokinins in root and the translocation to leaf: implication of cytokinin species that induces gene expression of maize response regulator. Plant Cell Physiol. 42: TAKEI K., TAKAHASHI T., SUGIYAMA T., YAMAYA T., SAKAKIBARA H. (2002): Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin. J. Exp. Bot. 53: TAKEI K., UEDA N., AOKI K., KUROMORI T., HIRAYAMA T., SHINOZAKI K., YAMAYA T., SAKAKIBARA H. (2004a): AtIPT3 is a key determinant of nitrate-dependent cytokinin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 45: TAKEI K., YAMAYA T., SAKAKIBARA H. (2004): Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. J. Biol. Chem. 279: TAM Y.Y., NORMANLY J. (1998): Determination of indole-3-pyruvic acid levels in Arabidopsis thaliana by gas chromatography-selected ion monitoring-mass spectrometry. J. Chromatography A 800:

92 TANAKA Y., SUZUKI T., YAMASHINO T., MIZUNO T. (2004): Comparative studies of the AHP histidine-containing phosphotransmitters implicated in Histo-Asp phosphorelay in Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68: TARKOWSKÁ D., DOLEŽAL K., TARKOWSKI P., ǺSTO C., HOLUB J., FUKSOVÁ K., SCHMÜLLING T., SANDBERG G., STRNAD M. (2003): Identification of new aromatic cytokinins in Arabidopsis thaliana and Populus canadensis leaves by LC-(+)ESI-MS and capillary liquid chromatography/fritfast atom bombardment mass spectrometry. Physiol. Plant. 117: TAYA Y., TANAKA Y., NISHIMURA S. (1978): 5'-AMP is a direct precursor of cytokinin in Dictyostelium discoideum. Nature 271: TO J.P., HABERER G., FERREIRA F.J., DERUERE J., MASON M.G., SCHILLER G.E., ALONSO J.M., ECKER J.R., KIEBER J.J. (2004): Type-A Arabidopsis response regulators are partially redundant negative regulators of cytokinin signaling. Plant Cell 16: TRČKOVÁ M., KAMÍNEK a ZMRHAL Z. (1992): Physiology and biochemistry of cytokinins in Plants. The Hague, The Netherland. SPB Academic Publishing: TREWAVAS A.J. (1982): Growth substance sensitivity - the limiting factor in plant development. Physiol. Plant. 50: TREWAVAS A.J. a MALHO R. (1997): Signal perception and transduction: The origin of the phenotype. Plant Cell. 9: URAO T., YAKUBOV B., SATOH R., YAMAGUCHI-SHINOZAKI K., SEKI M., HIRAYAMA T., SHINOZAKI K. (1999): A transmembrane hybrid-type histidine kinase in Arabidopsis functions as an osmosensor. Plant Cell 11: VEACH Y.K., MARTIN R.C., MOK D.W., MALBECK J., VAŇKOVÁ R., MOK M.C. (2003): O-glucosylation of cis-zeatin in maize. Characterization of genes, enzymes, and endogenous cytokinins. Plant Physiol.131: VESELÝ J., HAVLÍČEK L., STRNAD M.., BLOW J.J., DONELLA-DEANA A., PINNA L., LETHAM D.S., KATO J., DETIVAUD L., LECLERC S., MEIJER L. (1994): Inhibition of cyclin-dependent kinasis by purin analogues. Eur. J. Biochem. 224:

93 VICENTE-AGULLO F., RIGAS S., DESBROSSES G., DOLAN N., HATZOPOULOS P., GRABOV A. (2004): Potassium carrier TRH1 is required for auxin transport in Arabidopsis roots. Plant Journal 40: VLASÁKOVÁ V., BŘEZINOVÁ A., HOLÍK J. (1998): Study of cytokinin metabolism using HPLC with radioisotope detection. J Pharmad Biomed Anal (17): VON SCHWARZENBERG C., KRUSE S., RESKI R., MOFFAT B., LALOUE M. (1998): Cloning and characterization of an adenosin kinase from Physcomitrella involved in cytokinin metabolism. Plant J. 13: WEIGEL D. a JŰRGENS G. (2002): Stem cells that make stems. Nature 415: WENT F. (1926): On growth accelerating substances in the coleoptile of Avena sativa. Proc. Con. Ned. Acad. Wet. 30: WENT F.W. a THIMANN K.V. (1937): Phytohormones, New York WERBROUCK S.P.O., STRNAD M., Van ONCKELEN H.A., DEBERGH P.C. (1996): Meta-topolin, an alternative to benzyladenine in tissue culture. Physiol. Plant. 98: WERNER T., MOTYKA V, STRNAD M., SCHMÜLLING T. (2001): Regulation of plant growth by cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: WHITTY C.D. a HALL R.H. (1974): A cytokinin oxidase in Zea mays. Can. J. Biochem.52: WOODWARD A. W. a BARTEL B. (2005): Auxin: Regulation, action, and interaction. Annals Bot. 95: WORMIT A., TRAUB M., FLÖRCHINGER M., NEUHAUS E., MÖHLMANN T. (2004): Characterization of free novel membres of the Arabidopsis thaliana equilibrative nucleoside transporter (ENT) family. Biochem. J. 383: YAMADA H., SUZUKI T., TERADA K., TAKEI K., ISHIKAWA K., MIWA K., YAMASHINO T., MIZUNO T. (2001): The Arabidopsis AHK4 histidine kinase is a cytokinin binding receptor that transduces cytokinin signals across the membrane. Plant Cell Physiol 42: YOUNG H. a LETHAM D.S. (1969): 6-(Substitued amino)purines: Synthesis by a new method and cytokininactivity. Phytochemistry 8: YOUNG S.W., JIN E., CHUNG I.K., KIM W.T. (2002): Cell cycle-dependent regulation of telomerase activity by auxin, abscisic acid and protein 80

94 phosphorylation in tobacco BY-2 suspension culture cells. Plant J. 29: ZAŽÍMALOVÁ E., KŘEČEK P., SKUPA P., HOYEROVÁ K., PETRÁŠEK J. (2007): Polar transport of the plant hormone auxin - the role of PINFORMED (PIN) proteins. Cell.Mol. Life Sci. 64: ZHANG H.B., HORGAN K.J., REYNOLDS P.H.S., JAMESON P.E. (2010): 6- Benzyladenine metabolism during reinvigoration of mature Pinus radiata buds in vitro. Tree Physiology. 30: ZHANG W., YUMANE H., TAKAHASHI N., CHAPMAN D. J., PHINNEY B.O. (1989): Identification of a cytokinin in the green alga Chara globularis. Phytochemistry 28: ZHAO Y., HULL A.K., GUPTA N.R., GOSS K.A., ALONSO J., ECKER J.R., NORMANLY J., CHORY J., CELENZA J.L. (2002): Trp-dependent auxin biosynthesis in Arabidopsis: involvement of cytochrome P450 CYP79B2 and CYP79B3. Genes Dev. 16: ZHAO Y., CHRISTENSEN S.K., FANKHAUSER C., CASHMAN J.R., COHEN J.D., WEIGEL D., CHORY J. (2001): A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis. Science 291: ZIMMERMAN P.W. a HITCHCOCK A.E. (1942): Substituted phenoxy and benzoic acid growth substances and the relation of structure to physiological activity. Contributions of the Boyce Thompson Institute 12. ZUBIETA C., ROSS J.R., KOSCHESKI P., YANG Y., PICHERSKY E., NOEL J.P. (2003): Structural basis for substrate recognition in the salicylic acid carboxyl methyltransferase family. The Plant Cell 15: ZUBKO E., ADAMS C.J., MACHAEKOVA I., MALBECK J., SCOLLAN C., MEYER P. (2002): Activation tagging identifies a gene from Petunia hybrida responsible for the production of active cytokinins in plants. Plant J. 29:

95 8. PŘÍLOHY A. Fotodokumentace B. Abstrakty 82

96 A. Fotodokumentace Snímek 1: Kultivace rostlin petúnie na šikmém MS médiu Snímek 2: Kultivace vzrostlých rostlin v in vitro podmínkách na GAMBORG médiu při laboratorních podmínkách 83

97 Snímek 3: Kultivace segmentů ze střední části čepelí listů na Petriho misce na IM médiu obohaceném o CK( BA, BAR, BAR5 MP a BA7G) Snímek 4: Regenerace na segmentech listů po 35 dnech kultivace na IM s BA s pasáží v pátém dni po založení Snímek 5: Regenerace na segmentech listů po 35 dnech kultivace na IM s BAR s pasáží 84 v pátém dni po založení

98 Snímek 6: Regenerace na segmentech listů po 35 dnech kultivace na IM s BAR5 MP s pasáží v pátém dni po založení Snímek 7: Regenerace na segmentech listů po 35 dnech kultivace na IM s BA7G s pasáží v pátém dni po založení. Tvorba kořenů na segmentech Snímek 8: Detailní snímek regenerace na segmentu listu petúnie 85