Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A

Transkript

1 Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení ochratoxinu A v krmivech. 1 Ochratoxin A patří mezi pentaketidy a je dominantní ve skupině ochratoxinů. Po chemické stránce se jedná o {N- [((3R)-5-chloro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-7- isochromanyl)carbonyl] -3-phenyl-L-alanine} (název podle IUPAC). 2 Princip Vzorek se extrahuje vodným roztokem acetonitrilu. Extrakt se přečistí na imunoafinitní kolonce. Ochratoxin A se stanoví pomocí HPLC na reverzní fázi s fluorescenční detekcí při excitační vlnové délce 333 nm a emisní vlnové délce 460 nm. 3 Chemikálie Používají se chemikálie analytické čistoty, pokud není uvedeno jinak. 1 Acetonitril, CH3C N, HPLC grade. 2 Methanol, CH3OH, min. 99,7 % v/v, HPLC grade. 3 Toluen, C6H5CH3. 4 Voda (deionizovaná, demineralizovaná nebo destilovaná). 5 Chlorid sodný, NaCl, min 99%. 6 Hydrogenfosforečnan disodný, Na2HPO4, min. 99 %. 7 Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2 PO4, min. 99 %. 8 Chlorid draselný, KCl, min. 99%. 9 Hydroxid sodný, NaOH, roztok c = 8 g/l. Příprava: 8 g hydroxidu sodného se rozpustí v 900 ml vody a doplní se do 1000 ml vodou.

2 Národní referenční laboratoř Strana 2 10 Solný fosfátový pufr (PBS). Příprava: 8 g chloridu sodného (5), 1,2 g hydrogenfosforečnanu disodného (6), 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného (7) a 0,2 g chloridu draselného (8) se rozpustí v 900 ml vody, ph se upraví roztokem hydroxidu sodného (9) na hodnotu ph 7,4 a pak se doplní do 1000 ml vodou. Lze použít komerčně dostupné tablety pro PBS (5 tablet/l000 ml). 11 Ledová kyselina octová, CH3COOH, min. 98% (v/v). 12 Mobilní fáze pro HPLC voda + acetonitril + ledová kyselina octová ( ), (v/v). Příprava: Smíchá se 1020 ml vody (4), 960 ml acetonitrilu (1) a 20 ml ledové kyseliny octové (11). 13 Extrakční směs acetonitril + voda, ( ), (v/v ). Příprava: Smíchá se 600 ml acetonitrilu (1) a 400 ml vody (4). 14 Směs rozpouštědel - toluen + ledová kyseliny octová, (99 + 1), (v/v). Příprava: Smíchá se 99 ml toluenu (3) a 1 ml ledové kyseliny octové (11). 15 Nástřikové rozpouštědlo - methanol + voda + ledová kyselina octová, ( ), (v/v). Příprava: Smíchá se 30 ml methanolu (2), 70 ml vody (4) a 1 ml ledové kyseliny octové (11). 16 Ochratoxin A, zásobní roztok standardu. Příprava: Ochratoxin A v krystalické podobě se rozpustí ve směsi rozpouštědel (14) tak, aby výsledný roztok obsahoval přibližně 20 µg/ml až 50 µg/ml. Roztok standardu se také dodává připravený v zatavených ampulích. 17 Kalibrační roztok standardu. Příprava: Část zásobního roztoku standardu se nechá odpařit pod proudem dusíku a rozpustí se v takovém objemu nástřikového rozpouštědla (15), aby výsledná koncentrace byla 20 ng/ml. Připravuje se vždy čerstvý. 18 Promývací roztok (např. Vicam). 19 Hydroxid sodný, NaOH, roztok, c = 40g/l. Příprava: Ve vodě (4) se rozpustí 40 g hydroxidu sodného a po vytemperování se doplní vodou do 1000 ml. 20 Desorpční roztok. Příprava: Smíchá se 98 ml methanolu (2) a 2 ml ledové kyseliny octové (11).

3 Národní referenční laboratoř Strana 3 4 Přístroje a pomůcky 1 Vysokoúčinný kapalinový chromatograf s fluorescenční detekcí. 2 Laboratorní třepačka horizontální. 3 Vakuový manifold. 4 Vakuová pumpa. 5 Plastové stříkačky a kohouty pro připojení imunoafinitních kolonek. 6 Koncentrátor vzorku. 7 Ultrazvuková lázeň. 8 Analytické váhy s přesností na 0,01 mg. 9 Imunoafinitní kolonky určené pro přečištění ochratoxinu A. Např. OchraPrep, firmy R- Bhiopharm, OchraTest, firmy Vicam. 10 Filtrační papír (např. Whatman 113V nebo filtrační papír (firmy Vicam k.č ) a filtry z mikrovlákna např. Vicam k.č ). 11 Laboratorní sklo. 5 Pracovní postup 5.1 Extrakce Do kónické baňky (250 ml nebo 500 ml) se naváží 25 g vzorku s přesností na 0,01 g, přidá se 2,5 g NaCl (5) a 100 ml extrakční směsi (13). Baňka se uzavře zátkou a vzorek se třepe na laboratorní třepačce po dobu 1 h. Poté se vloží do ultrazvukové lázně na dobu 10 min. Pak se extrakt přefiltruje do suché podložní nádoby, přičemž prvních 5 ml se nepoužije. 2 Před vlastní extrakcí se vzorek upraví homogenizací a mletím na částice o velikosti 1,0 mm až 0,5 mm tak, aby se zabránilo přehřátí vzorku během homogenizace. 3 Vlhké vzorky (siláže, senáže) je nutné nejprve usušit v sušárně při teplotě 50 C na vlhkost menší než 14 % a pak postupovat stejně jako u suchých vzorků. 4 Některé matrice (sušené siláže a senáže, seno) poutají velké množství extrakční směsi. Její objem je pak nutné zvýšit na 200 ml. 5 Po extrakci siláží a senáží je nutné změřit ph a upravit na hodnotu 7,0 až 7,4 roztoky (9) a (19).

4 Národní referenční laboratoř Strana Přečištění na imunoafinitní kolonce Do skleněné kádinky se pipetuje 4 ml filtrátu vzorku (viz. 5.1) a rozředí se 44 ml PBS (10). Naředěný vzorek se dobře promíchá a přefiltruje přes filtr z mikrovlákna (10). Imunoafinitní kolonka (9) se připraví dle instrukcí výrobce. Vrchní kryt kolonky se propíchne ostrým hrotem nůžek, sejme se dolní kryt. Nasadí se přes kohout na vakuový manifold (3) a na kolonku se připojí plastové stříkačky, nalije veškerý naředěný extrakt vzorku a nechá se přecházet přes kolonku až do průchodu vzduchu. Průtok by neměl překročit 5ml/min (1 až 2 kapky/s). Imunoafinitní kolonka se propláchne dle instrukcí výrobce (OchraTest 10 ml promývacího roztoku firmy Vicam a 10 ml vody, OchraPrep 20 ml PBS) opět až do průchodu vzduchu. Vyjme se z manifoldu a umístí se nad vialku. 5.3 Příprava zkušebního roztoku vzorku Ochratoxin A se eluuje do vialky 2 0,75 ml methanolu (2) a eluát se rozředí 1,5 ml vody. Směs se dobře promíchá. Pokud je to nezbytné, může se před analýzou HPLC ještě zfiltrovat nebo odstředit na laboratorní odstředivce po dobu 5 min při ot/min. 6 Podle návodu R-Biopharm se k eluci používá 1,5 ml kyselého metanolu (20) a 1,5ml vody (4), která se aplikuje na kolonku. 5.4 HPLC analýza Kalibrační křivka Do odměrných baněk na 5 ml se pipetuje postupně (125; 250; 500; 1250; 2500) µl z kalibračního roztoku (17) a doplní se nástřikovým rozpouštědlem (15). Výsledná koncentrace kalibračních roztoků je (0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0) ng/ml. Kalibrační křivka se připravuje na počátku každého dne analýzy a kdykoliv se změní chromatografické podmínky. HPLC podmínky Tabulka 1. Příklad podmínek chromatografického systému. Kolona Mobilní fáze (12) Teplota kolony 30 C Objem nástřiku 100 µl Fluorescenční detekce Průtok mobilní fáze Analytická kolona s reverzní fází, např. C18, 250 mm 4,6 mm I.D. 4 µm nebo podobná Emisní vlnová délka 460 nm, excitační vlnová délka 333 nm 1,0 ml/min

5 Národní referenční laboratoř Strana 5 6 Výpočet a vyjádření výsledků Obsah ochratoxinu A (X) v krmivech vyjádřený v ng/g se vypočítá podle vztahu c V E X = m A c je koncentrace ochratoxinu A vypočítaná z kalibrační křivky (ng/ml), V objem rozpouštědla použitý na extrakci (ml), E konečný objem roztoku, m navážka vzorku (g), A objem extraktu použitý na přečištění (ml). 7 Veškeré sklo, které přišlo do styku s mykotoxiny, je nutné dekontaminovat. K dekontaminaci se používá 2% roztok chlornanu sodného, který se nechá působit minimálně 2 h. Sklo se po opláchnutí vodou umyje běžným způsobem. 7 Literatura 1 ČSN EN Krmiva - Stanovení ochratoxinu A v krmivu metodou HPLC s předčištěním na imunoafinitní kolonce a s fluorescenční detekcí. Rok vydání 2012.