ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM

Transkript

1 ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM Analytický systém Photochem (firmy Analytik Jena, Německo) je vhodný pro stanovení celkové antioxidační kapacity (tj. celkové schopnosti vzorku vychytávat volné radikály) různých druhů vzorků, ať už z oblasti klinické biochemie (krevní plasma), tak i z oblasti biochemie potravin (vzorky masa, vína, čajů, kávy aj.). Přístroj pracuje na principu fotochemiluminiscence, která je založena na produkci volných radikálů osvícením fotoluminiscenčního roztoku (R3-viz dále). Tohoto roztoku se vždy používá stejné množství (25 μl), tudíž i množství vyprodukovaných radikálů je vždy stejné. Tyto radikály jsou vychytány antioxidanty, které se nacházejí v příslušném vzorku. Zbylé antioxidanty (při použití vhodného ředění) vyvolají luminiscenci, která je zachycena detektorem a znázorněna pomocí křivky v programu PCLSoft. Tento program vypočítá příslušnou koncentraci v nmol ekvivalentu použitého standardu a také RSD odchylku měření. Pokud by křivka vyšla nulová (tzn., že by kopírovala osu x ), je potřeba vzorek naředit. Photochem pracuje se dvěma základními metodami - ACW (water-soluble antioxidant capacity; antioxidační kapacity ve vodě rozpustných látek) a metodu ACL (lipidsoluble antioxidant capacity; antioxidační kapacita v tuku rozpustných látek). Obě metody využívají stejného principu stanovení, ale odlišného standardu, v jehož ekvivalentech je výsledek vyjádřený. Metoda ACW využívá jako standard kyselinu askorbovou (vitamin C) a metoda ACL využívá Trolox, tj. ve vodě rozpustný ekvivalent vitaminu E. Preanalytická příprava vzorků je odlišná podle druhu vzorku (matrice). Všechna měření ale mají něco společného a to v první řadě sestrojení kalibrační křivky za využití příslušných standardů - kyseliny askorbové pro ACW (nebo Troloxu pro ACL) - připravených v koncentracích 0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 a 2,5 nmol/l (podrobnou přípravu standardu pro kalibraci viz dále) Princip analýzy: ACW: lag time, lineární parametry ACL: inhibice, reciproční (převrácené) parametry 1

2 Výpočet analytických parametrů Lag time: pro metodu ACW; doba lag fáze je určena stanovením inflexního bodu pomocí 1. derivace, následně je vypočten sklon (tangent) v inflexním bodě. Inhibice: pro metodu ACL; inhibice integrálu naměřené křivky blanku a vzorku. Výhody a vlastnosti analytického systému Photochem schopnost stanovení antioxidační kapacity jak ve vodě (ACW), tak i v tucích (ACL), rozpustného podílu použitá metoda fotochemiluminiscence je metodou rychlou, přesnou, relativně levnou a k životnímu prostředí šetrnou metodu, nevyžadující úzce specifické hodnoty ph a teplot fotochemická excitace vzorků vede k oxidačním reakcím, které jsou řádově 100 x až 1000 x rychlejší než za běžných podmínek stanovení celkové (totální) antioxidační kapacity (TAC) různorodých a komplexních směsí (důležitá homogenizace) krátká doba měření (kolem 2 minut pro ACW a 3 minut pro ACL). malá spotřeba vzorků nekomplikovaná a časově nenáročná příprava vzorků nasávání vzorků, samotné měření a jejich promývání prováděny zcela automaticky kompaktní vzhled s nízkými požadavky na prostor (viz obrázek č.7) uživatelsky přehledný software PCLsoft 2

3 METODA ACW Metoda ACW využívá kit od firmy Jena AG, který obsahuje: - Reagent R1 rozpouštědlo - Reagent R2 reakční pufr - Reagent R3 fotosenzitivní roztok (rozpouštěný v 750 µl reagentu R2) - Reagent R4 standard (kyselina askorbová vitamin C) Reagenty R1 a R2 je nutno udržovat ve tmě a při chladničkové teplotě, reagenty R3 a R4 je nutno udržovat zmrazené (-20 C). Reagent R3 je velmi citlivý na světlo, proto je důležité přidávat jej jako poslední, krátce promíchat a ihned nasát do přístroje. I během měření je nutné tento reagent udržovat chlazený, zatímco R1 a R2 mohou být při laboratorní teplotě. Kalibrace: 1. Příprava standardu: Standard (R4) je nejprve nutno naředit 500 μl reagentu R1 a promíchat na třepačce s. Z této směsi se připraví pracovní roztok standardu a to jeho naředěním 1:100 (tj. 10 μl R4 a 990 μl R1). Tím se docílí toho, že 10 μl tohoto pracovního roztoku obsahuje 1 nmol kyseliny askorbové. 2. Tvorba kalibrační přímky (viz obrázek č.1): Je využita rostoucí kalibrační řada pracovního roztoku standardu kyseliny askorbové s množstvím 3 μl, 5 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl a 25 μl. Toto množství odpovídá koncentraci standardu kyseliny askorbové 0,3 nmol; 0,5 nmol; 1,0 nmol; 1,5 nmol; 2,0 nmol a 2,5 nmol (viz tabulka č.1). Křivky jednotlivých standardů je možné vidět na obrázku č.2. Vzorky je nutno zhomogenizovat, dle potřeby naředit a pro vlastní analýzu odebrat množství 10 μl. Příklady jejich křivek je možné vidět na obrázku č.3. Dále se postupuje dle tabulky č.1. 3

4 Tabulka č.1: Příprava vzorků pro metodu ACW Reagent R1 (µl) R2 (µl) R3 (µl) R4 (µl) Vzorek (µl) Blank Kalibrace 1500 (X) X 0 Vzorek 1500 (Y) Y Vysvětlivky: X = množství standardu (µl); Y = množství vzorku (µl) Obrázek č.1: Kalibrační přímka pro metodu ACW 4

5 Obrázek č.2: Průběh křivek při kalibraci pomocí standardů Obrázek č.3 : Ukázka průběhu křivky vzorků (E-F) ve srovnání s blanky (A) a standardy (B- D) 5

6 METODA ACL Metoda ACW využívá kit od firmy Jena AG, který obsahuje: - Reagent R1 methanol (rozpouštědlo) nutno dokoupit samostatně - Reagent R2 reakční pufr - Reagent R3 fotosenzitivní roztok (rozpouštěný v 750 µl reagentu R2) - Reagent R4 standard (Trolox vitamin E) Reagenty R1 a R2 je nutno udržovat ve tmě a při chladničkové teplotě, reagenty R3 a R4 je nutno udržovat zmrazené (-20 C). Reagent R3 je velmi citlivý na světlo, proto je důležité přidávat jej jako poslední, krátce promíchat a ihned nasát do přístroje. I během měření je nutné tento reagent udržovat chlazený, zatímco R1 a R2 mohou být při laboratorní teplotě. Kalibrace: 2. Příprava standardu: Standard (R4) je nejprve nutno naředit 500 μl reagentu R1 a promíchat na třepačce s. Z této směsi se připraví pracovní roztok standardu a to jeho naředěním 1:100 (tj. 10 μl R4 a 990 μl R1). Tím se docílí toho, že 10 μl tohoto pracovního roztoku obsahuje 1 nmol Troloxu. 3. Tvorba kalibrační přímky (viz obrázek č.4): Je využita rostoucí kalibrační řada pracovního roztoku standardu Troloxu s množstvím 3 μl, 5 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl a 25 μl. Toto množství odpovídá koncentraci Troloxu 0,3 nmol; 0,5 nmol; 1,0 nmol; 1,5 nmol; 2,0 nmol a 2,5 nmol (viz tabulka č.2). Křivky jednotlivých standardů je možné vidět na obrázku č.5. Vzorky je nutno zhomogenizovat, dle potřeby naředit a pro vlastní analýzu odebrat množství 10 μl. Příklady jejich křivek je možné vidět na obrázku č.6. Dále se postupuje dle tabulky č.2. 6

7 Tabulka č.2: Příprava vzorků pro metodu ACL Reagent R1 (µl) R2 (µl) R3 (µl) R4 (µl) Vzorek (µl) Blank Kalibrace 2300 (X) X 0 Vzorek 2300 (Y) Y Vysvětlivky: X = množství standardu (µl); Y = množství vzorku (µl) Obrázek č.4: Kalibrační přímka pro metodu ACL 7

8 Obrázek č.5: Průběh křivek při kalibraci pomocí standardů Obrázek č.6: Ukázka průběhu křivky vzorků (1-3) ve srovnání s blanky (A) a standardy (B-F) 8

9 Obrázek č.7: Analytický systém Photochem 9

10 PŘÍKLADY PREANALYTICKÉ PŘÍPRAVY VZORKŮ Extrakty ze zeleného čaje pro ACL: - centrifugace vzorků otáček/1 minuta - naředění supernatantu 1:10-1:100 reagentem R1 a použití μl vzorku ke stanovení Sušené ovoce pro ACL i ACW: - odvážit 20 g vzorku a v hmoždíři rozetřít dokud nezmizí viditelná struktura - vzít 0,5 g vzorku, přidat 20 ml methanolu a důkladně protřepat 1-5 minut - centrifugovat vzorek otáček/2 minut - naředit methanolem 1:9-1:19 Vzorky mouky pro ACL i ACW: - rozpustit 100 mg vzorku ve směsi 200 μl n-hexanu a 800 μl methanolu - vzorek promíchat 5 minut - centrifugace otáček/3 minuty. Vzorky následně naředěny R1 pro ACL nebo ACW a pro analýzu využito μl vzorku Extrakty rostlin pro ACL i ACW: - 10 mg vzorku rozpustit v 1 ml methanolu - vzorek promíchat - centrifugace vzorku otáček/3 minuty - naředit vzorek 1:150 reagentem R1 pro ACW nebo R1 pro ACL a využit v množství 20 μl k analýze 10

11 Sýry: ACW - 1 g vzorku smíchat s 2 ml 1M HCl - promíchat na třepačce - ponechat 30 minut stát, poté znovu 2x promíchat - centrifugace otáček/5 minut - přenést supernatant a doplnit vodou do 10 ml (sediment použít pro ACL) μl vzorku použít pro analýzu ACL - přidat 2 ml methanolu k sedimentu z ACW - nechat stát 30 minut, poté 2x promíchat - centrifugace otáček/5 minut - přenést supernatant a doplnit do 5 ml methanolem μl vzorku použít k analýze Pivo pro ACL i ACW: - sonifikace vzorku pro odstranění bublin CO 2 po dobu 5 minut - naředit R1 pro ACW 1:20 - naředit R1 pro ACL 1:5 - homogenizace vzorku - 10 μl použít vzorku pro analýzu 11