LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ"

Sára Pavlína Tesařová
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ STANOVENÍ BIOLOGICKY AKTIVNÍCH LÁTEK POMOCÍ VYSOKOÚČINNÉ CHROMATOGRAFIE VE SPOJENÍ S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (LC-MS) Garant úlohy: Ing. Vojtěch Hrbek 1

2 Základní požadované znalosti pro vstupní test: Základní informace o biologicky aktivních látkách Princip a využití kapalinové chromatografie Princip a užití hmotnostní spektrometrie Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři a protipožární ochrany Náplň úlohy: Extrakce opiových alkaloidů ze vzorků makových semen Seznámení s LC-MS instrumentací, měření kalibrace a extraktů vzorků Interpretace naměřených dat Časový snímek cvičení 30 minut Kontrola požadovaných znalostí, diskuse: způsob přípravy vzorků, měření a vyhodnocování naměřených dat 50 minut Příprava jednotlivých vzorků a standardů 120 minut Měření vzorků 30 minut v rámci Seznámení s LC-MS instrumentací měření vzorků 30 minut Vyhodnocení naměřených dat a diskuse výsledků 10 minut Ukončení úlohy + úklid 2

3 Teoretický úvod Biologicky aktivní látky Biologicky aktivní látky jsou chemické sloučeniny, které v nízkých koncentracích ovlivňují pozitivně, ale i negativně funkce živého organismu. Tělo přijímá tyto látky buď formou potravy, nebo jako léčiva. Mezi potraviny obsahující významné biologicky aktivní látky patří zejména ovoce, zelenina, rostlinná strava a mnoho dalších. Cílem těchto látek je zvýšit odolnost organismu při různých nepříznivých situacích, například pomoci organismu v boji proti nemocem a stabilizovat tělesné funkce. Opiové alkaloidy Mezi biologicky aktivní přírodní látky můžeme mimo jiné zařadit i skupinu alkaloidů obsažené v opiu, zaschlé mléčné šťávě z nezralých makovic. V opiu se nachází okolo 40 různých alkaloidů. Mezi nejvýznamnější z nich paří morfin, kodein, tebain, papaverin, narcein a noskapin. Z chemického hlediska se jedná o dusíkaté sloučeniny s dusíkem vázaným v heterocyklech. Mají zásaditý charakter a v opiu se váží na organické nebo anorganické kyseliny, jako jsou kyselina mekonová, mléčná, fosforečná nebo sírová. Mák setý Zdrojem opia jsou především nezralé makovice máku setého (Papaver Somniferum L.), jehož odrůdy lze rozdělit na dva hlavní typy, a to na odrůdy potravinářské a technické. Technické odrůdy se pěstují především pro zisk makoviny, jakožto hlavním zdrojem opiových alkaloidů, které se hojně využívají ve farmacii. Naopak potravinářské odrůdy se pěstují pro zisk semen, která se používají na přípravu náplní sladkých dezertů nebo jako posyp běžného pečiva či také slouží k výrobě jedlého oleje. Na rozdíl od technických se potravinářské odrůdy vyznačují nízkým obsahem opiových alkaloidů. Česká republika se řadí mezi nejvýznamnější pěstitele kvalitního potravinářského máku. Falšování máku Jeden z nejdůležitějších parametrů kvality semen máku je právě obsah opiových alkaloidů. Jsou zaznamenávány případy, kdy kvalitní potravinářský mák je míchán se semeny technických odrůd nebo je jimi zcela nahrazen a pak jsou tyto semena označována a prodávána jako kvalitní potravinářský mák. Semena z technických odrůd jsou levný odpadní produkt při získávání opiových alkaloidů a vyznačují se zvýšeným obsahem opiových alkaloidů na povrchu. Z důvodu splnění limitu o obsahu těchto alkaloidů se technická semena upravují například procesem termostabilizace, čímž však mohou ztratit své senzorické vlastnosti. Přílišná konzumace technických semen máku může způsobit u citlivých jedinců mírný pocit točení hlavy, závratě či střevní obrnu. Mezi příznaky intoxikace opiovými alkaloidy patří bledost, zčervenání, žaludeční nevolnost, žaludeční křeče, zvracení, průjem, třesení, otupělost, bolest hlavy, závratě, mátožnost, deprese nebo i svědění kůže. 3

4 Legislativa V České republice byla uvedena v platnost novela č. 399/2013 vyhlášky č. 329/1997 Sb., která uvádí, že pro potravinářské účely lze použít pouze semeno máku setého olejného typu pocházející z odrůd, které obsahují maximálně 0,8 % morfinových alkaloidů v sušině tobolky, makovici. Je zde také uvedeno, že obsah morfinových alkaloidů na povrchu makového semene je limitován hodnotou 25 mg kg -1. Tabulka I: Majoritní alkaloidy v máku Alkaloid Sumární vzorec Přesná hmota aduktu [M+H] + Struktura Morfin C 17H 19NO 3 286,1443 Tebain C 19H 21NO 3 312,1600 Kodein C 18H 21NO 3 300,1600 4

5 Návod laboratorní práce Předmětem této úlohy je analýza makových semen na obsah majoritních opiových alkaloidů morfinu, tebainu a kodeinu. Pro sumu těchto opiových alkaloidů je doporučený limit 25 mg.kg -1. Princip metody: Opiové alkaloidy ve zralém máku nejsou uvnitř semen, ale pouze jako znečištění na jejich povrchu, které pochází z makových palic. Pro jejich analýzu se použijí nepomletá maková semena. Vlastní stanovení opiových alkaloidů ve vzorku se provádí s využitím techniky kapalinové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí za ionizace elektrosprejem (LC-ESI-MS). Hmotnostním analyzátorem je jednoduchý kvadrupól (Q). Specifické detekce je dosaženo měřením molekulového iontu sledované látky, který je odvozen od molekulové hmotnosti dané látky. Konfirmačním kritériem je shoda retenčních časů analytu ve vzorku Kvantifikace se provádí metodou kalibrační křivky, srovnáním ploch píků vybraných iontů v MS chromatogramu vzorku a standardu. Úkoly: 1. Příprava testovaných vzorků makových semen (reálných vzorků) k analýze, příprava mobilní fáze 2. Měření vzorků metodou LC-MS 3. Vyhodnocení naměřených dat Chemikálie a standardy: - Morfin (koncentrace 1,000 ± 0,050 mg volné báze v methanolu; Lipomed, Švýcarsko) - Kodein (koncentrace 1 mg volné báze v methanolu; Lipomed, Švýcarsko) - Tebain (koncentrace 1 mg volné báze v methanolu; Lipomed, Švýcarsko) - Methanol, pro LC-MS LiChrosolv (Merck, Německo) - Acetonitril (Sigma-Aldrich, USA) - Mravenčan amonný 99,999 % (Sigma-Aldrich, Německo) - Kyselina mravenčí, p.a. 98 % (Sigma-Aldrich, Německo) - Kyselina octová, glacial, % (Sigma-Aldrich, Německo) Použité přístroje: - Kapalinový chromatograf Waters Acquity UPLC, Waters (USA) - Hmotnostní spektrometr QDA, Waters (USA) 5

6 Tabulka 2: HPLC podmínky stanovení opiových alkaloidů kolona Atlantis HILIC 100 x 2,1 mm, 3 µm mobilní fáze A: 50 mm mravenčan amonný (ph 3) B: Acetonitril objem nastřikovaného vzorku 3 l teplota kolony 40 C teplota autosampleru 10 C Tabulka 3: Gradient Pracovní postup: Čas [min] Průtok A [%] B [%] Křivka [ml.min -1 ] počátek 0, počátek 1 0, , ,5 0, , , a. Extrakce makových semen Naváží se přesně 5,00 g nepomletých semen máku do 100 ml Erlenmayerovy baňky a přidá se 50 ml roztoku 0,1% kyseliny octové v methanolu a umístí se na třepačku, kde se vzorek extrahuje 15 min, při intenzitě 230 min -1. Poté je extrakt přefiltrován přes filtrační papír (č. 390) do 100 ml odměrné baňky, filtrační koláč se důkladně promyje extrakčním činidlem. Získaný extrakt je následně v odměrné baňce doplněn okyseleným methanolem po rysku. Na závěr se extrakt naředí 10x a 50x methanolem přímo do vialky a spolu s neředěným extraktem se analyzuje pomocí techniky LC-MS. b. Identifikace a kvantifikace Identifikace analytů se provádí porovnáním retenčního času píku daného analytu v chromatogramu analyzovaného vzorku a kalibračního standardu. Kvantitativní vyhodnocení se provádí odečtením koncentrace analytu z kalibrační křivky a přepočtem na původní vzorek. c. Výpočet obsahu analytů ve vzorku a vyjádření výsledku Během zpracování dat (výpočtů) je kontrolována linearita kalibrační křivky a rozptyl pomocí regresního koeficientu (R 2 ). Výpočet koncentrace analytu ve vzorku metodou interní kalibrace: C C f vz cal V f m extrakt Cvz Ccal koncentrace analytu ve vzorku (mg/kg) koncentrace analytu vypočítaná z kalibrační závislosti (μg/ml) 6

7 Vextrakt m f objem extraktu (ml) navážka vzorku (g) přepočítávací faktor (obsah matrice v extraktu) Výsledek je vyjádřen v jednotkách mg/kg a uvádí se spolu s nejistotou, která ve spojení s výsledkem měření tvoří interval hodnot, o němž se tvrdí, že uvnitř něho leží skutečná hodnota. U = 2. RSD RSD = (s/x) 100 s = 1 n n 1 (x i x) 2 i=1 U rozšířená nejistota (%) RSD relativní směrodatná odchylka s směrodatná odchylka n počet hodnot x průměrná hodnota i-tá hodnota xi d. Výstup práce Vyhodnocení naměřených dat Výpočet obsahu opiových alkaloidů Srovnání naměřených hodnot s doporučením o maximálním množství alkaloidů na povrchu semen máku Sepsání protokolu Zkušební otázky: 1. Co jsou to biologicky aktivní látky? 2. Jaké znáte separační techniky? 3. Jakou instrumentální metodu byste zvolili pro stanovení morfinu? 4. Popište princip chromatografické separace. 5. Jaký je rozdíl mezi gradientovou a isokratickou elucí? 6. Jak se liší chromatografie na normální fázi a na reverzní fázi? 7. Vysvětlete princip analýzy látek pomocí hmotnostní spektrometrie. 8. Jaké jsou základní části hmotnostního spektrometru? 7

Podobné dokumenty

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení nepovolených doplňkových látek Zn-bacitracinu,