Diplomová práce 1. ÚVOD 8 2. STUDOVANÁ PROBLEMATIKA 9
|
|
- Tereza Beránková
- před 9 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 1. ÚVOD 8 2. STUDOVANÁ PROBLEMATIKA BAKTERIE PROTEOBAKTERIE NITROSPIRA MAGNETOTAKTICKÉ BAKTERIE VYBRANÍ ZÁSTUPCI MTB BIOMINERALIZACE MAGNETOZÓMY MAGNETOZOMÁLNÍ MEMBRÁNA (MM) SEPARAČNÍ METODY PRO IZOLACI MTB MAGNETIC COLLECTION HANGING DROP RACE-TRACK CÍL PRÁCE LOKALITY METODIKA ODBĚR VZORKŮ A JEJICH ZPRACOVÁNÍ ANALÝZA VODY Z PROSTŘEDÍ POTVRZENÍ PŘÍTOMNOSTI MTB PŘÍMÝM POZOROVÁNÍM GRANULOMETRICKÁ ANALÝZA STANOVENÍ CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) CELKOVÁ ABUNDANCE BAKTERIÍ ISOPYKNICKÁ HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE STANOVENÍ ABUNDANCE BAKTERIÍ TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE (TEM) METODA KLONOVÁNÍ GENU VÝSLEDKY A DISKUZE ANALÝZA VODY POTVRZENÍ PŘÍTOMNOSTI MTB PŘÍMÝM POZOROVÁNÍM GRANULOMETRICKÁ ANALÝZA CELKOVÝ ORGANICKÝ UHLÍK (TOC) CELKOVÁ ABUNDANCE BAKTERIÍ TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE (TEM) KLONOVÁNÍ A SEKVENACE 16SRRNA ZÁVĚR LITERATURA PŘÍLOHY 44 7
2 1. ÚVOD Sediment vodního prostředí, sladkovodního i mořského je považován za jedno z míst s velmi hojným výskytem bakterií. Bakterie jsou důležité svou schopností rozkladu organických hmot v akvatických ekosystémech, jsou považovány za důležitou součást při přeměně rozpuštěného uhlíku na partikulovaný. Ten může být dále předán do vyšší trofické úrovně. Bakterie se v sedimentu nacházejí v různých morfologických i fyziologických variantách. Jednou z těch, kterými se zabývá i tato diplomová práce jsou tzv. magnetotaktické bakterie (MTB). Tyto bakterie jsou typické přítomností magnetotaktických částic v cytoplazmě tzv. magnetozómů, které si sami vytváří pomocí biomineralizace. MTB jsou v dnešní době významné zejména pro svoji potencionální možnost použitelnosti v medicíně, a proto se jimi zabývá mnoho výzkumných týmů po celém světě. Vyskytují se poměrně často, ovšem kultivace v laboratorních podmínkách je ztížena nároky, které MTB vyžadují. V této práci je kladen důraz na potvrzení přítomnosti MTB na vybraných lokalitách pomocí molekulárních technik. Existují dva základní rozdíly, podle kterých se magnetotaktické bakterie rozlišují a tím je přítomnost určité sloučeniny, která z části tvoří jejich magnetozómy. Jednak je to magnetit (Fe3O4) a také greigit (Fe3S4). Typ závisí na prostředí, kde se MTB nacházejí, jelikož prvky potřebné k biomineralizaci čerpají z prostředí. Dalším rozlišovacím faktorem je tvar a uspořádání magnetozómů. 8
3 2. STUDOVANÁ PROBLEMATIKA 2.1. Bakterie Bakterie (Bacteria) jsou prokaryotické organismy, které se vyznačují určitými charakteristickými vlastnostmi. Je to přítomnost mureinové buněčné stěny, nukleoidu, plazmidů, prokaryotického typu ribozómů, DNA bez intronů. Velikost bakterií je rozmanitá. Obvykle se pohybuje mezi desetinami a desítkami mikrometrů. Nejen velikost, ale také tvar bakterií kolísá podle rodů a někdy i podle druhů. Bakteriální buňky mají různý tvar a seskupení tyčinkovitý (diplobakterie, streptobakterie a palisádové bakterie), kulovitý (koky, diplokoky, tetrakoky, stafylokoky, streptokoky a sarciny), zakřivený (vibria, spirily, spirochéty), větvený či vláknitý. Tloušťka bakteriálních tyčinek se pohybuje v rozmezí 0,3 až 2 µm, délka bývá 1 až 7 µm. Průměr koků je zhruba 0,5 až 5,5 µm. Zakřivené bakterie však mohou být dlouhé až 500µm s tloušťkou 0,2 až 0,75 µm. Dle Gramova barvení dělíme tradičně na grampozitivní (Firmicutes), gramnegativní (Gracilicutes) a bakterie bez buněčné stěny (Tenericutes). Další dělení může být prováděno podle kultivačních znaků, jako je teplota (podle optima na psychrofilní /15 C/, mezofilní /20-45 C/, termofilní /45-70 C/, hypertermofilní /70-90 C/), ph (alkalofilní /nad 8/, neutrofilní /6 7/, acidofilní /pod 6/, acidorezistentní), vztah k O2 (aerobní, anaerobní). Rozmnožování je nepohlavní příčným dělením, případně pučením. Aktivní pohyb je prováděn pomocí různých typů bičíků. Může být též klouzavý nebo pomocí taxe (magneto, foto, aj.). Z fylogenetického hlediska dělíme živé organismy do tří říší. Každá z nich je na nejvyšší úrovni. Dřívější skupina Prokaryota se rozdělila, Eukaryota zůstala. Rozlišuje se nyní takto: Bacteria, Archea a Eukaryota (Obr.č.1). Námi studované magnetotaktické bakterie (MTB, viz níže) patří do kmenů Proteobacteria a Nitrospira. 9
4 Obr.č. 1 Fylogeneze živých organismů (Brock et al. 2008) Proteobakterie Jedna ze skupin říše Bacteria tvoří skupinu většinou známých gramnegativních bakterií, které jsou však dosti rozdílné z metabolického (fyziologického) hlediska. Dělí se na následující pododdělení: alfa beta gama delta a epsilon proteobacteria. Do skupiny Proteobacteria patří i námi studované magnetotaktické bakterie (MTB, viz níže). Na základě sekvenace DNA byly zařazeny zejména do podskupin alfa, delta a beta. 10
5 Nitrospira Kmen Nitrospira spadající do Bacteria byl popsán na základě sekvenování ribozomální RNA. Zástupci tohoto kmene mají schopnost oxidovat NO 2- a NO 3- a jsou autotrofní. Navzdory těmto vlastnostem jsou ale odlišné od klasických nitrifikačních bakterií. Nitrospira např. postrádá interní membránu, běžně nacházenou u druhů nitrifikačních Proteobakterií (Brock et al. 2006). Někteří zástupci kmene Nitrospira jsou mají také magnetotaktické vlastnosti Magnetotaktické bakterie Magnetotaktické bakterie (MTB) byly objeveny téměř před 40-ti lety, v roce 1975 (Frankel 2009). MTB řadíme mezi gramnegativní prokaryota, podskupiny α (alfa) a δ (delta) skupiny Proteobacteria a do kmene Nitrospira (Obr.č. 3). Tyto bakterie se vyskytují kosmopolitně, byly zjištěny v mnoha lokalitách po celém světě, například v USA (Blakemore et al. 1979), Japonsku (Kawaguchi et al. 1995), Řecku (Sievert et al. 1999), Brazílii (Spring et al. 1998), Německu (Flies et al. 2005a, Flies et al. 2005b) a Číně (Liu et al. 2006). MTB jsou převážně akvatické sladkovodní i mořské a pohybují se podél geomagnetického pole Země (Frankel 2009). Bakterie se na severní polokouli pohybují převážně k jižnímu pólu, bakterie na jižním pólu naopak k severu. Nejnovější poznatky ale také potvrzují přítomnost MTB na severní polokouli, které se pohybují k severnímu pólu magnetu. Magnetotaktické bakterie tuto svoji schopnost pravděpodobně používají v případech, kdy jsou vlivem turbulence různého původu vytrženy ze svého prostředí. Největší množství MTB se nachází v nebo blízko tzv. oxic-anoxic transition zone (Flies et al. 2004) (Obr.č. 2). Oxicko-anoxická zóna (OATZ) se ve sladkovodním prostředí nachází v místě přechodu sediment/voda, na rozhraní aerobního a anaerobního metabolismu. Mechanismem, který pomáhá k orientaci - magnetotaxi jsou tzv. magnetozómy (viz 2.4.) (Flies et al. 2004). Termín magnetotaxické bakterie nemá žádný taxonomický význam, ale i přesto má skupina těchto bakterií několik společných znaků. Jejich metabolismus je výhradně respirační, jsou mikroaerofilní nebo anaerobní či obojí dohromady a jsou to mezofilové, kteří mají nitrogenázovou aktivitu a pravděpodobně mohou fixovat atmosférický dusík. Nejdůležitější je však přítomnost magnetických bakteriálních částic. 11
6 Obr.č. 2 Oxicko-anoxická zóna (Bazylinski et al. 2002) Přestože nebylo publikováno mnoho studií zabývajících se nároky MTB na chemismus prostředí, tento faktor bude hrát jistě nezanedbatelnou roli. Například studie Bazylinskiho (Bazylinski 2004) dokazují závislost výskytu magnetotaktických kmenů MV-1a MV-2 na chemismu prostředí. Tyto chemolitoautotrofní bakterie vyžadují jako donor elektronů S2O3 2- / H2S, N2O / O2 jako konečného příjemce elektronů a HCO3 - / CO2 využívá pro zdroj uhlíku (Bazylinski et al. 2004) Vybraní zástupci MTB Magnetotaktické bakterie jsou typickými gradientními mikroorganismy. To je také důvod, proč nelze napodobit ideální podmínky v laboratoři. Proto je tedy většina známých MTB laboratorně nekultivovatelná. Ta část známých MTB, které jsou kultivovatelné a lze tedy získat čistou kulturu, patří do rodu Magnetospirillum (Alphaproteobacteria): M.gryphiswaldense kmen MSR-1 (Schleifer et al. 1991), M.magnetotacticum MS-1 (Schleifer et al. 1991), M.magnetotacticum AMB-1 (Matsunaga et al. 1991). Ostatní kultivovatelné kmeny: mořská vibria MV-1 a MV-2 (Bazylinski et al. 1988, Amann et al. 2007), mořské koky MC-1 (Meldrum et al. 1993), rod spirillum kmene MMS-1 (MV-4) (Meldrum et al. 1993) a anaerobní sulfát redukující MTB Desulfobactermagneticus kmen RS-1 (Sakaguchi et al. 1993, Sakaguchi et al ). Všichni kultivovatelní zástupci rodu Magnetospirillum rostou chemoorganoheterotrofně. Jako zdroj uhlíku a elektronů využívají určité organické kyseliny, nevyužívají cukry ani fermentací ani oxidací. Jako konečné akceptory elektronů složí kyslík nebo nitráty u všech kultivovatelných kmenů a 12
7 všechny mohou být považovány za denitrifikační bakterie, které redukují nitráty (NO3) na plynné produkty oxidu dusného (N2O) či dusíku (N2) (Bazylinski et al. 2007). Jednou z velmi zajímavých magnetotaktických bakterií je Magnetobacterium bavaricum. Je to velká tyčinkovitá bakterie, jež byla izolována z vápenatých sedimentů v alpském jezeře Chiemsee v Horním Bavorsku. Dále také později vyizolovaný kmen MHB-1, morfologicky velmi podobný M.bavaricum. Místem nálezu je jezero Wallen See, Brémy. Oba zástupci patří do kmene Nitrospira. Celkový seznam objevených MTB se neustále rozšiřuje. Jsou nacházeny nejen nové kmeny, ale i různé morfotypy. Pro nastínění nynějšího rozčlenění MTB přikládám fylogenetický strom magnetotaktických bakterií (Obr.č.3.). Obr.č.3 Fylogenetický strom MTB (Bäuerlein 2004) Magnetotaxické bakterie lze ve vzorku velmi snadno detekovat. Jednou z metod je tzv. hanging drop, které může předcházet metoda magnetic collection (viz , ). 13
8 2.3. Biomineralizace Biomineralizace je proces (Obr.č.4), při němž organismy produkují tzv. biogenní minerály, které se stávají součástí jejich organismu. Jedná se o řízené ukládání v organické matrici, která je tvořena přírodními polymery nebo polysacharidy. Mezi biogenními minerály převažují uhličitany vápníku (kalcit, aragonit), fosforečnany vápníku (apatit, francolit) a vodnatý oxid křemičitý (opál). Biogenní magnetit nebo sulfidy Fe (pyrhotin a greigit Fe3S4) umožňují magnetotaktickým bakteriím orientaci v geomagnetickém poli. V ojedinělých případech biomineralizací vzniká fluorit, pyrit, sádrovec, celestin, baryt nebo goethit. U mikroorganismů byly popsány dva způsoby vzniku materiálů: tzv. biologicky indukovaná biomineralizace ( biologically induced mineralization BIM) a biologicky řízená mineralizace ( biologically controlled mineralization BCM) (Bazylinski et al. 2005). V biologicky indukované mineralizaci vznikají částice extracelulárně ve vnějším prostředí z metabolitů produkovaných mikroorganismy. Vlastnosti těchto minerálů jsou určeny podmínkami vnějšího prostředí. Obecně se vyznačují variabilním chemickým složením, zhoršenou krystalinitou, různou velikostí a nedostatkem specifické krystalové morfologie, která se v případě magnetitu neliší od krystalické struktury magnetitu vznikajícího ryze anorganickou cestou. Biologicky řízená produkce magnetitu je typická pro skupinu tzv. magnetotaktických bakterií. Tyto mikroorganismy vytvářejí intracelulární struktury, nazývané bakteriální magnetické částice neboli magnetozomy (viz. 2.4.) (Schüler 2008). Dalšími mikroorganismy, které vytvářejí magnetit biologicky indukovanou mineralizací jsou např. železo redukující bakterie a sulfát redukující bakterie. Extracelulární magnetit produkují rovněž heterotrofní bakterie Geobacter metallireducens (GS-15) a Thermoanaerobacter ethanolicus (TOR-39). Regulačním mechanismem biomineralizace je koncentrace Fe, nukleace krystalů, redox potenciál a ph. Biochemickou kontrolu procesů umožňuje kompartmentarizace v magnetozómech. 14
9 Obr.č. 4 Model biomineralizace železa Magnetospirillum sp. (Cochise college on line) Vznik magnetozómů v krocích: 1. Invaginace cytoplazmatické membrány 2. Příjem Fe iontů z externího prostředí do vzniklých vezikulů o Fe 3+ konvertovány na Fe 2+ o využití transmembránových kanálů, H + /Fe 2+ antiport (sekvenční homologie s Na + /H + antiportem), transport díky protonovému gradientu o kanály v cytoplazmatické i magnetozomální membráně 3. Nukleace magnetitových krystalů o trans-membránové proteiny Mms Magnetozómy Magnetozómy jsou jednodoménové, chemicky čisté částice o velikosti nm s magnetickou vlastností, které si MTB vytvářejí pomocí biomineralizace (viz výše). Částice vykazují druhově specifickou, dokonalou krystalovou morfologii. Lze říci, že co bakterie, to unikátní biomineralizační systém. Krystalové částice v řetízcích bakterií jsou potom nadále všechny stejné. Základní struktura megnetozómů (Obr.č.5) je oktahedrální, dodekahedrální a kubická. Další tvary jsou již odvozené (Obr.č. 6, 8). 15
10 Obr.č. 5 Struktury magnetozómů (Bazylinski et al. 2004) Obr.č. 6 Odvozené struktury magnetozómů (Scheffel et al. 2006) Magnetozómy se uvnitř bakterie nachází buďto rozptýlené nebo v řetízcích. V tomto případě jsou krystaly navázány na cytoskelet buňky (Obr.č. 7). Obr.č. 7 Vazba magnetozómů na cytoskelet (Scheffel et al. 2006) Chemické složení magnetozómů je dvojího typu, podle kterého se MTB řadí do fylogenetických podskupin. Jednou z dvou hlavních je α podskupina. Ta zahrnuje zástupce, jež mají magnetozómy tvořeny Fe3O4, magnetitem. Druhá 16
11 podkupina δ, má magnetozómy tvořené greigitem Fe3S4. Magnetotaktické bakterie se také vyskytují i v jiným (pod)skupinách, a to např. mezi β- proteobakteriemi a v kmeni Nitrospira. Tyto struktury uspořádané v bakteriálních buňkách jim udělují magnetický dipólový moment. Cílem je reakce a orientace v případě, kdy je bakterie vlivem turbulence vytržena z místa s optimálními životními podmínkami. Fungují tedy jako miniaturní interní magnety (Klaban 2001) neboli vnitřní kompas. Obr.č. 8 Diverzita a uspořádání magnetozómů v různých MTB (Schüler 2008) Magnetozomální membrána (MM) Membrána magnetozómů byla na strukturální a biochemické úrovni studovány na magnetozómech, které byly pomocí magnetických separací a centrifugace vyizolovány z druhu Magnetospirillum gryphiswaldense. U MM lze předpokládat podobnou strukturu. Membrána magnetozómů je podobná ostatním eukaryotním organelám. Skládá se z fosfolipidové dvojvrstvy. MM je také nazývána jako membránový vezikul, jelikož je dokázáno, že membrána magnetozómů vzniká vychlípením vnitřní cytoplazmatické membrány. MM lze 17
12 většinou snadno vidět pod elektronovým mikroskopem (Obr.č.9) nebo pomocí kryoelektronových tomografů jako vezikulární struktury, které jsou prázdné nebo částečně zaplněné drobnými nezralými krystaly z magnetitu v na železo chudém prostředí nebo v tzv. premagnetických buňkách (Schüler 2008). Většina poznatků o biochemickém složení této membrány pochází ze studií kmene MSR-1 (Drünber et al. 2004) a AMB-1 (Matsunaga et al. 2005). Membrána obsahuje proteiny, které dosud nebyly nalezeny v jiných buněčných orgánech u jiných mikroorganismů. Jedná se o proteiny Mag A, Mam a Msm (Jogler et al. 2007). Obr.č.9 Magnetozómy izolované z M.gryphiswaldense. Magnetické krystaly mají v průměru 42 nm a jsou obaleny magnetozomální membránou viz šipka. Měřítko odpovídá 25 nm (Šafařík et al. 2002). 2.5 Separační metody pro izolaci MTB Magnetic collection Metoda magnetic collection spočívá v naakumulování magnetotaktických bakterií pro efektivnější odběr. Ke sklenici se sedimentem se přiloží magnet do výšky cca 2 3 cm nad rozhraní sediment/voda po dobu přibližně 2 hodiny (Obr.č. 10) (Lins et al. 2003, Flies et al. 2005b). Po té se odebere vzorek pro další analýzy z oblasti magnetu, kde je předpokládán větší výskyt MTB. 18
13 Hanging drop Na mikroskopické podložní sklíčko se Pasteurovou pipetou kápne kapka sedimentu z oblasti magnetu (viz výše). K ní se přidá kapka přefiltrované vody z prostředí (sterilní voda z prostředí). Na stranu sklíčka se sterilní vodou se přiloží magnet jižním pólem (Obr.č. 11) a hrana kapky se pozoruje pod mikroskopem s fázovým kontrastem (Olympus BX 60) při zvětšení 400x. Po 5 10 min lze pozorovat pohybující se bakterie ve směru k magnetu (Obr.č. 12). Obr.č. 10 Metoda magnetic collection Obr.č. 11 Metoda hanging drop Obr.č. 12 Reakce bakterií na přiložení magnetu (tzv.magnetotaxe) (Frühwirtová 2007) 19
14 Race-track Pro tento typ separace jsou používány kapiláry připravené z Pasteurových pipet. Širší konec se zkrátí cca na 1 cm délky a užší konec podle délky použité jehly. Užší konec se dále zataví nad plamenem a širší konec se nepatrně ohne nahoru. Kapiláry se sterilizují a do širšího konce se umístí kousek sterilní vaty. Kapilára se pomocí jehly naplní sterilní vodou z prostředí a na vatu se kápne vzorek sedimentu. K užšímu konci se přiloží magnet a cca po dvou hodinách se tenký konec kapiláry ulomí a separát MTB se odebere sterilní injekční jehlou (Flies et al. 2004b). Takto je separát magnetotaktických bakterií připraven k dalšímu použití. 20
15 3. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo: 1. Z dostupných zdrojů vybrat lokalitu s nejvyšším potvrzeným výskytem magnetotaktických bakterií. Z těchto lokalit odebrat vzorek a zpracovat jej pro další využití 2. Vizuálně potvrdit přítomnost MTB pomocí magnetotaxe v laboratorních podmínkách. 3. Provést granulometrickou analýzu a stanovit celkové množství organického uhlíku a dusíku. Stanovit celkovou abundanci bakterií pomocí fluorescenčního barvení DAPI. 4. Pomocí extrakce bakteriální DNA ze sedimentu a následné metody klonování zkonstruovat fylogenetický strom. 21
16 4. LOKALITY První vzorek byl odebrán na malém vodním toku Sitka. Lokalita odběru se nachází cca 5 km severně od Olomouce. Sitka pramení v oblasti Hrubého Jeseníku, v nadmořské výšce 650 m n.m., poslední úsek toku se nachází v krajině s intenzivní zemědělskou činností. Ústí jako levostranný přítok do řeky Oskavy v blízkosti obce Chomoutova (v nadmořské výšce cca 215 m n.m.). Lokalita Sitka byla vybrána, jelikož i zde byl dříve prokázán výskyt MTB a zároveň proto, že jako jediná má tekoucí charakter. Další vzorek byl odebrán 2 km od centra města Buchlovice, které leží v podhůří lesnatého pohoří Chřiby, 12 km od Uh.Hradiště. Odebírali jsme přímo v areálu Lázní Leopoldov - Smraďavka. Nádrž je kontinuálně plněna sirným pramenem nacházejícím se pod kapličkou. Lokalita Dyje-slepé rameno se nachází blízko CHKO Pálava, mezi obcemi Milovice a Nové Mlýny Poslední dvě lokality byly vybrány podle seznamu z diplomové práce Světlany Frühwirtové. Buchlovice a slepé rameno Dyje byly podle jejich záznamů dvě z nejhojnějších lokalit na výskyt magnetotaktických bakterií. 22
17 5. METODIKA 5.1. Odběr vzorků a jejich zpracování Vzorky jsem získali ze tří různých lokalit (viz. kap. 4. Lokality). Sediment jsme odebírali pomocí lopatky z hloubky vody cca 0,2 až 0,5 m. Samotný vzorek obsahoval částice cca 20cm do hloubky. Získaným sedimentem jsme naplnili plastové kyblíky o objemu 5 l. Součástí odběru bylo také naplnění kanystrů vodou povrchovou i intersticiální pro následné zpracování vzorků a chemickou analýzu vody. Sediment byl zpracován pomocí síta s velikostí oka 1,5 mm a dále je přechováván v umělohmotných nádobách s objemem 0,5 l, kdy sediment zaujímá 2/3 objemu, zbylá 1/3 je voda z prostředí. Nádoby jsou uloženy v temnu při pokojové teplotě s ne úplně dovřeným uzávěrem. Vzorky jsme ponechali v klidu cca 2 měsíce. Přímým pozorováním bylo prokázáno, že po této době je výskyt bakterií ve vzorcích nejhojnější Analýza vody z prostředí Při odběru vzorků jsme také analyzovali charakteristiku vody prostředí, a to vody povrchové i intersticiální. K měření byl použit multimetr HANNA HI9892, calibration solution HI Cílem této analýzy bylo zjistit základní parametry vody z prostředí, a to: teplota, ph, redox potenciál, vodivost, množství kyslíku a procentuální nasycení. Totální hmotnost dusíku byla později zjištěna v laboratoři. Vzorky Buchlovice a Dyje pocházejí z , lokalita Sitka z Zjištěné hodnoty jsou uvedeny v Tab.č Potvrzení přítomnosti MTB přímým pozorováním K potvrzení přítomnosti magnetotaktických bakterií byl používán inverzní optický mikroskop Olympus IX-70, objektiv LCACH PhF2, zvětšení 400x. Dva dny před plánovaným pozorováním byl ke stěně nádoby umístěn magnet jižním pólem směrem k sedimentu. Tento proces měl zaručit zvýšenou 23
18 koncentraci MTB ve vzorku. Na mikroskopické podložní sklíčko jsem si připravila vzorek pomocí metody hanging drop. Pasteurovou pipetou jsem odebrala kapku sedimentu z oblasti přiloženého magnetu. K sedimentu jsem přidala kapku přefiltrované-sterilní vody z prostředí, kterou jsem získala přefiltrováním přes jednorázové filtry TAMDA. Na stranu sklíčka se sterilní vodou jsem přiložila magnet jižním pólem (Obr.č. 9) a hranu kapky pozorovala pod mikroskopem. Počty pozorovaných bakterií jsem zaznamenávala pomocí znamének: +_výskyt do 1-50 bakterií v zorném poli mikroskopu; ++_výskyt do bakterií v zorném poli mikroskopu; +++_vysoký počet bakterií - nelze spočítat; 0_nevyskytovaly se žádné bakterie; -_sediment nebyl kontrolován. Pozorované počty jsou uvedeny v kapitole Granulometrická analýza Granulometrická analýza zrnitosti půd spočívá v postupném prosívání materiálu. K tomuto slouží sestava sít s různou velikostí ok, která se umístí na třepačku (Obr.č. 13) a po době cca 2 min se váží obsah jednotlivých sít. Data se dále zpracovávají pomocí software programu SeDi. Obr.č. 13 Ilustrační foto soupravy k provádění granulometrie (VŠCHT on line) 24
19 V tomto případě jsme použili devět sít s velikostí ok (mm): 22,40; 11,20; 8,00; 5,60; 3,00; 1,00; 0,40; 0,10 a 0,08. Síta jsme sestavili vertikálně-sestupně nad sebe a umístili na třepačku. Po dvou minutách jsme síta opatrně rozdělili, aby nedošlo ke ztrátě vzorku a postupně jsem zvážili materiál z jednotlivých sít Stanovení celkového organického uhlíku (TOC) Přirozeně se vyskytující celkový organický uhlík (TOC total organic carbon) v říčních sedimentech je klíčový komponent v množství chemických, fyzikálních a biologických procesů (Ouyang et al. 2006). TOC představuje celkovou sumu uhlíku vázaného v organických látkách ve vodě. K analýze jsme použili keramické misky o průměru 6 cm a hmotnosti 21,7895 g (podrobněji viz. tab.č. 5). Materiál použitý na granulometrickou analýzu jsme smíchali, aby opět došlo k rovnoměrnému rozmístění částic. Jednotlivé misky jsme naplnili až po okraj vysušeným sedimentem a zvážili. Po té jsme misky se sedimentem umístili do elektrické laboratorní pece (LH 30/13 HT 40) a při teplotě 600 C po dobu 4 hodin žíhali. Tímto procesem se spálí všechny organické částice v sušině. Rozdíl hmotností se převede na procenta celkové hmotnosti sušiny a vynásobí se koeficientem pro obsah organického uhlíku vodní biomasy, tj. 0,45. Takto získáme procentuální hodnotu TOC Celková abundance bakterií Isopyknická hustotní centrifugace Hustotní centrifugace je metoda používaná k úpravám environmentálních vzorků sedimentů (Aakra et al. 2000). Této metodě předchází postup, který bakterie uvolní z povrchu částic sedimentu. Isopyknická centrifugace v hustotním gradientu je založena pouze na principu různé hustoty částic. Ostatní vlastnosti jako například velikost, tvar či viskozita tedy nemají na průběh vliv. Základem je prostředí o měnící se hustotě (hustotní gradient), přičemž rozsah hustot média leží v oblasti očekávaných hustot dělených částic. Hustoty obvykle přibývá od hladiny média směrem ke dnu. Z fyzikálního hlediska se jedná o formu rovnovážné centrifugace. 25
20 Principem je, že každá částice sedimentuje v centrifugační tubě pouze do té úrovně média, která odpovídá hustotou její vlastní hustotě; zde se zastaví a setrvá. V řadě experimentů, které s touto metodou pracují, je gradient vytvářen tak, že hustota na dně centrifugační tuby odpovídá hustotě částic, které chceme ze vzorku odstranit, zatímco hustotní vrstva nebo vrstvy nad ní odpovídají hustotě částic, které chceme uchovat, případně dále dělit. Jako hustotní gradient pro separaci buněk a jejich komponent se používal Nycodenz. Ten je autoklávovatelný a je na rozdíl od jiných jodovaných gradientových médií méně toxický (Obr.č. 14) (Rickwood et al. 1982). Obr.č.14 Separace organel prostřednictvím isopyknické hustotní centrifugace s hustotním gradientem (Rickwood et al. 1982). Pro stanovení bakteriální abundance jsme použili velikostní frakci sedimentu menší než 1 mm. K 5 ml sedimentu bylo poté přidáno 5 ml fyziologického roztoku a 50 µl detergentu Triton (Merck), který účinně odděluje bakterie od sedimentu. Vzorek s detergentem jsme třepali po dobu 4 hod (RS 10 Control). Hustotní centrifugace byla provedena s médiem Nycodenz (hustota 1,31 g/ml; Axis- Shield). Do centrifugační zkumavky jsme nepipetovali 4 ml vzorku sedimentu a poté byly 2 ml Nycodenzu opatrně zavedeny injekční jehlou pod vzorek. Vzorky byly vloženy do centrifugy (Rotofix 32A,), po dobu 60 min, 4600 ot/min. Centrifugovali jsme vždy 2 opakování jednoho vzorku. 26
21 Po ukončení centrifugace bylo jasně patrné nové uspořádání vzorku s ostrým rozhraním dvou vrstev o různé hustotě a na dně peleta tvořená částečkami sedimentu; injekční stříkačkou byla opatrně odebrána svrchní vrstva (supernatant), zde by měly být zachyceny veškeré volné bakteriální buňky Stanovení abundance bakterií K určení celkové abundance bakterií ve vzorku jsem použila molekulární metodu fluorescenčního barvení DAPI. DAPI neboli 4',6-diamidino-2-fenylindol je fluorescenční barvivo, které se váže na dvouřetězcovou DNA v A-T zóně, v malé rýze (minor groove) (Obr.č. 15). Používá se ve spojení s fluorescenční mikroskopií. Maximální excitace celku DAPI- DNA je dosažena ozářením UV paprsky o vlnové délce 358 nm, maximum emise probíhá v oblasti viditelného světla s vlnovou délkou 461 nm. Intenzita emise molekul s navázaným barvivem je zhruba dvacetinásobně vyšší, než molekuly nenavázané. DAPI se váže také na molekuly RNA. Zde je ale intenzita emise pětinásobně menší než u vazby DAPI - DNA. Barva emitovaného světla je modrá. 15.a 15.b 15.c Obr.č. 14 a: Umístění molekuly DAPI v malé rýze (minor groove) DNA; b: Molekula DAPI; c: Strukturní vzorec molekuly fluorescenčního barviva DAPI (Wikipedia on line) 27
22 Díky fyzikálně- chemickým vlastnostem je DAPI v mikrobiální ekologii užíváno především k zjišťování celkové bakteriální abundance mrtvých buněk, pro detekci buněk živých není příliš vhodné, protože barví také bakterie v inaktivním stavu (Cupalová 2006). Postup: 1 ml vzorku odebraný po hustotní centrifugaci jsme napipetovali do filtrační aparatury (Millipore) přidali 2 ml destilované vody a zfiltrovali (filtr Millipore, 0,2 µm GTTP; vývěva Millipore). Poté byl vzorek ještě v aparatuře promyt přefiltrováním cca 2 ml destilované vody (za účelem odstranění zbytků formalínu) a usušen na vzduchu. Na suchý filtr jsme nanesli cca 20 µl fluorescenčního barviva DAPI o koncentraci 0,0063 g.ml -1 (Sigma - Aldrich) a nechali jej na podložním sklíčku v chladničce asi deset minut. Po uplynutí této doby, nezbytné ke správnému nabarvení DNA, jsme ze vzorků vymyli nespecificky navázané zbytky barviva. Promývání jsme prováděli střídavě v etanolu a destilované vodě, přičemž poslední fází byla vždy voda; poměrně intenzivní praní filtru v etanolu a následné důkladné odstranění etanolu z filtru vodou se ukázalo zásadní pro jasný obraz v mikroskopu. Filtr jsme usušili, vložili do kapky imerzního oleje (Olympus, Olympus optical co.) na podložní sklíčko, zakápli další kapkou imerzního oleje, přikryli sklíčkem krycím a hodnotili. Snímání jsme prováděli na epifluorescenčním mikroskopu Olympus BX 60 (Olympus), kamera Olympus (DP 12, Olympus). Použili jsme imerzní objektiv při excitační vlnové délce 360 nm, zvětšení 1000x. Vyhodnocení abundance bakteriálních buněk na snímcích jsme provedli v programu Lucia (Laboratory imaging, ČR). Počet buněk bakterií v 1 ml vzorku (abundance) byl potom na základě těchto hodnot vypočítán podle vzorce: B= n * F/P *V1/V2*V3/V1*1/V kde n je tzv. průměrný snímek (tj. průměrný počet bakterií na snímek), F... plocha filtru (resp. vnitřní průměr filtračního komína) P... plocha, kterou stanovujeme (tj. plocha, na níž počítám, resp. plocha snímku; lze ji zjistit v programu Lucia) 28
23 V1.. centrifugovaný objem vzorku sedimentu V2 centrifugovaný objem vzorku sedimentu + objem media Nycodenz V3 objem fyziologického roztoku přidaného k sedimentu a detergentu V... objem zfiltrovaného vzorku v ml U každého vzorku byla provedena dvě opakování a z výsledných hodnot vypočetli průměr. Výsledná bakteriální abundance je převedna na 1ml sedimentu Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) Vzorky byly měřeny na transmisním elektronovém mikroskopu JEOL 2010F-typ HC (high contrast). Tento mikroskop umožňuje rozsah urychlovacího napětí od 80kV-200kV, poskytuje zvětšení od 1000x x. Pro náš vzorek bylo použito urychlovací napětí 160kV. Vzorek byl nanesen na měděné podložní síťce s napařenou uhlíkovou fólií (obr.č. 13). Získané fotografie magnetotaktických bakterií z lokalit Sitka a Buchlovice viz. kapitola 10. Přílohy. Obr.č. 13 Měděná mřížka pro TEM (Wikipedia on line) 5.8. Metoda klonování genu Klonování genů patří mezi moderní a velmi perspektivní molekulární metody. Význam klonování spočívá v zisku čistého vzorku jednotlivého genu, odděleného od všech ostatních genů v buňce. Takto získaný čistý gen může být dále sekvenován (tj. určí se přesné pořadí nukleotidů v sekvenci) a porovnán s daty uloženými v mezinárodní bance klonů. Výsledkem je potom přiřazení klonu k již známým klonům (podle vzájemné podobnosti nukleotidových sekvencí) a vytvoření fylogenetického stromu (Brown 2007). 29
24 Principem klonování genů je vytvoření mnoha kopií cílového genu díky přirozenému množení hostitelských buněk. Úsek DNA, který chceme klonovat, je vložen do kružnicové molekuly DNA zvané vektor vzniká tzv. rekombinantní molekula DNA. Vektor je přenesen do hostitele (zpravidla bakterie), kde se pomnoží a produkuje velké množství vlastních kopií a zároveň kopií genu, který nese. Množením hostitelských buněk se do dceřiných buněk přenáší i kopie rekombinantní DNA, kde opět dochází k replikaci. Po mnohonásobném dělení vzniká kolonie neboli klon identických hostitelských buněk. Každá buňka klonu obsahuje jednu nebo více kopií molekuly rekombinantní DNA gen, nesený rekombinantní molekulou DNA, se pak nazývá klonovaný (Brown 2007). Detailní popis postupu metody sekvenace a klonování DNA, který byl proveden v laboratoři HUFS v Jižní Koreji, je součástí článku uvedeného v kapitole č.10 Přílohy. 30
25 6. VÝSLEDKY A DISKUZE 6.1. Analýza vody Analýza povrchové a intersticiální vody se prováděla přímo na lokalitě. Pouze hodnoty dusíku byly určeny v laboratoři. Zjištěné hodnoty jsou uvedeny v tab.č. 1. Buchlovice Buchlovice Buchlovice intersticiál povrchová voda pramen pod kapličkou Kyslík 3,77 mg/l 4,32 mg/l 4,5 mg/l Nasycení 41% 49,80% 42% ph 7,96 7,76 7,6 redox potenciál - 60 mv - 42 mv - 36 mv teplota 20,96 C 19,9 C 11,8 C vodivost 600 µs/cm 578 µs/cm 513 µs/cm total N koncentrace 1,5 mg/l Dyje sl.rameno Dyje sl.r. povrchová voda intersticiál Kyslík 9,5 mg/l 3,95 mg/l Nasycení 118% 49,30% ph 8,64 7,15 redox potenciál mv - 30,9 mv teplota 25,2 C 24,9 C vodivost 427 µs/cm 497 µs/cm total N 1,3 mg/l Sitka Sitka povrchová voda interstiiciál Kyslík 6,5 mg/l 3,9 mg/l Nasycení 69% 40% ph 7,45 7,1 redox potenciál - 43,1 mv - 7 mv teplota 16,9 C 16,9 C vodivost 258 µs/cm 179 µs/cm total N 3,1 mg/l Tab.č. 1 Hodnoty povrchové a intersticiální vody z vybraných lokalit 31
26 Naměřené hodnoty uvedené v tabulce charakterizují životní prostředí magnetotaktických bakterií. Diskuze o vlivu podmínek životního prostředí na MTB uvedena v kapitole 6.5. (Abundance bakterií) Potvrzení přítomnosti MTB přímým pozorováním Metodou přímého pozorování (viz. 5.3.) jsem potvrdila přítomnost a množství magnetotaktických bakterií pomocí znamének +, - a 0 (Tab.č. 2). BUCHLOVICE 5 min 10 min 5 min 10 min 5 min 10 min 1.a b c a b c a b c + + DYJE 5 min 10 min 5 min 10 min 5 min 10 min 1.a b c a b c a b c 0 0 SITKA 5 min 10 min 5 min 10 min 5 min 10 min Tab.č. 2 Potvrzení přítomnosti a počtu MTB v sedimentu přímým pozorováním. Jelikož jsou magnetotaktické bakterie zřetelné pod fázovým mikroskopem, bylo možno pozorovat jejich aktuální reakci na magnet. Pokud jsem magnet vychýlila, bylo zřejmé, jak se bakterie pohybují tímtéž směrem. Pokud jsem magnet odstranila úplně, MTB se rozptýlily zpět do prostoru kapky vody. Za magnetotaktické bakterie (MTB) byly považovány všechny bakterie, které reagovaly na přítomnost magnetu pohybem k němu do 5 minut. Z výše uvedených tabulek je zřejmé, že hromadění magnetotaktických bakterií na hraně kapky směrem k jižnímu pólu magnetu bylo zřetelnější po době 10-ti a více minut. Nejvíce MTB jsem pozorovala ve vzorcích 1.a a 3.a lokality Buchlovice, u lokality Dyje ve vzorcích 1.b a 2.b. Při pozorování vzorku z lokality Sitka bylo množství MTB po deseti minutách stejné. 32
27 6.3. Granulometrická analýza Po zpracování vysušeného sedimentu pomocí soustavy sít jsme získali hodnoty uvedené v Tab.č. 3. Granulometrická analýza Buchlovice Dyje s.r. Velikost ok (mm) hmotnost (g) % hmotnost (g) % 22,4 108,9 6,169 8,2 2,443 11,2 320,5 18,158 19,7 5,870 8,0 149,2 8,453 30,0 8,939 5,6 53,4 3,025 14,1 4,201 3,0 178,9 10,135 33,4 9,952 1,0 185,9 10,532 25,7 7,657 0,4 402,2 22,787 51,2 15,256 0,1 306,0 17, ,9 39,600 0,08 27,1 1,535 7,4 2,205 < 0,08 32,9 1,864 13,0 3,873 Hmotnost celkem , ,6 99,996 Tab.č. 3 Váhové hodnoty při zpracování sedimentu na granulometrickou analýzu. Po zpracování výše uvedených hodnot programem SeDi můžeme konstatovat, že u lokality Dyje je nejvíce zastoupena frakce o velikosti 0,18 mm. U lokality Buchlovice činí padesáti procentní kvartil 0,77 mm a u lokality Sitka 5,4 mm (viz Ta.č.4). Q25 Q50 Q75 Lokalita Dyje 0,08 mm 0,18 mm 2,29 mm Buchlovice 0,15 mm 0,77 mm 7,82 mm Sitka 0,49 mm 5,4 mm 9,13 mm Tab.č. 4 Vyhodnocení granulometrické analýzy Jelikož se magnetotaktické bakterie nacházejí na rozhraní oxickoanoxické zóny (OATZ) a dokáží se pohybovat podle aktuální polohy vzhledem ke geomagnetickému poli Země, nepředpokládá se jakákoliv závislost výskytu MTB a velikosti částic sedimentu. Ovšem velikost frakce souvisí s koncetrací TOC i s množstvím totálního dusíku. Obecně lze říci, že na zrnech s menší velikostí se zachytává relativně větší množství živin. Toto by mohlo mít následně vliv na výskyt MTB. Diskuze v kapitole 6.5. (Abundance bakterií). 33
28 6.4. Celkový organický uhlík (TOC) Metodou žíhání organického uhlíků jsem dostala průměrné procentuální hodnoty obsahu TOC. Množství TOC z lokality Sitka jsme získali z měření, které na této lokalitě probíhají již delší dobu (viz. Tab.č. 5). č.m. m/ miska m/mis+sed po žíhání m/mis+sed hmotnost g % % TOC průměrné % TOC 4hod600 C B1 22,238 g 78,305 g 75,182 g 3,123 g 5,57 2,5 B2 21,917 g 81,863 g 78,824 g 3,039 g 5,06 2,28 B3 21,412 g 73,252 g 70,747 g 2,505 g 4,83 2,17 2,31 % TOC(B) D4 21,899 g 67,344 g 64,127 g 3,217 g 7,07 3,18 D5 21,247 g 69,356 g 65,867 g 3,489 g 7,25 3,26 D6 22,024 g 65,175 g 62,033 g 3,142 g 7,28 3,27 3,23 % TOC(D) S 22,045 g 77,335 g 77,005 g 0,33 g 0,6 0,27 0,27 % TOC (S) Tab.č. 5 Hodnoty celkového organického uhlíku (TOC). Analýza hodnot celkového organického uhlíku ukázala, že nejvyšší obsah je u lokality Dyje (D). Vzhledem k tomu, že metoda klonování (viz 6.6.) určila nejvyšší počet DNA klonů ( D17, D28, D32 a D47) také na lokalitě D, je tedy možné, že výskyt MTB klonů pozitivně koreluje s hodnotou celkového organického uhlíku Celková abundance bakterií Celková bakteriální abundance se na našich lokalitách pohybovala v rozmezí 2,84 5, b/ml, tj. průměrně 4, b/ml sedimentu. Lokalita Buchlovice a Dyje měly velmi podobné hodnoty, třetí z lokalit Sitka vykazovala nižší počty bakterií (viz Tab.č. 6). Tyto výsledky se shodují s prací Ch.Flies (Flies et al. 2004b), která ve své studii uvádí průměrnou bakteriální abundanci 4, b/ml sedimentu. Jak již bylo uvedeno, výskyt MTB může být ovlivněn chemismem vody. Množství zjištěného celkového dusíku v našich vzorcích negativně koreluje s bakteriální abundancí. Na lokalitě Sitka dosáhl dusík nejvyšší hodnoty a i zde se z hlediska abundance vyskytuje nejméně bakterií (viz. Tab.č.6). Tento vztah potvrzuje i práce Ch.Flies (Flies et al 2004b). Obecně přijímaný fakt, že hodnota 34
29 celkového organického uhlíku vykazuje negativní korelaci se zrnitostí sedimentu, byl prokázán pouze u jednoho vzorku ze tří. Největší zrnitost byla zjištěna u lokality Sitka a i zde byl zjištěn nejnižší obsah TOC, než u ostatních lokalit, u kterých byla zrnitost menší (viz Tab.č.6). abundace total N GA - Q50 TOC B 5, b/l 0,15 g/l 0,18 mm 2,31 % D 5, b/l 0,13 g/l 0,77 mm 3,23 % S 2, b/l 0,31 g/l 5,4 mm 0,27 % Tab.č. 6 Výskyt bakterií ve srovnání s množstvím totální hmotnosti N a množstvím TOC. Přestože v současnosti vychází mnoho publikací zabývajících se problematikou MTB, převážná část je orientována na sekvenační analýzy genomu a principům tvorby magnetozómů, jejich separaci a praktickému využití. Studie, zabývající se ekologií a životním prostředím MTB, jsou velmi ojedinělé, proto bylo obtížné srovnat získané údaje se zahraniční literaturou Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) Z fotek pořízených na TEM byla v našich vzorcích sedimentu z lokality Sitka potvrzena přítomnost magnetotaktických bakterií, a to minimálně dvou druhů. Jednou z nich je kulovitá bakterie (obr.č. 14) patřící do rodu Magnetobacterium, což potvrdily i molekulární analýzy. Bakterie na druhém snímku (obr.č. 15) svým tvarem nápadně připomíná magnetotaktickou bakterii rodu Magnetospirillum, která je jako jedna z mála kultivovatelná. 35
30 Obr.č. 14 Kulovitá MTB ve fázi dělení; magnetozómy viz. žluté body Obr.č. 15 MTB protáhlého tvaru, pravděpodobně rod Magnetospirillum; magnetozómy viz. zelené body 6.7. Klonování a sekvenace 16SrRNA Třicet osm procent z 24 analyzovaných sekvencí patřilo ke kmeni Proteobacteria, zatímco 25% z nich byly členy kmenu Nitrospira. Další menší skupiny patřily ke kmeni Acidobacteria (17%), Chloroflexi (13%) a Verrucomicrobia (8%). Bylo zjištěno, že všechny klony v kmeni Nitrospira jsou příbuzné se známou magnetotaktickou bakterií; všech šest těchto sekvencí vykazovalo velmi vysokou podobnost (> 98% založena na RDP databázi). Tyto klony byly použity pro další fylogenetické analýzy. Ukázalo se, že frekvence MTB 36
31 klonů byla nejvyšší ve vzorku z lokality D ( slepé rameno Dyje). Fylogenetická různorodost ve vzorku D byla tedy podstatně vyšší než v ostatních dvou vzorcích, kde byl nalezen pouze jeden klon MTB. Podle fylogenetického stromu byly všechny bakteriální 16S rrna genové sekvence úzce příbuzné s rodem Magnetobacterium sp., patřícím do kmene Nitrospira. Nejbližší příbuzní čtyř klonů z lokality D (D17, D28, D32 a D47), byly nalezeny v usazeninách jedné čínské nádrže (DQ833491), v sedimentu Žlutého moře (EU652666) a dva klony rodu Magnetobacterium (EF and EF613379) v reaktoru s lávovými kameny. Zdá se, že čtyři klony uvedené v této studii k sobě mají navzájem vztah, nicméně vysoká úroveň divergence sekvencí ukazuje, že tyto klonované sekvence by mohly patřit do různých rodů. Klon S46 z malého nížinného proudu byl nejblíže klonu Magnetobacterium ZZ L1B6 (EF613368), který rovněž z reaktoru s lávovými kameny. Poslední klon B6 z lokality B (malý lázeňský rybník Buchlovice-Leopoldov) se zdá být přinejmenším podobný klonům z ostatních českých lokalit a je úzce příbuzný s klonem TDNP USbc97 (Acc. No FJ516912) z mokřadu ve středním Španělsku. V našich vzorcích dominovaly fylotypy generované z klonové knihovny, a to rod Magnetobacterium z kmene Nitrospira. Velká magnetotaktická tyčinkovitá bakterie předběžně pojmenovaná Candidatus Magnetobacterium bavaricum, poprvé popsaná v sedimentu ze sladkovodního jezera v Bavorsku, se často nachází v sedimentech některých sladkovodních jezer. Tato nekultivovatelná magnetotaktická bakterie je fylogeneticky přiřazená ke kmeni Nitrospira. Předpokládáme, že Magnetobacterium bavaricum je chemolitotrofní bakterie schopná získávat energii ze železitých sloučenin. Metodou stabilních izotopů (13C) bylo dokázáno, že organismy příbuzné rodu Magnetobacterium jsou schopné metabolizovat acetát v metanogenních sedimentech. Nekultivovatelný magnetotaktický kmen Nitrospira byl také dříve zjištěn v různých oligotrofních jezerech v Horním Bavorsku a v jezeře v severním Německu Většina MTB klonů nalezená v našich vzorcích sedimentů z České republiky patří do kmene Nitrospira a má poměrně vysokou podobnost s Magnetobacterium bavaricum. Ta naznačuje, že výskyt MTB patřící do této skupiny není geograficky omezen pouze na Německo. Pokud je nám známo, je toto první studie poskytující důkazy o tom, že MTB mohou pobývat v sedimentech tekoucích vod. 37
32 Na základě našich výsledků jsme dospěli k závěru, že všechny sekvence ze vzorků sladkovodních sedimentů byly úzce spojeny s kmenem Nitrospira, který není kultivovatelný. Našim úsilím je najít kultivovatelnou skupinu MTB, a proto je třeba provádět další rozbory sedimentů z různých sladkovodních subjektů. Tato diskuze je součást článku, který je v plné verzi přiložen v kapitole 10. Přílohy. 38
33 8. ZÁVĚR Při zjišťování přítomnosti magnetotaktických bakterií (MTB) se potvrdily naše předpoklady, MTB byly detekovány ve na všech třech lokalitách. Výskyt se potvrdil přímým pozorováním pod fázovým inverzním mikroskopem. Metoda klonování genu a sekvenace DNA přítomnost MTB z našich vzorků sedimentu nejen potvrdila, ale také přiřadila k rodu Magnetobacterium. Ovšem pomocí transmisní elektronové mikroskopie byly pořízeny snímky minimálně dvou druhů magnetotaktických bakterií. Protáhlá bakterie (Foto.č. 5, 6, 7, 8) svým tvarem připomínající rod Magnetospirillum nebyl pomocí sekvenace DNA detekován, nicméně její přítomnost je na lokalitě Sitka pozorováním pod TEM potvrzena. Rod Magnetospirillum je narozdíl od rodu Magnetobacterium kultivovatelný v laboratorních podmínkách, a proto je žádoucí se i nadále zabývat detekcí tohoto rodu v našich podmínkách, potvrdit její zařazení a získat čistou kulturu, která by sloužila k dalším výzkumům. 39
34 9. LITERATURA Aakra, A., M. Hesselsoe, and L. R. Bakken, 2000: Surface attachment of ammonia-oxidizing bacteria in soil.microb. Ecol., Volume. 39, p Amann, R., Peplies, J., Schüler, D. (2007): Diversity and taxonomy of magnetotactic bacteria in magnetoreception and magnetosomes in bacteria, (Dirk Schüler) Springer Verlag Berlin Heidelberg 2007, p Bazylinski, D.A., Frankel, R.B., Jannasch, H.W. (1988): Anaerobic production of magnetite by a marine magnetotactic bacterium. Nature 334, p Bazylinski, D., Frankel, R.B. (2004): Magnetosomes formation in prokaryotes. Nature Reviews Microbiol 2, p Bazylinski, A.D., Dean, A.J., Williams, T.J., Kimble Long, L., Middleton, S.L., Dubells, B.L. (2004): Chemolithoautotrophy in the marine, magnetotactic bacterial strains MV-1 and MV-2, Arch.Microbiol. 182, p Bazylinski D., Frankel R. B. (2005): Magnetic iron oxide and iron sulphide minerale within microorganismes: potential biomarkers, in biomineralization, WILEY-VCH Verlag GmbH a Co.KGaA, p.17. Bazylinski, D.A., Williams, T.J. (2007): Ecophysiology of magnetotactic bacteria, in magnetoreception and magnetosomes in bacteria, (Dirk Schüler) Springer Verlag Berlin Heidelberg 2007, p. 44. Bäuerlein, E., Biomineralization_Progress in biology, molecular biology and application. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 2004, p. 57. Blakemore, R.P. (1975): Magnetotactic bacteria. Science 190, p Brock, T.D., Madigan, M.T., Martinko, J.M. Biology of microorganisms. Pearson Pertice Hall USA, Brown, T.A., Klonování genů a analýza DNA. UP Olomouc, Cochise College [on line]. Cit Dostupné na WWW: 2.gif Cupalová, J. (2006): Detekce fylogenetických skupin bakterií v biofilmu říčních sedimentů pomocí metody FISH. Diplomová práce PřF UP Olomouc. Drünber, K., Miller, E.C., Otto, A. Reszka, R., Linder,D., Kube,M., Reinhardt, R., Schüler, D. (2004): Biochemical and proteomic analysis of the magnetotactic membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. 40
35 Appl.Environ.Microbiol.70, p Flies, Ch.B., Jonkers, H.M., de Beer, D., Bosselmann, K., Bötcher, M.E., Schüler, D. (2004): Diversity and vertical distribution of magnetotactic bacteria along chemical gradients in freshwater microcosm, FEMS Microbiology Ecology 2005, p Flies, Ch.B., Peplies, J., Schüler, D. (2004): Combined approach for characterization of uncultivated magnetotactic bacteria from various aquatic environments, Appl.and environ.microbiol 2005, p Flies, Ch.B., Junkers, H.M., Beer, D., Bosselmann, K., Böttcher, M.E., Schüler, D. (2005 a): Diversity and vertical distribution of magnetotactic bacteria along chemical gradients in freshwater microcosms. FEMS Microbiol Ecol 52, p Flies, Ch.B., Peplies, J., Schüler, D. (2005 b): Combined approach for characterization of uncultived magnetotactiv bacteria from various aquatic enviroments. Applied and enviromental microbiology 2005, p Frankel, R.B. (2009): The discovery of magnetotactic/magnetosensitive bacteria, Chinese Journal of Oceanology and Limnology 2009, p.1 2. Frühwirtová, S., (2007): Studium magnetických vlastností nanočástic produkovaných mikroorganismy. Diplomová práce PřF UP Olomouc. Jogler, Ch., Schüler, D. (2007): Genetic analysis of magnetosome biomineralization in magnetoreception and magnetosomes in bacteria, (Dirk Schüler) Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007, p Kawaguchi, R., Burgess, J.G., Sakaguchi, T., Takeyama, H., Thornhill, R.H., Matsunaga, T. (1995): Phylogenetic analysis of a novel sulfate-reducing magnet bacterium, RS-1, demonstrates its membership of δ-proteobacteria. FEMS Microbiol Lett. 126, p Klaban, V., Svět mikrobů. Ilustrovaný lexikon mikrobiologie životního prostředí. Gaudeamus Hradec Králové, Lins, U., Freitas, F., Neumann Keim, C., de Barros, H.L., Esquivel, D.M.S., Farina, M. (2003): Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms, Brazilia Journal of Microbiology 2003, p Liu, Y., Gao, M., Dai, S., Peng, K., Jia, R. (2006): Characterization of magnetotactic bacteria and their magnetosomes isolated from Tieshan iron ore 41
36 in Hubei Province of China. Mater. Sci. Eng. 26, p Matsunaga, T., Sakaguchi, T., Tadokoro, F. (1991): Magnetite formation by a magnetic bacterium capable of growing aerobically. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, p Matsunaga, T., Sakaguchi, T., Okanuta, Y. (2005): Molecular and biotechnological aspect of bacterial magnetite in biomineralization. Appl. Microbiol. Biotechnol., p Meldrum, F.C., Heywood, B.R., Mann, S., Frankel, R.B., Bazylinski, D.A. (1993): Electron microscopy study of magnetosomes in a cultured coccoid magnetotactic bacterium. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 251, p Museum Mineral [on line]. [cit ]. Dostupné na WWW: Rickwood, D., Ford, T., Graham, J., 1982: Nycodenz: A new nonionic iodinated gradient medium. Analytical biochemistry, Volume 123, p Sakaguchi, T., Burgess, J.G., Matsunaga, T. (1993): Magnetite formation by a sulphate reducing bacterium. Nature 356, p Sakaguchi, T., Arakaki, A., Matsunaga, T. (2002): Desulfovibrio magneticus sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium that produces intracellular singledomain-sized magnetite particles. Int. J. Syst. Microbiol. 52, p Scheffel, A., Gruska, M., Faivre, D., Linaroudis, A. Draumann, P.L., Plitzko, J.M., Schüler, D. (2006): An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature 440, p Schleifer, K.H., Schüler, D., Spring, S., Weitzenegger, M., Amann, R., Ludwig, W., Koehler, M. (1991): The genus Magnetospirillum gen. nov. description of and transfer of Aquaspirillum magnetotacticum to Magnetospirillum magnetotacticum comb.nov. System. Appl. Microbiol. 14, p Schüler, D. (2008): Genetics and cell biology of magnetosome formation in magnetotactic bacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, p Sievert, S., Brinkhoff, T., Muyzer, G., Ziebis, W., Kkuever, J. (1999): Spatial heterogenity of bacterial populations slony an enviromental gradient at a shallow submarine hydrotermal vent near Milos Island (Greece). Appl. Environ. Microbiol. 9, p Spring, S., Lins, U., Amann, R., Schleifer, K.H., Ferreira, L.C.S., Esquivel, D.M.S., Farina, M. (1998): Phylogenetic affiliation and ultrastructure of 42
37 uncultured magnetic bacteria with unusually large magnetosomes. Arch, Microbiol. 169, p Šafařík, I., Šafaříková, M. (2002): Magnetic nanoparticles and biosciences. Mon.Chem. 133, p UP Olomouc [on line]. Olomouc, [cit ]. Dostupné na WWW : VŠCHT [on line]. Praha, [cit ]. Dostupné na WWW: lometrie/index.htm Wikipedia [on line]. [cit ]. Dostupné na WWW: Wikipedia [on line]. [cit ]. Dostupné na WWW: TEM by Mgr. Klára Šafářová, Centrum výzkumu nanomateriálů 43
38 10. Přílohy 44
Magnetotaktické bakterie
Magnetotaktické bakterie G- bakterie, objeveny v 60.l. 20.stol. koky, bacily, vibria, spirily; pohyb bičíky obligátně mikroaerofilní nebo anaerobní negativní aerotaxe výskyt: svrchní sedimenty ve vodě
VíceMOLEKULÁRNÍ METODY V EKOLOGII MIKROORGANIZMŮ
MOLEKULÁRNÍ METODY V EKOLOGII MIKROORGANIZMŮ (EKO/MMEM) ÚPRAVA PŘÍRODNÍCH VZORKŮ A STANOVENÍ MIKROBIÁLNÍ ABUNDANCE (DAPI) Pro přímé stanovení celkových počtů mikrobiálních buněk (buněčné abundance) ve
VíceBUŇKA ZÁKLADNÍ JEDNOTKA ORGANISMŮ
BUŇKA ZÁKLADNÍ JEDNOTKA ORGANISMŮ SPOLEČNÉ ZNAKY ŽIVÉHO - schopnost získávat energii z živin pro své životní potřeby - síla aktivně odpovídat na změny prostředí - možnost růstu, diferenciace a reprodukce
VíceBakteriální nanočástice magnetitu. Produkce - biomineralizace, modifikace a aplikace. Zdenka Marková, Michaela Pečová a kolektiv CVN
Bakteriální nanočástice magnetitu Produkce - biomineralizace, modifikace a aplikace. Zdenka Marková, Michaela Pečová a kolektiv CVN Bakteriální nanočástice magnetitu 1. Biomineralizace a produkce magnetických
VíceFLUORESCENČNÍ MIKROSKOP
FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP na gymnáziu Pierra de Coubertina v Táboře Pavla Trčková, kabinet Biologie, GPdC Tábor Co je fluorescence Fluorescence je jev spočívající v tom, že některé látky (fluorofory) po
VíceCZ.1.07/1.5.00/
Projekt: Příjemce: Digitální učební materiály ve škole, registrační číslo projektu CZ.1.07/1.5.00/34.0527 Střední zdravotnická škola a Vyšší odborná škola zdravotnická, Husova 3, 371 60 České Budějovice
VíceMetoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi
Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Co je to vlastně ta fluorescence? Některé látky (fluorofory)
VíceIzolace nukleových kyselin
Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které
VíceTECHNIKA PRO ZPRACOVÁNÍ ODPADŮ (13)
3. června 2015, Brno Připravil: doc. Mgr. Monika Vítězová, Ph.D. TECHNIKA PRO ZPRACOVÁNÍ ODPADŮ (13) Základní biologické principy využívané v rámci zpracování Inovace studijních programů AF a ZF MENDELU
VíceLRR/BUBCV CVIČENÍ Z BUNĚČNÉ BIOLOGIE 3. TESTY ŽIVOTASCHOPNOSTI A POČÍTÁNÍ BUNĚK
LRR/BUBCV CVIČEÍ Z BUĚČÉ BILGIE 3. TESTY ŽIVTASCHPSTI A PČÍTÁÍ BUĚK TERETICKÝ ÚVD: Při práci s buňkami je jedním ze základních sledovaných parametrů stanovení jejich životaschopnosti (viability). Tímto
VíceSTANOVENÍ TVARU A DISTRIBUCE VELIKOSTI ČÁSTIC MODELOVÝCH TYPŮ NANOMATERIÁLŮ. Edita BRETŠNAJDROVÁ a, Ladislav SVOBODA a Jiří ZELENKA b
STANOVENÍ TVARU A DISTRIBUCE VELIKOSTI ČÁSTIC MODELOVÝCH TYPŮ NANOMATERIÁLŮ Edita BRETŠNAJDROVÁ a, Ladislav SVOBODA a Jiří ZELENKA b a UNIVERZITA PARDUBICE, Fakulta chemicko-technologická, Katedra anorganické
VíceTéma: Testy životaschopnosti a Počítání buněk
LRR/BUBV vičení z buněčné biologie Úloha č. 3 Téma: Testy životaschopnosti a Počítání Úvod: Při práci s buňkami je jedním ze základních sledovaných parametrů stanovení jejich životaschopnosti (viability).
VíceCvičení 4: CHEMICKÉ SLOŽENÍ BUŇKY, PROKARYOTA Jméno: PROKARYOTA PŘÍPRAVA TRVALÉHO PREPARÁTU SUCHOU CESTOU ROZTĚR BAKTERIÍ
Cvičení 4: CHEMICKÉ SLOŽENÍ BUŇKY, PROKARYOTA Jméno: Skupina: PROKARYOTA PŘÍPRAVA TRVALÉHO PREPARÁTU SUCHOU CESTOU ROZTĚR BAKTERIÍ Praktický úkol: bakterie (koky, tyčky) vyžíhejte bakteriologickou kličku
VíceVyužití metagenomiky při hodnocení sanace chlorovaných ethylenů in situ Výsledky pilotních testů
Využití metagenomiky při hodnocení sanace chlorovaných ethylenů in situ Výsledky pilotních testů Stavělová M.,* Macháčková J.*, Rídl J.,** Pačes J.** * Earth Tech CZ, s.r.o ** ÚMG AV ČR PROČ METAGENOMIKA?
Více05 Biogeochemické cykly
05 Biogeochemické cykly Ekologie Ing. Lucie Kochánková, Ph.D. Prvky hlavními - biogenními prvky: C, H, O, N, S a P v menších množstvích prvky: Fe, Na, K, Ca, Cl atd. ve stopových množstvích I, Se atd.
VíceMIKROSKOPIE JAKO NÁSTROJ STUDIA MIKROORGANISMŮ
Mikroskopické techniky MIKROSKOPIE JAKO NÁSTROJ STUDIA MIKROORGANISMŮ Slouží k vizualizaci mikroorganismů Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) Čočka zvětšující 300x Různé druhy mikroskopů, které se liší
VíceLátky jako uhlík, dusík, kyslík a. z vnějšku a opět z něj vystupuje.
KOLOBĚH LÁTEK A TOK ENERGIE Látky jako uhlík, dusík, kyslík a voda v ekosystémech kolují. Energii se do ekosystémů dostává z vnějšku a opět z něj vystupuje. Základní podmínky pro život na Zemi. Světlo
Vícezákladní přehled organismů
základní přehled organismů Všechny tyto organismy mají podobný chemický základ Doména Archaea Tato doména nebyla rozpoznána až do konce 70. let minulého století Co se týče morfologie, neliší se archeální
Víceprokaryotní Znaky prokaryoty
prokaryotní buňka Znaky prokaryoty Základní stavební jednotka bakterií a sinic Mikroskopická velikost viditelné pouze v optickém mikroskopu Buňka neobsahuje organely Obsahuje pouze 1 biomembránu cytoplazmatickou
Vícezákladní přehled organismů
základní přehled organismů Doména Archaea Tato doména nebyla rozpoznána až do konce 70. let minulého století Co se týče morfologie, neliší se archeální buňky od buněk bakteriálních Rozdíly jsou biochemické
VíceBUNĚČ ORGANISMŮ KLÍČOVÁ SLOVA:
BUNĚČ ĚČNÁ STAVBA ŽIVÝCH ORGANISMŮ KLÍČOVÁ SLOVA: Prokaryota, eukaryota, viry, bakterie, živočišná buňka, rostlinná buňka, organely buněčné jádro, cytoplazma, plazmatická membrána, buněčná stěna, ribozom,
VíceOhlašovací prahy pro úniky a přenosy pro ohlašování do IRZ/E-PRTR
Celkový dusík Základní informace Ohlašovací prahy pro úniky a přenosy pro ohlašování do IRZ/E-PRTR Základní charakteristika Použití Zdroje úniků Dopady na životní prostředí Dopady na zdraví člověka, rizika
VíceBiologické čištění odpadních vod - anaerobní procesy
Biologické čištění odpadních vod - anaerobní procesy Martin Pivokonský, Jana Načeradská 7. přednáška, kurz Znečišťování a ochrana vod Ústav pro životní prostředí PřF UK Ústav pro hydrodynamiku AV ČR, v.
VíceN Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie
ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Mikrobiologie a hydrobiologie: Klasické metody barvení Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace
VíceVY_32_INOVACE_07_B_17.notebook. July 08, 2013. Bakterie
Bakterie 1 Škola Autor Název SOŠ a SOU Milevsko Mgr. Jaroslava Neumannová VY_32_INOVACE_07_B_17_ZDR Téma Bakterie Datum tvorby 14.4.2013 Číslo projektu CZ.1.07/1.5.00/34.0557III/2 Inovace a zkvalitněnívýuky
VíceÚvod do biochemie. Vypracoval: RNDr. Milan Zimpl, Ph.D.
Úvod do biochemie Vypracoval: RNDr. Milan Zimpl, Ph.D. TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Co je to biochemie? Biochemie je chemií živých soustav.
VíceÚvod do mikrobiologie
Úvod do mikrobiologie 1. Lidské infekční patogeny Subcelulární Prokaryotické o. Eukaryotické o. Živočichové Priony Chlamydie Houby Červi Viry Rickettsie Protozoa Členovci Mykoplasmata Klasické bakterie
Více1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru
Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující
VícePrezentace navazuje na základní znalosti z biochemie (lipidy, proteiny, sacharidy) Dynamický fluidní model membrány 2008/11
RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie PřF UP Olomouc Prezentace navazuje na základní znalosti z biochemie (lipidy, proteiny, sacharidy) Rozšiřuje přednášky: Stavba cytoplazmatické membrány Membránový
VíceBuňka. základní stavební jednotka organismů
Buňka základní stavební jednotka organismů Buňka Buňka je základní stavební a funkční jednotka těl organizmů. Toto se netýká virů (z lat. virus jed, je drobný vnitrobuněčný cizopasník nacházející se na
VíceDoména Archaea. Tato doména nebyla rozpoznána až do konce 70. let minulého století
Doména Archaea Tato doména nebyla rozpoznána až do konce 70. let minulého století jednobuněčné, prokaryotický typ buněk morfologie jako bakterie rozdíly jsou biochemické a genetické žijí v extrémních stanovištích,
VíceEmise vyvolaná působením fotonů nebo částic
Emise vyvolaná působením fotonů nebo částic PES (fotoelektronová spektroskopie) XPS (rentgenová fotoelektronová spektroskopie), ESCA (elektronová spektroskopie pro chemickou analýzu) UPS (ultrafialová
Více5. Bioreaktory. Schematicky jsou jednotlivé typy bioreaktorů znázorněny na obr. 5.1. Nejpoužívanějšími bioreaktory jsou míchací tanky.
5. Bioreaktory Bioreaktor (fermentor) je nejdůležitější částí výrobní linky biotechnologického procesu. Jde o nádobu různého objemu, ve které probíhá biologický proces. Dochází zde k růstu buněk a tvorbě
VíceMOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha
MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V BIOREMEDIACÍCH enumerace FISH průtoková cytometrie klonování produktů PCR sekvenování
VíceSTANOVENÍ, CHARAKTERIZACE A IDENTIFIKACE BIOREMEDIAČNÍCH MIKROORGANISMŮ
Abstrakt STANOVENÍ, CHARAKTERIZACE A IDENTIFIKACE BIOREMEDIAČNÍCH MIKROORGANISMŮ Jana Chumchalová, Eva Podholová, Jiří Mikeš, Vlastimil Píštěk EPS, s.r.o., V Pastouškách 205, 686 04 Kunovice, e-mail: eps@epssro.cz
VíceBIOLOGICKÉ LOUŽENÍ KAMÍNKU Z VÝROBY OLOVA
BIOLOGICKÉ LOUŽENÍ KAMÍNKU Z VÝROBY OLOVA Dana Krištofová,Vladimír Čablík, Peter Fečko a a) Vysoká škola báňská Technická univerzita Ostrava, 17. listopadu 15, 708 33 Ostrava Poruba, ČR, dana.kristofova@vsb.cz
VíceZákladní pojmy a vztahy: Vlnová délka (λ): vzdálenost dvou nejbližších bodů vlnění kmitajících ve stejné fázi
LRR/BUBCV CVIČENÍ Z BUNĚČNÉ BIOLOGIE 1. SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE A PREPARÁTY V MIKROSKOPII TEORETICKÝ ÚVOD: Mikroskopie je základní metoda, která nám umožňuje pozorovat velmi malé biologické objekty. Díky
VíceBiologické čištění odpadních vod - anaerobní procesy
Biologické čištění odpadních vod - anaerobní procesy Martin Pivokonský 7. přednáška, kurz Znečišťování a ochrana vod Ústav pro životní prostředí PřF UK Ústav pro hydrodynamiku AV ČR, v. v. i. Tel.: 221
VíceTřídění látek. Chemie 1.KŠPA
Třídění látek Chemie 1.KŠPA Systém (soustava) Vymezím si kus prostoru, látky v něm obsažené nazýváme systém soustava okolí svět Stěny soustavy Soustava může být: Izolovaná = stěny nedovolí výměnu částic
VíceUNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO - TECHNOLOGICKÁ
UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO - TECHNOLOGICKÁ BIOMINERALIZACE A JEJÍ VYUŽITÍ V NANOTECHNOLOGII Lucie Kissová BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2011 TADY BUDE OFICIÁLNÍ ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE 2 STRANY Poděkování
VíceIZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek
IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení
VícePřímé stanovení celkového počtu buněk kvasinek pomocí Bürkerovy komůrky Provedení vitálního testu
Přímé stanovení celkového počtu buněk kvasinek pomocí Bürkerovy komůrky Provedení vitálního testu Otázky k zamyšlení: Bude se jednat o přímé nebo nepřímé stanovení počtu buněk? Stanovujeme počet živých
VíceBiologické odstraňování nutrientů
Biologické odstraňování nutrientů Martin Pivokonský, Jana Načeradská 8. přednáška, kurz Znečišťování a ochrana vod Ústav pro životní prostředí PřF UK Ústav pro hydrodynamiku AV ČR, v. v. i. Nutrienty v
VíceIzolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie
Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny
VíceBiologické odstraňování nutrientů
Biologické odstraňování nutrientů Martin Pivokonský 8. přednáška, kurz Znečišťování a ochrana vod Ústav pro životní prostředí PřF UK Ústav pro hydrodynamiku AV ČR, v. v. i. Tel.: 221 951 909 E-mail: pivo@ih.cas.cz
VíceStřední průmyslová škola strojnická Olomouc, tř. 17. listopadu 49
Střední průmyslová škola strojnická Olomouc, tř. 17. listopadu 49 Výukový materiál zpracovaný v rámci projektu Výuka moderně Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0205 Šablona: III/2 Přírodovědné
VíceLátka toxická pro mikroorganismy a vyšší živočichy i v nízké koncentraci. Do prostředí se dostává: Používá se například:
Látka toxická pro mikroorganismy a vyšší živočichy i v nízké koncentraci. Do prostředí se dostává: při rozkladu organických zbytků lesních požárech většina má průmyslový původ Používá se například: při
VícePROBLÉMY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ ORGANISMY
PROBLÉMY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ ORGANISMY 2010 Ing. Andrea Sikorová, Ph.D. 1 Problémy životního prostředí - organismy V této kapitole se dozvíte: Co je to organismus. Z čeho se organismus skládá. Jak se dělí
VíceBIOLOGICKÁ MEMBRÁNA Prokaryontní Eukaryontní KOMPARTMENTŮ
BIOMEMRÁNA BIOLOGICKÁ MEMBRÁNA - všechny buňky na povrchu plazmatickou membránu - Prokaryontní buňky (viry, bakterie, sinice) - Eukaryontní buňky vnitřní členění do soustavy membrán KOMPARTMENTŮ - za
VíceZkouška inhibice růstu řas
Zkouška inhibice růstu řas VYPRACOVALI: TEREZA DVOŘÁKOVÁ JINDŘICH ŠMÍD Porovnáváme : Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas Scenedesmus subspicatus a Senastrum capricornutum : sekce C.3. Zkouška inhibice
VíceProjekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují
Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují s finanční podporou v Operačním programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost Královéhradeckého kraje Modul 02 Přírodovědné předměty Hana Gajdušková 1 Viry
Více) se ve vodě ihned rozpouští za tvorby amonných solí (iontová, disociovaná forma NH 4+ ). Vzájemný poměr obou forem závisí na ph a teplotě.
Amoniakální dusík Amoniakální dusík se vyskytuje téměř ve všech typech vod. Je primárním produktem rozkladu organických dusíkatých látek živočišného i rostlinného původu. Organického původu je rovněž ve
VíceProtokol č. 7 Pozorování živých a mrtvých buněk kvasinek Vitální test
Protokol č. 7 Pozorování živých a mrtvých buněk kvasinek Vitální test Cíl cvičení: Bude se jednat o přímé nebo nepřímé stanovení počtu buněk? Stanovujeme počet živých nebo mrtvých buněk? Jak odlišíme živé
VíceNanobiotechnologie a bionanotechnologie
Nanobiotechnologie a bionanotechnologie Ivo Šafařík Oddělení nanobiotechnologie Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, v.v.i České Budějovice Nanobiotechnologie a bionanotechnologie z pohledu nanočástic
VíceTest vlastnosti látek a periodická tabulka
DUM Základy přírodních věd DUM III/2-T3-2-08 Téma: Test vlastnosti látek a periodická tabulka Střední škola Rok: 2012 2013 Varianta: A Zpracoval: Mgr. Pavel Hrubý Mgr. Josef Kormaník TEST Test vlastnosti
VíceMIKROORGANISMY EDÍ. Ústav inženýrstv. enýrství ochrany ŽP FT UTB ve Zlíně
MIKROORGANISMY A OCHRANA ŽIVOTNÍHO PROSTŘED EDÍ Ústav inženýrstv enýrství ochrany ŽP FT UTB ve Zlíně Důvody využívání mikroorganismů v procesech ochrany životního prostřed edí jsou prakticky všudypřítomné
VíceMnohobuněčné kvasinky
Laboratoř buněčné biologie PROJEKT Mnohobuněčné kvasinky Libuše Váchová ve spolupráci s laboratoří Prof. Palkové (PřFUK) Do laboratoře přijímáme studenty se zájmem o vědeckou práci Kontakt: vachova@biomed.cas.cz
VíceHodnocení pekařského droždí
Hodnocení pekařského droždí Čistá mikrobiální kultura kvasinek Saccharomyces Cerevisiae Hanzen Vyrábí se aerobní fermentací melasové zápary Díky kvasným schopnostem zajišťují kvasinky nakynutí těsta ovlivňují
VíceIzolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..
Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich
VíceVitální barvení, rostlinná buňka, buněčné organely
Vitální barvení, rostlinná buňka, buněčné organely Vitální barvení používá se u nativních preparátů a rozumíme tím zvýšení kontrastu určitých buněčných složek v živých buňkách, nebo tkáních pomocí barvení
VíceCílená konstrukce bioaugmentačních preparátů a jejich pozice v procesu efektivních bioremediací
Cílená konstrukce bioaugmentačních preparátů a jejich pozice v procesu efektivních bioremediací Průmyslová ekologie 2011 Bioaugmentace cílené vnesení mikrobiální populace v podobě tzv. biopreparátu (inokula)
VíceÚloha protein-nekódujících transkriptů ve virulenci patogenních bakterií
Téma bakalářské práce: Úloha protein-nekódujících transkriptů ve virulenci patogenních bakterií Nové odvětví molekulární biologie se zabývá RNA molekulami, které se nepřekládají do proteinů, ale slouží
VíceÚPRAVA VODY V ENERGETICE. Ing. Jiří Tomčala
ÚPRAVA VODY V ENERGETICE Ing. Jiří Tomčala Úvod Voda je v elektrárnách po palivu nejdůležitější surovinou Její množství v provozních systémech elektráren je mnohonásobně větší než množství spotřebovaného
VíceVyužití analýzy celkových buněčných proteinů pomocí SDS-PAGE při charakterizaci fluorescentních pseudomonád izolovaných ze speleotém
Využití analýzy celkových buněčných proteinů pomocí SDS-PAGE při charakterizaci fluorescentních pseudomonád izolovaných ze speleotém Mgr. Marcel Kosina Česká sbírka mikroorganismů Masarykova univerzita,
Více3.02 Dělení směsí, aneb i separace může být legrace (filtrace). Projekt Trojlístek
3. Separační metody 3.02 Dělení směsí, aneb i separace může být legrace (filtrace). Projekt úroveň 1 2 3 1. Předmět výuky Metodika je určena pro vzdělávací obsah vzdělávacího předmětu Chemie. Chemie 2.
VíceAnalýza magnetických mikročástic mikroskopií atomárních sil
Analýza magnetických mikročástic mikroskopií atomárních sil Zapletalová 1 H., Tvrdíková 2 J., Kolářová 1 H. 1 Ústav lékařské biofyziky, LF UP Olomouc 2 Ústav chemie potravin a biotechnologií, CHF VUT Brno
VíceTEORETICKÝ ÚVOD. Počítání buněk
Jméno: Obor: Datum provedení: TEORETICKÝ ÚVOD Počítání buněk Jednou z nezbytných dovedností při práci s biologickým materiálemk je stanovení počtu buněk ve vzorku. V současné době se v praxi k počítání
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení dekochinátu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie
VíceRNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie PřF UP Olomouc 2008/11. *Ivana FELLNEROVÁ, PřF UP Olomouc*
RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie PřF UP Olomouc 2008/11 Prezentace navazuje na základní znalosti z biochemie (lipidy, proteiny, sacharidy) Rozšiřuje přednášky: Stavba cytoplazmatické membrány
VíceAnaerobní mikrobiální procesy - teorie, praxe a potenciál pro bioremediace ANAEROBNÍ LABORATOŘ. Metabolismus. Respirace. Fermentace.
Anaerobní mikrobiální procesy - teorie, praxe a potenciál pro Praxe I ANAEROBNÍ Praxe II LABORATOŘ Sanační technologie, 2013 Ipsum CNP zdroje Dolor Redfield Sit praxe Amet Proces látkové a energetické
VíceSada Životní prostředí UW400 Kat. číslo Stanovení obsahu kyslíku, nasycení kyslíkem a hodnoty BSK5
Sada Životní prostředí UW400 Kat. číslo 100.3720 Stanovení obsahu kyslíku, nasycení kyslíkem a hodnoty BSK5 Teorie a hodnocení Obsah kyslíku ve vodě má pro přežití organismů nesmírný význam. Podle něho
VíceOpakování
Slabé vazebné interakce Opakování Co je to atom? Opakování Opakování Co je to atom? Atom je nejmenší částice hmoty, chemicky dále nedělitelná. Skládá se z atomového jádra obsahujícího protony a neutrony
VíceChemicko-technologický průzkum barevných vrstev. Arcibiskupský zámek, Sala Terrena, Hornická Grotta. štuková plastika horníka
Chemicko-technologický průzkum barevných vrstev Arcibiskupský zámek, Sala Terrena, Hornická Grotta štuková plastika horníka Objekt: Předmět průzkumu: štuková plastika horníka, Hornická Grotta, Arcibiskupský
VíceFYZIOLOGIE ROSTLIN VÝŽIVA ROSTLIN 1) AUTOTROFNÍ VÝŽIVA ROSTLIN 2) HETEROTROFNÍ VÝŽIVA ROSTLIN
FYZIOLOGIE ROSTLIN Fyziologie rostlin, Biologie, 2.ročník 25 Podobor botaniky, který studuje životní funkce a individuální vývoj rostlin. Využívá poznatků z dalších odvětví biologie jako je morfologie,
VíceMŘÍŽKY A VADY. Vnitřní stavba materiálu
Poznámka: tyto materiály slouží pouze pro opakování STT žáků SPŠ Na Třebešíně, Praha 10;s platností do r. 2016 v návaznosti na platnost norem. Zákaz šířění a modifikace těchto materálů. Děkuji Ing. D.
VíceLABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie
LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) C Použití GC-MS spektrometrie Vedoucí práce: Doc. Ing. Petr Kačer, Ph.D., Ing. Kamila Syslová Umístění práce: laboratoř 79 Použití GC-MS spektrometrie
VíceKVALITATIVNÍ ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA ORGANICKÝCH LÁTEK
LABORATORNÍ PRÁCE Č. 24 KVALITATIVNÍ ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA ORGANICKÝCH LÁTEK PRINCIP Organická kvalitativní elementární analýza zkoumá chemické složení organických látek, zabývá se identifikací jednotlivých
VíceElektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM
Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM Historie 1931 E. Ruska a M. Knoll sestrojili první elektronový prozařovací mikroskop 1939 první vyrobený elektronový mikroskop firma Siemens rozlišení 10 nm 1965 první
VíceGENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI
GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI INDUKOVANÉ PŮSOBENÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Z PRACHOVÝCH ČÁSTIC V OVZDUŠÍ Kateřina Hanzalová Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR v.v.i.
VíceDenitrifikace odpadních vod s vysokou koncentrací dusičnanů
Denitrifikace odpadních vod s vysokou koncentrací dusičnanů Dorota Horová, Petr Bezucha Unipetrol výzkumně vzdělávací centrum, a.s., Ústí nad Labem dorota.horova@unicre.cz Souhrn Biologická denitrifikace
VíceExperimentální postupy. Půda Fyzikální vlastnosti půd Chemické vlastnosti půd
Experimentální postupy Půda Fyzikální vlastnosti půd Chemické vlastnosti půd Půda definice, složení Půda je heterogenní, vícefázový, polydisperzní, oživělý systém, vyznačující se určitými vlastnostmi fyzikálními,
VícePEMZA, ALTERNATIVNÍ FILTRAČNÍ MATERIÁL VE VODÁRENSTVÍ
PEMZA, ALTERNATIVNÍ FILTRAČNÍ MATERIÁL VE VODÁRENSTVÍ Ing. Ladislav Bartoš, PhD. 1), RNDr. Václav Dubánek. 2), Ing. Soňa Beyblová 3) 1) VEOLIA VODA ČESKÁ REPUBLIKA, a.s., Pařížská 11, 110 00 Praha 1 2)
VíceČÍSLO PROJEKTU: OPVK 1.4
NÁZEV ŠKOLY: Základní škola Javorník, okres Jeseník REDIZO: 600 150 585 NÁZEV: VY_32_INOVACE_185_Skupenství AUTOR: Ing. Gavlas Miroslav ROČNÍK, DATUM: 8., 16.11.2011 VZDĚL. OBOR, TÉMA: Fyzika, ČÍSLO PROJEKTU:
VíceVY_32_INOVACE_002. VÝUKOVÝ MATERIÁL zpracovaný v rámci projektu EU peníze školám
VY_32_INOVACE_002 VÝUKOVÝ MATERIÁL zpracovaný v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ. 1.07. /1. 5. 00 / 34. 0696 Šablona: III/2 Název: Buňka Vyučovací předmět: Základy ekologie
VíceVliv selenu, zinku a kadmia na růstový vývoj česneku kuchyňského (Allium sativum L.)
Vliv selenu, zinku a kadmia na růstový vývoj česneku kuchyňského (Allium sativum L.) Botanická charakteristika: ČESNEK KUCHYŇSKÝ (ALLIUM SATIVUM L.) Pravlastí je Džungarsko (severní Čína) v Střední Asii,
VíceOBSAH 1 ÚVOD... 7. 1.1 Výrobek a materiál... 7 1.2 Přehled a klasifikace materiálů pro výrobu... 8 2 ZDROJE DŘEVA... 13
OBSAH 1 ÚVOD................................................. 7 1.1 Výrobek a materiál........................................ 7 1.2 Přehled a klasifikace materiálů pro výrobu..................... 8 2
VíceMolekulární biotechnologie č.9. Cílená mutageneze a proteinové inženýrství
Molekulární biotechnologie č.9 Cílená mutageneze a proteinové inženýrství Gen kódující jakýkoliv protein lze izolovat z přírody, klonovat, exprimovat v hostitelském organismu. rekombinantní protein purifikovat
VíceTypy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA).
Typy nukleových kyselin Existují dva typy nukleových kyselin (NA, z anglických slov nucleic acid): deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA). DNA je lokalizována v buněčném jádře, RNA v cytoplasmě a
VíceStruktura bílkovin očima elektronové mikroskopie
Struktura bílkovin očima elektronové mikroskopie Roman Kouřil Katedra Biofyziky (http://biofyzika.upol.cz) Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum Přírodovědecká fakulta, Univerzita
VíceMagnetické částice, izolace a detekce chřipky (hemaglutininu)
Název: Magnetické částice, izolace a detekce chřipky (hemaglutininu) Školitel: Ludmila Krejčová, MVDr. Datum: 7.11. 2013 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního
VíceEva Benešová. Dýchací řetězec
Eva Benešová Dýchací řetězec Dýchací řetězec Během oxidace látek vstupujících do různých metabolických cyklů (glykolýza, CC, beta-oxidace MK) vznikají NADH a FADH 2, které následně vstupují do DŘ. V DŘ
VíceBuňka. Kristýna Obhlídalová 7.A
Buňka Kristýna Obhlídalová 7.A Buňka Buňky jsou nejmenší a nejjednodušší útvary schopné samostatného života. Buňka je základní stavební a funkční jednotkou živých organismů. Zatímco některé organismy jsou
VíceMendělejevova tabulka prvků
Mendělejevova tabulka prvků V sušině rostlin je obsaženo přibližně 45% uhlíku, 42% kyslíku, 6,5% vodíku, 1,5% dusíku a 5% minerálních prvků. Tzv. organogenní prvky (C, O, H, N) představují tedy 95% veškerých
VíceBuňka. Autor: Mgr. Jitka Mašková Datum: Gymnázium, Třeboň, Na Sadech 308
Buňka Autor: Mgr. Jitka Mašková Datum: 27. 10. 2012 Gymnázium, Třeboň, Na Sadech 308 Číslo projektu Číslo materiálu CZ.1.07/1.5.00/34.0702 VY_32_INOVACE_BIO.prima.02_buňka Škola Gymnázium, Třeboň, Na Sadech
VíceStanovení mikroskopického obrazu ve vodě Petr Pumann
Stanovení mikroskopického obrazu ve vodě Petr Pumann Determinační kurz 2009 15.-18.6.2009 Dolní Věstonice Co se nachází při mikroskopickém rozboru vody? sinice a řasy prvoci (bezbarví bičíkovci, nálevníci)
VíceOptické spektroskopie 1 LS 2014/15
Optické spektroskopie 1 LS 2014/15 Martin Kubala 585634179 mkubala@prfnw.upol.cz 1.Úvod Velikosti objektů v přírodě Dítě ~ 1 m (10 0 m) Prst ~ 2 cm (10-2 m) Vlas ~ 0.1 mm (10-4 m) Buňka ~ 20 m (10-5 m)
VíceMetabolismus, taxonomie a identifikace bakterií. Karel Holada khola@lf1.cuni.cz
Metabolismus, taxonomie a identifikace bakterií Karel Holada khola@lf1.cuni.cz Klíčová slova Obligátní aeroby Obligátní anaeroby Aerotolerantní b. Fakultativní anaeroby Mikroaerofilní b. Kapnofilní bakterie
VíceSeznam řešených projektů včetně informací o délce trvání projektu, objemu a poskytovateli finančních prostředků
Seznam řešených projektů včetně informací o délce trvání projektu, objemu a poskytovateli finančních prostředků Podíl na řešení celkem: 52 grantových projektů V roli hlavního e/e za UP/spoluautora návrhu
Více