IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

Transkript

1 IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

2 Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení detekce po izolaci a následné separaci proteinů - SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

3 METODA 1: Fluorescenční barvení detekce F-aktinu, G-aktinu a DNA dvě formy: F-aktin: phalloidin konjugovaný s TRITC G-aktin: DNáza I konjugovaná s Alexa Fluor 488 DNA: DAPI G-aktin = globulární, jedna molekula nezpolymerované formy F-aktin = filamenta, polymerované do vláken použité buňky buněčná linie NES2Y (lidské -buňky Langerhansových ostrůvků)

4 METODA 1: Fluorescenční barvení Signál produkující molekula zviditelnění detekované molekuly Detekovaná molekula ve vzorku neviditelné

5 METODA 1: Fluorescenční barvení detekce F-aktinu PHALLOIDIN jed z houby Amanita phalloides specificky váže F-aktin kovalentní připojení fluoroforu nemá vliv na vazbu phalloidinu k F-aktinu TRITC po excitaci zeleným světlem vyzařuje červené světlo

6 METODA 1: Fluorescenční barvení detekce F-aktinu TRITC zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu F-aktin ve vzorku neviditelné

7 METODA 1: Fluorescenční barvení detekce G-aktinu DNáza I malý protein, který specificky interaguje s G-aktinem v jádře fyziologická funkce této interakce není známa (je možné, že vazba ke G-aktinu slouží k regulaci aktivity DNázy) vazba fluoroforu neovlivňuje vazbu na G-aktin AlexaFluor 488 po excitaci modrým světlem vyzařuje zelené světlo

8 METODA 1: Fluorescenční barvení detekce G-aktinu AlexaFluor 488 zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu G-aktin ve vzorku neviditelné

9 METODA 1: Fluorescenční barvení detekce DNA DAPI interkaluje se do malého žlábku dsdna tato vazba zvyšuje excitační vlastnosti DAPI po excitaci UV světlem vyzařuje modré světlo

10 METODA 1: Fluorescenční barvení detekce DNA UV DAPI DAPI DNA zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu DNA ve vzorku neviditelné

11 Fixace první krok přípravy vzorku brání rozkladu a autolýze tkáně cíl - zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín) vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet tkáň se stává rigidnější (snazší manipulace)

12 Pracovní postup: fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS inkubace buněk s phalloidinem-tritc a DNázou I-Alexa Fluor 488 odstranění nevázaného phalloidinu-tritc a DNázy I-Alexa Fluor 488 pomocí opakovaného promytí v PBS barvení DNA pomocí DAPI pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

13 Trojité barvení F-aktinu, G-aktinu a DNA

14

15 METODA 2: Porovnání zastoupení aktinu v různých typech tkání pomocí metody SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného) Izolace proteinů z různých typů tkání použité typy tkání: sval srdce játra

16 Izolace proteinů z tkáně: prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk dezintegrace (lýza) buněk působením: chemickým (používáme v našem experimentu) mechanickým fyzikálním

17

18 Pracovní postup: Izolace proteinů přenos tkáně do zkumavky dezintegrace buněk pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát) oddělení směsi proteinů od nezlyzované tkáně centrifugací Stanovení koncentrace proteinů pomocí metody podle Bradfordové použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu nezbytného pro vytvoření kalibrační křivky

19 Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícím SDS nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinů na polyakrylamidový gel separace proteinů pomocí vertikální elektroforézy Identifikace proteinů barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku Coomassie Brilliant blue lokalizace aktinu a ostatních proteinů v gelu, porovnání míry exprese v jednotlivých tkáních

20 Princip metody Bradfordové kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (arginin (ARG), fenylalanin (PHE), tryptofan (TRY) a prolin (PRO))

21 Coomassie Brilliant Blue po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou detekce při 595 nm

22 Kalibrační křivka Absorbance (A595 nm) y = x R 2 = BSA (ug/ul)