Svět RNA a bílkovin. Transkripce. Transkripce TRANSKRIPCE. Úrovně regulace genové exprese eukaryot

Transkript

1 Úrovně regulace genové exprese eukaryot Svět RNA a bílkovin TRANSKRIPCE Transkripce Transkripce DNAvazebné bílkoviny DNAvazebné bílkoviny 1

2 DNA dependentní Katalyzuje chemicky téměř stejnou reakci jako DNA polymerasa při replikaci Rozdíly: délka syntetizované molekuly disociace RNA z templátového vlákna DNA inkorporace ribonukleotidů start syntézy bez přítomnosti primeru vyšší frekvence chyb (10 4 x 10 7 ) Transkripční jednotka každý přepisovaný úsek DNA RNAOH + pppnoh > RNApNOH + pp Vznik fosfodiesterové vazby Rychlost 4590 nt/s RNAOH + pppnoh > RNApNOH + pp Vznik fosfodiesterové vazby Aktivní centrum Několik zbytků Asp Dva atomy Mg ++ Mg ++ (A) aktivace 3 OH k nukleofilnímu ataku αp v NTP Mg ++ (B) disociace PPi a translokace RNAP podél DNA Pohyb RNA polymerasy po vlákně DNA DNA supercoiling DNA topoisomerasa 2

3 Typy RNA v buňce Bakteriální Core RNAP 5 bílkovin: 2 podjednotky α, po jedné podjednotce β, β a ω podjednotka α spolupodílí se na rozpoznání promotoru podjednotky β a β katalytické centrum enzymu In vitro syntéza RNA podle templátu bez promotoru bez dalších faktorů In vivo specifická aktivita kontrolována pomocí faktorů σ rozpoznávají promotorové elementy bezprostředně proti proudu od začátku transkripce po ukončení iniciace z holoenzymu disociuje Eukaryotické RNA polymerasy Transkripce Komplex 814 podjednotek Společný evoluční původ všech typů RNAP Homologie jednotlivých podjednotek různých typů RNAP DNAvazebné bílkoviny Částečná homologie určitých podjednotek s podjednotkami bakteriální RNAP 3

4 Kooperace core RNAP a obecných a specifických transkripčních faktorů Vícesložkový komplex Stabilní transkripční komplex Prvnístabilníkomplex vytvořený při iniciaci transkripce 1) Stabilita v přítomnosti detergentu a kompetující DNA 2) Přítomnost faktorů, které po vzniku komplexu disociují I Acanthamoeba Jediný transkripční faktor TIF1 Zodpovědný za rozpoznání sekvence promotoru i asociaci RNAP I Zůstává navázaný na promotor i po zahájení transkripce asociace další RNAP I Obratlovci UBF rozpoznání DNA sekvence promotoru SL1 homolog TIF1, nezbytný pro navázání RNAP I vedlejší úloha při vlastní transkripci, nezbytné pro vytvoření stabilního transkripčního komplexu X X X X III Tři třídy I, II, III I. třída (gen pro 5S rrna) Sekvenčně specifické navázání TFIIIA a TFIIIC na promotor Asociace TFIIIB (proteinprotein) Disociace TFIIIA a TFIIIC Navázání RNAP III a transkripce II. třída (geny pro trna) Absence TFIIIA III. třída (např. gen pro U6 snrna) TATA box v promotoru Aktivita TFIIIB a dalších pomocných faktorů II Intenzivní regulace Bazální (stabilní) transkripční komplex esenciální pro iniciaci a průběh transkripce schopnost transkripce in vitro mnohem více složek než u ostatních RNAP Formování stabilního transkripčního komplexu 1. TFIIA/TFIID 2. TFIIB 3. TFIIF TFIIE/TFIIH/TFIIJ 6. RNAP holoenzym iniciace transkripce TFIIH kinasa a helikasa pohyb RNAP a TFIIF po DNA TFIIA/TFIID zůstávají na promotoru snad disociace TFIIE/H/J/B 4

5 Teorie holoenzymu RNA polymerasy RNAPII v eukaryotické buňce Alternativní cesta vytvoření holoenzymu navázání předem zformovaného komplexu RNA polymerasy na DNA Bazální transkripční komplex Transkripce DNAvazebné bílkoviny TFIIE heterodimer často komplexy řady rozdílných bílkovin společně zodpovědných za vlastnosti toho kterého faktoru TFIIH multiproteinový komplex kinasa RNA helikasa a další TFIIF heterodimer TFIID multiproteinový komplex TBP TATA box binding protein TAFs (TBPassociated factors) koaktivátory neváží se na TATA box 5

6 RNA helikasa Kinasa TATA boxbinding protein (TBP) Jedna z nejkonzervovanějších eukaryotických bílkovin Kritická úloha při transkripci promotorů obsahujících TATA box Regulační úloha TFIIH TFIIA TFIIB Vazba TBP na TATA box první krok formování stabilního transkripčního komplexu Tvar sedla po navázání mění tvar DNA Velikost jednoho nukleosomu Funkce TBP Změna struktury nukleosomu Komplex DNA/TBP ústřední platforma pro formování STK TBP RNAP II promotory postrádající TATA box některé housekeeping geny některé tkáňově specifické geny Kritická úloha TBP při formování STK Vazba TBP prostřednictvím INRBP (vazba k INR) TBP základní transkripční faktor úloha paralelní úloze SL1 (RNAP I) a TFIIIB (RNAP III) 6

7 TATA boxbinding protein RNAP I SL1 komplex čtyř faktorů vazba prostřednictvím UBF RNAP III TFIIIB komplex mnoha faktorů I. třída vazba prostřednictvím TFIIIA a TFIIIC II. třída vazba prostřednictvím TFIIIC III. třída přímá vazba k TATA boxu III. II. TBP evolučně starobylý transkripční faktor Podobnost jednotlivých typů RNAP ~ společná účast TBP Existence před divergencí tří typů RNAP Existence před rozdělením říší Archaebacteria a Eukaryota Popsány homology TBP i u archebakterií TBP základní transkripční faktor úloha je podjednotkou paralelní úloze SL1 SL1 (RNAP I) I) a TFIIIB a (RNAP III) III) Transkripce Identifikace promotoru (promoter engagement) Přechod RNAP ze zavřené do otevřenékonformacepřes RPi intermediát DNAvazebné bílkoviny Recyklace Terminace Elongace Uvolnění promotoru (promoter clearance) Syntéza iniciační fosfodiesterové vazby 7

8 Cterminální doména Transkripce CTD platforma Tandemová repetice heptapeptidu TyrSerProThrSerProSer 1. Regulace aktivity RNAP II Defosforylovaná forma asociace s promotorem Fosforylace iniciace konformačních změn, stabilizace ternálního komplexu 2. Platforma pro asociaci komplexů posttranskripčních modifikací nascentního transkriptu Vytvoření čepičky, sestřih, rozštěpení, polyadenylace DNAvazebné bílkoviny Rozdílná míra transkripce různých genů Regulace transkripce 8

9 Promotor Oblast DNA předcházející transkribovaný gen obsahující obecné i specifické regulační sekvenční prvky Transkripce Jádro promotoru (core promoter) oblast mezi TATA boxem a počátkem transkripce Obecné sekvenční elementy Vazba obecných TF TATA box Regulační sekvenční elementy Vazba specifických TF HSE, MRE, GRE, CRE Vzdálené sekvenční elementy Enhancers, silencers Vazba specifických bílkovin DNAvazebné bílkoviny jsou bílkoviny 1) vážící se k sekvencím DNA zpřístupněným díky změnám na úrovni chromatinu 2) ovlivňující transkripci prostřednictvím přímých nebo nepřímých interakcí s komplexem RNA polymerasy Předpoklady 1) vazba k specifickým sekvencím v DNA 2) interakce s dalšími bílkovinnými faktory či přímo s RNA polymerasou 3) prostorově a časově regulovaná syntéza či aktivace TF 9

10 Helixturnhelix motiv Dvě αšroubovice v úhlu cca 120 ; smyčka většinou 3 aa První popsaný motiv HTH Helixturnhelix motiv Časté homo/heterodimery Funkční specializace regulace transkripce různých genů jedním TF Rodiny TF: Homeobox/homeodomain Recognition helix interakce s velkým žlábkem DNA Přídavné šroubovice zvýšení vazebné specificity Kvasinky α2 represor represe transkripce a1/mcmi specificita vazby Zinc finger motiv Zinc finger motiv Strukturní úloha Zn 2+ inotu Tetraedrová struktura C4 či C2H2 zbytků koordinovaná iontem Zn 2+ Expozice cca 12 aa prstu pro interakci s DNA v oblasti velkého žlábku Častá multimerizace motivu většinou 3 a více prstů interakce s DNA v intervalu cca 3 bp Extrémy: Drápatka, Xfin 37 prstů Člověk, TDF 13 prstů I. třída Cys 2 His 2 Zn 1 Častá dimerizace TF estrogen receptor II. třída Cys 8 Zn 2 III. třída Cys 6 Zn 2 kvasinky IV. třída Cys 3 His 1 Zn 1 rostliny, HIV 10

11 Basická DNAvazebná doména Leucine zipper motiv Leucine zipper motiv rodina bzip Helixloophelix motiv rodina bhlh Původní model: Leu tvoří zuby zipu dvou antiparalelních šroubovic Modifikovaný model: Interakce dvou paralelních šroubovic prostřednictvím Leu zbytků 3040 aa zbytků αšroubovice, každá sedmá aa Leu, 3,6 Leu/otáčku Leu ob otáčku na stejné straně Dimerizace bzip TF Leucinový zip dimerizační doména Dimer struktura coiled coil Zásadní pro funkci TF Helixloophelix motiv Monomer: dvě αšroubovice spojené 524 aa smyčkou Amfipatické šroubovice, hydrofobní aa značně konzervované Dimerizace Dimer: svazek čtyř αšroubovic stabilizovaný hydrofobním jádrem Homodimery Heterodimery Heterodimery bhlhbzip 11

12 Transkripce DNAvazebné bílkoviny 12

13 Transkripce Lákání opylovačů Model evoluce diverzity epidermálních buněk Ochrana DNAvazebné bílkoviny Vodní režim a výměna plynů Nespecializované buňky Příjem živin Lákání opylovačů Komplex MYBbHLHWD40 Regulace vývoje květních orgánů Ústřední úloha TTG1 jádro pro navázání bhlh a MYB faktorů Apikální meristém > květní meristém Květní meristém > kalich, koruna, tyčinky, pestík 1) Geny identity květního meristému Prvotní indukce genů orgánové identity Třída A Třída B Třída C 2) Katastrální geny Prostorová regulace genů orgánové identity 3) Geny identity květních orgánů Kontrola tvorby a funkce květních orgánů 13

14 Raný ABC model Klasický ABC model A + + Identita čtyř květních orgánů je dána unikátní kombinací tří genových aktivit B + + C + + Kalich Koruna Tyčinky Pestík List Třída A Třída B Třída C Tři geny orgánové identity a, b, c Haughn a Somerville, Dev. Genet ) Za aktivitami A, B, C může být více než jeden gen 2) Vzájemná negativní regulace aktivit A a C Coen a Meyerowitz, Nature 1991 Divoký typ Ztráta aktivity A Regulace vývoje květních orgánů Ztráta aktivity B Ztráta aktivity C Čtyřnásobný mutant (ap1,ap2,ap3/pi,ag) Třída A Třída B Třída C Johann Wolfgang Goethe ( ): Květní orgány představují vysoce modifikované listy 14

15 Nové, komplikovanější modely Nutná reklasifikace významů ABC 1) oblasti květního meristému Nové, komplikovanější modely Nutná reklasifikace významů ABC 1) oblasti květního meristému ABCD model 2) třídy homeotických mutací 3) regulační genové funkce ABCDE model 2) třídy homeotických mutací 3) regulační genové funkce SEPALATA (13) sep1;sep2;sep3 mutant ~ BC double mutant Nutná kooperace aktivit B a C se SEP SEP > nová třída D ABCD model SEPALATA (13) sep1;sep2;sep3 mutant ~ BC double mutant Nutná kooperace aktivit B a C se SEP Gerbera: gen GRCD1 nutný pro vývoj vajíček v semeníku Arabidopsis homolog AGL11? nová třída D (SEP > třída E) ABCDE model Pelaz et al., Nature 2000 Theissen, Curr. Opin. Plant Biol Nové, komplikovanější modely kvartetový model Regulace vývoje květních orgánů Arabidopsis thaliana Identita čtyř květních orgánů je dána unikátní kombinací produktů čtyř homeotických genů Theissen, Curr. Opin. Plant Biol EspinosaSoto, The Plant Cell 2004 Petunia hybrida 15