Hodnocení genotoxického potenciálu UV filtru

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ Hodnocení genotoxického potenciálu UV filtru Diplomová práce Anežka Nečasová VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. PAVEL ČUPR, Ph.D. BRNO 2013

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Bc. Anežka Nečasová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Hodnocení genotoxického potenciálu UV filtru Chemie Chemie životního prostředí RNDr. Pavel Čupr, Ph.D. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 85 Klíčová slova: Genotoxicita, UV filtry, EHMC, fotoisomerizace, optické isomery, UmuC test, SOS Chromotest

3 Bibliographic Entry Author Bc. Anežka Nečasová Faculty of Science, Masaryk University Research Centre for Toxic Compounds in the Environment Title of Thesis: Degreeprogramme: Field of Study: Supervisor: Evaluation of the genotoxicity of UV sunscreen Chemistry Chemistry of environment RNDr. Pavel Čupr, Ph.D. Academic Year: 2012/2013 Numberof Pages: 85 Keywords: Genotoxicity, UV filters, EHMC, photoisomerisation, optical isomers, UmuC test, SOS Chromotest

4 Abstrakt UV filtry používané v kosmetických přípravcích jsou denně aplikovány na kůži zejména v letních měsících pro ochranu před škodlivým UV zářením, proto je důležité se zabývat jejich případnými biologickými efekty a znát jejich mechanismy působení. V řadě studií bylo prokázáno, že některé UV filtry, patřící paradoxně mezi nejpoužívanější aktivní složky opalovacích krémů, působí na endokrinní systém. Mezi tyto UV filtry patří také EHMC (trans-ehmc isomer), který na světle podléhá fotodegradaci, při níž vzniká méně stabilní optický isomer cis-ehmc. Toxikologické studie se doposud zabývaly jen isomerní formou trans-ehmc a informace o fotoproduktu cis-ehmc chybí. Tato diplomová práce se zabývá hodnocením rozdílných odpovědí obou isomerů ve vybraných testech toxicity. Jelikož cis-ehmc není dostupný jako standard, bylo nutné vyvinout metodiku ozařování EHMC pomocí UV světla a metodu separace cis-isomeru z ozářené směsi. Z důvodu ověření přesných koncentrací v průběhu testování byly isomery cis i trans analyzovány pomocí GC-FID. Byla vyvinuta metodika separace cis-ehmc, kdy bylo dosaženo velmi vysokého výtěžku cis-isomeru o čistotě více než 98 %. Cis-EHMC byl testován spolu se standardem EHMC na modelech genotoxicity UmuC test a SOS Chromotest. Cílem práce bylo také zavést inovovanou metodu UmuC testu s použitím substrátu CPRG do laboratoře RECETOX. Cis-EHMC a standard EHMC byl rovněž testován na estrogenní aktivitu na buňkách MVLN a HeLa9903. V testech estrogenity nebyl estrogenní potenciál EHMC potvrzen. Standard EHMC a izolovaný cis-isomer vykázaly rozdílné odpovědi v testech genotoxicity. Je tedy potřeba se této látce věnovat v dalších studiích.

5 Abstract UV filters used in cosmetic products are applied to the skin daily in the summer months to protect against harmful UV rays, so it is important to consider the biological effects and know their mechanisms of action. a number of studies have shown that some UV filters, paradoxically the most widely used sunscreens, have an influence on the endocrine system. Among these UV filters belong also EHMC (trans isomer EHMC) that is subject to photodegradation under UV light and in this process is created less stable optical isomer cis-ehmc. Toxicological studies have examined only isomeric form of trans-ehmc and information about photoproducts cis-ehmc is missing. This thesis deals with the evaluation of different responses of the two isomers in selected toxicity tests. Since cis EHMC is not available as a standard, it was necessary to develop a methodology EHMC irradiation with UV light and the method of separation of cis-isomer from the irradiated mixture. In order to verify the exact concentrations during the testing were the isomers cis-and trans analyzed by GC-FID. It was developed methodology separation of cis-ehmc, achieving a very high yield of cis-isomer with a purity of more than 98%. Cis EHMC was tested together with the standard model of EHMC on two models of genotoxicity: UmuC test and SOS Chromotest. The aim of this thesis was to introduce to the laboratory RECETOX an innovative method of UmuC test using the substrate CPRG to the. Cis-EHMC and standard of EHMC was also tested for estrogenic activity in cells MVLN and HeLa9903. In the tests of estrogenicity wasn t confirmed the estrogenic potential EHMC. Standard of EHMC and isolated cis-isomer showed different responses in tests of genotoxicity. It is therefore necessary to devote to this substance in further studies.

6

7 Poděkování Děkuji svému vedoucímu, RNDr. Pavlu Čuprovi, Ph.D. za trpělivé vedení mé diplomové práce, za jeho velkou motivaci a odborné rady, děkuji doc. RNDr. Zdeňku Šimkovi, Csc. a Mgr. Jaromíru Literákovi, Ph.D. za pomoc při realizaci analytické části experimentů. Velký dík patří také Mgr. Jiřímu Novákovi, Ph.D. za pomoc při realizaci toxikologických experimentů. Ze srdce děkuji svým rodičům a blízkým, kteří mě ve studiu nesmírně podporují. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 15. května 2013 Anežka Nečasová

8 OBSAH Seznam zkratek Úvod Cíle diplomové práce Teoretická část UV záření Vlivy UV záření Kůže Působení UV záření na pokožku Trendy v opalování Příznivé působení UV záření UV filtry a jejich vlastnosti Sun Protection Factor UV filtry a jejich rozdělení Chemické (organické) filtry Organické nerozpustné pigmenty Minerální (anorganické) UV filtry Ethylhexyl methoxycinamát Toxicita EHMC Karcinogenita, genotoxicita EHMC Genotoxicita vymezení pojmů Imunotoxicita a alergenní potenciál EHMC Testy EHMC laboratoře EnTox Test imunotoxicity Estrogenní potenciál EHMC Fotoisomerizace EHMC a jiných UV filtrů Fotostabilita a reakční kinetika Fytotoxicita Penetrace sunscreenů přes pokožku Produkce reaktivních forem kyslíku v souvislosti se sunscreeny Potenciální rizika pro vodní prostředí Zajímavé poznatky o opalovacích krémech Materiály a metody Chemická analýza UV filtrů Ozařování UV-lampou Analýza fotoproduktu Plynová chromatografie Metody separace Chromatografie na tenké vrstvě Sloupcová kapalinová chromatografie Použité bakteriální kultury v testech genotoxicity Escherichia coli

9 Escherichia coli K Salmonella Typhimurium DMSO a jeho vliv na buněčnou membránu SOS Chromotest Příprava zamražené kultury Provedení testu Příprava médií Pracovní postup Zpracování výsledků Porovnání citlivosti SOS Chromotestu v mezilaboratorní studii UmuC test Příprava zamražené kultury Provedení testu Příprava médií Pracovní postup Zpracování výsledků Validace testu Testy estrogenního potenciálu Test na buněčných liniích MVLN Test na buněčných liniích HeLa Výsledky a diskuze Ozařování a fotoprodukty látky EHMC Separace cis-isomeru Chromatografie na tenké vrstvě Kolonová chromatografie SOS Chromotest a UmuC test na cis-ehmc a standardu EHMC SOS Chromotest UmuC test Test estrogenity cis-ehmc a standardu EHMC na buněčných liniích MVLN Test estrogenity cis-ehmc a standardu EHMC na buněčných liniích HeLa Analýza rizik EHMC a dalších sunscreenů Výpočet CDI (Chronic Daily Intake) Výsledky a diskuze analýzy rizik EHMC MBC BP Závěr Použitá literatura

10 Seznam zkratek 3-BC 3-benzylidene camphor 4-MBC 4-methylbenzylidene camphor 4-NQO 4-nitroquinoline-1-oxid AAD americká akademie pro dermatologii (American Academy of Dermatology) ACN acetonitril AT přepočet na časový průměr (averaging time) BL blank BMBM butyl methoxydibenzoylmethane BP-3 benzophenone-3 BP-4 benzophenone-4 BP-10 benzophenone-10 BW tělesná hmotnost (Body Weight) CA množství aplikované dávky (applied concentration) CAS číselné identifikátory látek přiřazené Chemical Abstracts Service CDDP cis-dichloro-diamin-platina CDI chronický denní příjem (Chronic Daily Intake) cis-ehmc (Z)-2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate CPRG chlorophenol red-β-d-galactopyranoside ΔD nárůst během inkubace DAD detektor s diodovým polem (Diode array detector) DCM dichlormethan DDT dichlordifenyltrichlorethan DMEM medium pro kultivaci buněk (Dulbecco's Modified Eagle Medium) DMSO dimethylsulfoxid DNA deoxyribonukleová kyselina EE 2 ethinylestradiol E 2 17β-estradiol EBPI společnost zaměřující se na biotechnologie (Environmental Bio-detection Products Inc.) EC 50 efektivní koncentrace testované látky, při které dochází k úhynu nebo imobilizaci 50 % organismů ED doba expozice (exposure duration) ED 50 efektivní dávka testované látky, při které dochází k úhynu nebo imobilizaci 50 % organismů E-EHMC (E)-2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate EF četnost expozice (exposure frequency) EHDPABA ethylhexyl dimethyl p-aminobenzoate EHMC 2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate EHTMC 2-ethylhexyl-2,4,5-trimethoxycinnamate ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EnTox National Research Centre for Environmental Toxicology ER estrogenní receptor EWG Environmental Working Group FDA Food and Drug Administration FID plamenově ionizační detektor (Flame Ionization Detector) G růstový faktor (growth factor) GC plynová chromatografie (Gass Chromatography) HCH hexachlorcyklohexan HeLa9903 lidské buňky karcinomu děložního čípku HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid HI hazard index HLB hydrofilně-lipofilní rovnováha HMS 2-hydroxybenzoic acid-3,3,5-trimethylcyclohexyl ester HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography) HWN Health Worldnet IAMC isoamyl p-methoxy cinnamate IARC International Agency for Research on Cancer 10

11 IF IFN IL INH IR LC LPS MCF-7 MS MVLN n app NK NOAEL NTP OC OD-PABA OMC ONPG PABA PAH PBSA PCB Perm PK PLE PNPP PPD PUVA RB RECETOX REF RfD ROS SA SBSE SCC SCCP SCCNFP SD SDS SF SPE SPF TLC TMB trans-ehmc UF UT UV UVA UVB UVC Z-EHMC indukční faktor interferon interleukin inhibice index ratio kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography) lipopolysacharid buňky lidského karcinomu prsu hmotnostní spektrometr (mass spectometry) lidské buňky karcinomu prsu četnost aplikace za den (number of application) negativní kontrola hodnota dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku (no observed adverse effect level) oddělení pro lidské zdraví (National Toxicology Program) octocrylene octyl dimethyl-p-aminobenzoate octyl methoxycinnamate (2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate) 2-nitrophenyl β-d-galactopyranoside para-aminobenzoic acid polyaromatické uhlovodíky phenylbenzimidazole sulphonic acid polychlorované bifenyly procento sledované látky, které projde přes kůži pozitivní kontrola extrakce akcelerovaná rozpouštědlem (Pressurized liqiud extraction) 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate trvalé ztmavení pigmentu (Persistent Pigment Darkening) ozáření UVA v kombinaci s psoraleny, používáno v dermatologické fyzioterapii testovaná látka Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí (Research Centre for Toxic Compounds in the Environment) finální obohacovací faktor referenční dávka reaktivní formy kyslíku povrch dostupný pro kontakt s testovanou látkou extrakce na míchací tyčince Scientific Committee on Cosmetology Scientific Committee on Consumer Products Scientific Committee on Cosmetology and Non-food products intended for Consumers směrodatná odchylka dodeccylsíran sodný (Sodium dodecyl sulfate) stacionární fáze extrakce na tuhé fázi (Solid phase extraction) ochranný sluneční faktor (Sun Protection Factor) chromatografie na tenké vrstvě (Thin Layer Chromatography) di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxybenzalmalonate (E)-2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate faktor nejistoty (uncertainty factor) relativní jednotka ultrafialové záření ultrafialové záření v oblasti A ( nm) ultrafialové záření v oblasti B ( nm) ultrafialové záření v oblasti C ( nm) (Z)-2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate 11

12 1. Úvod Opalovací krémy jsou kosmetickými přípravky, se kterými se setkáváme denně zejména během letních měsíců. Naše pokožka je chemickým látkám, které jsou v těchto ochranných prostředcích obsaženy, exponována nezanedbatelným koncentracím. Je proto nutné znát toxické vlastnosti těchto látek. Důležitým aspektem, který by neměl být opomíjen, je celkový scénář, spolupůsobení faktorů, ovlivňující reaktivitu těchto látek, prostupnost přes kůži, jejich molekulární přeměnu a degradační procesy. Je tedy nezbytné zahrnout veškeré faktory při hodnocení nebezpečnosti těchto látek. Sunscreeny jsou látky, které mohou na slunci působením UV záření podléhat degradačním procesům či reakcím, zejména fotodegradaci. Příkladem takového UV filtru je EHMC, který podléhá isomerizaci poměrně v krátkém čase, kdy ze stabilnější formy trans-ehmc vzniká cis-ehmc, jehož komplexní biologické efekty nejsou doposud známy a je potřeba tyto chybějící údaje doplnit. Tato práce je zaměřena na hodnocení genotoxického potenciálu zmíněného UV filtru a také na jeho estrogenní potenciál. Genotoxicita je toxický efekt, při němž dochází ke změnám a poškození genetické informace v buňkách. Genotoxický potenciál by měl být studován u všech chemických látek, jejich forem a degradačních produktů v životním prostředí. Genotoxicita isomeru cis-ehmc nebyla dosud testována. Tato diplomová práce hodnotí genotoxický potenciál tohoto optického isomeru pomocí dvou modelů genotoxicity SOS Chromotest (Quillardet et al. 1982) a UmuC test (Oda et al. 1985). První část práce (kapitola 3. Teoretická část) je věnována souhrnu informací o sunscreenech používaných v Evropě, jejich rozdělení, popis mechanismu působení, nové trendy a poznatky o potenciální nebezpečnosti těchto látek. Zvláštní kapitola je věnována zástupci chemických (organických) UV filtrů, ethylhexyl methoxycinamátu, jeho fotoisomerizaci, prostupu přes kůži a potenciálním rizikům pro člověka a životní prostředí. V této části je také zahrnuta kapitola věnována genotoxickým efektům, které jsou v diplomové práci testovány v experimentální části. Jsou zde zahrnuty také výsledky testu imunotoxicity a E-screen z laboratoře EnTox, které mi byly poskytnuty se souhlasem autora k jejich publikování v mé diplomové práci. Další kapitola (4. Materiály a metody) popisuje metody a materiály, použité při přípravě vzorku, separaci, jeho analýze a následně při samotných experimentech. Dále se tato část zabývá metodikou SOS Chromotestu, UmuC testu a testů na estrogenní potenciál. V kapitole 4.7. SOS Chromotest je rovněž zahrnuto srovnání výsledků SOS Chromotestu prováděného v laboratoři RECETOX s výsledky ostatních laboratoří (mezilaboratorní porovnání výsledků testů). V poslední kapitole (5. Výsledky a diskuze) jsou zahrnuty výsledky přípravy fotoproduktu cis-ehmc a výtěžnost použité metody separace fotoproduktu ze směsi. Dále jsou zde popsány výsledky efektů testovaných na různých modelech toxicity SOS Chromotest, UmuC test, test estrogenního potenciálu na buňkách MVLN a HeLa9903. Následuje diskuze 12

13 a hodnocení výsledků s návrhem pro budoucí testování látky EHMC. V závěru práce je vytvořen model analýzy rizik EHMC a dvou dalších UV filtrů pro porovnání nebezpečnosti při dermální expozici. 13

14 2. Cíle diplomové práce V úvodu zpracování práce byl proveden souhrn dostupných vědeckých informací o opalovacích krémech a jejich aktivních složkách působících proti škodlivým účinkům UV záření na lidskou pokožku. Hlavní část diplomové práce je věnována UV filtru používaného v opalovacích prostředcích 2-ehylhexyl-4-methoxycinamát (EHMC), hodnocení a analýze jeho potenciálních rizik se zaměřením na dermální expozici člověka. EHMC při vystavení UV záření mění svou isomerní formu trans-ehmc na méně stabilní cis-ehmc. Hlavním cílem této diplomové práce bylo posouzení rozdílných odpovědí v testech toxicity isomeru cis-ehmc a trans-ehmc. Toxikologické informace o trans-ehmc jsou v literatuře dostatečně popsány, zatímco o cis-ehmc tyto informace chybí. Experimentální část je zaměřena na hodnocení genotoxického potenciálu na modelech SOS Chromotestu a UmuC testu a hodnocení estrogenního potenciálu pomocí MVLN a HeLa9903 buněk. Nedílnou součástí práce byla také inovace UmuC testu a jeho zavedení do laboratoře RECETOX. Dalším cílem bylo popsat humánní rizika této látky při dermální expozici. Informace o penetraci sunscreenů přes pokožku se v literatuře rozcházejí. Je proto nutné věnovat pozornost této problematice v návaznosti na toxické vlastnosti látek a zahrnout všechny faktory variance, které mohou při vystavení těchto látek na slunci při dermální aplikaci nastat. 14

15 3. Teoretická část 3.2. UV záření UV záření slunečního spektra se rozděluje na 3 typy: UVC ( nm) krátkovlnné, desinfekční : tato část UV spektra má nejsilnější biologické efekty, ale je téměř celá absorbována ozonovou vrstvou atmosféry. UVC záření se používá v germicidních zářičích, pokud by tedy UVC prostupovalo přes atmosféru, nebyl by na Zemi život možný. Záření UVC je prokazatelně zhoubné (karcinogenní) pro živé organizmy. Penetrace UVC pletivy a tkáněmi živých organismů je větší než u UVB. UVB ( nm): představuje necelé 1 % celého energetického objemu slunečního záření dopadajícího na zemský povrch. Paprsky UVB záření vyvolávají erytrémy pokožky (akutní projevy expozice slunečnímu záření, jako je zarudnutí nebo až tvorba puchýřů). Částečně vyvolávají také pigmentaci pokožky. UVA ( nm): tyto paprsky se ještě rozdělují na UVA-I ( nm) a UVA-II ( nm). UVA je zastoupeno v terestriálním (pozemním, zemském) slunečním záření více než 4 %. Tato část spektra se používá v soláriích a např. i v dermatologické fyzioterapii (metoda PUVA ozáření UVA v kombinaci s psoraleny). PUVA ale není zcela bezpečná metoda a má karcinogenní potenciál - prokazatelně zvyšuje riziko vzniku druhotných nádorů kůže. V případě opakované PUVA terapie s vysokými kumulativními dávkami UVA se vznik kožního karcinomu stává velkým problémem (Matsumura and Ananthaswamy 2004). UVA může způsobovat erytrém (ve sto až tisícinásobné dávce než UVB), je hlavní částí spektra, které způsobuje pigmentaci pokožky. Tato část slunečního záření sice nezpůsobuje akutní reakce, ale má mnohem vyšší vlnovou délku než UVB záření a může tedy pronikat hlouběji do kůže a je zodpovědná za chronická poškození pokožky. UVA záření je méně pohlcováno atmosférou než UVB a dopadající UVA záření je tedy několikanásobně vyšší Vlivy UV záření Kůže Kůže je největší orgán těla a plní řadu funkcí. Chrání před vlivy okolního prostředí, udržuje tělesnou teplotu. Plocha kůže dospělého člověka se pohybuje v rozmezí 1,5 až 2 m 2. Na lidskou hlavu a krk připadá přibližně 11 % kůže, na trup 30 %, na horní končetiny 23 % a na dolní končetiny asi 36 % celkového povrchu kůže. Kromě termoregulační, ochranné, smyslové či vylučovací funkce má kůže také funkci resorpční. Přes kůži je tedy možné vstřebávat do těla látky lipofilní povahy nebo látky rozpuštěné v tukových rozpouštědlech (toho se využívá při vtírání některých mastí, jakožto léčiv). Přes kůži je možné absorbovat také dýchací plyny (Dokládal and Páč 1995). Kůže se skládá ze tří vrstev: epidermis (zahrnuje i stratum corneum), dermis a hypodermis. UVB záření proniká do stratum corneum a způsobuje erytrém. UVA záření má menší energii, ale zato proniká toto záření hlouběji do pokožky, kde způsobuje ztrátu elasticity kůže a poškození DNA buněk pokožky, což může způsobit i nádorové onemocnění. 15

16 Působení UV záření na pokožku UV záření o vlnové délce méně než 310 nm je absorbováno ozónovou vrstvou atmosféry, proto UVC dopadá na Zemi jen v minimálním množství. Naproti tomu 5-10 % UVB a % UVA ze slunečního záření může dopadat na pokožku člověka (Kanavy and Gerstenblith 2011; Narayanan et al. 2010). UVA může prostoupit hlouběji do dermis a % slunečního UVA záření může dosáhnout hloubky melanocytů (pigmentových buněk ve svrchní vrstvě pokožky a ve vlasových folikulech). U záření UVB může do této hloubky dosáhnout jen 9 15 % (Costin and Hearing 2007). Vyšší dávka UV záření způsobuje apoptózu v keratinoocytech (hlavních pokožkových buněk). Bylo zjištěno, že melanocyty jsou méně citlivé na UV záření než keratinocyty (De Leeuw et al. 1994). Expozice UVA záření může navíc vyvolat tvorbu radikálů singletového kyslíku, který indukuje zlomy v DNA, poškození nukleárních bazí a mutace (Wang et al. 2001). ROS (reaktivní formy kyslíku) indukované UVA zářením mohou poškozovat mitochondrie a indukovat apoptózu v buněčné kultuře (Godar 1999) Trendy v opalování Móda opálené pokožky se začala objevovat přibližně od 20. let minulého století. To samozřejmě vedlo ke zvýšení rizika nežádoucích účinků nadměrné expozici slunečnímu záření. Tento trend je charakteristický pouze pro bílou euro-americko-australskou populaci. Jejich bílá barva pokožky se vyvíjela již od dob ledových, kdy bylo potřebné, aby nezahalené části těla dokázaly absorbovat dostatek UV záření pro endogenní syntézu vitaminu D, proto zpravidla neobsahuje dostatek melaninu přirozeného ochranného faktoru. Se zvyšující se expozicí slunečnímu záření u bělošské populace dochází v posledních desetiletích k enormnímu nárůstu výskytu nádorových onemocnění kůže (Rameš and Bencko 1993). Výskyt melanomu se prokazatelně vyskytuje častěji na pokožce, která je vystavována slunečnímu záření (Lund and Timmins 2007), než místa obvykle zakrytá. Melanom je s největší pravděpodobností způsobován jak UVA, tak UVB zářením (Helmke et al. 2004; Moan et al. 1999; Wong et al. 2005). Ostatní nádory a jejich vznik jsou spojovány především s expozicí UVB záření (Wang et al. 2001), je ale pravděpodobné, že UVA je stejně nebezpečné jako UVB (Garland et al. 2003) Příznivé působení UV záření Již malá dávka UV záření o vlnové délce 320 nm působí na přeměnu 7-dehydrocholesterolu na provitamin D 3, který se pak termální isomerizací mění na aktivní formu vitaminu D 3. Pokud by byla biosyntéza tohoto vitaminu omezena (teoreticky i důsledným používáním ochranných krémů a přípravků s vysokým SPF), může dojít u dospělých lidí vyššího věku k osteoporóze. Vitamin D se pokládá i za jeden z faktorů působící proti vzniku nádorových onemocnění včetně melanomu (Dennis et al. 2003). Lze tedy říci, že paradoxně i příliš velké omezení průniku UV záření může zvýšit riziko rakoviny. Stačí však pro dostatečnou produkci vitaminu D jen několik desítek minut expozice slunečnímu světlu týdně. Při standardním používání ochranných faktorů nebylo pozorováno snížení tvorby vitaminu D (Couteau et al. 2007; Janjua et al. 2004). 16

17 3.3. UV filtry a jejich vlastnosti Škodlivé působení UV záření je nezpochybnitelným faktem. Hlavním rizikovým faktorem je karcinogenní působení. Malé množství záření je sice potřebné pro některé fyziologické procesy, ale v každém případě je potřeba omezit vystavování se UV záření. Pokud není možné se vyhnout expozici slunečnímu záření, nabízí se možnost použití ochranných přípravků přímo na kůži. Trh nabízí řadu typů chemických organických sloučenin a organických i anorganických pigmentů, které se používají jako UV filtry/blokátory UV záření (Miletín 2011) Sun Protection Factor SPF (sun protection factor) je míra ochrany před slunečním UVB zářením a udává, kolikrát déle můžeme být exponováni slunečnímu záření, aniž by došlo ke spálení či zarudnutí pokožky. Pokud je SPF = 10, můžeme strávit na slunci 100 minut po použití tohoto krému (bez něj pouze 10 minut). Číslo je ale pouze orientační. Je nutné brát v úvahu také typ pokožky uživatele, aplikované množství a opakovanou aplikaci krému, činnost, kterou uživatel během expozice slunci provozoval, množství krému, které je absorbováno pokožkou. SPF nevypovídá nic o ochraně proti UVA, jelikož primárně nezpůsobuje erytrém kůže. Pro ochranu proti UVA na základě mnoha testů byla stanovena číselná hodnota PPD (persistent pigment darkening) (Moyal et al., 2006). Odvození hodnoty PPD na základě testů není jednoduché a jednoznačné, proto některé opalovací přípravky tuto informaci na obalu stále ještě neudávají (HWN 2011) UV filtry a jejich rozdělení UV filtry jsou látky, které chrání naši pokožku před UV zářením. V zásadě jsou tři typy mechanismů působení: absorpce, rozptyl a odraz. Nejznámější typy UV filtrů a jejich nejdůležitější parametry jsou uvedeny v tabulce 1. 17

18 Tabulka 1: Fyzikálně-chemické vlastnosti filtrů ultrafialového záření, regulovaných a registrovaných v EU (FDA 1999). Převzato a upraveno z (Santos et al. 2012). Struktura Anglický název Alternativní CAS Zkratka M Log K OW Log BCF Rozpustnost λ max název [g/mol] [g/l] [nm] Benzofenony Benzophenone-3 Oxybenzon BP-3 228,24 3,79 1,38 0, Benzophenone-4 Sulisobenzon BP-4 308,31 0,88-0,65 240; 288 Diethylamino hydroxy benzoyl hexyl benzoate Uvinul A Plus DHH 397,51 6,93-9,5 x Paraaminobenzoáty acid 4-Aminobenzoic PABA PABA 137,14 0, PEG-25 PABA P25 277, Ethylhexyl dimethyl PABA Padimate O EHDPABA 277,4 6,15 3,74 2,1 x Salicyláty Homosalate HS 262,35 6,16-0,02 - Ethylhexyl salicylate Octisalate EHS 250,34 5,77-0, Cinamáty Ethylhexyl EHMC, Octinoxat methoxycinnamate OMC 290,4 5,8 5,8 0, Isoamyl p-methoxycinnamate Octocrylene Amiloxat IAMC OC 248,32 361,49 4,06 7, ,06 2,0 x benzotriazolyl Polysilicone P Dibenzoylmethany Butyl methoxydibenzoyl- Avobenzone BMBM 310,39 2,41 4,51 0, methane Deriváty kafru Camphor benzalkonium methosulfate CBM 409,55 0, Terephtalydene Ecamsule, dicamphor sulfonic acid Mexoryl SX TDSA 562,69 1,35-0, Benzylidene camphor sulfonic acid Polyacrylamidomethyl benzylidene camphor - Mexoryl SW BCS PBC 320,4-2, , Methylbenzylidene camphor Enzacamene MBC 254,37 4,95 3,51 5,1 x Benzylidene camphor BC 240,34 4,49 9,9 x Triaziny Ethylhexyl triazone Uvinul T EHT 826,1 15, Diethylhexyl Iscotrizinol DBT 765,98 11,9-4,6 x butamido triazone Bis-Ethylhexyloxyphenol Bemotrizinol, EMT 672,81 13,89-4,9 x methoxyphenyl triazine Tinosorb S Benzimidazoly Drometrizole trisiloxane Mexoryl XL DRT 225,25 9,79-1,3 x ; 303 Organické nerozpustné pigmenty Minerální UV filtry Disodium phenyl dibenzimidazole tetrasulfonate Phenyl benzimidazole sulfonic acid Methylene bis- tetramethylbutylphenol Bisdisulizole disodium Ensulizole Bisoctrizole, Tinosorb M PDT 674, PBSA MBT 274,3 0,01 0,5 0,26 658,87 14,35-3,0 x Titanium dioxide Oxid titaničitý TiO 2 79,87 2,23 1,05 1,63 - Zinc oxide Oxid zinečnatý ZnO 81,4 1,53 0,49 6, Chemické (organické) filtry Většina používaných látek patří do této skupiny. Naši pokožku chrání před sluncem chemickou reakcí přeměnou na teplo. Řadíme sem paraaminobenzoáty, antraniláty, 18

19 benzofenony, deriváty kafru, cinamáty, dibenzoylmethany, salicyláty, triaziny a benzimidazoly. Tyto látky jsou na trhu již dlouhou dobu a u některých byly zjištěny nežádoucí účinky na životní prostředí i na člověka. Bylo zjištěno, že některé chemické UV filtry mohou produkovat volné radikály (Damiani et al. 2007; Damiani et al. 2000), které by mohly reagovat s dalšími molekulami a poškozovat tak lipidy, bílkoviny a DNA buňky a tím iniciovat vznik rakoviny. Tato hypotéza však nebyla dosud potvrzena. Některé látky patřící do skupiny benzofenonů, salicylátů, některých derivátů kafru, cinamátů, paraaminobenzoátů a avobenzonů mají potenciální estrogenní aktivitu (AAD 2003). Jejich nedostatkem je také nestabilita, snadná degradace na slunci a tedy s tím spojený pokles účinnosti UV filtru (Huong et al. 2007; Rodil et al. 2009). Jako nejvíce znepokojující UV filtry pro jejich možná humánní rizika a toxicitu byly označeny látky 4-MBC (4-methylbenzylidene camphor), BP-3 (benzophenone-3), 3-BC (3-benzylidene camphor), EHMC (2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate) a EHDPABA (ethylhexyl dimethyl PABA) (EWG 2012a). Novější chemické filtry, jako jsou například Mexoryl SX, LX, Tinosorb S a Tinosorb M mají mnohem lepší vlastnosti. Jejich penetrace je mnohonásobně nižší (Benech-Kieffer et al. 2003; Mavon et al. 2007) a nebyl u nich prokázán žádný vliv na hormonální rovnováhu (Ashby et al. 2001; FDA 2006). U organických chemických filtrů je důležité, že nástup jejich ochranného efektu se dostaví až po 20 minutách po nanesení opalovacího krému. Musí se nejdříve vstřebat do pokožky, proto by se měl krém aplikovat již půl hodiny před začátkem expozice slunečním paprskům. Chemické UV filtry se nevstřebávají jen do pokožky, ale také přes kůži do krevního oběhu. Hladiny těchto látek byly detekovány v mateřském mléce (Schlumpf et al. 2008b), krevní plazmě (Janjua et al. 2008) i moči (Hayden et al. 1997; Janjua et al. 2008; Wolff et al. 2007) Organické nerozpustné pigmenty Z této skupiny se používá zatím pouze Tinosorb M (Bisoctrizole), který má vlastnosti chemických i fyzikálních UV filtrů. Působí jako mikropigment i jako organický UV absorbér a poskytuje širokou ochranu v UVA i UVB oblasti. Má také stabilizační efekt vůči jiným UV filtrům. Jeho nevýhodou je, že na kůži může ve vyšších koncentracích tvořit bílý film (Miletín 2011) Minerální (anorganické) UV filtry Mezi tyto filtry patří oxidy kovů, nejúčinnější z nich jsou oxid titaničitý a oxid zinečnatý. Jejich schopnost propouštět a zároveň blokovat UV záření je známa již od roku 1981 (Kobayashi and Kalriess 1997). Nové metody dnes umožňují připravovat tyto minerální UV filtry o velikosti částic v řádu několika nanometrů, díky tomu ztrácí tyto nanopigmenty schopnost odrážet viditelné světlo (s delší vlnovou délkou) a fungují na kůži jako UV zrcadlo. Výhodou těchto UV filtrů je jejich nealergenní potenciál. 19

20 ZnO a TiO 2 chrání před UV zářením tak, že dopadající světlo rozptýlí či odrazí a ve velmi malém množství dokážou UV záření také absorbovat. TiO 2 absorbuje především v UVB oblasti (Lademann et al. 1999) ve velmi malé míře pak v UVA oblasti. ZnO je schopno absorbovat v celé šíři UV záření, a proto je považován za univerzální širokospektrý UV filtr. Schopnost těchto UV filtrů absorbovat UV záření roste se snižující se velikostí částic, a tedy se zvyšujícím se povrchem na jednotku hmotnosti (Schulz et al. 2002). Velmi často se ZnO a TiO 2 používají v kombinaci s chemickými UV filtry, čímž se zvyšuje účinnost samotného ochranného přípravku. Další výhodou těchto látek je jejich odolnost vůči fotodegradaci. Těmto filtrům je vytýkána jejich fotokatalytická aktivita, průnik nanočástic do svrchních částí pokožky a tvorba bílého filmu na povrchu kůže. Proti fotokatalytické aktivitě se dělají taková opatření, že jsou malé částice oxidu titaničitého pokrývány vrstvou silikonu či sloučenin hliníku (Jafry et al. 2011). U ZnO je fotokatalytický potenciál zanedbatelný. Co se týče obav z průniku přes kůži, je vzhledem k velikosti částic možný (20-50 nm), ale reálně k tomu nedochází. Nanočástice TiO 2 a ZnO se vyskytují pouze ve svrchní rohovinové části pokožky a nebyly v nižších vrstvách stratum corneum, epidermis ani dermis objeveny (Kimura et al. 2012; Sadrieh et al. 2010). Nanočástice TiO 2 a ZnO se málokdy vyskytují jednotlivě, společně mají tendenci tvořit sekundární aglomeráty, což zabraňuje jejich prostupu do spodnějších částí pokožky. Bílý film závisí na velikosti nanočástic. Kvalitní přípravky obsahující částice ZnO a TiO 2 do velikosti částic 50 nm bílý film téměř netvoří, lépe řečeno, bílý film na pokožce není viditelný. K určitému zviditelnění dochází na mokré pokožce, což je ale jev přechodný a po uschnutí pokožky opět zmizí. Dochází zde k odrazu i části viditelného spektra na rozhraní kapiček vody a UV filtru na kůži, proto se v tomto případě objevuje na pokožce bílý až našedlý film nebo kapičky. Na účinnost UV filtrů to ale nemá žádný vliv (pokud nedojde k příliš dlouhému pobývání ve vodě v řádu několika hodin, tedy ke smytí ochranné vrstvy). I přes tuto kosmetickou vadu jsou tyto nanopigmenty vhodné zejména pro citlivou pokožku a pro použití v ochranných prostředcích pro děti. Jejich výhodou je, že při správném zpracování jsou inertní a netoxické ve vztahu k organismu, nemají alergenní potenciál, jsou fotostabilní, termostabilní a blokují UV záření v širokém spektru Ethylhexyl methoxycinamát Ethylhexyl methoxycinamát (EHMC, CAS: ), patřící do skupiny chemických (organických) UV filtrů, je viskózní bezbarvá až světle žlutá kapalina bez zápachu s bodem tání -25 C a bodem varu 160 C (při 1 hpa). Jedná se o organickou sloučeninu, která je tvořena kyselinou methoxyskořicovou a 2-ethylhexanolem. Její rozdělovací koeficient log K OW je 5,8. Látka je nerozpustná ve vodě. Ethylhexyl methoxycinamát je nejpoužívanější UV filtr v Evropě i ve světě. V Evropě byla provedena studie četnosti EHMC v používaných opalovacích krémech. Ze 75 opalovacích krémů byl EHMC nalezen v 49 % přípravků, dalším nejčastějším UV filtrem byl butyl methoxydibenzoylmethan (v 44 %) (Rastogi 2002). V USA byl EHMC obsažen v 90 % opalovacích prostředků (Brown 2000). 20

21 EHMC vytváří ochrannou vrstvu a zůstává na povrchu kůže nebo proniká do vrstvy stratum corneum. Studie transdermální penetrace ukazují, že jen malé množství (<3 %) z dermálně aplikovaného EHMC může být vstřebáváno do kůže (NTP 2008). Velká část EHMC je distribuována ve stratum corneum u dospělých lidí. Při použití EHMC u dětí, kde je vrstva stratum corneum mnohonásobně tenčí, je ale pravděpodobné, že může být penetrace mnohonásobně vyšší. Navíc děti mohou mít méně vyvinutou eliminační kapacitu s ohledem na expresi a aktivitu cytochromu P450 a glukuronidaci (vznik glukosiduronátů ve II. fázi biotransformace) (NTP 2008). EHMC chrání před UV zářením indukující spálení, imunosupresi a rakovinou kůže tím, že absorbuje UVB záření. O EHMC je známo, že poměrně rychle degraduje na slunci. Při působení UV záření dochází k isomerizaci jeho stabilnější trans-formy na cis-formu (Pattanaargson et al. 2004). Podrobněji je tento proces popsán v kapitole 3.5. Fotoisomerizace EHMC a jiných UV filtrů. Cis-trans isomerie je rozdílné relativní uspořádání substituentů na dvojné vazbě nebo na planarizovaném kruhu. Pro dvojnou vazbu se symbolů cis/trans užívá pouze, jde-li o relativní konfiguraci stejné dvojice (vzhledem ke koncům dvojné vazby) substituentů, jinak se používá obecnějších stereodeskriptorů E/Z (Kroutil 2005). Správné označování je popsáno na obrázku 1. Ačkoli je v případě EHMC správnější označení E/Z, trans-isomer E-isomer, protože dvojce substituentů Ph,H a CH 3,H není stejná Obr. 1: Označení optických isomerů. Převzato z (Kroutil 2005). rozhodla jsem se v diplomové práci popisovat jednotlivé optické isomery EHMC jako cis a trans. Označení jsem zvolila z toho důvodu, že je mnohem používanější a pro ty, kteří nejsou odborníky v organické stereochemii, srozumitelnější. Dalším důvodem byl fakt, že ve většině dostupných článcích se u EHMC používá označení cis/trans mnohem častěji. Navíc označení cis/trans v anglicky psané literatuře je mnohem volnější, dokonce v hrubé Elielově učebnici organické stereochemie (Eliel et al. 2001) se doporučení, kdy použít E/Z a kdy cis/trans, skoro vůbec neřeší. Označení cis-ehmc tedy odpovídá isomeru Z-EHMC a označení trans-ehmc odpovídá E-EHMC. Rozlišení optických isomerů EHMC pomocí symbolů cis/trans je použito v celé diplomové práci Toxicita EHMC V této kapitole jsou shrnuty informace o potenciální nebezpečnosti EHMC. Veškerá níže uvedená data o toxicitě se týkají pouze isomeru trans-, tedy stabilnějšího optického isomeru, neboť v této formě se EHMC vyskytuje za běžných podmínek. Celková data o toxicitě EHMC udávají, že tato látka nevykazuje akutní toxicitu, není kožním ani očním iritantem, není kožně senzibilizující ani fotoreaktivní (o tom svědčí studie na fototoxicitu a fotocitlivost) (SCC 1996). 21

22 V testu na kontaktní hypersenzitivitu ale vykázal senzibilizační potenciál při dermální aplikaci na myších samicích (NTP 2012a). Byly zaznamenány otoky uší při aplikaci 1% roztoku EHMC v olivovém oleji, přičemž největší nárůst otoku byl zaznamenán při dávce 25% roztoku EHMC. EHMC může být štěpen na 4-methoxyskořicovou kyselinu, 2-ethylhexanol a 2-ethylhexanovou kyselinu (2-ethylhexanol i 2-ethylhexanová kyselina jsou považovány za vývojově toxickou látku) (NTP 2008). Metabolismus této látky by měl být detailněji studován, aby bylo zjištěno, jaký je skutečný potenciál vzniku těchto metabolitů. Další informace o této problematice nejsou známy. EHMC byl testován v dvougenerační vývojové studii na potkanech (Schneider et al. 2005). Bylo zjištěno, že EHMC nemá nežádoucí účinky na estrální cykly, chování při páření, zabřeznutí, porod a laktaci, EHMC neměl negativní účinky na spermie a velikost vajíček, ani na makropatologii či histopatologii pohlavních orgánů. Při denní dávce 1000 mg.kg -1.den -1 byla pozorována snížená konzumace potravy u dospělců, což mělo vliv na tělesnou váhu (pokles o 14 až 16 % u samců a 4 až 5 % u samic). Estrogenní potenciál EHMC byl potvrzen v řadě studií (spolu s jinými UV filtry) (Gomez et al. 2005; Schlumpf et al. 2001). Některé studie přímo vyzývají k omezení používání EHMC v opalovacích přípravcích z důvodu jeho multi-organické endokrinní aktivity (Klammer et al. 2005). S rostoucím povědomím o nebezpečnosti UV záření, jsou sunscreeny používány k ochraně po celou dobu života člověka, což vede k chronické expozici těmto látkám. V důsledku toho může docházet k expozici plodu v děloze. Tento expoziční scénář by měl být zahrnut do hodnocení nebezpečnosti EHMC a také všech sunscreenů Karcinogenita, genotoxicita EHMC Byla provedena studie některých sunscreenů pro důkaz mutagenní aktivity na bakteriálních kmenech Salmonelly typhimurium (Bonin et al. 1982), kdy u látky ethylhexyl methoxycinamát byl opakovaně potvrzen genotoxický potenciál. Mutagenní testy při použití miskové zkoušky byly provedeny dle stanovených metod (Ames et al. 1975) a se standardními bakteriálními kmeny TA100, TA98, TA1535, TA1537 a TA1538. Toxicita a genotypové reverze mutantních kolonií byly pečlivě monitorovány. Všechny látky kromě EHMC vykázaly negativní výsledky. Všechny pozitivní výsledky (tedy signifikantní genotoxicita) u vzorků EHMC byly zjištěny se stejným kmenem TA1538 a bez metabolické aktivace (bez přítomnosti S9 mixu). Výsledky vzorků, které vykázaly nejvyšší genotoxicitu, jsou uvedeny v tabulce 2. 22

23 Tabulka 2: Výsledky genotoxicity EHMC v Ames testu. Upraveno a převzato z (Bonin et al. 1982). Podtržené výsledky jsou ty, které v testu měly minimálně dvojnásobnou odpověď než kontrola. Číslo (označení) chemikálie Datum provedení testu Objem chem. látky [µl] ,2 Kontrola rozpouštědla 72/ , 39 27, 29 22, 19 16, 17 14, , 57 25, 27 15, 19 10, 10 49/ , 8 75, 76 41, 43 15, 26 10, , , 79 48, 59 27, 28 5, 8, , , 75 56, 59 26, 34 6, 6, 6 V souhrnu toxikologických informací týkajících se EHMC (SCC 1996) je uvedeno, že nebyla prokázána žádná iniciační aktivita nádorů a EHMC se rovněž neprojevil jako promotor vzniku nádoru. Soubor dat neprokázal ani mutagenitu či genotoxicitu in vivo ani in vitro v přítomnosti či nepřítomnosti UV expozice. Jediný pozitivní výsledek byl zaznamenán právě ve výše uvedeném Ames testu (Bonin et al. 1982). V následující kapitole jsou shrnuty pojmy, které jsou důležité pro pochopení problematiky, mechanismů a efektů genotoxických látek Genotoxicita vymezení pojmů Genotoxicita neboli mutageneze je proces, při kterém dochází k poškození DNA vlivem mutagenních faktorů (mutagenů). Někdy je mutageneze spojována s karcinogenezí, mutagen s karcinogenem. Toto zaměnění je chybné, neboť každý karcinogen je mutagenem, ale ne u každého mutagenu byla prokázána karcinogenní aktivita. Mutagenní faktory Mutagenní faktory dělíme dle jejich povahy a podstaty na: 1) Chemické mutageny: působí na základě chemické modifikace nukleotidu a mění polynukleotidový řetězec. Do této skupiny mutagenních faktorů patří například arylační, alkylační látky jako jsou yperit, benzo(a)pyren, které vytváří tzv. adukty s bázemi nukleových kyselin. Dále sem patří interkalátory (např. fluorescenční barviva), které způsobují deaminaci, hydroxylaci či štěpení vazeb v DNA a RNA. Jako chemické mutageny mohou působit také různé syntetické analogy bazí, které se párují s komplementárními bazemi během replikace a způsobují tak substituční mutace. Typickými zástupci jsou produkty spalování, PCB složky umělých hmot, potravinářská barviva, apod. 2) Fyzikální mutageny: patří sem zejména ionizační a UV záření. UV záření způsobuje mutace při replikaci, tyto mutace se shromažďují v kožních orgánech, které nás chrání před škodlivým působením UV. Při nadměrném vystavování UV záření může dojít k nahromadění mutací a to zapříčiní vznik rakoviny kůže. 3) Biologické mutageny: řadíme sem biologicky aktivní částice, jako jsou viry a transpozony (segmenty v DNA, které jsou schopny měnit svou pozici v genomu). 23

24 Mutageny můžeme také dělit z hlediska biochemického mechanismu působení na přímé a nepřímé mutageny: 1) Přímé mutageny jsou faktory, které svou vlastní podstatou a složením mohou způsobovat změny v DNA 2) Nepřímé mutageny jsou samy o sobě neškodné a mutagenní charakter získají až po metabolické aktivaci, která umožňuje jejich zpracování organismem. Mutace Mutace jsou změny v genotypu organismu oproti normálnímu stavu. Většina mutací vzniká náhodně. Mutace cílená je používána téměř výhradně pro vědecké účely. Mutace můžeme dělit na spontánní a indukované dle okolností jejich vzniku. Spontánní mutace vznikají bez vnějšího zásahu, k chybě dochází při replikaci DNA. DNA polymeráza je velmi přesná, tudíž pravděpodobnost jedné takovéto chyby se pohybuje v řádech asi Navíc buňky jsou schopné do jisté míry tyto chyby díky reparačním enzymům likvidovat. Většina mutací je vyvolaná mutagenními faktory (indukované mutace). Podle úrovně, na které je genetická informace ovlivňována, můžeme mutace dělit na: 1) Genomové: jsou to nejrozsáhlejší typy mutací, týkající se celého genomu nebo jeho velkých částí chromozomů. Nejrozsáhlejší změnou je znásobení celé chromozomální sady (polyploidie). 2) Chromozomové: tyto mutace se odehrávají na úrovni jednotlivých chromozomů (chromozomové aberace). Následky chromozomálních zlomů závisí na tom, zda je i po strukturní přestavbě zachováno normální množství genetické informace. Pokud ne, potom dochází k fenotypovým projevům. Strukturní změny chromozomů můžeme rozdělit na balancované (kde je zachováno původní množství genetické informace) a nebalancované (kde není zachováno původní množství genetické informace a jejich nositel může mít různě závažné fenotypové projevy). Chromozomové přestavby klasifikujeme podle mechanismu vzniku jako: - Duplikace: znásobení úseku chromozomu - Delece: část chromozomu chybí - Inzerce: následek minimálně tří chromozomálních zlomů, kdy dojde k začlenění části chromozomu, který byl vyštěpen z jiného chromozomu - Inverze: vyštěpení části chromozomu, převrácení a následné napojení - Translokace: část chromozomu je vyštěpena z původního chromozomu a připojena k jinému 3) Genové: tyto mutace probíhají na úrovni vlákna DNA, jsou to tedy změny, které mění pořadí nukleotidů oproti normální sekvenci. Mutace, které se týkají pouze jednoho nukleotidu, označujeme jako mutace bodové. Podle mechanismu vzniku rozlišujeme: - Adice: zařazení jednoho či více nadbytečných nukleotidových párů, pokud je zařazen počet nukleotidů, který není násobkem 3, dojde k posunu čtecího rámce a tedy k syntetizování zcela jiného polypeptidu nebo dokonce k předčasnému ukončení proteosyntézy vznikem terminačního kodonu. 24

25 - Delece: ztráta jednoho nebo více nukleotidů původní sekvence, účinek je podobný jako u adice, dochází zde naopak ke zkracování řetězce. Opět může dojít ke změně čtecího rámce. - Substituce: náhrada, či záměna báze původní sekvence bází jinou. Jako transcizi označujeme ten případ, kdy jde o záměnu purinové báze za purinovou bázi, nebo o záměnu pyrimidinové báze za pyrimidinovou bázi. Jako transverze se označuje záměna purinové báze za bázi pyrimidinovou nebo naopak. Citlivost živých organismů vůči genotoxinům není absolutní. Během vývoje si vyvinuly opravné mechanismy, které zajišťují odstranění nežádoucích změn v genetickém materiálu vedoucí k rakovině či dědičným poškozením. Nejjednodušším opravným mechanismem je excize bazí a excize nukleotidů, které patří mezi bezchybné opravné mechanismy. Tímto mechanismem lze opravit pouze jednodušší formy poškození DNA (Seeberg et al. 1995). Další významný opravný mechanismus závažných poškození je spojen s homologní rekombinací (Moustacchi 2000). Dalším opravným mechanismem, který ale není bezchybný a nemusí vést (s jistou pravděpodobností) k opravení genetické informace do původního stavu, je SOS reparační systém. SOS odpověď je indukována prostřednictvím více než 20 genů jako odpověď na genotoxický zásah jako je mutace, rekombinace, vznik zlomů v řetězcích DNA. Ústřední roli v SOS systému hrají dva SOS geny lexa a reca. Poškozením DNA je iniciován přepis genu reca, který stimuluje proteolýzu represorového proteinu LexA. Po odstranění proteinu LexA (bránící přepisu ostatních SOS genů) je umožněn přepis SOS genů spojen se zahájením SOS odpovědi (Little and Mount 1982). Zároveň se přepisuje i DNA-polymeráza III, která se podílí na opravě poškozeného úseku v molekule DNA (Frank et al. 1993; Rajagopalan et al. 1992). Ztráta schopnosti opravovat poškození DNA je příčinou mnoha genetických chorob a mutantní linie buněk vykazují zvýšenou citlivost k environmentálním genotoxickým faktorům Imunotoxicita a alergenní potenciál EHMC Imunitní systém reaguje na cizorodé vysokomolekulární látky, zejména bílkoviny. Základní součástí imunitního systému je lymfatický systém (lymfatické uzliny a žlázy, slezina) a bílé krvinky (leukocyty). V případě, že je nějaká látka, antigen rozpoznána jakožto cizí, začnou se proti ní produkovat protilátky, které tvoří s antigenem komplex a tím jej inaktivují. Imunitní odpověď se pak může projevovat mírnými kožními projevy, kopřivkou, dýchacími potížemi či anafylaktickým šokem. Imunotoxické látky mohou tyto reakce potlačit nebo naopak vyvolat alergickou reakci. Řada jednoduchých chemikálií působí právě imunosupresivně, tedy tlumí imunitní reakci. Patří sem například benzen, PAHs, PCBs, ozon. Alergickou reakci mohou vyvolat mnohé reaktivní organické látky, např. toluendiisokyanáty, p-fenylendiamin, pyly a prachy různého původu (Horák et al. 2004). U EHMC byly zjištěny imunomodulační účinky ve vyšších koncentračních dávkách (Rachon et al. 2006) v testu in vitro na produkci interferonu (IFN)-gamma a interleukinu (IL)-10. UV filtry jsou testovány hlavně z hlediska alergenní reakce na kůži. Co může být ale mnohdy opomíjeno, je alergická reakce po aplikaci a po pobytu na slunci, tedy při současné 25

26 expozici UV záření. Na světle dochází k řadě reakcí, které by mohly zapříčinit i vyšší citlivost na složky opalovacího krému, popřípadě na fotodegradační produkty. Je tedy potřeba znát zejména u sunscreenů jejich fotoalergenní potenciál, nejen alergenní reakce na samotnou aplikovanou látku. UV filtry byly testovány na iniciaci fotoalergické kontaktní dermatitidy (Rodriguez et al. 2006), kdy bylo potvrzeno, že řada opalovacích krémů má fotoalergenní potenciál u některých citlivějších jedinců. Fotoalergická dermatitida je charakterizována zarudnutím, pupínky a puchýřky v místě exponovaném působení fotoalergenu a UV záření. Vzniká pouze u jedinců, kteří mají přecitlivělost na určitý alergen. V tomto testu vykázal fotoalergenní potenciál nejčastěji benzophenone-3 (BP-3) u 22 z 82 exponovaných pacientů, dalším nejčastějším fotoalergenem byl EHMC, který byl potvrzen u 8 z 82 exponovaných pacientů, dále benzophenone-4 (BP-4) a benzophenone-10 (BP-10) (2/82), phenylbenzimidazole sulphonic acid (PBSA), 4-methylbenziliden camphor (4-MBC) a octyl dimethyl PABA (1/82) Testy EHMC laboratoře EnTox EHMC byl ve všech dosavadních testech hodnocen pouze jako isomer trans-ehmc, jelikož se v této formě vyskytuje v 99,9 % za normálních podmínek. Expozice z hlediska možné fotodegradace a vzniku isomeru cis-ehmc nebyla dosud dostatečně diskutována. Existují informace o fotodegradaci této látky, nikoli však o možných rozdílech v toxických efektech těchto dvou isomerů. Přitom jsou známy látky, jejichž isomery mají prokazatelně jiné vlastnosti a liší se i svými toxikologickými vlastnostmi. Příkladem může být trans- a cis-dichloro-diamin-platina (CDDP) (Roberts and Friedlos 1987), dále HCH a jeho isomerní formy (Willett et al. 1998), α- a β-asarone (ether, který se vyskytuje v rostlinách jako acorus a asarum) (Unger and Melzig 2012) nebo velmi známý lék thalidomid a jeho optické isomery (Nishimura et al. 1994). První zmínky o testování jednotlivých produktů EHMC po ozáření na světle (tedy při působení UV záření) pochází z laboratoře EnTox. Laboratoř EnTox (National Research Center for Environmental Toxicology, Australia) se zaměřuje na získávání nových poznatků o zdrojích, osudu, expozici a účincích znečištění životního prostředí. Byl připraven roztok EHMC v etanolu o koncentraci c = 530 µg.ml -1 a ten byl ponechán na slunci po dobu sedmi dní. Ozářená směs EHMC obsahovala 31 % cis-ehmc a 69 % trans-ehmc. Tato směs spolu s neozářeným EHMC byla testována na imunotoxicitu a estrogenní potenciál. Výsledky testů jsou uvedeny v následujících kapitolách (v současné době se výsledky připravují k publikování) Test imunotoxicity Pro tento test se nejčastěji používají lidské alveolární buňky A549, které spolu s bronchiálními buňkami jsou schopny produkovat cytokiny s potenciálním významem pro imunotoxicitu (Roggen et al. 2006). Test byl proveden pomocí Human IL-8 DuoSet ELISA kit, který je určen pro detekci IL-8 v supernatantu buněčných kultur. Tento test využívá techniku kvantitativní sendvičové enzymové imunoanalýzy, která měří IL-8 v době kratší než 5 hodin. Polyklonální protilátka 26

27 specifická pro lidský IL-8 byla před-vrstvena do jamek mikrotitrační destičky. IL-8 ve standardu a vzorcích je sendvičována imobilizovanou protilátkou a polyklonální protilátkou (na kterou je kovalentně vázaný biotin) specifickou pro lidský IL-8, která je rozpoznána konjugátem streptavidin-peroxidázou. Nenavázaný materiál je potom spláchnut a do jamek se přidá enzymový substrát. Po přidání chromogenního substrátu se barvaa změní z modré na žlutou. Intenzita barvy se měří spektrofotometricky. Graf 1: Závislost stimulačního faktoru na koncentraci EHMC v jamce (ng/jamku). Fialová křivka udává prozánětlivý potenciál - imunotoxicitu EHMC, tedy původní primární směsi, ve které převládá trans-ehmc; zelená křivka prozánětlivý potenciál ozářené směsi EHMC, která obsahovalaa 31 % cis-ehmc a 69 % trans-ehmc. Zdroj: EnTox. Z výsledků můžeme vidět, že ozářené EHMC obsahující směs isomerů cis a trans v poměru 31 % ku 69 % má v tomto testu rozdílnou odpověď než primární látka EHMC, která je z 99,99 % tvořena isomeremm trans. Ozářená směs vykázala na rozdíl od standardu měřitelný imunotoxický potenciál Estrogenní potenciál EHMC Pro zjištění estrogenního potenciálu byl použit E-screen test (Soto et al. 1995), který je založen na schopnosti množení buněk MCF-7 v přítomnosti estrogenů. Tento kvalitativní test porovnává počet buněk, kterých je dosaženo stejným inokulem MCF-7 buněk za nepřítomnosti estrogenů (negativní kontrola) a za přítomnosti 17β-estradiolu (pozitivní kontrola). V laboratoři EnTox byl proveden test estrogenity EHMC na buňkách MCF-7 (poskytnuté Ana Soto, Tuft University School of Medicine, Boston MA, USA), které byly kultivovány na médiu při 37 C 24 hodin. Test byl proveden na 96-jamkové mikrodestičce. Buněčná hustota byla 5000 buněk na jednu jamku. Estrogenní účinnost vzorku je vyčíslena porovnáním jeho schopnosti indukovat buněčnou proliferaci v kultuře buněk rakoviny prsu MCF-7 a 17β-estradiolu. Bylyy srovnány dva vzorky, standard EHMC a ozářená směss EHMC obsahující isomery cis a trans v poměru 31 ku 69%. Jako standard byl použit standardní estrogen E2. Výsledky je možné sledovat v grafu 2. Graf znázorňuje proliferaci buněk v závislosti na logaritmu 27

28 koncentrace vzorku. Čím je vyšší estrogenita, tím je vyšší proliferace screeningových buněk. Proliferace byla měřena spektrofotometricky. Absorbance byla měřena spektrofotometricky při 490 nm. Graf 2: Závislost absolutní hodnoty absorbance měřené při 490 nm na logaritmu koncentrace testovaných látek. Červená křivka představuje standardní estrogen E2, který byl použit jako pozitivní kontrola pro test estrogenní aktivity E-screen assay. Fialová křivka představuje ozářený vzorek EHMC (obsahující 31 % cis-ehmc a 69 % trans-ehmc), zelená křivka znázorňuje neozářené EHMC. Zdroj: EnTox. Z grafu můžeme vidět, že se obě varianty vzorků (ozářené i neozářené EHMC) chovají jako endokrinní disruptory. Ozářená směs isomerů při tom vykázalaa vyšší estrogenní potenciál než neozářený standard EHMC. Tento fakt vyzývá k další studii a provedení dalších testů, kde by odpovědi těchto isomerů mohly být rovněž rozdílné. Z výsledků laboratoře EnTox je zřejmé, že ozářená směs obsahující cis-ehmc měla zcela jinou odpověď v testech imunotoxicity a estrogenní aktivity. Nabízí se tedy hypotéza, že právě fotoprofukt cis-ehmc je zodpovědný za vyšší toxický potenciál v těchto testech. Proto by tato látka (cis-ehmc) ověřeny její efekty. V diplomové práci jsem se rozhodla tuto hypotézu ověřit. měla být studována také jako samostatně izolovaná, aby byly detailněji Navrhnout vhodnou metodu pro ozařování EHMC s co největším výtěžkem cis-ehmc a jeho následnou separaci ze směsi a tento produkt otestovat na genotoxicitu a estrogenní aktivitu Fotoisomerizace EHMC a jiných UV filtrů Fotostabilita sunscreenů a produktů používaných v kosmetice je klíčovým parametrem pro in vitro hodnocení jejich účinnosti. Při expozici slunečnímu záření dochází u některých UV filtrů ke snížen kapacity blokovat UV záření (Huong et al. 2007). Zvláště nestabilními UV filtry jsou ethylhexyl methoxycinamát (EHMC) a UVA filtr butyl methoxydibenzoylmethan (BMBM). Oba filtry jsou široce používanými UV filtry, jelikož v kombinaci pokrývají širokou škálu obávaných škodlivých vlnových délek UV záření, konkrétně nm. Jejich struktura a změny molekuly v důsledku působení světla jsou uvedeny na obrázku 2. 28

29 BMBM EHMC Obr. 2: Molekulární struktura BMBMM a EHMC, převzato a upraveno z (Oguchi-Fujiyama et al. 2012). UV absorpční spektra EHMC a BMBMM jsou uvedena v grafu č. 3. Graf 3: Absorpční spektra (a) EHMCa (b) BMBM. Převzato a upraveno z (Oguchi-Fujiyamaa et al. 2012). Isomerizace trans-ehmc na světle je poměrně rychlý jev. Vzhledem k tomu, že expozice světlu se děje přímo na pokožce, dochází k rychlé a nevyhnutelné ztrátě ochrany uživatele při použití výrobků, které obsahují EHMC (Huong et al. 2007). Rozsah ztráty účinnosti závisí na složkách opalovacího krému. Při minimální rychlosti průběhu fotoisomerizace dochází k produkci cis-isomeru z 20 %. To způsobí pokles SPF přibližně o 10 %. Při isomerizaci vyšší než z 60 % může dojít ke snížení SPF o 29 až 38 % (opět to závisí na složení produktu). Tento test byl proveden pouze in vitro a při měření pomocí spektrofotometru. Je proto důležité odvodit index pomocí testů in vivo, který by odrážel skutečné chemické vlastnosti výrobku po isomerizaci. K nejvyšším degradacím docházelo v přípravcích, které obsahovaly maximální povolené množství EHMC (tedy 10 %). Dále tyto směsi obsahovaly MBM, Octocrylene, Uvinul A+ a některé z nich i Tinosorb S. vybrané hodnoty s obsahem 10 % EHMC jsou uvedeny v tabulce 3. 29

30 Tabulka 3: Vypočtené hodnoty SPF na základě procenta UV filtrů a různé míry (τ) isomerizace. Převzato a upraveno z (Huong et al. 2007). Číslo Procento UV filtru Výchozí SPF (% zbytkového) trans-ehmcc BMBM Octocrylenee Uvinul A+ Tinosorb S SPF τ = 20% τ = 60% ,0 3,0 4,0 30,5 29,0 26,9 (88) 20,4 (67) 25,3 (87) 18,6 (64) ,5 3,0 2,0 2,0 29,3 59,4 25,6 (87) 19,0 (65) 51,2 (86) 37,1 (62) ,0 3,0 2,0 1,5 60,6 60,7 52,6 (87) 38,4 (63) 53,6 (88) 40,5 (66) Fotostabilita a reakční kinetika Fotochemické reakce indukované světlem patří mezi významné abiotické procesy, které určují osud látek v životním prostředí. Pro dostatečné posouzení rizik je třeba identifikovat a také sledovat degradační produkty některých výrobků používaných v kosmetice. Fotodegradace byla prokázána u řady testovaných UV filtrů, mezi které patří i EHMC. Byla provedena studie šesti UV filtrů, které byly exponovány slunečnímu světlu a jejich obsah byl analyzován po různých časových intervalech v rozmezí 5 až 72 hodin (Rodil et al. 2009). Alikvóty byly analyzovány pomocí SBSE-GC-MS. Průběh isomerizace je zobrazen na grafu 4. Každý bod představuje průměr dvou experimentů. Je důležité zmínit, že 4-MBC (4-methylbenzylidene camphor), IAMC (isoamyl p-methoxycinnamate) a EHMC se skládají z geometrických isomerů a ty byly v případě tohoto experimentu kvantifikovány jako celek. Graf 4: Časové profily UV filtrů v průběhu expozice UV záření. Koncentracee se vztahují k odpovídajícíí kontrole. Převzato z (Rodil et al. 2009). BP-3 (benzophenone-3), OC (octocrylene) a 4-MBC vykázaly vysokou stabilitu v průběhu ozařování po 72 hodinách, zatímco fotodegradace EHMC, IAMC a OD-PABAA (octyl dimethyl-p-aminobenzoate) byla jasně prokázána. Kinetika fotodegradacee těchto tří UV filtrů byla dále detailnějii studována pro přesnější stanovení poločasu života těchto látek, výsledky jsou uvedeny v tabulce 4. 30

31 Tabulka 4: Kinetické rychlostní konstanty a poločasy rozpadu UV filtrů EHMC, IAMC a OD-PABA v závislosti na fotodegradačním procesu při ozařování umělého slunečního záření. Převzato a upraveno z (Rodil et al. 2009). Sloučenina Kinetická rychlostní EHMC IAMC OD-PABA konstanta [h -1 ] 0,0327 0,0117 0,0342 Korelační koeficient R 0,993 0,994 0, Fytotoxicita Pro EHMC byla experimentálně zjištěna EC50 = 0,19 ± 0,012 mg.l -1 v buněčném reprodukčním testu na S. vacuolatus (Altenburger et al. 1990). Tento testt toxicity se provádí na synchronizované kultuře jednobuněčné zelené sladkovodní řasy kmene S. vacuolatus Parametrem toxicity je inhibice růstu řas. Buňky jsou exponovány zkoušené látce po dobu jednoho generačního cyklu (24 h). Výše uvedená hodnota EC 50 přibližně odpovídá EC 50 = 0,36 mg.l -1, která byla modelována převzetím dat základní toxicity. Zajímavý je fakt, který vychází z hodnocení fytotoxicity v průběhu ozařování světlem. U látek EHMC a IAMC se během expozice UV záření fytotoxicita snižovala (viz graf 5). To znamená, že toxicita souvisí přímo s koncentrací mateřské látky, produkty degradačního procesu mají nižší toxicitu než mateřské látky (Rodil et al. 2009). R 2 t ½ [h] Graf 5: Toxicita pro řasy degradačních produktů UV záření v závislosti na ubývající koncentraci mateřské látky EHMC po ozařování v časech 0, 14, 28, 42 a 77 h. Každý bod reprezentuje průměr dvou opakování. Převzato z (Rodil et al. 2009). Z tohoto výstupu je zřejmé, že s narůstajícím podílem cis-isomeru ve směsi klesá fytotoxicita primární látky EHMC. Jedná se sice o opačný efekt, tedy o pokles toxicity, na rozdíl od výstupů z laboratoře EnTox, kdy estrogenní potenciál i imunotoxické efekty pravděpodobně souvisely s vyšším podílem cis-ehmc. Obě informace (a zatím jediné zmínky o sledování toxických efektů jednotlivých optických isomerů této látky) vyzývají k dalším studiím mechanismu isomerizace a srovnávání toxických efektů isomeru cis-ehmc a trans-ehmc Penetrace sunscreenů přes pokožku Tato kapitola je zaměřenaa na prostup látek přes kůži a jejich možné škodlivé účinky na lidský organismus. Sunscreeny jsou látky lipofilní povahy. Buněčnou membránou tedy procházejí prostou difuzí přes fosfolipidovou dvojvrstvu. Nejlépe prochází látky o nižší molekulové hmotnosti 31

32 (M < 500) (Bos and Meinardi 2000), mezi něž patří i EHMC (M = 290). Možnost přestupu látek přes membránu závisí ale také na tvaru molekuly, takže látky i s vyšší molekulovou hmotností mohou v menším množství procházet přes kůži. Množství vstřebané látky pak závisí na rozdělovacím koeficientu K OW (čím je K OW vyšší, tím více látky přechází přes membránu). Látky s log K OW vyšší než 3 mají největší předpoklad pro vstup do rohovinové vrstvy, ale pravděpodobně nebudou přecházet do dalších částí pokožky a později budou odstraněny při procesu odlupování zbytků odumřelé kůže. Látky s log K OW mezi 1 až 3 budou prostupovat nejlépe přes pokožku, u látek s nižším K OW se prostup do lipofilní rohovinové vrstvy nepředpokládá (Chilcott and Price 2008). EHMC, jehož log K OW je rovno 5,8, má předpoklady k prostupu do rohovinové vrstvy pokožky a dle teorie Chilcott and Price (2008) by mělo ve stratum corneum zůstat a dále neprocházet. Klinubol et al. (Klinubol et al. 2008) při studii transdermální penetrace některých UV filtrů zjistili, že přes kůži může projít po 24 hodinové expozici až 3 % látky EHMC, což je vyšší množství, než je uváděno v jiných zdrojích (Huong et al. 2007; NTP 2008). V této studii byla použita metoda ex vivo při použití Franzovy difúzní cely. Jako model kůže byly použity kousky kůže z dvoutýdenních myších mláďat. Na kůži bylo aplikováno 4,4 mg.cm -2 UV filtru a penetrace byla sledována po 0, 2, 4 a 24 hodinách expozice. Kvantitativní analýza byla provedena pomocí kalibrační křivky UV absorpčního spektra. Výsledky testovaných látek EHMC (2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate), 4-MBC (4-methyl benzylidenecamphor), BMBM (butyl methoxydibenzoylmethane), EHTMC (2-ethylhexyl-2,4,5-trimethoxycinnamate) a TMB (di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxybenzalmalonate) v etanolu (připravené rozpuštěním 1,00 g UV filtru v 10,0 ml etanolu, c = 100 mg.ml -1 ) a v emulzi (připravené z 1,00 g UV filtru rozpuštěného v 3,0 ml etanolu a doplněním do 10,0 ml krémem, c = 100 mg.ml -1 ) jsou znázorněny v grafu 6. Graf 6: Pronikání UV filtrů přes kůži myších mláďat metodou Franzovy cely připravených v roztoku ethanolu (a) a vody (b). Kontaktní plocha s kůží: 0,175 cm 2.ml -1. Množství krému na kůži myších mláďat: 4,4mg.cm -2. Výsledky jsou uvedeny v procentech UV filtrů nacházející se v receptorové kapalině, které se vztahují k původnímu množství použitých UV filtrů na kůži myších mláďat, v různých časech po aplikaci. Údaje jsou 32

33 uvedeny jako průměrné hodnoty z alespoň pěti experimentálních opakování (chybové úsečky představují jejich směrodatné odchylky). Převzato z (Klinubol et al. 2008). Dále byl proveden test na přestup těchto látek přes lidskou kůži metodou Suction Blister Technique, kdy byly tyto látky aplikovány na kůži pěti dobrovolníkům v konečném pokrytí 0,6 mg.cm -2. Z výše uvedených sunscreenů byl v blistrové kapalině po tříhodinové expozici detekován pouze EHMC a BMBM. výsledky měření pomocí UV absorpční spektrometrie jsou uvedeny v tabulce 5. Tabulka 5: Procentuelní přestup přes lidskou kůži látek EHMC, BMBM, EHMC a TMB. Upraveno a převzato z (Klinubol et al. 2008). Celkové množství v Množství detekovaného blistrové kapalině UV filtru, vztažené na UV filtry 3h po aplikaci [mg] aplikované množství [%] EHMC 0,0070 ± 0,0001 0,35 BMBM 0,0031 ± 0,0001 0,15 EHTMC 0 0 TMB 0 0 Celkové množství UV filtru aplikovaného na 3,5 cm 2 blistrového povrchu bylo 2 mg. Výsledky testu dobře korelují s výsledky penetrací látek přes kůži myších mláďat. Oba testy ukázaly, že látky EHTMC a TMB neprochází kůží vůbec. Zatímco EHMC se ukázalo jako látka nejvíce prostupující přes kůži z vybraných UV filtrů. Tyto výsledky se shodují i s jinými dřívějšími studiemi (Hany and Nagel 1995; Janjua et al. 2004; Yener et al. 2003) Fakt, že EHTMC přechází přes kůži špatně na rozdíl od EHMC, ukazuje na funkci methoxy skupin na schopnost látky setrvávat na povrchu kůže. Methoxy skupiny substituované na benzenovém jádře cinamátů neovlivňují pouze absorpční profil cinamátů (Monhaphol et al. 2007), ale také permeabilitu látek přes kůži. V tomto testu nebylo pozorováno zhoršení penetrace v závislosti na vyšší molekulové hmotnosti látek. Například EHMC (M = 290) pronikalo kůží ve dvojnásobném množství než např. 4-MBC (M = 254). Další velmi diskutovanou látkou co se týče přestupu přes kůži je BP-3. Evropská komise stanovila na základě provedených studií, že přes kůži prochází 3 až 4 % z aplikované dávky BP-3 (SCCP 2008). Studie penetrace této látky přes lidskou kůži u tří dobrovolníků uvádí, že v moči bylo detekováno pouze 3 % aplikovaného BP-3 na kůži (Sarveiya et al. 2004). Další studie provedená na 29 dobrovolnících uvádí, že po 48 hodinách bylo v moči detekováno 1 až 2 % aplikovaného množství BP-3 (Hayden et al. 1997). Přitom ve studii (Gonzalez et al. 2006) bylo v moči detekováno mnohem větší množství aplikované látky. Test byl proveden u 25 dobrovolníků po dobu deseti dnů, kdy respondenti denně aplikovali na kůži předepsané množství 2 mg.cm -2 opalovacího krému a sbírali vzorky k analýze. Skupina A se pouze mazala krémem a skupina B byla navíc vystavována po určitou dobu UVA a UVB záření. Ozařování UV světlem však nijak významně neovlivnilo vylučování BP-3 močí. Výsledky studie jsou zobrazeny v grafu 7. Z výsledků byla vypočítána průměrná hodnota detekovaného množství 33

34 BP-3 v moči 3,7 %. Nejvyšší množství vyloučené látky v moči bylo detekováno u dobrovolníka číslo 1: 8,7 % BP-3. Což je výrazně odlišné od stanovené hodnoty permeace 3 až 4 % a výrazně se liší také od ostatních provedených studií. Je tedy zřejmé, že v permeaci sunscreenů přes kůži je velká variabilita. Graf 7: Vylučování BP-3 (benzophenone-3) močí po 10 dnech lišící se u jednotlivých dobrovolníků. Detekované množství BP-3 se pohybovalo mezi 1,2 % a 8,7 %. Horizontální křivka znázorňuje průměrnou hodnotu vyloučeného množství (3,7 %). Převzato z (Gonzalez et al. 2006). Některé sunscreeny byly díky své prostupnosti přes kůži detekovány také v mateřském mléce. První zmínky o detekci sunscreenů v mateřském mléce se objevují ve studii (Hany and Nagel 1995). Na základě těchto informací a zjištění nežádoucích účinků některých UV filtrů (estrogenní a anti-androgenní aktivita, interakce s thyroidními hormony, vliv na vývoj pohlavních orgánů (Faass et al. 2009; Schlumpf et al. 2008a; Schlumpf et al. 2008b) a dlouhodobý efekt na bilaterálně ovariektomovaných samic potkanů (Seidlova-Wuttke et al. 2006a)) byla provedena první kohortová studie reprezentující analýzu expozice lidské populace kosmetickým UV filtrům (Schlumpf et al. 2010). V této tříleté studii (2004, 2005 a 2006) byly zjišťovány obsahy nejpoužívanějších sunscreenů (EHMC, OC, 4-MBC, 3-BC, HMS, BP-3, BP-2 a OD-PABA) v mateřském mléce celkem 54 respondentek. UV filtry byly detekovány v 85,19 % vzorků mateřského mléka, přičemž 54,7 % žen v dotaznících uvedlo, že používá opalovací krémy obsahující testované sunscreeny a 60,4 % používá jiné kosmetické přípravky obsahující UV filtry. Hladiny sunscreenů detekovaných v mateřském mléce jsou uvedeny v tabulce 6. 34

35 Tabulka 6: Koncentrace UV filtrů v mateřském mléce. Převzato a upraveno z (Schlumpf et al. 2010). UV filtry Ethylhexylmethoxy cinnamate Medián 95% Rozsah 35,31 ± 17, ,60 ± 25, ,98 ± 23, ,50 ± 22, ,41 73,31 Octocrylene 22,57 ± 25, ,08 ± 10, ,63 ± 25, ,18 ± 24, ,32 70,64 Kohorta 2004 N = 13 Průměr ± SD [ng.g -1 tuku] N poz. Kohorta 2005 N = 21 Průměr ± SD [ng.g -1 tuku] N poz. Kohorta 2006 N = 20 Průměr ± SD [ng.g -1 tuku] Všechny kohorty N = 54 Průměr ± SD 19, ,50 ± 6, ,84 ± 14, ,12 ± 12, ,70 43, ,10-79,85 4,70-134,95 6,70-48,37 4-Methylbenzylidene camphor 3-Benzylidene camphor Homosalate ,37 ± 27, ,37 ± 37, ,40 15,5 56,63-61,20 Benzophenone-3 117, ,48 ±48, , ,23 ± 50,69 7 7,30 26,7 120,08-121,40 Benzophenone Octyldimethyl- PABA 49, ,00 1 Průměr, směrodatná odchylka (SD), medián, 95. percentil (95%) a rozsah představují hodnoty z pozitivních vzorků (N poz.). Celkový počet analyzovaných vzorků (N), je zobrazen v horní části každé kohorty. Hodnoty < LOD = 0. N poz. [ng.g -1 tuku] N poz. Kohortová studie se zabývala mimo jiné i detekcí některých vybraných POPs v mateřském mléce. Koncentrace UV filtrů byly srovnatelné s obsahem PCB. Sunscreeny jsou látky lipofilní povahy, nejsou ale tak vysoce perzistentní ve srovnání s některými POPs. Expozice a postupy v hodnocení rizik těmto UV filtrům se od expozičního scénáře POPs velmi liší. Je zde mnohem větší variabilita s ohledem na frekvenci použití kosmetických výrobků a hladiny UV filtrů detekované v mateřském mléce se mohou měnit ve velmi krátkém čase. Jelikož jsou sunscreeny obsaženy i v řadě výživných denních krémů a ve velké míře také v balzámech na rty, jsme jimi exponováni v průběhu celého roku (v létě se koncentrace UV filtrů mnohonásobně zvýší při používání opalovacích krémů). Je tedy důležité při jejich hodnocení rizik zahrnout téměř chronickou expozici naší pokožky těmto látkám. S tímto faktem je tedy možné, že hladiny sunscreenů detekované v mateřském mléce mohou být srovnatelné s perzistentními organickými polutanty Produkce reaktivních forem kyslíku v souvislosti se sunscreeny Byly zjištěny případy, kdy v souvislosti s použitím UV filtrů došlo k nárůstu ROS (reaktivních forem kyslíku). Byl testován BP-3 (benzophenone-3), EHMC a OC (octocrylene) na množství produkce volných radikálů (Hanson et al. 2006). V této studii bylo zjištěno, že s rostoucí dobou pronikání UV filtrů do pokožky rostlo také množství vznikajících radikálů. Nárůst oproti pozaďovým hodnotám reaktivních forem kyslíku (které jsou produkovány přirozeně epidermálními chromofory) byl zaznamenán již po 20 minutách (což je běžná doba vstřebání krému do kůže), po 60 minutách byl nárůst ROS mnohonásobně vyšší. Takový 35

36 nárůst ROS by mohl zvýšit možnost vzniku melanomu, ale tato hypotéza dosud testována nebyla. Produkce ROS byla zaznamenána také u často používaného UVA filtru BMBM (butyl methoxydibenzoylmethane) (Damiani et al. 2000). Některé UV filtry generují reaktivní formy kyslíku (ROS), pokud jsou vystaveny UVA (Damiani et al. 2007). UVA záření může zvýšit karbonylovou tvorbu v albuminu (Damiani et al. 2000) a poškozovat DNA a je dobře známo, že DNA změny indukují vznik rakoviny. U lidí používajících sunscreeny byl zjištěn častější výskyt maligního melanomu ve srovnání s lidmi, kteří opalovací krémy nepoužívají (Westerdahl et al. 2000). Jiné studie také poukazují na souvislost používání sunscreenů s vyšším počtem rakoviny kůže (Autier et al. 1995; Vainio and Bianchini 2000; Weinstock 1999). Není však známo, zda rakovina není způsobena spíše častým pobytem na slunci u uživatelů sunscreenů, než samotnou schopností UV filtrů indukovat vznik rakoviny Potenciální rizika pro vodní prostředí Opalovací krémy používáme zejména při opalování na slunci a zejména při pobytu u vody. Proto je zcela zřejmé, že sunscreeny se mohou velmi snadno splachovat z naší pokožky do vody a zejména v letních měsících může docházet k expozici větším koncentracím pro vodní prostředí. Jedná se o látky lipofilní povahy, které se tedy velmi dobře mohou bioakumulovat v tělech vodních živočichů, zejména ryb. Je tedy nutné zaměřit se také na xenoestrogenní a xenoandrogenní potenciál těchto látek a zjistit tak, zda mají tyto látky schopnost interagovat s endokrinním systémem exponovaných organismů a mohou tak negativně působit na jejich celkovou homeostázu, reprodukční a behaviorální funkce. UV filtry EHMC, BP-3 (benzophenone-3), 4-MBC (4-methylbenzylidene camphor), HMS (homosalate), OD-PABA (octyl dimethyl-p-aminobenzoate) a BMBM (butyl methoxydibenzoylmethane) byly testovány na lidských buňkách MCF-7 dle metodiky (Soto et al. 1995). Výsledky odpovědí jednotlivých UV filtrů byly srovnány s pozitivní kontrolou E 2. Zvýšená proliferace buněk byla v závislosti na dávkách jednotlivých UV filtrů zjištěna u všech výše uvedených sunscreenů (Schlumpf et al. 2001). Dále byl proveden test in vivo na krysách, kdy byly BP-3, EHMC a 4-MBC (UV filtry s pozitivní odpovědí v testu in vitro) podávány perorálně po dobu 4 dnů. 4-MBC vykazoval výrazné zvýšení děložní hmotnosti při dávce 119 mg.kg -1.den -1, ED 50 pak byla stanovena na 309 mg.kg -1.den -1. Zajímavé je, že v testu in vitro způsobil největší proliferaci buněk BP-3 (následně 4-MBC a EHMC), zatímco v testu in vivo byla potence nejvyšší u 4-MBC > EHMC > BP-3. Výsledky obou testů jsou znázorněny na grafu 8. 36

37 Graf 8: Křivka dávka odpověď estrogenní aktivity některých UV filtrů. (A) In vitro efekt UV filtrů na buněčnou proliferaci MCF-7 buněk (počet buněk na jamku) jako procentoo maximálního efektu E 2.(B) Efekt orální expozice UV filtrů na děložní váhu nevyvinutých krys jako procento maximálního efektu ethinylestradiolu (EE 2 ). Pozn.: EHMC (2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate) odpovídá OMC (octyl methoxycinnamate). Převzato z (Schlumpf et al. 2001). Jak již bylo zmíněno, sunscreeny jsou potenciálně bioakumulovatelné. Řada UV filtrů, které vykázaly estrogenní aktivitu (4-MBC, BP-3, HMS a EHMC), byly nalezeny v tělech ryb (Nagtegaal et al. 1997). Koncentrace se v rybím tukuu pohybovaly v rozmezí 1,6 μm a 7,8 μm, koncentrace v celém těle ryb byly v rozmezí 0,02 a 0,2 μm. Efektivní dávky při orálním podání v in vivo uterotropním testu na krysách (119 mg.kg -1.den -1 pro 4-MBC, 935 mg.kg -1.den -1 pro EHMC a 1500 mg.kg -1.den -1 pro BP-3) jsou srovnatelné s denní dávkou zvyšující děložní hmotnost u bisfenolu a (400 mg.kg -1 ) (Ashby and Tinwelll 1998), nonylfenolu ( mg.kg -1 ), methoxychloru ( mg.kg -1 ) nebo například o,p -DDT (10000 mg.kg -1 ) (Odum et al. 1997; Shelby et al. 1996) Zajímavé poznatky o opalovacích krémech Opalovací krémy zabraňují spálení pokožky na slunci, ale nad rámec této skutečnosti je až překvapivě málo komplexních informací o bezpečnosti a účinnosti těchto přípravků. Environmental Working Group (EWG) se věnuje mimo jiné také přezkoumávání bezpečnosti opalovacích přípravků. Tato společnost upozornila na skutečnosti (popsané níže), které by mohly vést až k úplnému nepoužívání opalovacích krémů (EWG 2012b). Při prezentování některých opalovacích krémů jsou uživatelům předkládány ne zcela pravdivé informace. Není žádný důkaz o tom, že opalovací krémy předcházejí vzniku rakoviny kůže, tyto přípravky pouze chrání proti slunečnímu záření. Výrobci by proto neměli inzerovat, že jejich výrobky mohou snížit riziko rakoviny a se sluncem související stárnutí. Agentura Food and Drug Administrationn (FDA 2011) uvedla, že doposud neexistují žádné klinické studie, které prokazují, že použití jakéhokoli krému samotného může zabránit vzniku rakoviny kůže. Opalovací krémy by proto neměly být první a jedinou volbou při prevenci rakoviny kůže (IARC 2001) a lidé by se měli chránit před škodlivými účinky slunečního záření také oděvem a vyhýbat se pobytu na přímém poledním slunci. 37

38 Někteří vědci objevili zvýšené riziko vzniku melanomu u některých uživatelů používajících opalovací krémy. Příčina není známa, ale spekuluje se, že v případě těchto uživatelů došlo k příliš dlouhému pobývání na slunci a jejich kůže absorbovala více slunečního záření. Další hypotéza je, že volné radikály uvolňující se při rozkladu chemických látek v opalovacích krémech mohou hrát významnou roli (EWG 2012b). Sluneční záření podporuje také některé rozhodující funkce v těle, kterým by opalovací krém s vysokým SPF mohl zabránit. Hlavním zdrojem vitamínu D je sluneční svit. Vitamin D je velmi důležitý pro naše zdraví posiluje kosti a imunitní systém, snižuje riziko různých druhů rakoviny (karcinom prsu, tlustého střeva, ledvin a vaječníků) a reguluje nejméně tisíc různých genů ovládajících prakticky každou tkáň v těle (Mead 2008). Nová studie (Pye et al. 2012) zjistila, že 59 % populace má nedostatek vitamínu D. Navíc asi 25 % z toho má extrémně nízkou úroveň vitamínu D. Dle nových výzkumů je stále pravděpodobnější, že nedostatek vitamínu D může být společným faktorem pro většinu moderních degenerativních nemocí. Pacienti se selháním ledvin téměř všeobecně mají nedostatek vitamínu D a rovněž tak pacienti s cukrovkou. Lidé trpící rakovinou a lidé s roztroušenou sklerózou a osteoporózou, mají vždy těžký nedostatek vitamínu D. Vědcům je známo již dlouho, že vitamín D je důležitý pro absorpci kalcia, a že tento vitamín také souvisí s nemocemi, jako je rakovina a roztroušená skleróza. Tento vitamín je také důležitý pro aktivaci imunitního systému (Alleyne 2010). Byly uveřejněny studie, že forma vitaminu A (retinyl palmitát) může urychlit vývoj kožních nádorů a lézí po aplikaci na kůži v přítomnosti slunečního záření. Jednalo se o studium fotokarcinogenity kyseliny retinové a retinyl palmitátu (NTP 2012b). Výrobci dodávají vitamin A do 25 % všech opalovacích přípravků, jelikož se jedná o antioxidant, který zpomaluje stárnutí kůže. Vitamin A takto funguje (jakožto antioxidant) v pleťových vodách a nočních krémech, které se používají v interiéru. V kombinaci se slunečním záření má však účinky jiné. EWG provedla studii fotokarcinogenních vlastností tohoto vitaminu. U laboratorních zvířat ošetřených opalovacím krémem, obohaceným o vitamin A, byl pozorován rychlejší vznik nádorů a lézí, než u zvířat ošetřených krémem bez vitaminu A. Obě skupiny byly po jeden rok denně exponovány 9 minut intenzivnímu slunečnímu záření. Je také známo, že vitamin A může urychlit hyperplazii (zvýšené zmnožení kožních buněk), a že na slunci mohou vznikat volné radikály, které poškozují DNA. Spotřebitelům se proto doporučuje vyhýbat se opalovacím krémům s vitaminem A (na obalech označován jako retinyl palmitát nebo retinol) (EWG 2010). 38

39 4. Materiály a metody Praktická část diplomové práce se skládala z přípravy fotoproduktů ozařováním UV lampou, analýzy vzniklých směsí na HPLC-DAD za použití kolony C-18 a následně také pomocí metody GC-FID, izolace izomeru cis-ehmc z ozářené směsi použitím tenkovrstvé kapalinové chromatografie a sloupcové kolonové chromatografie. Další důležitou součástí experimentální části bylo osvojení UmuC testu a uvedení inovované metody do laboratoře RECETOX a následně testování genotoxického potenciálu izolovaného isomeru na bakteriálních modelech UmuC test a SOS Chromotest Chemická analýza UV filtrů UV filtry můžeme nacházet zejména ve vodním prostředí, kam se dostávají splachem z pokožky a to nejen ve vodě, ale i v tělech ryb či jiných vodních organismů. Díky penetraci přes kůži můžeme sledovat hladiny těchto látek (i když v malém množství) také v lidském těle: v moči, krvi a mateřském mléce. Dále je možné tyto látky analyzovat přímo v matricích/směsích, ve kterých se používají. Tedy v krémech, olejích, tělovém mléce či v jiných nosičích, které se v kosmetickém průmyslu používají. Pro stanovení UV filtrů zejména ve vodných roztocích se nejčastěji používá metoda HPLC s kolonou C-18, s UV detektorem DAD nm (Liu and Wu 2011; Vilela et al. 2011). Jako mobilní fáze se používá MeOH/voda, EtOH/voda či MeCN/voda (Chisvert et al. 2001; Kim et al. 2011). Pro stanovení sunscreenů v kalu se používá metoda GC-MS, tato metoda spolu s použitím PLE extrakce byla vyhodnocena jako vhodnější při analýze zejména velmi nízkých hladin salicylátů (včetně EHMC) než použití LC-MS, kdy byly detekční limity ve srovnání s metodou GC-MS výrazně horší (Negreira et al. 2011). Stanovení UV filtrů přímo v kosmetických produktech se častěji provádí pomocí GC-MS (Ro et al. 1994). Při experimentech provedených v této diplomové práci byla použita metoda GC s plamenovým detektorem. Podrobnosti k metodě jsou uvedeny v kapitole 4.3. Analýza fotoproduktu Ozařování UV-lampou Ozařování s cílem získání cis-isomeru a dalších fotoproduktů, které způsobují snížení účinnosti UV filtru EHMC, bylo provedeno pomocí UV lampy o výkonu 400W Analýza fotoproduktu Plynová chromatografie Pro analýzu EHMC byla použita metoda GC s plamenovým detektorem (GC-FID). Byla upřednostněna před HPLC kvůli lepší interpretaci výsledků. Vzorky EHMC totiž obsahovaly látky (nečistoty) s podobným retenčním časem a u kapalinové chromatografie by nebylo možné zcela jednoduše látky od sebe oddělit. Analýzy byly prováděny na plynovém chromatografu Agilent 7890A s detektorem FID (280 C). Byla použita kolona Agilent DB-SMS o délce 60 m s vnitřním průměrem 0,25 mm se 39

40 SF o tloušťce 0,25 mm. Teplota inletu byla 250 C, objem nástřiku 1 μl. Jako nosný plyn bylo použito helium s průtokem kolonou konstantní rychlostí 30,5 cm.s -1, splitovací poměr byl 8: Metody separace Chromatografie na tenké vrstvě Tato separační metoda se používá k oddělení látek na základě odlišné afinity jednotlivých složek směsi ke stacionární a mobilní fázi. U tenkovrstvé chromatografie se jako stacionární fáze používá skleněná, plastová či hliníková destička potažená vrstvou silikagelu. Pro naši separaci cis-isomeru byla použita hliníková destička s vrstvou silikagelu (TLC Silica gel 90 F 254, 20 x 20 cm, MERCK, spol. s.r.o.). Snímek řezu hliníkovou destičkou je uveden na obrázku 3. Jako mobilní fáze (či eluent) se používá rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel, které transportuje vzorek v podobě skvrn plochou stacionární fáze. Obr. 3: Snímek řezu napříč hliníkovou fólií s vrstvou silikagelu (elektronový mikroskop 500x). Částice μm, tloušťka vrstvy μm. Převzato z přednášky Chromatografické metody II., (Šimek 2012) Sloupcová kapalinová chromatografie Kolonová chromatografie v chemii je metoda, která se používá k čištění jednotlivých chemických sloučenin ze směsí sloučenin. Hlavní výhodou sloupcové chromatografie je relativně nízká cena a dostupnost stacionární fáze použité v procesu. Klasická preparativní chromatografická kolona je skleněná trubice o průměru od 5 mm do 50 mm a výšce 5 cm až 1 m s výpustním kohoutkem a nějaký druh filtru (nejčastěji smotek vaty) v dolní části. K přípravě sloupce jsou používány dvě metody přípravy: suchá metoda a metoda mokrou cestou. Při použití suché metody je sloupec naplněn suchou stacionární fází ve formě prášku. Následně se přidá mobilní fáze, která se prolévá kolonou tak dlouho, dokud nedojde k úplnému smočení stacionární fáze. Při použití mokré cesty se připraví suspenze eluentu se stacionární fází a ta se poté opatrně nalije do kolony. Je nutné dbát o to, aby v suspenzi nevznikaly nežádoucí vzduchové bubliny. K důkladnému promísení a vyhnání vzduchových bublin je vhodné použít ultrazvukovou lázeň. Tato metoda byla použita při kolonové separaci cis-ehmc. Roztok s organickým materiálem se nakape na horní vrstvu SF (silikagelu), která bývá obvykle převrstvena malým množstvím písku, který chrání vrstvu naneseného analytu před rozvířením při přídavku elučního činidla. Eluent pak prochází stacionární fází a rozděluje směs na jednotlivé frakce, které se jímají do jednotlivých zkumavek. Složení eluátu je možné sledovat např. na tenké vrstvě silikagelu (pomocí TLC) pod UV lampou. 40

41 4.5.. Použité bakteriální kultury v testech genotoxicity Escherichia coli E. coli byla poprvé objevena Theodorem Escherichem, německo-rakouským pediatrem a bakteriologem v roce Je to tyčinkovitá gramnegativní fakultativně anaerobní bakterie, která spadá pod čeleď Enterobacteriaceae. Patří mezi nejlépe prostudované mikroorganismy a je modelovým organismem pro genové a klinické studie. Vnější membrána je tvořena lipidovou dvojvrstvou, ve které jsou ukotveny membránové proteiny. Mezi proteiny, které tvoří póry, patří poriny Omp C, Omp F a Pho E. Poriny slouží jako vstupní a výstupní kanály pro buněčné metabolity a pro příjem vitaminů z okolí. Mezi vnější membránou a buněčnou stěnou je periplazmatický prostor, kde se vyskytují například proteiny vážící cukry a aminokyseliny nebo enzymyy degradující antibiotikaa (beta-laktamasy). Buněčná stěna E. coli se skládá z tenké vrstvy peptidoglykanu, pod nímž je cytoplazmatická membrána, skládající se především z proteinů (70%), lipopolysacharidů a fosfolipidů. Odehrává se zde mnoho biochemických pochodů, (dýchací řetězec a syntéza ATP). Její optimální růst je při 37 C (Madigan and Martinko 2006) Escherichia coli K-12 Tento sérotyp byl původně izolován ze stolice pacienta po rekonvalescenci záškrtu v roce 1922 (Bachmann 1972). Vzhledem k tomu, že E. coli K-12 chybí virulentní vlastnosti, roste rychle na běžných laboratorních médiích. Proto se ukázala být cenným nástrojem pro Obr. 4: Bakterie E. coli K-12 pozorována pod elektronovým mikroskopem. Převzato z (Holden 2002) ). mikrobiální fyziologii a genetický výzkum. E. coli K-12 je nejprobádanějším zástupcem E. coli vůbec. Důvodem je přítomnost lysogenního bakteriofága lambda v bakterii a také široká vybavenost E. coli K-12 množstvím plasmidů, což dává široké možnosti pro využití v genovém inženýrství. E. coli K-12 je znázorněna na obrázku Salmonella Typhimurium Salmonella typhimurium (obrázek 5) je patogenní gramnegativní bakterie převážně se vyskytující ve střevě. Její vnější membrána je tvořena převážně z lipopolysacharidů (LPS), která chrání bakterii od okolního prostředí. LPS se skládá z O-antigenu, polysacharidového jádra a lipidu A, který ji spojuje s vnější membránou. Lipid a se skládáá ze dvou fosforylovaných glukosaminů, které jsou připojeny na mastné 41 Obr. 5: Snímek z elektronového mikroskopu. Převzato z (PLOS 2005).

42 kyseliny. Tyto fosfátové skupiny určují její bakteriální toxicitu. Zvířata nesou enzym, který specificky odstraňuje tyto fosfátové skupiny ve snaze chránit se před těmito patogeny (Tuin et al. 2006). O-antigen je zodpovědný za imunitní odpověď hostitele. S. typhimurium má schopnost podlehnout acetylaci tohoto O-antigenu, který mění svou konformaci, a protilátky pak nejsou schopny tento O-antigen rozpoznat (Slauch et al. 1995) DMSO a jeho vliv na buněčnou membránu Dimethylsulfoxid je organosírová sloučenina se vzorcem (CH 3 ) 2 SO. Tato bezbarvá kapalina je důležitým aprotickým polárním rozpouštědlem, které rozpouští polární i nepolární sloučeniny a je mísitelné se širokou škálou organických rozpouštědel i s vodou. Velmi snadno proniká skrz kůži, následně se vylučuje na povrch jazyka a způsobuje tam česnekovou chuť. Při nízké koncentraci DMSO (méně než 10 mol%) dochází k významné laterální expanzi membrány se souběžným poklesem membránové tloušťky. Při použití DMSO o koncentraci v rozmezí 10 až 20 mol% dochází ke vzniku přechodných pórů a defektů v souvislosti s progresivním ztenčením membrány. Další zvýšení koncentrace DMSO vede k desorpci jednotlivých lipidových molekul z povrchu membrány a následuje rozpad dvojvrstvé struktury lipidové membrány. Membránové ztenčení a zejména vznik pórů je důkazem, že DMSO podporuje pronikání molekul, zejména těch s hydrofilní povahou, přes lipidovou membránu (Gurtovenko and Anwar 2007). V bakteriálních testech toxicity se používá velmi malé množství DMSO (0,5 až 1 % v reakční směsi), aby nedošlo k ovlivnění růstu buněk E. coli během expozice. V původní metodice UmuC testu (Oda et al. 1985) je koncentrace rovna až 4 %. Přitom bylo zjištěno, že vysoké koncentrace DMSO mohou způsobit indukci SOS odpovědi v UmuC testu (Nakamura et al. 1990). V této studii při koncentraci DMSO rovno 5 % bylo dosaženo IF = 2 a při koncentraci DMSO 10 % až IF = 2,5. Michal Škarek ve své diplomové práci studoval pokles růstu bakterie v závislosti na koncentraci DMSO (Škarek 2001). Bylo zjištěno, že již při koncentraci 5 % DMSO dochází k výraznému poklesu nárůstu bakterie a při koncentraci 10 % byla pozorována až 40 % inhibice růstu. Dále byl proveden test na ověření vlivu DMSO na hodnotu indukčního faktoru, kdy bylo zjištěno, že při vyšší koncentraci než 1 % DMSO v reakční směsi může docházet ke zvýšené indukci SOS systému. V těchto koncentracích sice není patrný vliv na růst buněk, nicméně ovlivnění indukce může být znatelné SOS Chromotest SOS Chromotest (Quillardet et al. 1982) je kvantitativní krátkodobý screeningový bakteriální test genotoxicity využívající specifické schopnosti buněk E. coli reagovat na poškození genetické informace. Při poškození bakteriální DNA je indukován SOS-reparační systém. Strukturální gen pro enzym β-galaktosidázu podléhá kontrole genu sfia (sula). Tento gen je součástí SOS-reparačního systému buňky, který je aktivován v případě poškození genetické informace. Gen sfia (sula) podléhá kontrole LexA reperesoru, který je v případě SOS odpovědi inaktivován aktivovaným RecA proteinem a to vede k transkripci lacz genu. 42

43 Standardní provedení testu je vypracováno pro kmen E. coli PQ37, který nese genetické markery rfa a uvra, které tento kmen činí velmi citlivým ke genotoxinům. Test je založen na citlivém systému pro detekci poškození genetického materiálu, v jehož důsledku se stává aktivní SOS enzymatický komplex a je schopen opravit genetické poškození. Tento efekt se navenek projevuje produkcí enzymu β-galaktosidázy. Některé koncentrace testovaných látek mohou působit toxicky, což snižuje produkci β-galaktosidázy a to by mohlo zkreslovat výsledky genotoxicity. Proto byla zavedena (jako indikátor toxického vlivu) extracelulárně syntetizovaná alkalická fosfatáza a pokles její aktivity signalizuje toxický efekt testovaných látek. Oba enzymy jsou detekovány pomocí přeměny specifických chromogenních substrátů (ONPG, PNPP). Výstupem je poměr produkce těchto dvou enzymů. Přeměna chromogenních substrátů je měřena pomocí spektrofotometru. Test genotoxicity (SOS reparace) mutagenní látky systémy reportérových genů LexA represor nízká úroveň exprese hromadění LexA represoru reca lexa >20 cíl. genů reporterový gen pokles úrovně aktivovaného RecA poškození DNA pokles úrovně signálu indukující signál DNA je opravena tol-c gen. mut. aktivace RecA proteinu signál aktivovaný RecA oprava DNA a jiné SOS funkce SIGNÁL o-nitrofenol β-d-galaktopyranosid štěpení LexA represoru reca lexa >20 cíl. genů reporterový gen β-galaktosidáza Obr. 6: A: lacz operon (syntéza β-galaktosidázy) má odstraněnou promotorovou část a podléhá tedy společné kontrole s vybraným SOS genem. B: Pro zvýšení citlivosti celého systému byla metodami genetického inženýrství vytvořena excizní deficience mutace tolc genu. C: Poškození DNA = přepis reca genu, který umožňuje aktivaci specifického RecA proteinu, který štěpí represor LexA a umožňuje přepis jednotlivých SOS genů a tedy spuštění celého SOS reparačního systému (včetně reporterového lacz). Převzato a upraveno z přednášky Ekotoxikologické biotesty Testy genotoxicity a mutagenity, (Čupr 2011) Příprava zamražené kultury Lyofilizovanou bakterii získanou z kitu (SOS-Chromotest, EBPI, Kanada) otevřeme a rozpustíme ji ve 20 ml LB média, převedeme do erlenmayerovy baňky a inkubujeme ji při 37 C, 120 r.p.m hodin. Následující den změříme optickou hustotu při 600 nm a do inokula přidáme 50% glycerin (rozpuštěn ve sterilní destilované vodě) v poměru 3:1 (inokulum:glycerin). Do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek o objemu 0,75 ml pipetujeme 0,5 ml připraveného inokula v glycerinu. Kulturu ihned zamrazíme ve svislé poloze při -80 C. 43

44 Provedení testu Jako detekční systém v našem provedení SOS Chromotestu je využíván kmen Escherichia coli K-12 PQ 37 získaný v podobě lyofilizátu (komerční kit SOS-Chromotest, EBPI, Kanada). Zásobní bakteriální kultura je uchovávána v zamraženém stavu v glycerinovém médiu Příprava médií Tato část obsahuje návod na přípravu médií a roztoků. Sterilizace probíhá po 20 minut při 121 o C. Při přípravě je nutné dodržovat základní pravidla sterilní práce. LB médium Jedná se o kompletní růstové médium poskytující optimální podmínky pro růst bakterie a přípravu noční kultury. Přídavek ampicilinu umožňuje zajištění selekce funkčních buněk detekčního systému. Médium se připravuje rozpouštěním 1 g tryptonu, 0,5 g yeast extraktu, 1 g NaCl ve 100 ml destilované vody. Po následné sterilizaci média se přidají 2 mg ampicilinu. Uchovává se při 4 o C. Fosfátový pufr Fosfátový pufr je přidáván do reakční směsi za účelem stabilizace a minimalizace změn ph roztoku po přídavku vzorku optimálního pro růst bakterie. Vychází ze Sorensenova pufračního systému tvořeného dvojicí NaH 2 PO 4 a Na 2 HPO 4. Postup přípravy je následující: 0,2 M roztok NaH 2 PO 4 připravíme rozpuštěním 1,56 g NaH 2 PO 4. 2 H 2 O v 50 ml destilované vody a 0,2 M roztok Na 2 HPO 4 připravíme rozpuštěním 7,156 g Na 2 HPO H 2 O ve 100 ml destilované vody. Následně roztoky smícháme v poměru 3:22 (0,2 M NaH 2 PO 4 : 0,2 M Na 2 HPO 4 ) a upravíme ph na 7,4 přídavkem jednoho či druhého z fosforečnanových roztoků. Roztok vysterilizujeme a uchováváme při 4 o C. B-pufr B-pufr je roztok, který zajišťuje optimální podmínky pro enzymatickou reakci β-galaktosidázy s chromogenním substrátem ONPG. Přítomnost detergentu umožňuje rozbití buněk detekčního systému a tím dochází k uvolnění enzymu z cytosolu. Připravuje se rozpuštěním 4,057 g Na 2 HPO H 2 O, 0,622 g NaH 2 PO 4. 2 H 2 O, 0,075 g KCl, 0,025 g MgSO 4. 7 H 2 O, 0,1 g SDS ve 100 ml sterilní destilované vody. Po úpravě ph na hodnotu 7,0 uchováváme při teplotě 4 o C. P-pufr P-pufr je roztok, který zajišťuje optimální podmínky pro enzymatickou reakci alkalické fosfatázy s chromogenním substrátem PNPP a navíc přítomnost detergentu umožňuje rozbití buněk detekčního systému a tím uvolnění enzymu z cytosolu. Připravuje se rozpuštěním 12,1 g tris(hydroxymethyl)aminomethanu a 0,1 g SDS ve 100 ml sterilní destilované vody. Po úpravě ph na hodnotu 7,0 pomocí koncentrované HCl (12 M) uchováváme při teplotě 4 o C. 44

45 Pracovní postup Inkubace bakteriální kultury Zamraženou bakteriální kulturu necháme roztát a po šetrném promíchání inokulujeme 200 µl do 20 ml čerstvého LB média. Inkubujeme hodin při 37 C, 120 r.p.m. Následující den převedeme 1 ml předinkubované bakterie do 20 ml čerstvého LB média a inkubujeme 2 h, 37 C, 120 r.p.m. Poté změříme optickou densitu (OD) v 1 cm kyvetě na spektrofotometru při vlnové délce 600 nm. Bakterii naředíme na hustotu s absorbancí A 600 = 0,04 čerstvým LB médiem a fosfátovým pufrem v poměru 3:1. Výpočet je uveden níže:, Kde OD je optická densita naměřená při vlnové délce 600 nm, V je objem inokula, který potřebný pro všechny reakční varianty v testu (je snížený o 1/3, kterou zastupuje fosfátový pufr). Inkubace bakteriální kultury s testovaným vzorkem Do jednotlivých Ependorf mikrozkumavek, obsahujících 10 µl vzorku pipetujeme 990 µl inokula. Nezbytnou součástí testu je také negativní kontrola, pozitivní kontrola a blank. Do blanku je namísto reakční směsi přidána směs LB a fosfátového pufru v poměru 3:1. Schéma obsahu jednotlivých variant je uvedeno v tabulce 7. Tabulka 7: Složení reakčních směsí v negativní kontrole (NK), pozitivní kontrole (PK), blanku a samotném vzorku. Varianta Reakční směs [µl] Standardní mutagen [µl] Jako pozitivní kontrola se používá standardní mutagen 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO) o koncentraci c = 0,469 µg.ml -1. Ependorfovy mikrozkumavky vložíme do inkubátoru a inkubujeme 2 h, 37 C, 120 r.p.m. Příprava referenčních roztoků Připravíme ONPG a PNPP roztoky rozpuštěním 20 mg ONPG/PNPP v 10 ml B-pufru/P-pufru. K roztoku ONPG přidáme 27 µl β-merkaptoethanolu. Roztoky rozpipetujeme po 100 μl do jamek dvou mikrodestiček pro stanovení aktivity β-galaktosidázy (s ONPG roztokem) a pro stanovení aktivity alkalické fosfatázy (s PNPP roztokem). Inkubace v referenčních roztocích Po inkubaci směsí v Ependorf mikrozkumavkách z nich převedeme 25 µl do jamky s ONPG/PNPP roztokem. Vzorky pipetujeme od nejnižší koncentrace, každou koncentraci ve 45 DMSO [µl] Vzorek [µl] NK PK blank 990 LB+puf vzorek

46 třech opakováních (do tří jamek). Poté změříme absorbanci jednotlivých mikrodestiček při 420 nm (měření t = 0). Inkubujeme 45 min, 37 C, 120 r.p.m. Poté znovu změříme absorbanci při 420 nm (měření t = 45) Zpracování výsledků Odečet hodnot: Z naměřených hodnot A 420 v substrátu ONPG i PNPP v čase t = 0 a t = 45 vypočítáme tyto hodnoty: Kde A 420 RB t=0 je absorbance jamky s testovanou látkou před inkubací se substrátem, A 420 RB t=45 je absorbance po 45 minutách inkubace, A 420 NK t=0 je absorbnace v negativní kontrole před zahájením inkubace, A 420 NK t=45 je absorbance po 45 minutách inkubace, A 420 BL t=0 je absorbance spontánně rozloženého substrátu v blanku před zahájením inkubace a A 420 BL t=45 je absorbance spontánně rozloženého substrátu po ukončení inkubace. Tyto hodnoty použijeme při výpočtu I a IF. Výpočet inhibice (I): Inhibice alkalické fosfatázy (I i ) odrážející inhibici buněk testovanou látkou je zjišťována na základě změny přeměny chromogenního substrátu PNPP ve srovnání s negativní kontrolou. A 420 (RB i ) je změna absorbance vznikajícího p-nitrofenolu v jamce i s testovanou látkou po 45 minutách inkubace při 37 C snížený o změnu absorbance v blanku A 420 (BL). A 420 (NK) je změna absorbance přeměněného substrátu v negativní kontrole snížená opět o změnu v blanku A 420 (BL). Výsledek lze následně prezentovat v podobě průměrné procentuální inhibice bakterie (v podobě syntézy alkalické fosfatázy) v určité koncentraci testované látky, doplněné o směrodatnou odchylku, ve srovnání s negativní kontrolou rovné 100 %. V případě, že I < 0,5, tedy je-li bakteriální syntéza enzymu inhibována o více než 50 % syntézy v negativní kontrole, nelze tuto koncentraci vzorku použít pro hodnocení její genotoxických účinků. Výpočet indukčního faktoru (IF): 1 IF i je roven součinu převrácené hodnoty I i a podílů absorbancí přeměněného substrátu ONPG za vzniku o-nitrofenolu v jamce i s testovanou látkou a negativní kontrole při 420 nm, 46

47 kde A 420 (RB i ) je změna absorbance v jamce i s testovanou látkou v chromogenním substrátu ONPG po 45 minutách inkubace při 37 C snížený o změnu absorbance spontánně rozloženého ONPG v blanku A 420 (BL). A 420 (NK) je změna absorbance v negativní kontrole snížená opět o změnu v blanku A 420 (BL). Výsledný IF následně prezentujeme opět ve vztahu k negativní kontrole, která je rovna IF = 1. Genotoxické působení testovaných látek zvyšuje hodnotu IF. Průměrná hodnota IF pro jednu koncentraci vzorku je doplněna o směrodatnou odchylku (SD). Za významný genotoxický potenciál vzorku je označena schopnost indukovat IF = 1,5. Výsledky lze interpretovat pouze v případě, že hodnota indukční faktoru pro standardní mutagen 4-NQO překročila hranici IF = Porovnání citlivosti SOS Chromotestu v mezilaboratorní studii V této kapitole popisuji výsledky z projektu Vývoj bio-analytických technik pro posouzení potenciálního dopadu na lidské zdraví recyklovaných vod, do kterého jsem byla zapojena. Cílem tohoto projektu bylo rozšířit škálu buněčně založených testů pro monitoring kvality vody a udělat tak první kroky směrem k mezinárodní harmonizaci postupů pro posuzování kvality vod. Vzorky byly odebrány v prosinci 2011 a v lednu 2012 a extrahovány SPE (HLB + kokosové uhlí) a alikvóty byly zaslány do partnerských laboratoří, které se projektu zúčastnily. Vzorky byly odebrány v různých fázích čištění charakterizovaných takto: sekundárně vyčištěná odpadní voda, membránová filtrace, reverzní osmóza, sekundární odpadní voda, ozonizace a filtrace biologicky aktivním uhlím, pitná voda vstup do úpravny (řeka), pitná voda výstup z úpravny, dešťová voda, blank. Vzorky pak byly zakódovány v jiném pořadí písmeny A, B, C, D, E, F, G, H, J, K (I bylo vyřazeno, aby nedocházelo k záměně I a J). K suchým extraktům byly přidány 2 µl DMSO pro převezení vzorků. V naší laboratoři RECETOX bylo ke vzorkům přidáno ještě 300 µl DMSO (tedy celkem 302 µl DMSO). Byl vypočítán obohacovací faktor SPE dle vzorce: í Ředící faktor byl vypočítán z objemu extraktu přidaného do testu a z celkového objemu reakční směsi v testu: ř í í ř é ý Finální obohacovací faktor REF byl vypočítán z obohacovacího a ředícího faktoru: ř í í í Hodnoty odpovídající jednotlivým vzorkům jsou uvedeny v tabulce 8. 47

48 Tabulka 8: Hodnoty obohacovacích faktorů v jednotlivých ředících krocích. Označení Ekvivalent Obohacovací faktor Ředící faktor vzorku vody [ml] SPE SOS chromotest ,26 825, , ,10 823, , , ,01 798, , , , , , , , , , , ,76 REF ředění 0x 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 13,70 13,67 27,22 27,22 13,63 27,24 26,77 27,25 13,22 27,23 6,85 6,84 13,61 13,61 6,81 13,62 13,39 13,63 6,61 13,61 REF REF ředění 1x ředění 2x REF ředění 3x REF ředění 4x 3,42 1,71 0,86 3,42 1,71 0,85 6,81 3,40 1,70 6,81 3,40 1,70 3,41 1,70 0,85 6,81 3,41 1,70 6,69 3,35 1,67 6,81 3,41 1,70 3,30 1,65 0,83 6,81 3,40 1,70 REF ředění 5x 0,43 0,43 0,85 0,85 0,43 0,85 0,84 0,85 0,41 0,85 Výsledky testovaných vzorků vody jsou uvedeny v následujících grafech: 2,00 3. reverzní osmóza 1,60 1,20 IF 0,80 0,40 0,00 27,22 13,61 6,81 3,40 1,70 0,85 REF 48

49 Grafy 9 až 18: Závislost indukčního faktoru (IF) na finálním obohacovacím faktoru (REF), jehož výpočet je popsán výše. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická. V prvním grafu (vzorek vody č. 1) byly hodnoty odstraněny z důvodu du zvýšené cytotoxicity těchto koncentrací. Cytotoxicita nebyla v opakovaných testech SOS Chromotestu potvrzena. SOS S Chromotest vykázal mírný genotoxický potenciál pouze u vzorků 1, 2 a 5. Genotoxicita se potvrdila v opakovaných testech. Každý vzorek byl testován v triplikátu. Jako pozitivní kontrola byl použit standardní mutagen 4-NQO (c = 0,469 µg.ml -1 ), jehož průměrný indukční faktor byl roven 25,18. V následující tabulce 9 jsou shrnuty odpovědi v jednotlivých testech genotoxicity z laboratoří, které byly zapojeny do okružní mezilaboratorní studie odpadních vod. Výsledky jsou srovnávány pouze s testy genotoxicity UmuC test a Ames test a to pouze bez metabolické aktivace (-S9). 49

50 Tabulka 9: Pozitivní/negativní (+/-) výsledky v testech genotoxicity jednotlivých extraktů. Srovnání SOS Chromotestu s testy UmuC a Ames test bez metabolické aktivace. Číslo vzorku Označení vzorku vody Výsledky SOS Chromotestu RECETOX Shoda s výsledky ostatních lab. shoda neshoda 1 Sekundární vyčištěná odpadní voda (vstup na 2) Membránová filtrace Reverzní osmóza Pokročilá oxidace Sekundární odpadní voda (vstup na 6) Ozonizace a filtrace biologicky aktivním uhlím Pitná voda, vstup do úpravny (řeka) Pitná voda, výstup z úpravny Dešťová voda Blank Z výsledků je zřejmé, že pozitivní odpovědi SOS Chromotestu se ve většině případů shodovaly s ostatními testy genotoxicity a tato metoda je tedy dostatečně citlivým nástrojem pro zjištění genotoxického potenciálu. Některé testy vykázaly pozitivní odpověď u více vzorků, což může být způsobeno tím, že extrakty vod měly ostatní laboratoře více zakoncentrované, čehož jsme nemohli kvůli limitaci množství vzorku dosáhnout. Podrobný výstup a hodnocení australské mezilaboratorní studie nebyly ještě publikovány, a proto zde nemohly být uvedeny. Předběžně však lze říci, že se výsledky shodovaly UmuC test UmuC test (Oda et al. 1985) je velmi citlivý screeningový test, pomocí kterého se detekují genotoxické účinky různých chemických látek. Tento test je součástí mezinárodních norem ISO (ISO 1997). Jako detekční systém se zde používá (stejně jako v Amesově testu) kmen Salmonella typhimurium TA 1535 s inkorporovaným plazmidem psk1002, který nese umuc operon. Při poškození genetické informace dochází k okamžité aktivaci SOS-reparačního systému (ten je spojen s umuc-genem a tvoří společně umuc operon. Tento operon je propojen s lacz-genem (umuc'::'lacz), který nese informaci pro aktivaci β-galaktosidázy. Na základě aktivity β-galaktosidázy pak můžeme detekovat aktivaci umuc operonu a ta je tedy úměrná poškození DNA v buňce. Aktivitu β-galaktosidázy při tom sledujeme pomocí kolorimetrické přeměny substrátu (ONPG, CPRG). Test je prováděna na 96-jamkových mikrodestičkách (což výrazně minimalizuje materiálové náklady) a vyhodnocován pomocí spektrofotometru. 50

51 Neindukovaná buňka umu LexA lacz Aktivní proteáza žlutá SOS signál RecA CPRG efekt DNA léze Neaktivní proteáza enzym červená Indukovaná buňka Obr. 7: Schéma principu UmuC testu. Převzato a upraveno z (Škarek 2001) Příprava zamražené kultury Lyofilizovanou bakterii získanou z kitu (UMU-Chromotest, EBPI, Kanada) otevřeme a rozpustíme ji ve 20 ml TGA-média, převedeme do erlenmayerovy baňky a inkubujeme ji při 37 C, 120 r.p.m hodin. Následující den změříme optickou hustotu při 600 nm a do inokula přidáme 50% glycerin (rozpuštěn ve sterilní destilované vodě) v poměru 3:1 (inokulum:glycerin). Do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek o objemu 0,75 ml pipetujeme 0,5 ml připraveného inokula v glycerinu. Kulturu ihned zamrazíme ve svislé poloze při -80 C Provedení testu Jako detekční systém je v našem provedení UmuC testu využíván kmen Salmonella typhimurium TA 1535/pSK1002 (komerční kit UMU-Chromotest, EBPI, Kanada). Zásobní bakteriální kultura je uchovávána v glycerinovém médiu Příprava médií Tato část obsahuje návod na přípravu médií a roztoků. Sterilizace probíhá po 20 minut při 121 C a ph je upravováno pomocí koncentrovaných roztoků HCl (37 g.l -1 ) a NaOH (40 g.l -1 ). Při přípravě je nutné dodržovat základní pravidla sterilní práce. TGA médium TGA médium představuje plnohodnotné růstové médium obohacené o ampicilin zajišťující selektivní přítomnost buněk s plazmidem psk1002. TGA médium (100 ml) se připravuje smícháním vysterilizovaných 93 ml roztoku R1 a 2 ml roztoku R2. Po zchlazení se přidá 5 mg ampicilinu rozpuštěném v 5 ml sterilní vody. R1 se připravuje rozpuštěním 1,0 g tryptonu, 0,5 g NaCl, 1,19 g HEPES v 93 ml destilované vody a upravením ph na 7,0 ± 0,2. R2 se připravuje rozpuštěním 0,4 g D(+)glukózy v 4 ml destilované vody. Uchováváme při 4 C. 51

52 10x TGA médium Koncentrované TGA médium je v samotném testu naředěno sterilní vodou a vzorkem tak, že konečná koncentrace živin i ampicilinu je srovnatelná s kultivačním plnohodnotným TGA médiem. 10x TGA médium (25 ml) se připravuje smícháním 18 ml roztoku R1 a 5 ml roztoku R2. Po zchlazení se přidá 12,5 mg ampicilinu rozpuštěného ve 2 ml sterilní vody. R1 se připravuje rozpuštěním 2,5 g tryptonu, 1,25 g NaCl, 2,975 g HEPES v 18 ml destilované vody. PH se upraví na hodnotu 7,0 ± 0,2. R2 se připravuje rozpuštěním 1,0 g D(+)glukózy v 10 ml destilované vody. Uchováváme při 4 C. B-pufr B-pufr obsahuje detergent, který narušuje buněčné stěny buněk a umožňuje uvolnění enzymu β-galaktosidázy z cytosolu, navíc svým ph a iontovou silou umožňuje optimální průběh enzymatické reakce s chromogenním substrátem. B-pufr pro ONPG (250 ml) se připravuje rozpuštěním 10,15 g Na 2 HPO H 2 O, 1,55 g NaH 2 PO 4. 2 H 2 O, 0,188 g KCl a 0,063 g MgSO 4. 7 H 2 O v 230 ml sterilní vody. Po úpravě ph na 7,0 ± 0,2, doplníme roztok sterilní vodou do 250 ml a přidáme 0,25 g SDS. Těsně před použitím přidáme do 10 ml B-pufru 27 µl β-merkaptoethanolu. Uchováváme při 4 C. B-pufr pro CPRG (250 ml) se připravuje rozpuštěním 5,67 g Na 2 HPO H 2 O, 0,114 g KH 2 PO 4, 0,188 g KCl a 0,024 g MgCl 2. 6 H 2 O v 230 ml sterilní vody. Po úpravě ph na 8,0 ± 0,2, doplníme roztok sterilní vodou do 250 ml a přidáme 0,25 g SDS. Těsně před použitím přidáme do 10 ml B-pufru 27 µl β-merkaptoethanolu. Uchováváme při 4 C. Fosfátový pufr pro ONPG Fosfátový pufr slouží jako vhodné rozpouštědlo pro chromogenní substrát ONPG, který nám umožňuje stanovit aktivitu β-galaktosidázy v roztoku. 100 ml se připraví rozpuštěním 2,18 g Na 2 HPO H 2 O, 0,608 g NaH 2 PO 4. 2 H 2 O ve 100 ml vody. Po úpravě ph na 7,0 ± 0,2 vysterilizujeme a uchováváme při 4 C. Fosfátový pufr pro CPRG Fosfátový pufr slouží jako vhodné rozpouštědlo pro chromogenní substrát CPRG, který nám umožňuje stanovit aktivitu β-galaktosidázy v roztoku. 250 ml se připraví rozpuštěním 5,372 g Na 2 HPO H 2 O, 0,05 g MgCl 2. 6 H 2 O a 0,186 g KCl ve 250 ml vody. Po úpravě ph na 8,0 ± 0,2 vysterilizujeme a uchováváme při 4 C. Roztok ONPG 2 hodiny před použitím se připraví roztok chromogenního substrátu rozpuštěním 13,5 mg ONPG ve 3 ml fosfátového pufru ve sterilní ampicilince. Uchováváme při teplotě místnosti za nepřístupu světla. 52

53 Roztok CPRG 2 hodiny před použitím se připraví roztok chromogenního substrátu rozpuštěním 3,4 mg CPRG ve 3 ml fosfátového pufru ve sterilní ampicilince. Uchováváme při teplotě místnosti za nepřístupu světla Pracovní postup Předkultivace Den před samotným provedením testu rozpustíme zamraženou kulturu S. typhimurium a z ampulky převedeme 300 μl do 20 ml čerstvého TGA média. Inkubujeme hodin při 37 C, 120 r.p.m. Následující den změříme optickou hustotu při 600 nm a naředíme kulturu čerstvým TGA médiem tak, aby hustota bakterie byla s absorbancí A 600 = 0,08. Výpočet je uveden níže:, Kde OD je optická densita naměřená při vlnové délce 600 nm, V je objem inokula, který potřebný pro všechny reakční varianty v testu. Inkubace bakteriální kultury s testovaným vzorkem Do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek, obsahujících 5 µl vzorku pipetujeme 260 µl inokula, 660 μl sterilní H 2 O a 75 μl 10x TGA. Nezbytnou součástí testu je také negativní kontrola, pozitivní kontrola a blank. Do blanku je namísto reakční směsi přidáno TGA médium. Schéma obsahu jednotlivých variant je uvedeno níže: Tabulka 10: Složení reakčních směsí v negativní kontrole (NK), pozitivní kontrole (PK), blanku a samotném vzorku pro UmuC test. Varianta 10 x TGA [µl] Steril. H 2 O Inokulum [µl] Jako pozitivní kontrola byl použit 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO). PK1 o koncentraci c = 0,078 μg.ml -1 a PK2 o koncentraci c = 0,156 μg.ml -1. Po důkladném promíchání obsahu Ependorf mikrozkumavek rozpipetujeme jejich obsah po 250 μl do jamek na mikrodestičce ve třech opakováních. Mikrodestičku A proměříme v readeru při 600 nm (měření č. 1) a poté ji vložíme do inkubátoru a inkubujeme 4 h, 37 C, 120 r.p.m. Po ukončení inkubace proměříme mikrodestičku opět při 600 nm (měření č. 2). Příprava referenčních roztoků Během inkubace připravíme roztok ONPG/CPRG asi 2 hodiny před jeho použitím a neustále jej uchováváme ve tmě. Dále připravíme mikrodestičku B s B-pufrem pro ONPG/CPRG (pipetujeme 100 µl do každé jamky), kterou předinkubujeme 30 minut při 28 C. 53 TGA [µl] Standardní mutagen [µl] DMSO [µl] Vzorek [µl] [µl] NK PK blank vzorek

54 Inkubace v referenčních roztocích Po čtyřhodinové inkubaci (a jejím změření při 600 nm měření č. 2) pipetujeme do desky B 25 µl z příslušné jamky na mikrodestičce A a 25 µl roztoku ONPG/CPRG. Desku B změříme v mikrodestičkovém readeru při 420/570 nm (měření č. 3) a inkubujeme při teplotě 28 C po dobu 30 minut. Po ukončení inkubace znovu změříme absorbanci při 420/570 nm (měření č. 4) Zpracování výsledků Výpočet nárůstu během inkubace (ΔD): Kde A 600 T end je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm na konci inkubace, A 600 BL end je průměrná absorbance blanku při 600 nm na konci inkubace, A 600 T start je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm na začátku inkubace a A 600 BL start je průměrná absorbance v blanku při 600 nm na začátku inkubace. Pokud všechny výsledné hodnoty nárůstu ΔD jsou kladné, můžeme říci, že testovaná látka neinhibuje kriticky buněčné dělení. Výpočet růstového faktoru (G): Kde A 600 T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm: A 600 BL je průměrná absorbance blanku při 600 nm: A 600 NK je průměrná absorbance negativní kontroly při 600 nm: Odečet hodnot: Z naměřených hodnot A 420 /A 570 v čase t = 0 (měření č. 3) a t = 30 (měření č. 4) vypočítáme tyto hodnoty: Tyto hodnoty použijeme při výpočtu IR a UT. 54

55 Výpočet IR (Induction Rate): Pro ONPG: Kde A 420 T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 420 nm. A 420 BL je průměrná absorbance v blanku při 420 nm. A 420 NK je průměrná absorbance v negativní kontrole při 420 nm. Pro CPRG: Kde A 570 T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 570 nm. A 570 BL je průměrná absorbance v blanku při 570 nm. A 570 NK je průměrná absorbance v negativní kontrole při 570 nm. Je-li IR u nejkoncentrovanějšího vzorku < 1,5 lze jej počítat za výsledek. Aktivita β-galaktosidázy: Pro ONPG: Kde A 420 T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 420 nm, A 420 BL je průměrná absorbance v blanku při 420 nm, A 600 T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm a A 600 NK je průměrná absorbance blanku při 600 nm. Pro CPRG: Kde A 570 T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 570 nm, A 570 BL je průměrná absorbance v blanku při 570 nm, A 600 T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm a A 600 NK je průměrná absorbance blanku při 600 nm Validace testu Jestliže některá z koncentrací testovaných látek vykáže ΔD < 0, tzn. působí cytotoxicky, je nutné přehodnotit zvolené koncentrace a popřípadě je snížit. Výsledek testu lze považovat za platný, jestliže v referenčních jamkách je IR alespoň 2 za daných podmínek. Je-li G < 0,5, výsledek je neplatný. Testovaná látka je považována za mutagenní, jestliže IR > 1, Testy estrogenního potenciálu Test na buněčných liniích MVLN Estrogenní účinky byly zkoumány na buněčné linii MVLN, která je odvozena od linie MCF-7. Jedná se o buňky lidského karcinomu prsu, které jsou transfekovány luciferázovým genem, který je pod kontrolou estrogenního receptoru (ER) (Demirpence et al. 1993; Freyberger and Schmuck 2005; Villeneuve et al. 2002). ER-specifická transkripční aktivita je přímo spojená se syntézou luciferázy, jejíž aktivita je stanovována luminiscenčně. 55

56 Buňky byly pěstovány v DMEM médiu bez fenolové červeně (PAA, Rakousko) s přídavkem 10% fetálního hovězího séra (PAA, Rakousko) při 37 C, 5% hladině CO 2 v atmosféře a vysoké relativní vlhkosti. Buňky byly exponovány v 96-jamkové mikrodestičce v DMEM bez fenolové červeně s přídavkem 5% dialyzovaného FBS, které bylo dodatečně ošetřeno suspenzí aktivního uhlí (Sigma-Aldrich, CZ) z důvodu odstranění interferujících látek (estrogenních hormonů) přirozeně obsažených v séru. 17β-estradiol (E2) slouží jako referenční estrogenní sloučenina. Buňky MVLN jsou exponovány po dobu 24 hodin negativní kontrole (0,5% DMSO), sérii ředění příslušné referenční sloučenině a sérii ředění testovaných vzorků. Účinky vzorků na buňkách MVLN jsou hodnoceny v přítomnosti nebo nepřítomnosti konkurenčního endogenního ligandu. Luminiscence vyvolaná luciferázou, která je produkován reportérovým genem MVLN buněk, je detekován po 24 hodinové expozici použitím Steady-Glo luciferasového kitu (Promega, Madison, WI, USA) dle instrukcí výrobce pomocí luminometru Synergy Mx (Biotek, USA) Test na buněčných liniích HeLa9903 Estrogenní účinky byly zkoumány také na buněčné linii HeLa9903; lidských buněk karcinomu děložního čípku, které jsou transfekovány luciferázovým genem pod kontrolou aktivace estrogenního receptoru (Ono 2012). Test se provádí na mikrodestičkách v triplikátu pro každou koncentraci vzorku. Buňky HeLa9903 jsou exponovány po dobu 24 hodin negativní kontrole (0,5% DMSO), sérii ředění příslušné referenční sloučenině a sérii ředění testovaných vzorků. Buňky jsou kultivovány a exponovány v DMEM médiu bez fenolové červeně (PAA, Rakousko) s přídavkem 10% fetálního hovězího séra (PAA, Rakousko), které bylo dodatečně ošetřeno suspenzí aktivního uhlí, aby byla snížena úroveň rušivých steroidů (Sigma-Aldrich, CZ). Účinky vzorků na buňkách MVLN jsou hodnoceny v přítomnosti nebo nepřítomnosti konkurenčního endogenního ligandu. Luminiscence vyvolaná luciferázou, která je produkován reportérovým genem MVLN buněk, je detekován po 24 hodinové expozici použitím Steady-Glo luciferasového kitu (Promega, Madison, WI, USA) dle instrukcí výrobce pomocí luminometru Synergy Mx (Biotek, USA). 56

57 5. Výsledky a diskuze 5.1. Ozařování a fotoprodukty látky EHMC Absorpční spektra cis- a trans-isomeru EHMC se liší a aby bylo dosaženo co nejúčinnějšího ozáření a získání co největšího výtěžku fotoproduktu cis-ehmc, byl použit filtr připravený z roztoku skalice modré (CuSO 4. 5H 2 O, c = 250 g.l -1 ), který filtruje UV záření až do vlnové délky 310 nm (Murov et al. 1993). EHMC byl ozařován UV lampou 400 W, která byla vložena do chladícího válce. V její bezprostřední blízkosti byl umístěn vzorek rozpuštěný ve vhodném rozpouštědle. Pro náš experiment byla použita dvě rozpouštědla: hexan a acetonitril. Z důvodu vyšších výtěžků cis-isomeru byl zvolen acetonitril. Důvodem použití roztoku skalice modré tedy bylo docílit ozařování EHMC ve vlnových délkách, kdy se od sebe jednotlivé isomery nejvíce liší. Vycházeli jsme z naměřených hodnot absorpčních maxim, které byly změřeny pomocí UV detektoru při HPLC analýze v acetonitrilu. Absorpční spektra jsou uvedena na obrázku 8. Obr. 8: Absorpční spektra cis-ehmc a trans-ehmc v acetonitrilu (po době ozáření 300 min). Ozařovaná směs byla připravena rozpuštěním 110 µl EHMC v 55 ml ACN. Směs byla analyzována pomocí HPLC-DAD (MF: 65 % ACN ku 35 % H 2 O, nástřik 3 µl). Směs isomerů byla v poměru 43 % cis-ehmc ku 57 % trans-ehmc. Roztok skalice modré byl nalit do pláště kolem UV-lampy. Byl připraven vzorek rozpuštěním 400 µl EHMC v acetonitrilu a vložen do 100 ml baňky, směs byla neustále promíchávána pomocí magnetické míchačky, byla kontrolována teplota (24 C) a pravidelné odběry byly analyzovány na GC-FID. Aparatura je zobrazena na obrázku 9. Proces ozařování se při použití filtru ze skalice modré velmi zpomalil, a proto byl filtr posléze odstraněn. Vývoj obsahu cis- a trans-isomeru ve vzorku je zobrazen v grafech 19 a 20. Obr. 9: snímek pořízený při samotném ozařování roztoku EHMC. 57