Fakulta biomedicínského inženýrství, ČVUT

Fakulta biomedicínského inženýrství, ČVUT Letní semestr, 2. Ročník PMB Kapitola 3 Biomolecular Design and Biotechnology Strany 43 54 Překlad : Jaroslav Krucký Předmět: Nanotechnologie 11.4.2011

Biomolekulární design a biotechnologie Problémy chemie a biologie mohou být velmi nápomocné, jestliže se naše schopnost vidět to, co děláme, a dělat věci na atomární úrovni, nakonec vyvine - vývoj, kterému se myslím nelze vyhnout. -Richard Feynman Dnes máme bohatou paletu metod pro dělání věcí na atomární úrovni. Chemici už konstruovali molekuly atom po atomu v době, kdy Richard Feynman měl své vizionářské projevy, a dnes je chemie mocný nástroj pro vytváření molekul i z několik desítek atomů. Během doby od Feynmanovi řeči, oblasti fyziky a biologie přinesly další metody pro práci v atomovém měřítku. Fyzici mají kontrolu nad atomy díky mikroskopii atomárních sil a chytají je pomocí optické pinzety, a biologové využívají bohatou sbírku přírodní bionanomašinérie k vývoji našich vlastních molekulárních prací. Bionanotechnologie je široce dostupná metoda, a to více než jakékoli jiné použití nanotechnologií. Na křemíku založené výrobní techniky, aby mohly dosáhnout měřítka v řádu nanometrů, musí rozlišení výrobních strojů tlačit na hranici jejich možností, díky čemuž je celý proces velmi drahý a dostupný pouze pro velké korporace a laboratoře s rozsáhlými zdroji. Diamantoidové modely molekulární nanotechnologie jsou čistě teoretické. Ale mocné nástroje pro vytváření bionanostrojů jsou k dispozici každému, kdo má počítač a představivost, a efektivní nástroje pro tvorbu těchto vlastních bionanostrojů jsou přístupné všem středně-velkým biotechnologickým začínajícím společnostem. Současné biotechnologické metody vynikají v modifikaci. To je silná schopnost, která využívá rozsáhlý soubor pracovních nano strojů, které jsou dostupné z přírodních zdrojů. Můžeme zavést specifické změny do plánů pro daný protein, nebo můžeme spojovat dohromady plány několika různých proteinů a vytvářet tak hybridní molekuly s kombinovanou funkcí. Pomocí těchto modifikovaných plánů, můžeme pak nařídit bakterii, aby produkovala velké množství mutovaných nebo chimérických proteinů. Tisíce akademických a průmyslových laboratoří používají tyto metody pro medicínské, bioremediační a nespočet dalších aplikací. A několik zajímavých nových technik, založených na biologické evoluci, popsaných v kapitole 6, umožňuje testování tisíce úprav současně, což značně urychluje objev biomolekul s novými funkcemi. Na druhou stranu návrh zcela nových bionanostrojů, je v současné době těžší než modifikace přírodních bionanostrojl. Vývoj vytvořil komplexní stroje s jemným mechanismy, zahrnující

flexibilitu a sebe stavbu způsoby, které je obtížné předvídat a navrhnout. Projektování bionanostrojů od nuly, je v současné době velkou výzvou, která je pod intenzivním studiem v mnoha laboratořích. V ideálním případě chceme úplnou kontrolu. Například bychom mohli chtít stavět "nanotrubičkovou syntázu", která konstruuje uhlíkových nanotrubky definovaných velikostí a geometrie. Chtěli bychom být schopni si sednout k počítači a navrhnout protein, který by se složil do stabilní struktury a vytvářel tak aktivní část, která by prováděla tyto chemické reakce. Bohužel v našich znalostech existují mezery, které, než tato funkce bude možná, musí být vyplněny. Dnes nemůžeme spolehlivě předpovědět složenou strukturu proteinu z jeho chemické sekvence, a vzhledem k tomu nemůžeme důsledně předvídat jehoh chemické aktivity. Ale tyto dva kroky jsou v současné době pod dohledem vědců s očekáváním, že budou v dohledné budoucnosti vyřešeny. Pak bude opravdový biomolekulární design realitou. Tato kapitola uvádí přehled z mnoha technik, které jsou k dispozici pro návrh, syntézu a analýzu biomolekul. Tento informace není v žádném případě úplná a poskytuje pouze úvod do této výkonné metody. Pro každou z těchto metod je k dispozici mnoho výborných článků a návodů. Rekombinační DNA technologie Rekombinační DNA technologie je základní schopností bionanotechnologií. Tato technologie nám umožňuje postavit jakékoli bílkoviny, a to jednoduše změnou genetických plánů, které jsou používány pro jejich stavbu. Dva přírodní enzymy - restrikční enzymy a DNA ligázajsou klíčem k rekombinační DNA technologii, která nám umožňuje upravovat informace ve vlákně DNA (obr.3-1). Před objevem těchto enzymů, upravili výzkumníci genetický kód živých organismů pomocí vlastních biologických nástrojů páření a křížení nebo náhodné mutageneze s chemikáliemi či ionizujícím zářením. Dnes vědci racionálně mění genetický kód na atomární úrovni. Obrázek 3-1 Rekombinační DNA technologie závisí na dvou klíčových enzymech. Restrikční enzymy, jako je EcoRI - na obrázku vlevo, dělí DNA na specifické sekvence. Tyto enzymy často produkují

během střihu "lepivé konce", jak je uvedeno ve středu. DNA ligáza, na obrázku vpravo, spojuje dva prvky dohromady. Restrikční enzymy jsou neuvěřitelně užitečné enzymy (Připomíná mi to žvatlání ryb v knize Stopařův průvodce po vesmíru od Douglase Adamse). Jsou vytvořeny bakteriemi, aby se chránily před virovou infekcí. Bakterie vytváří restrikční enzym, který štěpí DNA v jedné konkrétní sekvenci. Současně chrání vlastní DNA úpravou bází v té samé sekvenci, takže restrikční enzym neštěpí vlastní genom. Nicméně napadající virová DNA je okamžitě rozsekána restrikčním enzymem, protože není takto chráněna. Mnoho restrikčních enzymů stříhají nezávisle na sobě dvě vlákna DNA, místo přestřižení obou ramen rovnou přes šroubovici DNA. Tady je místo, kde biotechnologie nabízí své užití pro tyto enzymy. Tyto konce jsou "lepivé" a snadno spojitelné s jinými lepivými konci podobné sekvence. Takže restrikční enzymy mohou být použity ke stříhání DNA, při kterém produkují lepivé konce, které mohou být zpětně složeny s různou orientací. Takže restrikční enzymy, které byly vytvořeny pouze pro své ničivé schopnosti, jsou nyní nástrojem pro atomárně přesné změny velkých kusů DNA. Dnes technologie rekombinační DNA vzkvétá. Chytří vědci neustále objevují nové metody využití bílkovinových produkčních mašinerií buněk novými způsoby. Konzistentní metody, často ve formě komerčních souprav, jsou k dispozici pro všechny možné procesy. Můžeme najít a extrahovat konkrétní geny z organismů. Můžeme duplikovat a určit sekvence velkého množství těchto genů. Můžeme mutovat, rekombinovat a spojovat tyto geny nebo vytvořit zcela nové geny nukleotid za nukleotidem. Konečně můžeme nahradit geny v buňkách změnou jejich genetické informace. DNA může být navrženo komerčně dostupnými enzymy Přizpůsobené DNA je rutinně vytvářena v tisících laboratořích po celém světě. Biologické a syntetické techniky společně umožňují konstruovat velké řetězce DNA, složené z přírodních sekvencí DNA nebo zcela nové sekvence DNA. Úspěšné odvětví služeb došlo tak daleko, že poskytuje základní odborné znalosti pro DNA manipulace. Můžete snadno zakoupit úseky DNA nějaké dané sekvence a všechny enzymy potřebné k manipulaci s nimi. Výzkumníci používají širokou škálu přírodních biomolekul pro manipulaci s DNA. Jsou k dispozici dobře popsané protokoly a komerční zdroje pro tyto enzymy, takže jsou tyto procesy dostupné každé skromné laboratoři. Některé z nejdůležitějších biomolekul jsou: (1) Restrikční enzymy jsou izolovány z bakterií. Komerčně dostupných je více než 100 typů. Každý z nich stříhá DNA ve specifickém pořadí bází. Restrikční enzymy se typicky skládají ze dvou identických podjednotek, takže útočí na DNA symetricky a stříhají v palindromických sekvencích. (2) DNA ligáza připojí rozbité řetězce DNA. Když se dva lepkavé konce rozpojí, DNA ligáza se používá pro opětovné spojení. (3) DNA polymeráza vytváří novou DNA tak, že jako šablonu používá jiný řetězec, vytváří dvojitou šroubovici z jediného řetězce. To je používáno k vyplnění mezery a zkopírování celých kusů DNA.

Chemická syntéza DNA dokonale doplňuje tyto přírodní biomolekulární nástroje pro manipulaci s DNA. Současné metody umožňují automatizovanou syntézudna řetězců dlouhých asi 100 nukleotidů. Dva vzájemně se doplňující řetězce jsou snadno konstruovány a žíhány v roztoku, aby vytvořily dvojité šroubovice. Krátké oligonukleotidy jsou běžně syntetizovány a jsou komerčně dostupné. Jakmile je nová DNA je postavena, vyrábí se jich velké množství pomocí dvou hlavních metod: Klonováním DNA a polymerázovými řetězovými reakcemi. Termín "klonování"se odkazuje na vytvoření identické kopie bez normálních procesů pohlavního rozmnožování: kopie myší nebo ovce, stejné kultury buněk nebo v tomto případě mnoho identických kopií konkrétního fragmentu DNA. V DNA klonování je používána bakteriální buňka k vytvoření mnoha identických kopií DNA sekvence. Jednou z metod je vložit požadovanou DNA sekvenci do viru, který pak infikuje bakteriální buňky a nutí je k tvorbě množství kopií. Alternativně může být použit bakteriální plasmid. Bakterie přirozeně obsahují, kromě své hlavní genomu, malé kruhy plazmidů DNA. Pro naklonování sekvence DNA, ji přidáme do bakteriálního plasmidu, který vložíme do bakterie. Plasmid je pak zkopírován pokaždé, když se bakterie rozdělí a tvoří tak během svého dělení velké množství DNA (obr. 3-2). Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda pro kopírování malého vzorku DNA. Využívá efektivní, tepelně-stabilní DNA polymerázy izolované z bakterií, které žijí v horkých pramenech. Jak je ukázáno na obrázku 3-3, PCR probíhá v cyklech a zdvojnásobuje počet řetězců DNA na každém kroku. PCR je tak mocná, že můžete začít s jedním vláknem DNA a získat kolik potřebujete. Jakmile jsou navrhnuté DNA prvky postaveny, potřebujeme metody k vytvoření vlastních proteinů. Bílkoviny jsou konvenčně vytvářeny v navržených buňkách pomocí vektorů exprese, plazmidů, které obsahují gen určující protein spolu s vysoce aktivním promoterem sekvence. Promoter, který je často vzat z viru, řídí navrženou buňku, aby vytvářela velké množství messenger RNA založené na DNA plasmidu ve vektoru. Buňka pak syntetizuje bílkovinu na základě této mrna. Bakterie jsou nejčastěji využívané jako hostitelské buňky, které jsou navrženy pro produkci proteinů. Navržené bakterie vytvářejí velké množství bílkovin, často zahrnující 1-10% z celkových buněčných proteinů. Bakterie se také snadno pěstují a levné kvasící metody umožňují růst vysokého množství bakteriálních buněk ze skromných prostředků. Nicméně bakterie představují několik významných omezení. Zvířecí a rostlinné buňky často modifikují své proteiny po jejich syntéze a bakterie tyto změny neprovádí. Mnoho živočišných a rostlinných proteinů mají ke svým povrchům připevněné uhlohydrátové skupiny a bakterie tyto skupiny nepřidávají k navrženým proteinům. To může být fatální problém v produkci proteinů pro použití v medicíně. Mnoho z těchto proteinů musí mít odpovídající uhlohydrátovou skupinu, aby byly aktivní, a imunitní systém může nebezpečně reagovat s nevhodným obsahem uhlohydrátové skupiny (například potřeba být opatrný ohledně krevních typů během transfuze je kvůli rozdílům v uhlohydrátech připojených k buněčným proteinům). Modifikované kvasinkové buňky, hmyzí buňky, nebo savčí buňky se mohou použít v případech, kdy musí být pro správnou činnost upravené proteiny.

Obrázek 3-2 Plazmid pbr322 je jedním z nejčastějších vektorů používaných k modifikaci bakterie Escherichia coli. Je zde ukázána mapa plasmidu, který obsahuje 4361 párů bází DNA. Plazmid obsahuje oblast, která řídí replikaci plasmidu (ori) a dva geny, které kódují proteiny pro antibiotickou odolnost, jeden pro ampicilin (amp R ) a jeden pro tetracyklin (tet R ). Části, které jsou štěpeny různými restrikční enzymy, jsou uvedeny v okolí kruhu. Volbou vhodného enzymu, může plazmid odříznut na konkrétních místech. Výzkumníci přidají nové geny plazmidu odstřižením v některé z restrikčních oblastí spojováním v nové DNA. Lékům odolné geny poskytují inteligentní způsob určení, zda některá bakterie pohltila plazmid. Například pokud je přidána nová DNA na místo PstI, na pozici 3607, tak naruší ampicilinu odolný gen. Takže bakterie, které obsahují tento nový plazmid jsou snadno identifikovatelné a oddělil se od bakterií, které neobsahují plasmid: Budou odolné proti tetracyklinu, ale citlivé na ampicilin.

Obrázek 3-3 Přes opakovaná kola syntézy DNA a oddělení dvou řetězců, polymerázová řetězová reakce zvýší množství DNA ve vzorku. (1) Proces začíná s jediným řetězcem DNA. (2) Je oddělen zahřátím, a na konce se přidají krátké primerové řetězce. (3) DNA polymeráza vytvoří nový řetězec s použitím separovaného řetězce jako šablony. (4) Na konci cyklu jsou dvě identické DNA dvoušroubovice. Tento cyklus se opakuje, zdvojnásobujeí DNA na každém kroku.

Použití tepelně-stabilní polymerázy je trik k tomuto automatickému procesu, protože může přežít zahřívací krok každého cyklu. Dalším problémem s vytvořenou bakterií, která je občas aktivum, je, že bílkoviny mají tendenci agregovat, když dosáhnou vysokých koncentrací, tvoříc tělíska. Tělíska jsou hutné agregáty proteinů, které jsou snadno viditelné pod mikroskopem, často zabírající celou bakteriální buňku. Tvoří se, když se nové proteiny náhodně shluknou dříve, než budou moci podstoupit řádný skládací proces. Tělíska jsou velmi tvrdé, a k rozdělení jednotlivých proteinových řetězců musí být použity tvrdé podmínky. V mnoha případech pak tyto čištěné proteiny mohou být složeny za podmínek, které vedou k požadované struktuře. Pokud je možné renaturovat funkční protein z tělíska, m že být čištění značnou podporou. Vzhledem k tomu, že jsou tělíska hustší než většina ostatních struktur v buňce, jsou snadno oddělitelné od jiných buněčných složek jednoduchým odstředěním buněčného extraktu. Bílkoviny mohou také být vytvořeny bez pomoci živých buněk, a to izolací proteinových výrobních strojů a provedení reakce ve zkumavce. První krok proteinové produkce, přepis DNA do mrna, je nyní běžný pomocí čisté RNA polymerázy. Nicméně Druhý krok, syntéza bílkovin na bázi čištých mrna v systémech bez buněk, je stále technický problém. V některých případech jsou výtažky z cytoplazmy buněk, obsahující syntézu bílkovin stroje spolu se vším ostatním, účinné. Výtažky však můžou potkat problémy s omezenými dodávkami energie a přítomnost enzymů proteázy a nukleázy, které štěpí produkty a RNA zprávu. K překonání tohoto problému byly vytvořeny specializované systémy bez buněk s kontinuálním prouděním. Pokusy obnovit syntézu bílkovin pomocí čištěných přípravků komponentů byly rovněž úspěšné. Ale kvůli složitosti systému, který vyžaduje více než 100 samostatných složek, jsou stále omezeny na relativně skromné výnosy. Tyto metody se používají především ve výzkumu, než v průmyslové výrobě bílkovin. Nicméně výhody dělají z proteinové produkce bez buňek atraktivní cíl. Poskytuje kontrolovanou metodu pro syntézu bílkovin, které jsou obtížně ve vytvářených bakteriích, jako jsou na membránu vazané proteiny, proteiny, které jsou toxické pro bakterie, a bílkoviny, které obsahují neobvyklé aminokyseliny. Rozvoj efektivních překládacích mechanismů bez buněk je oblast aktivního výzkumu. Polohou cílené mutageneze dělají konkrétní změny v genomu V mnoha případech můžeme chtít, aby se pomocí několika malých změn na stávající přírodní protein, přizpůsobila jeho funkce pro danou aplikaci. Místem řízená mutageneze se používá v těchto případech ke změně pořadí aminokyselin v proteinu tím, že se provádí konkrétní změny ve stávajícím genu. Tímto způsobem můžeme vytvářet atomicky přesné změny ve struktuře proteinů, měnit strukturu a funkci. Pro úpravy stávajících genů je k dispozici široká škála metod. Některé z těchto metod jsou tak spolehlivé, že jsou k dispozici jako balené sady z komerčních zdrojů. Místem specifikované mutace jsou vhodně zavedeny do stávajících genů se speciálně konstruovaným oligonukleotidy, jak je znázorněno na obr. 3-4. Tyto krátká vlákna nahradí

normální sekvence DNA, s výjimkou v bodě, kde je žádoucí změna. Změna může spočívat v jediné změně aminokyseliny nebo krátkém vložení nebo vymazání. Jakmile je provedena změna, užije se klonování a exprese ke konstrukci modifikovaného proteinu. Místem řízená mutageneze způsobila převrat v molekulární biologii. Je to extrémně silná metoda pro stanovení funkcí specifických aminokyselin nebo regionů v rámci proteinu. Například, mohou být naráz mutovány jednotlivé aminokyseliny, které by mohly nahradit funkci. Tímto způsobem může být lokalizováno aktivní místo enzymu nebo vazebné místo pro hormon. Místem řízená mutageneze je také široce používána v pokusech o zlepšení stability proteinů, upravováním v cross-linkujících zbytcích nebo zlepšení vybavení reziduí v rámci proteinu (obr. 3-5). Tyto metody jsou nicméně pokořující. Až příliš často zjišťujeme, jak těžké to je předvídat změny, které nenaruší stabilní strukturu a funkce přírodních proteinů. Fúzní proteiny kombinují dvě funkce Rekombinační DNA techniky jsou také používány pro kombinování celých genů, které tvoří větší fúzní protein, který kombinuje funkčnost všech kusů. Zvláštní pozornost je třeba věnovat při navrhování propojení, aby fúzní proteiny neblokovaly jeden druhý při vytváření jejich aktivních struktur. Naštěstí mnohé přírodní proteiny jsou velmi robustní a provádí své funkce, i když se roztavily do jiné větší struktury. Obrázek 3-4 V místem řízených mutagenezích jsou konkrétní změny začleněny do genů pomocí speciálně konstruovaných malých oligonukleotidů. Oligonukleotid nahradí gen, s výjimkou místa, kde je požadovaná změna. K provedení změny je krátký

oligonukleotid žíhaný za podmínek, které umožňují párování přes neshody na požadované místo. DNA polymeráza je pak použita k vyplnění zbytku sekvence DNA tak, že použije tento krátký oligonukleotid jako primeru. Tento navržený řetězec je pak oddělen a původní DNA je zlikvidovat. Výsledkem je řetězec komplementární k původní DNA, avšak se změnami na místě, kde byl navázán oligonukleotid. Fúzní proteiny mohou využít přirozené mechanismy v buňkách. V našich buňkách jsou bílkoviny zaměřeny na různé oddíly (např. mitochondrie a endoplazmatické retikulum), pomocí krátkého signálního peptidu na konci proteinu. Tyto peptidy se používají jako značky pro rozpoznání správného místa pro protein a poté, co je protein doručen, jsou oříznuty pryč poté. Rekombinační DNA techniky mohou být použity pro připojení signálních peptidů jakékoli dané bílkoviny, která upřesňuje jeho umístění. Například signální peptid pro vylučování může být připojen k bílkovině našeho zájmu. Tento modifikovaná bílkovina pak bude uvolněna do okolního prostředí, připravena pro sběr a čištění. Obrázek 3-5 Enzym lysozym byl značně přetvořen při hledání způsobu, jak zlepšit jeho funkci a stabilitu. Nativní enzym je zde na vlevo se dvěma aminokyselinami na opačných koncích řetězce bílkoviny, znázorněnými růžovou barvou. Když se protein skládá, tyto dvě aminokyseliny skončí v této struktuře blízko samy sobě. V jedné navržené verzi lysozymu, na obrázku vpravo, byly tyto dvě aminokyseliny změněny na cystein. Když se protein složí, tyto dva cysteiny vytvoří disulfidickou vazbu, naznačenou červenou barvou, která zpevňuje složenou strukturu. Chimerické bílkoviny také ukázaly velkou užitečnost. Jsou zde zkombinované dva proteiny s různými funkcemi, které vytváří hybridní protein s oběma funkcemi. Například byly vytvořeny protinádorové imunotoxiny tím způsobem, že se zkombovala protilátka, která se váže na nádorové buňky s toxinem, který zabíjí buňky (obr. 3-6). Imunotoxiny vyhledávají rakovinné

buňky, zabíjí je a omezují tak vedlejší efekty normalní chemoterapie. Zeleně fluoreskující protein z medúzy byl pro výzkumné aplikace připojen k mnoha proteinům ke studiu umístění těchto proteinů v živých organismech. Části organismu, kde se nachází protein budou svítit zeleně.