Biologické přípravky na bázi entomopatogenních bakterií Přehled a praktické aspekty jejich záměrného využívání v ekologickém zemědělství

1 Biologické přípravky na bázi entomopatogenních bakterií Přehled a praktické aspekty jejich záměrného využívání v ekologickém zemědělství Entomopatogenní bakterie Doposud bylo izolováno více než 90 druhů bakterií prokazatelně vykazujících statut fakultativních nebo obligátních patogenů hmyzu. K významným druhům entomopatogenních bakterií patří jak Gram- tyčinkovité bakterie z čeledí Pseudomonadaceae (pohyblivé, anaerobní druhy, např. Pseudomonas aeuriginosa, P. fluoroscens) a Enterobacteriaceae (fakultativně anaerobní druhy, např. Serratia marcescens, S. entomophila), tak i Gram+ bakterie z čeledě Deinococcaceae (anaerobní nepohyblivé koky, např. Melissococcus pluton). Z hlediska praktického využití v biologické ochraně rostlin však v sortimentu entomopatogenních druhů sehrávají jednoznačně bezkonkurenční úlohu bakterie z čeledě Baccillacea (Gram+, tyčinkovité bakterie formující endospory), zejména pak zástupci rodů Clostridium sp. (striktně anaerobní, C. bifermentans) a Bacillus sp.(aerobní resp. fakultativně anaerobní). V rámci rodu Bacillus je známo přibližně 70 druhů, z nichž více než 20 je běžně izolováno z různých druhů hmyzích hostitelů. K běžným entomopatogenním zástupcům tohoto rodu patří Bacillus alvei, B. cereus, B. larvae, B. laterosporus, B. popilliae, B sphaericus, B. subtilis a svým významem zcela unikátní druh - Bacillus thuringiensis. V současnosti jsou k dispozici tisíce kmenů a izolátů B. thuringiensis (dále i jen Bt.), z nichž sice jen zlomek vykazuje virulenci vůči některému ekonomicky významnému druhu hmyzího hostitele, nicméně na bázi právě těchto kmenů jsou nejen produkovány standardní biopreparáty, ale v současnosti i konstruovány transgenní odrůdy mnoha druhů kulturních rostlin. B. thuringiensis byl poprvé odizolován z hmyzího hostitele (housenky bource morušového) již v roce 1901. Přímá insekticidní aktivita Bt. byla prokázána v roce 1911. Od té doby byly izolovány tisíce kmenů Bt., z nichž však pouze některé vykazují schopnost vyvolat primární onemocnění u larev některých druhů hmyzu. V 50. letech se na trhu objevily prvé biopreparáty na bázi Bt. určené proti larvám některých druhů motýlů. V roce 1976 byl na trh zaveden přípravek na bázi kmene Bt. vyvolávajícího letální onemocnění u některých skupin dvoukřídlého hmyzu (např. muchniček a komárů) a v roce 1984 byl odizolován kmen vykazující účinnost i na larvy některých druhů brouků (např. larvy mandelinky bramborové Leptinotarsa decemlineata). V současnosti se dokonce podařilo odizolovat i kmeny vykazující virulenci na nehmyzích hostitelích (např. na roztočích a háďátcích). V současnosti je v ČR k dispozici sice stále se zužující (!?) nicméně dostatečně reprezentativní sortiment Bt-biopreparátů pokrývající téměř celý komplex hmyzích hostitelů, tj. larvy významných druhů motýlů a mandelinky bramborové. V registru povolených přípravků však od roku 1999 nejsou evidovány přípravky na bázi B. thuringiensis ssp. israelensis (virulentní vůči larvám komárů a muchniček) a doposud nebyl registrován žádný přípravek na bázi Bt. ssp. azawai (vysoce virulentní vůči larvám zavíječe voskového Galleria mellonella). Bacillus thuringiensis Bt. je kosmopolitně rozšířená sporulující tyčinkovitá bakterie (velikost >0,9µm) zcela běžně se vyskytující v půdě, na povrchu rostlin a v různých organických odpadech (např. prašný odpad v obilních silech). Ve sporangiu Bt. je lokalizována oválná nepohlavní buňka (spora) a parasporální proteinová inkluze (tzv. krystal - 1

Klasifikace Bacillus thuringiensis 2 Cry). Přítomnost parasporálního tělíska odlišuje Bt. od příbuzného druhu půdní bakterie Bacillus cereus. Na rozdíl od B. cereus jsou u Bt. přítomny velké plazmidy nesoucí geny kódující produkci různých bílkovinných toxinů (tzv. δ-endotoxiny), které jsou součástí krystalu. Parasporální krystal představuje klíčový a unikátní prvek toxicity všech biopreparátů na bázi Bt. Parasporální krystal izolátů Bt. obsahuje 1-5 různých endotoxinů (proteinů), které vykazují odlišnou schopnost vazby na specifické receptory buněk epitelu středního střeva larev hmyzu. Virulence (či avirulence) každého izolátu Bt. vůči konkrétnímu druhu hostitele je závislá na kombinaci toxinů přítomných v krystalu a schopnosti jejich exprese v průběhu interakce s receptory buněk střeva hostitele. Doposud bylo popsáno a charakterizováno přibližně 70 různých toxinů Bt. jejichž přirozené kombinace představují reálnou či potenciální patogenitu druhu B. thuringiensis. Novým fenoménem výrazně ovlivňujícím přirozenou pathogenicitu Bt. je cílená konstrukce "nových kmenů" Bt. Pomocí genetických manipulací na úrovni Cry genů kódujících skladbu a množství δ- endotoxinů vznikají rekombinantní resp. geneticky modifikované kmeny Bt. vykazující některé nové vlastnosti (např. zvýšená virulence, účinnost i na rezistentní populace, zvýšená produkce δ-endotoxinů při submerzní fermentaci, větší odolnost abiotickým faktorům... a pod.). Klasifikace Bacillus thuringiensis Klasifikace druhu B. thuringiensis je poměrně složitá, nicméně pro pochopení vnitřní struktury sortimentu biopreparátů na bázi Bt. je její znalost absolutně nezbytná. Původní klasifikace Bt. byla založena na principu sérotypickém. Podle typu flagelárních antigenů byl druh Bt. vnitřně diverzifikován na 45 sérotypů zahrnujících 55 sérovarů. Cry Spora Sporangium entomopatogenní bakterie Bacillus thuringiensis (vegetativní buňka spora a parasporální proteinový krystal Cry) V tomto klasifikačním systému jsou sérovary identické s poddruhy (subspecies - ssp.) a při klasifikaci je využívána trinominální nomenklatura. K nejznámějším a v praktické ochraně rostlin nejvyužívanějším poddruhům patří B. thuringiensis ssp. kurstaki, Bt.-israelensis, Bt.-tenebrionis, Bt.-morrisoni, Bt.-aizawai a Bt.-san diego. Toto členění sice poměrně dobře koreluje s morfologickými a biochemickými charakteristikami Bt., ale v oblasti virulence již vykazuje nedostatečnou klasifikační a predikční úroveň. Při praktickém označování a charakteristice biopreparátů na bázi Bt. je však tato klasifikace stále běžně používána a jednotlivé podruhy jsou rostlinolékařskou praxí rutinně asociovány se standardním okruhem vnímavých 2

Mechanizmus účinku B. thuringiensis 3 hostitelů (Bt.-kurstaki - larvy motýlů, Bt.-israelensis - larvy muchniček a komárů, Bt.- tenebrionis - larvy některých brouků.. a pod.). Moderní klasifikace druhu B. thuringiensis se odvíjí od hodnocení komplexu Cry proteinů jednotlivých poddruhů, resp. od kategorizace sekvencí toxigenních aminokyselin v proteinech lokalizovaných v parasporálních krystalech jednotlivých poddruhů a kmenů Bt. V současnosti je definováno 6 tříd klasifikujících Cry proteiny Bt. (dříve Cry I-Cry VI, nověji pak Cry1-Cry6), které jsou dále detailně členěny na podtřídy (např. Cry1A až Cry1F; Cry2A a B, Cry3A až C a pod.). Každá z tříd Cry proteinů je charakterizována velikostí proteinů (kda) a je implicitně vázána na specifický okruh hostitelů (např. Cry1- larvy motýlů).tato klasifikace je jednoznačně přesnější a přes svou zdánlivou komplikovanost je i mnohem přehlednější. Důvodem změny klasifikačního systému bylo jednak zjištění, že některé sérotypově odlišné poddruhy mají shodné Cry-geny (např. ssp. aizawai a entomocidus) nebo že jeden sérotypově definovaný poddruh vykazuje schopnost produkovat proteinové krystaly obsahující δ-endotoxiny toxické pro různé skupiny hostitelů. Například, některé kmeny Bt.-morrisoni produkují proteinové krystaly s účinností proti housenkám motýlů, jiné kmeny téhož poddruhu proti larvám brouků a další kmeny jsou virulentní proti larvám dvoukřídlého hmyzu. Hlavním důvodem změny klasifikačního systému B. thuringiensis však byla absolutní nemožnost využít sérotypickou klasifikaci i v případě rekombinantních nebo geneticky modifikovaných kmenů. Mechanizmus účinku B. thuringiensis Mechanizmus účinku Bt. na larvy hmyzu lze rozdělit na dvě konsekventní fáze: 1. Toxikémie - fáze oslabení až usmrcení hostitele v důsledku působení toxických δ- endotoxinů parasporálního krystalu na buňky epitelu středního střeva hostitele 2. Septikémie - fáze masivní invaze bakterií do tělní dutiny a tkání a usmrcení hostitele v důsledku namnožení baktérií Detailně lze mechanizmus účinku Bt. interpretovat a demonstrovat různými způsoby. V obecné rovině lze základní posloupnosti v interakčním systému "Bt. - hostitel" popsat následovně. Krystaly Bt. jsou v principu agregáty velkých proteinů (polypeptidy, 130-140 kda), které fungují jako protoxiny a musí být nejprve aktivovány. Krystaly Bt. jsou velmi stabilní (nerozpustné v neutrálním a kyselém prostředí) a v zažívacím traktu většiny živočichů (včetně člověka) proto nedochází k aktivaci protoxinů. V alkalickém prostředí středního střeva hmyzích hostitelů (ph zpravidla > 9,5) však dochází k rozpuštění krystalů a uvolnění resp. aktivaci protoxinů. Protoxin sám o sobě toxicky nepůsobí, ale v důsledku působení proteolytických enzymů (enzymy přirozeně se vyskytujících ve středním střevě hostitele, velmi často trypsiny) jsou postupně degradovány na toxiny (proteiny o průměrné velikosti 60 kda). Toxiny se postupně vážou na specifické receptory na povrchu buněk epitelu středního střeva a indukují tvorbu mikroskopických pórů v buněčných membránách, následně dochází k vytvoření průchodných kanálků, které propojují vnitřní stěnu středního střeva s tělní dutinou. Při poškození buněčných membrán dochází k narušení jejich semipermeability což v důsledku vede k neusměrněnému pohybu iontů. Toxiny poškozené buňky bobtnají a následně odumírají (praskají, lyzují). V důsledku paralýzy a rozpadu buněk dochází k rychlé imobilizaci až desintegraci celé střední části zažívacího traktu napadeného hostitele, larva přestává přijímat potravu, produkuje tekuté výkaly, není schopna pohybu a často již v této fázi hyne (letální toxikémie, projevuje se již po několika hodin po perorálním příjmu krystalu). V narušeném středním střevě dochází k výraznému snížení ph, což způsobuje aktivaci spor Bt. (případně i jiných nepatogenních druhů 3

Toxikologické a ekologické efekty 4 bakterií), které klíčí, pronikají do tělní dutiny hostitele a po namnožení způsobují (letální) septikémii. V této fázi infikovaná larva v důsledku vnitřní dekompozice postupně měkne, ztekucuje a mění barvu na hnědočernou. Příznaky septikémie jsou na larvách zpravidla zjevné 3-5 dnů od iniciace infekce Recentní výzkumy prokázaly, že ve struktuře toxinů Bt. existují 3 výrazně definované oblasti (integrované skupiny ±220 aminokyselin na jednu doménu, modelová struktura viz Obr. 3), z nichž každá je zodpovědná za některou z klíčových fází interakcí s buňkami epitelu středního střeva. Tento poznatek má sice značný význam při konstrukci rekombinantních nebo konjugovaných kmenů Bt., nicméně biopreparáty na bázi takto modifikovaných kmenů jsou pro potřeby ekologického zemědělství nepoužitelné Toxikologické a ekologické efekty Biopreparáty na bázi Bt., (případně samotných separovaných krystalů) vykazují velmi nízkou akutní nebo chronickou toxicitu vůči teplokrevným živočichům, dermální iritace je zcela zanedbatelná a jen mírně iritují při inhalaci, účinek na oči je výrazně dráždivý. Dlouhodobé expozice Bt. nevykazují negativní vliv na reprodukci, nemají teratogenní účinky, mutagenní nebo kancerogenní účinky Bt. na savcích doposud nebyly zjištěny. Mírný mutagenní účinek Bt. byl prokázán pouze v testech na rostlinných pletivech. Při požití spolu s potravou nebyla zjištěna perzistence Bt. v zažívacím traktu savců, doposud nebyl zaznamenán žádný případ spontánní nebo doprovodné invaze do těla nebo jednotlivých orgánů testovaných savců. Primární proces aktivace protoxinu je hlavním důvodem vysoce specifického insekticidního účinku B. thuringiensis. Komplexní evaluace přímého vlivu a vedlejších účinků prokázala minimální vliv Bt. na necílové organizmy. Biopreparáty na bázi Bt. jsou zcela kompatibilní s většinou ostatních přirozených nepřátel hmyzích škůdců. Bt. byl testován na 74 druzích ptáků a 11 druzích ryb a ani v jednom případě nebyl zjištěn přímý toxický efekt nebo negativní vliv na reprodukci a vývoj, nebyla zaznamenána invaze do tkání nebo jednotlivých orgánů. V některých případech byl prokázán negativní vliv Bt. (ssp. israelensis) na některé druhy vodních měkkýšů a korýšů. Při hodnocení vlivu Bt. na opylovače (včela medonosná a čmelák Bombus terrestris) byl zjištěn vysoký stupeň kompatibility, což nejlépe dokazuje skutečnost, že i rekombinantní preparáty na bázi Bt.-aizawai jsou ve vysokých dávkách povoleny k ochraně včelstev před zavíječem voskovým Galleria mellonella. Bt. může za vhodných podmínek přežívat v půdě až 5 měsíců, avšak v prostředí ph<5 je velmi rychle degradován. Mobilita v půdním profilu je velmi malá a proto nepatří mezi agens rizikové z hlediska kontaminace spodních vod. Na povrchu půdy a rostlin vykazuje Bt. malou až velmi nízkou životnost. Klíčovým abiotickým faktorem ovlivňujícím přežívání Bt. na povrchu rostlin je UV složka slunečního záření. Při plném oslunění přežívá Bt. na povrchu ošetřených rostlin pouze několik hodin (polovina spor Bt. je inaktivována již po 4 hodinách expozice přímému slunečnímu záření!!!). Určitá omezení jsou doporučována pouze při aplikaci v okolí chráněných vodních zdrojů a při přímé aplikaci na vodní plochy. Po aplikaci na povrch vodních ploch má Bt. tendenci sedimentovat a krátkodobě (48-72 hod po aplikaci) mohou být překročeny bezpečné koncentrace Bt. v sedimentech na dně. Stručná sumarizace základních údajů dokumentuje vysoký až výjimečný stupeň hygienické, toxikologické a ekologické nezávadnosti Bt.-preparátů. 4

Biopreparáty na bázi B. thuringiensis 5 Biopreparáty na bázi B. thuringiensis Současný sortiment biopreparátů na bázi Bt. je velmi široký a sestává z desítek hlavních nebo generických verzí přípravků. Hlavním kriteriem kategorizace sortimentu Bt.-bioinsekticidů je podle kmenů, na jejichž bázi je přípravek koncipován. Většina Bt.-přípravků je stále koncipována na bázi původních kmenů, získaných po izolaci z výskytu na přirozeném hostiteli. Stále častěji se však na trhu objevují i přípravky nové generace koncipované na bázi kmenů pozměněných záměrnou selekcí nebo pomocí genetických modifikací (rekombinantní kmeny, transkonjugované kmeny a pod.). Až do konce 70. let byly k dispozici pouze přípravky na bázi kmene Bt.- kurstaki, které vykazují účinnost proti larvám některých druhů motýlů. V tomto období sehrál zcela výjimečnou úlohu kmen Bt.-kurstaki označovaný HD1, který je již více než 30 let používán při výrobě biopreparátů, které jsou i dnes na trhu dostupné. Převážná většina Bt.-insekticidů registrovaných v ČR je stále koncipována na bázi tohoto kmene (viz tabulky v přílohách). Současný sortiment biopreparátů na bázi Bt. lze rozdělit do 3 skupin: 1. Biopreparáty na bázi kmenů účinných na larvy motýlů - přípravky na bázi Bt.- kurstaki (komerční názvy přípravků a jejich verzí - Biobit, Condor, Cutlass, Dipel, Forey, Full-Bac, Javelin,..mnoho dalšícha) a Bt.- aizawai (Agree, Certan, Xentari..); Bt.-k mají široké uplatnění v ochraně polní zeleniny, bavlny, ovocných výsadeb a révy vinné, ochrana lesních porostů; převládají přípravky na bázi přirozených kmenů, ale v sortimetnu jsou zastoupeny i přípravky rekombinantní (přípravky Crymax, Raven - firma Ecogen) a transkonjugantní (např. přípravek Foil - kombinovaná účinnost na larvy motýlů a některých brouků, firma Ecogen); k dispozici je celá škála formulací (WP, WG, WD, LC) 2. Biopreparáty na bázi kmenů účinných na larvy dvoukřídlého hmyzu - biopreparáty na bázi kmene Bt.-israelensis (např. přípravky Skeetal a Vectobac - fi. Abbott, Bactimos - Solvay/Duphar, Teknar - Thermo Trilogy); velmi účinné na larvy některých druhů muchniček a komárů (Aedes spp., Psorophora spp.), nižší účinnost na larvy komárů rodu Anopheles a Culex, neúčinné na "vyšší mouchy" (např. moucha domácí Musca domestica aj.), velkoplošné aplikace na stojaté vody, velmi využívané v komunální hygieně; k dispozici jsou různé formulace včetně speciálních (tvrzené kroužky, ve kterých je Bt. immobilizován v kukuřičné drti, kroužky jsou kladou do vody a Bt. se do prostředí uvolňuje postupně, hojně využíván při likvidaci drobných zdrojů komárů - pneumatiky, rostliny, barely s dešťovou či jinak jímanou vodou.. a pod.), v ČR není v současnosti registrován žádný přípravek na bázi tohoto kmene Bt. 3. Biopreparáty na bázi kmenů účinných na larvy některých brouků - biopreparáty na bázi kmenů Bt.-tenebrionis a Bt.-san diego, účinné pouze vůči několika druhům brouků (mandelinka bramborové, některé druhy bázlivců a květopasů), selektivní účinnost na úrovni čeledí resp. podčeledí, zcela neúčinné na larvy většinu brouků; přípravky M-Trak (geneticky modifikovaný přípravek, část genomu kódující tvorbu Cry transformována do bakterie Pseudomonas florescens, přípravek obsahuje pouze Cry) a Novodor (registrován i v ČR), v sortimentu přípravků účinných na larvy brouků je zvláštním případem je přípravek Foil (transkonjugantní Bt.-kurstaki vykazující účinnost jak na larvy brouků, tak i housenky některých motýlů) 5

Současnost a perspektivy využívání B. thuringiensis 6 Současnost a perspektivy využívání B. thuringiensis Přípravky na bázi Bt. jsou široce využívány na celém světě. K tradičně nejvýznamnějším uživatelům Bt. patří USA (cca 45% světové spotřeby), Čína (15%) a evropské státy (15%). Globální nárůst roční produkce a spotřeby Bt.-přípravků činí 5,5-7,0% a z větší částí je realizován rozšiřováním trhu i do méně tradičních oblastí (státy Jižní Ameriky, Asie a Afriky). Při praktickém využívání Bt. doposud stále převládá strategie tzv. inundativních introdukcí. Inundativní introdukce je jednou ze strategií biologické ochrany, při které je přirozený nepřítel do cílového agroekosystému aplikován zpravidla jednorázově v množství, které za normálních okolností zajistí regulaci četnosti populace škůdce na požadované (tolerovatelné) úrovni. Tato strategie biologické ochrany je standardně využívána v ochraně proti endemickým druhům škůdců, kteří realizují jednu (monovoltinní druhy) maximálně dvě (bivoltinní druhy) generace v průběhu vegetačního cyklu. Příkladem je široké využívání přípravků na bázi kmene Bt.-kurstaki HD1 v ochraně rychlené i polní zeleniny, ovocných kultur, vinic a lesních porostů proti larvám různých druhů motýlů, případně biopreparátů na bázi Bt.-tenebrionis a san diego proti larvám mandelinky bramborové. Druhou strategii ve využívání biopreparátů na bázi Bt. představuje strategie sezónních inokulativních introdukcí, při které jsou biopreparáty na bázi Bt. aplikovány proti vícegeneračním druhům (polyvontinní druhy) opakovaně podle potřeby po celou sezónu. Příkladem této strategie je využívání biopreparátů na bázi Bt.-israelensis v biologické ochraně proti komárům resp. Bt.-aizawai v ochraně včelstev proti zavíječi voskovému Galleria mellonella. Biotechnologickým předpokladem realizace inundativní resp. sezónně inokulativní strategie je dostupnost standardních biopreparátů. Ve stávajícím sortimentu doposud sice stále převládají různé formulace biopreparátů koncipovaných na bázi původních přírodních kmenů Bt., nicméně stále častěji jsou zastoupeny i přípravky na bázi záměrnou selekcí vylepšených nebo geneticky manipulovaných kmenů. Razantní zásahy do přirozeného charakteru kmenů Bt. jsou motivovány řadou důvodů. Známou nevýhodou (?) přípravků na bázi Bt. v porovnání s konvenčními insekticidy je jejich úzké spektrum účinnosti. Jak již bylo uvedeno, velmi typickou vlastností jednotlivých kmenů Bt. je účinnost na úzký okruh hostitelů, který je nejen striktně limitován řádem (např. kmeny účinné pouze na larvy motýlů, Lepidoptera), ale i uvnitř takto vymezené taxonomické jednotky vykazují výrazné odlišnosti v účinnosti. Příkladem je vynikající účinnost nejrozšířenějšího kmen Bt.-israelensis HD1 na larvy motýlů rodu Spodoptera a zároveň nízká účinnost vůči jiným druhům téhož řádu (např. larvám motýlů rodu Heliothis, housenkám předivek rodu Plutella). Takto diverzifikovaná virulence snižuje zájem o využívání Bt.-biopreparátů v multidruhových komplexech škůdců, které jsou typické pro zemědělské systémy. Naopak, stejná vlastnost (tj. selektivita) je vysoce ceněna při využívání Bt. v ochraně proti lesním škůdcům (např. bekyně rodu Lymantria), případně proti obtížnému hmyzu a přenašečům chorob (komáři rodů Aedes, Psorophora, Anopheles nebo Culex), kdy je Bt. aplikován do relativně komplexních ekosystému s četným zastoupením necílových druhů organizmů. 6

Současnost a perspektivy využívání B. thuringiensis 7 Geneticky modifikované kmeny Bt. a biopreparáty neakceptovatelné ekologickým zemědělstvím Nově koncipované kmeny Bt. jsou zpravidla konstruovány pomocí genetických manipulací na úrovni Cry genů (tj. genů kódující tvorbu a složení parasporálního krystalu resp. -endotoxinů). V současnosti je definováno téměř 100 různých Cry genů lokalizovaných ve velkých plasmidech vegetativních buněk Bt. (Schéma 1) Cíleným přenosem vybraných Cry genů se podařilo vytvořit nové, rekombinantní resp. transkonjugované kmeny Bt. Nově konstruované kmeny vykazují některé vlastnosti, které nelze najít ani při monitoringu tisíců přírodních kmenů. Mezi unikátní vlastnosti geneticky modifikovaných kmenů patří například 1) obecné zvýšení účinnosti (až na úrovni synergismu), 2) rozšířené spektrum účinnosti až po kombinovanou účinnost (např. kombinací Cry1Ac a Cry3A byl zkonstruován transkonjugantní kmen Bt. vykazující účinnost jak na larvy některých motýlů tak i brouků, přípravek FOIL fi. Ecogen), 3) obnovená účinnost i na rezistentní populace hostitelů, 4) vyšší produkce parasporálních krystalů, 5) výrazné snížení až eliminace produkce nežádoucích sekundárních metabolitů a další. V mnoha zemích světa jsou již registrovány komerční biopreparáty koncipované na bázi geneticky manipulovaných kmenů Bt. (na bázi transkonjugantních kmenů - Agree, Design, Condor, Cutlass a Foil; na bázi rekombinantních kmenů - Crymax, Raven a Lepinox). Praktické využívání biopreparátů na bázi geneticky manipulovaných kmenů Bt. vyžaduje jak dobré znalosti ohledně původu modifikovaných kmenů, tak i legislativní úpravy, které používání preparátů na bázi geneticky manipulovaných organizmů (GMO) umožňují. V případě preparátů na bázi Bt. lze legislativní restrikce v oblasti GMO částečně obejít formulací přípravků (přípravky bez přítomnosti vegetativních buněk Bt. obsahující pouze parasporální krystaly imobilizované v inertním nosiči, 20-80g proteinových krystalů v 1 kg/l přípravku), nicméně i produkty (Cry proteiny) geneticky modifikovaných kmenů Bt. je nutno (obecně ekologické hledisko) považovat za rizikové. Na využívání geneticky modifikovaných kmenů Bt. a jejich produktů lze mít různý názor, nicméně tento fenomén není možné ignorovat. Zároven je však nutno konstatovat, že praktické využívání biopreparátů na bázi geneticky modifikovaných kmenů Bt. v Současnost i budoucnost Bt. - biopreparátů jednoznačně směřuje k maximální exploataci možností, které genetické manipulace potenciálně nebo již i prakticky poskytují. Konstrukce a komercionalizace nových kmenů Bt. a biopreparátů na jejich bázi je a bude nedílnou součástí praktického využívání tohoto unikátního druhu bioagens. 7

Současnost a perspektivy využívání B. thuringiensis 8 Larva běláska zelného P. brassicae usmrcená Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Schéma funkčních domén endotoxinu Bacillus thuringiensis 8

Současnost a perspektivy využívání B. thuringiensis 9 Přílohy k problematice Bacillus thuringiensis a jeho využití v biologické ochraně v ekologickém zemědělství SCHÉMA VÝVOJOVÉHO CYKLU B. thuringiensis plazmidy chromozom Spora Spo Cry Cry Sporangium Dormantní sporangium v průběhu aktivace dezintegruje (1) a uvolňuje se vegetativní buňka (Spora) a parasporální proteinový krystal (Cry - struktura a funkce podrobněji viz schéma č. 3 a 4). Vegetativní buňky klíčí, dělí se (2 a 3) a v průběhu sporulace (4) se z každé spory tvoří nové sporangium obsahující proteinový krystal, který je toxickou složkou Bt. Základní vývojový cyklus může být realizován jak v systému in vivo (parazitická verze uvnitř těla hmyzího hostitele, podrobněji schéma 2 a 3), tak i v systému in vitro (saprofytické verze - výroba biopreparátů na bázi Bt.) 9

formování nového krystalu stabilita vazba na membrány buněk odumírání buněk, perforace PROTOXIN 10 RŮZNÉ MECHANIZMU ÚČINKŮ TOXICKÝCH PROTEINŮ KRYSTALU Bacillus thuringiensis Cry TOXIN PROTOXIN PŘÍJEM TOXIGENNÍHO ROZPUŠTĚNÍ KRYSTALU S POTRAVOU TOXIGENNÍHO KRYSTALU PROTOXIN ROZVOD TEKUTINAMI TOXIN STŘEDNÍHO STŘEVA KONTAKT S BUŇKAMI EPITELU STŘEDNÍHO STŘEVA VZNIK KOMPLEXU RECEPTOR-TOXIN VLIV PROTEOLYTICKÝCH ENZYMŮ VAZBA NA MEMBRÁNY BUNĚK STŘEDNÍHO STŘEVA PARALÝZA EPITELU ROZKLAD BUNĚK A VZNIK STŘEDNÍHO STŘEVA PERFORACÍ STĚNY STŘEDNÍHO STŘEVA FUNKČNÍ DOMÉNY PARASPORÁLNÍHO KRYSTALU A PRŮBĚH AKTIVACE TOXINŮ Bacillus thuringiensis (příklad krystalu CryIAB - B. thuringiensis subsp. kurstaki) Cry CryIAB PROTOXIN Toxin alkalické prostředí proteolytické enzymy PROTOXIN ENDOTOXIN (66 kda) (130 kda) V zažívacím traktu hostitele dochází k dezintegraci sporangia Bt a uvolnění vegetativní buňky (1) a toxigenního krystalu (2). V alkalickém prostředí středního střeva je uvolňován protoxin (3 a 5+6), který je vlivem proteolytických enzymů dále štěpen na toxický endotoxin (4). Endotoxin (6) tvoří integrované skupiny 10

Toxin 11 aminokyselin ( 220 aminokyselin na funkční doménu), které plní specifické funkce v interakci s buňkami epitelu středního střeva hostitele) PARAZITICKÝ VÝVOJOVÝ CYKLUS ENTOMOPATOGENNÍ BAKTERIE Bacillus thuringiensis: Tox Spo Cry Bt proniká do těla hostitele spolu s potravou. V předním střevě dochází k rozpadu sporangií (1) a uvolňují se spory (Spo) a intracelulární proteinové krystaly (Cry), které jsou následně rozpouštěny na protoxiny a toxiny. Specifické toxiny (Tox) se váží na receptory buněk středního střeva (2) a indukují jejich postupnou paralýzu, rozklad a vznik perforací v epitelu středního střeva (3). Perforacemi ve střevě pronikají vegetativní spory do tělní dutiny a způsobují usmrcení hostitele v důsledku septikémie. V usmrceném hostiteli dochází k tvorbě nové generace sporangií (4), která po uvolnění do prostředí mohou iniciovat nový vývojový cyklus (5) (některé další aspekty procesu patogeneze Bt. viz schéma 4) 11

Toxin 12 PŘEHLED A CHARAKTERISTIKA NĚKTERÝCH BIOINSEKTICIDŮ NA BÁZI B. thuringiensis REGISTROVANÝCH PRO ÚČELY OCHRANY ROSTLIN Název přípravku Kmen Bt. Aktivita Výrobce Poznámka ABLE kurstaki Lepidoptera 1 CERTIS, USA - AGREE aizawai Lepidoptera CERTIS, USA - BIOBIT 2 HD1-kurstaki Lepidoptera ABOTT Laboratories Transkonjug. BACTIMOS israliensis Diptera ABBOTT Lab. - BACTOSPINE kurstaki Lepidoptera ABBOTT Lab. - CONDOR kurstaki Lepidoptera ECOGEN Inc. Transkonjug. COSTAR kurstaki Lepidoptera CERTIS, USA - CRYMAX kurstaki Lepidoptera ECOGEN Inc. Rekombin. Bt. CUTLASS kurstaki Lepidoptera ECOGEN Inc. Transkonjug. DESIGNE aizawai Lepidoptera CERTIS, USA Transkonjug. DIPEL HD1-kurstaki Lepidoptera ABBOTT Lab. FOIL kurstaki Lep. / Col. ECOGEN Inc. Transkonjug. FORAY HD1-kurstaki Lepidoptera ABBOTT Laboratories - FLORBAC aizawai Lepidoptera ABBOTT Laboratories - FUTURA kurstaki Lepidoptera ABBOTT Laboratories - GNATROL israliensis Diptera ABBOTT Laboratories - JAVELIN HD1-kurstaki Lepidoptera CERTIS, USA - LEPINOX kurstaki Lepidoptera ECOGEN Inc. Rekombin. Bt. MATTCH Pseudomonas Lepidoptera MYCOGEN Corp. Enkapsul. Cry MOLESTAR kurstaki Lepidoptera UNITED AGRI - PRODUCTS MTRAK Pseudomonas Coleoptera MYCOGEN Corp. Enkapsul. Cry MVP Pseudomonas Lepidoptera MYCOGEN Corp. Enkapsul. Cry NOVODOR tenebrionis 3 Coleoptera ABBOTT Laboratories - RAVEN kurstaki Lep. / Col. ECOGEN Inc. Rekombin. Bt. STEWARD HD1-kurstaki Lepidoptera CERTIS, USA - THURICIDE HD1-kurstaki Lepidoptera CERTIS, USA - TRIDENT tenebrionis Coleoptera CERTIS, USA - VAULT HD1-kurstaki Lepidoptera CERTIS, USA - VECTOBAC israliensis Diptera ABBOTT Laboratories - XENTARI aizawai Lepidoptera ABBOTT Laboratories - Zvýrazněné řádky biopreparáty dostupné a registrované v České republice 1 Lepidoptera - larvy motýlů; Diptera - larvy dvoukřídlého hmyzu, Coleoptera - larvy brouků 2 Ve vystínovaných řádcích jsou uvedeny přípravky na bázi Bt., které jsou registrovány v České republice (1999) 3 tenebrionis = subspecies morrisoni 12