Přímá analýza reálných vzorků hmotnostní spektrometrií s využitím nanodesorpčního elektrospreje (nano-desi-ms) Teorie: Desorpční elektrosprej (DESI) byl popsán v roce 2004 Zoltánem Takátsem. Jedná se o ambientní měkkou ionizační techniku, která umožňuje přímo analyzovat nízkomolekulární látky povrchu často bez jakékoliv úpravy. DESI ionizuje a desorbuje molekuly povrchu pomocí elektrospreje. Elektrosprej vytváří jemné nabité kapičky rozpouštědla, které dopadají na povrch pod úhlem, desorbují molekuly na povrchu a pod úhlem (viz. Obr. 1) jsou transportovány do hmotnostního spektrometru (MS). DESI je složeno ze dvou v sobě vložených kapilár. Vnitřní sprejovací kapilárou protéká rozpouštědlo (sprejovací kapalina), na které je vkládáno vysoké napětí 3-5 kv. Okolo vnitřní kapiláry proudí dusík, který pomáhá fokusovat jemný sprej a desorbovat molekuly povrchu do MS. Princip ionizace a desorpce molekul povrchu pomocí DESI není zcela objasněn. Na základě počítačových simulací se předpokládá, že analyzovaný povrch je postupně zavlažen sprejovací kapalinou, molekuly povrchu jsou extrahovány z povrchu do kapaliny, ionizovány a desorbovány. Ionty a nabité mikrokapičky jsou z povrchu odprašovány (tzv. droplet pick-up mechanismus) a transportovány do MS. DESI si pro svou jednoduchost našlo široké uplatnění např. v analýze farmakokinetik, výbušnin, produktů pyrolýzy a metabolismu, ale i ve forenzní chemii i v zobrazovacím 2D módu, např. při analýze lipidů v mozkové tkáni. Obr. 1 Schéma iontového zdroje DESI Pro toto cvičení byla navržena jednodušší alternativa desorpčního elektrosprej, desorpční nanoelektrosprej (nano-desi), se kterým má katedra analytické chemie letité zkušenosti. Nano-DESI nevyžaduje pomocný plyn k tvorbě spreje. Vysoké napětí je vkládáno na kapiláru s vnitřním průměrem 1-2 nm. Jenmý sprej nabitých kapiček rozpouštědla je vytvářen pomocí kapilárních sil ve sprejovací špičce a průtok kapaliny je v jednotkách nl/min (viz. Obr. 2).
Obr. 2 Schéma iontového zdroje nano-desi Nano-desorpční elektrosprej: Nano-DESI připevněný k hmotnostnímu spektrometru je zobrazen na Obrázku 3 a 4. Sprejer je pohyblivý v osách x, y, z a úhlu u. Barevně označené posuvné šrouby umožňují nastavit sprejer do správné geometrie. Žlutý šroub pohybuje sprejem v ose y, červený v ose x, zelený a šedý v ose z. Na pravé straně je červeně označeným drátem přiváděno vysoké napětí, proto buďte opatrní při manipulaci se zdrojem a vždy se ujistěte, že zdroj je vypnutý a v uživatelském okně svítí černý trojúhelník v zeleném pozadí (viz. níže). Pod sprejovací kapilárou je umístěno podložní sklíčko, na které je umístěn vzorek. Sprejer je snadno vyjmutelný k naplnění sprejovací kapiláry sprejovacím rozpouštědlem.
Obr. 3 DESI nasazené na hmotnostní spektrometr LCQ Finnigan Obr. 4 Sprejovací kapilára směřuje před ústí vstupní kapiláry hmotnostního spektrometru..
Analýza aktivních složek tablet metodou nano-desi-ms Úvod: Léčiva - tablety obsahují aktivní složky, které mají terapeutický účinek, a pomocné nebo nosné látky, které dávají léčivu praktickou formu k užívání nebo chrání aktivní složku léčiva před snížením účinnosti. Koncentrace aktivní složky je relativně nízká oproti pomocným látkám. Účinné látky v tabletách jsou rutinně stanovovány metodou HPLC-MS, kde je nutná jejich úprava tablet a převedení (např. extrakcí) účinné látky do roztoku. Metoda DESI umožňuje přímou analýzu tablet. Úkol: Analyzujte předložené tablety metodou DESI. Určete komerční název tablety na základě molekulové hmotnosti její aktivní složky. Chemikálie a pomůcky: Methanol, kyselina mravenčí, destilovaná voda, tři neoznačené tablety, příbalové letáky: Acylpyrin (Herbacos-Bofarma), Paralen (Zentiva), Ibumax (Vitabalans oy), podložní sklíčko, sprejovací špičky, oboustranná lepicí páska, pilník, mikrostříkačka, nano-desi, hmotnostní spektrometr Thermo LCQ Finnigan. Pracovní postup: 1) Přečtěte si příbalové letáky léčiv a na internetu vyhledejte molekulové hmotnosti aktivních složek tablet. 2) Připravte si roztok sprejovací kapaliny, směs metanol:voda, 1:1 s 0,2 % kyselinou mravenčí. 3) Připevněte DESI zdroj ke vstupu do hmotnostního spektrometru a upravte geometrii zdroje (viz. Teorie a Obr. 2, 3 a 4). Otevřete si program LCQ tune, ikonu najdete na ploše. Otevřete si metodu C:\Xcalibur\methods\desi\cvicení_lekypoz pro analýzu tablet v pozitivním módu nebo C:\Xcalibur\methods\desi\cvicení_lekyneg pro analýzu v negativním módu. Sprejovací špičku naplňte sprejovací kapalinou, upevněte ji do držáku, vložte čisté sklíčko do zdroje a přisuňte za pomoci pouhých roubů ke vstupu do hmotnostního spektrometru. Spusťte ladění. Na displeji se objevují spektra pozadí (sprejovací kapaliny), píky o nízké intenzitě okolo 10E3 (viz. Příloha I). Nevidíte-li spektra, upravte geometrii nano-desi. Je-li signál stabilní, zastavte ladění. 4) Tabletu jemně opilujte pilníkem a připevněte ji oboustrannou lepicí páskou na podložní sklíčko. Sklíčko s tabletou vložte do zdroje pod sprejovací kapiláru. Tableta je cca 3 mm široká, a proto je třeba o tuto vzdálenost výšku stolku snížit. 5) Spusťte ladění. Na displeji se objevují intenzivní píky účinné látky a jiných složek tablety. Není-li tomu tak, upravte geometrii zdroje.
6) Spusťte akvizici spekter po dobu 1 minuty. Spektra uložte do složky D:\Data\Desi_cvičení. Po akvizici zastavte měření a vyměňte tabletu. Ostatní tablety analyzujte stejným způsobem. 7) Po analýze všech tablet vypněte měření a zavřete LCQ tune okno. 8) Na základě molekulových hmotností účinných látek v tabletách identifikujte komerční názvy tablet. Nezapomeňte, že ve spektru se mohou vyskytovat i sodné a draselné adukty. S protokolem odevzdejte vytisklá spektra s označenými píky účinných látek.
Příloha I. Spektrum pozadí DESI.