Úloha metabotropních glutamátových receptorů v percepci bolesti The role of metabotropic glutamate receptors in pain perception

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA FYZIOLOGIE Speciální chemicko-biologické obory Helena Jindrová Úloha metabotropních glutamátových receptorů v percepci bolesti The role of metabotropic glutamate receptors in pain perception BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Školitel: doc. MUDr. Miloslav Franěk, Ph.D Praha 2011 1

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval/a samostatně a že jsem uvedl/a všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, 09.05.2011 Podpis 2

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli, doc. MUDr. Miloslavu Fraňkovi, Ph.D za trpělivost a cenné rady při sepisování této práce. Dále bych chtěla poděkovat svým rodičům za podporu při studiu. 3

Abstrakt Chronická bolest trvalá či periodická bolest trvající alespoň tři měsíce je bolest která pozbyla svého původního smyslu a stala se nemocí sama o sobě, postihuje kvalitu života a často komplikuje i znemožňuje běžné denní aktivity. Navzdory množství dostupných analgetik značná část pacientů vykazuje rezistenci na léčbu, což vede k nutnosti hledat nové druhy léků. Jedním z možných cílů pro nová analgetika jsou metabotropní glutamátové receptory. Tato práce si klade za cíl formou literární rešerše zpracovat současné poznatky o vlivu metabotropních glutamátových receptorů na vnímání bolesti ve fyziologickém i senzitizovaném stavu a uvést tyto poznatky do souvislosti s možným terapeutickým využitím. Klíčová slova: mglur, bolest, G-proteiny, hyperalgezie, alodynie, zánět Abstract Chronic pain persistent or intermittent pain lasting at least three months is pain that lost its original purpose and became disease by itself, affecting quality of life and often complicating even ordinary daily activities. In spite of wide range of available analgetic drugs significant proportion of patients shows resistance to medication which leads to need of novel drugs. One of possible targets of novel analgetics are metabotropic glutamate receptors. Aim of this thesis is to give an overview of current knowledge regarding effect of metabotropic glutamate receptors in pain transmission in physiological and sensitised state and show this evidence in context of possible therapeutic utilization. Keywords: mglurs, pain, G-proteins, hyperalgesia, allodynia, inflammation 4

Obsah 1. Seznam zkratek...6 2. Úvod...7 3. Zařazení metabotropních glutamátových receptorů...7 3.1 Receptory spřažené s G proteiny...7 3.2 Mechanismus účinku G proteinů...8 4. Metabotropní glutamátové receptory...9 4.1 I. skupina mglur...10 4.2 II. a III. skupina mglur...10 5. Vnímání bolesti...10 6. Lokalizace metabotropních glutamátových receptorů...11 6.1 Synaptická lokalizace...11 6.2 Lokalizace na dráze bolesti...11 7. Metabotropní glutamátové receptory a bolest...13 7.1 I. skupina mglur...13 7.2 II. skupina mglur...16 7.3 III. skupina mglur...19 8. Závěr...22 9. Seznam literatury...23 5

1. Seznam zkratek 4C3HPG 4CPG APDC AIDA CCI CPCOOEt kyseliny DCPG DHPG GPCRs camp GDP GTP HDAC IL-1β L-AP4 LCCG1 mglurs MPEP MSOP NF-κB PKC PKA (S)-CHPG t-ada 4-karboxy-3-hydroxyfenylglycin 4-karboxyfenylglycin aminopyrrolidin-2,4-dikarboxylát 1-amino-2,3-dihydro-1H-inden-1,5-dikarboxylová kyselina chronic constriction injury ethylester 7-hydroxyiminocyklopropanchromen-1α-karboxylové 3,4-dikarboxyfenylglycin 3,5-dihydroxyfenylglycin receptory spřažené s G proteiny cyklický adenosinmonofosfát guanosindifosfát guanosintrifosfát histon deacetyláza interleukin-1β L-2-amino-4-fosfobutanová kyselina L-(karboxycyklopropyl)-glycin metabotropní glutamátové receptory 2-methyl-6-(fenylethynyl)-pyridin α-methylserin-o-fosfát jaderný faktor κb proteinkináza C proteinkináza A (S)-4-karboxy-3-hydroxyfenylglycin trans-azetidinová dikarboxylová kyselina 6

2. Úvod Bolest je nepříjemný smyslový a emoční zážitek spojený se skutečným nebo potenciálním poškozením tkáně nebo popisovaný výrazy pro takovéto poškození. Varovnou funkci má pouze akutní bolest a pouze akutní bolest je symptomem. Od ní odlišujeme bolest chronickou, která vzniká senzitizací nervových vláken a nemá biologický smysl (Basbaum et al., 2009). Akutní bolest je pro organismus velmi přínosná, a proto jedním z požadavků na léky proti chronické bolesti je, že nesmí blokovat její vnímání. Tento požadavek dobře ozřejmí příklad jedinců, trpících vzácnou vrozenou necitlivostí k bolesti. Tito lidé často umírají v mladém věku, protože postrádají schopnost uvědomit si traumata a nemoci a přizpůsobit tomuto stavu svoje chování. (Nagasako et al., 2003). Senzitizace je proces, při kterém dochází k zesílení vnímavosti nervových vláken pro bolest. V tomto ději může dojít jak k nepřirozeně silnému vnímání bolestivých podnětů (hyperalgezie), tak i k bolestivému vnímání podnětů, které bolest normálně nezpůsobují (alodynie). Proces senzitizace je přirozenou vlastností, dochází k němu např. při spálení od sluníčka, ale může se vymknout kontrole a pak je podkladem chronické bolesti. Tento jev může být následkem úrazu nebo choroby (například diabetes, nádory nebo artritida) (Basbaum et al., 2009). 3. Zařazení metabotropních glutamátových receptorů 3.1. Receptory spřažené s G proteiny Metabotropní receptory jsou receptory eukaryotních buněk, které jsou s efektory spojeny nepřímo přes heterotrimerní G protein. Je to zřejmě nejpočetnější třída receptorů vůbec; savčí genom jich kóduje přes 1 000. Buněčná aktivita je zde ovlivňována nepřímo (narozdíl od receptorů ionotropních, kde je iontový kanál součástí samotného receptoru), napřed jsou vyvolány metabolické změny. G protein přenáší signál na membránový efektor, což je buďto iontový kanál, nebo enzym tvořící second messengers (Wettschureck et al., 2005). 7

Metabotropní receptory se dělí do tří základních rodin, které mohou být snadno rozlišeny podle sekvenční podobnosti, zatímco mezi jednotlivými rodinami žádná podobnost není. Zdá se tedy, že se jedná o případ molekulární konvergence. 1. Rodina Podrodina 1a tyto receptory jsou aktivovány malými molekulami (např. katecholaminy), které se váží do dutiny tvořené transmembránovými segmenty III-VI. V případě rhodopsinu je retinal kovalentně spojen s touto dutinou. Receptory podrodiny 1b jsou aktivovány krátkými peptidy, které interagují s N- koncovou doménou a s extracelulárními kličkami. Podrodina 1c je aktivována velkými glykoproteiny, které se váží na dlouhou N- terminální doménu a také interagují s první a třetí extracelulární kličkou. 2. rodina Receptory 2. rodiny jsou aktivovány velkými peptidy (například glukagon a sekretin) a jejich vazby se účastní také relativně dlouhá N-koncová doména. 3. rodina Vazebné místo 3. rodiny tvoří takzvaná Venus Flytrap doména, tvořena dvěma listy spojenými pantem, které se mohou uzavírat, čímž připomínají stejnojmennou masožravou rostlinu. Tato doména je umístěna na konci dlouhého N-terminálního řetězce (Bockaert et al., 1999). 3.2 Mechanismus účinku G proteinů Aktivace receptoru (např. vazbou endogenního ligandu) změní jeho konformaci a umožní mu navázat G protein přes Gα podjednotku. Heterotrimerní G protein je tvořen třemi podjednotkami: α, β a γ. Vazba na aktivovaný receptor umožní výměnu GDP za GTP; α podjednotka s navázaným GTP disociuje od komplexu βγ a přenáší signál na efektor. Gα podjednotka má GTP-asovou aktivitu, takže aktivní GαGTP stav po minutách končí; tento proces je urychlen vazbou na efektor. Efektor tedy působí jako GTPase-activating protein. Vzniklá GαGTP rychle reasociuje s Gβγ a systém je připraven k opakování procesu signalizace. Pro dlouhou aktivaci efektorů je nutné stálé aktivování receptorů (Wettschureck et al., 2005). 8

Obr. 1: schéma funkce GPCR. Ag = agonista (upraveno podle Wettschureck et al., 2005) 4. Metabotropní glutamátové receptory Metabotropní glutamátové receptory patří do 3. rodiny metabotropních receptorů, kam také patří Ca-senzitivní receptory, feromonové receptory, chuťové receptory a GABA-B receptor. Je známo osm genů kódujících mglurs, z nichž některé mají navíc různé splice varianty. mglurs byly rozděleny do tří skupin na základě podobnosti sekvencí, transdukčního mechanismu a farmakologie. Podobnost sekvencí je 60-70% mezi členy jedné skupiny, a 40-45% mezi členy jiných skupin. Receptory I. skupiny jsou spojeny s G q proteinem, receptory II. a III. skupiny jsou spojeny s G proteiny citlivými k pertusis toxinu (G i nebo G o protein). Do I. skupiny patří mglur1 (splice varianty a, b, c, d, e) a mglur5 (splice varianty a, b). Do II. skupiny patří mglur2 a mglur3. Ostatní receptory patří do III. skupiny, která se skládá z mglur4 (splice varianty a, b), mglur6, mglur7 (splice varianty a, b) a mglur8 (splice varianty a, b, c) (Pin et al., 2002). I. skupina mglur1, mglur5 II. skupina mglur2, mglur3 III. skupina mglur4, mglur6, mglur7, mglur8 4.1 I. skupina mglur 9

Receptory I. skupiny aktivují G-protein třídy Gq, jehož hlavním efektorem je fosfolipáza C, která po aktivaci vytváří druhé posly inositol trifosfát a diacylglycerol. Aktivace IP3 receptorů na endoplasmatickém retikulu vede k výlevu Ca 2+ z intracelulárních zásob. Tato dráha je citlivá na PKC dependentní fosforylaci těchto receptorů, na které závisí zda budou aktivovat nebo inhibovat uvolnění neurotransmiteru, případně hyperpolarizovat či depolarizovat neurony. Obecně jsou tyto receptory považovány za aktivační. mglurs I. skupiny regulují mnoho iontových kanálů v neuronech, jednak řadu K +, Ca 2+ a neselektivních kationtových kanálů, stejně jako NMDA a AMPA receptory. Vylití Ca 2+ zprostředkované IP3 může aktivovat Ca 2+ aktivované K + kanály, což vede k hyperpolarizaci neuronů. Spojení této skupiny s kationtovými neselektivními kanály je G-protein nezávislé, což je jeden z mála příkladů G-protein nezávislé kaskády ovládané heptahelickým receptorem. Tato kaskáda zahrnuje aktivaci Src-like protein tyrosin kináz. 4.2 II. a III. skupina mglur Receptory obou těchto skupin jsou spojeny s pertusis toxin sensitivními G-proteiny G i nebo G o. Jejich stimulace způsobuje inhibici adenylyl cyklázy a modulaci aktivity iontových kanálů, přesněji inhibici specifických typů Ca 2+ kanálů v neuronech. Specifity je dosaženo regulací pomocí PKC a PKA. Následkem této modulace je inhibice uvolnění transmiterů do synaptické štěrbiny. Receptory těchto skupin jsou obecně vzato inhibiční. Výjimku tvoří mglur6, které se vyskytují výhradně v bipolárních buňkách sítnice. Tyto receptory aktivují fosfodiesterasu, která hydrolyzuje cgmp, což vede k uzavření cgmp aktivovaného kationtového kanálu a snížení vodivosti buněčné membrány. Tato kaskáda se podobá kaskádě aktivované rodopsinem. (Pin et al., 2002) 5. Vnímání bolesti Za vnímání bolesti zodpovídá skupina periferních nervových vláken zakončených receptory pro bolest - nociceptory. Rozlišujeme dva typy nervových vláken vedoucích bolest - středně silná myelinizovaná Aδ vlákna a slabá nemyelinizovaná C vlákna. Aδ vlákna zodpovídají za vedení rychlé, dobře lokalizované bolesti, která vyvolává spíše únikovou reakci. C vlákna vedou bolest pomalou, obtížně lokalizovatelnou a jejich aktivace vede spíše 10

k zaujímání úlevné polohy. Těla těchto neuronů se nachází v gangliích zadních rohů míšních a v trigeminálním gangliu. První synapsí dráhy bolesti je synapse mezi periferním neuronem a neurony zadního rohu míšního (Rexedova zóna IV a V). Dráha je překřížena na míšní úrovni a vedena ascendentně v přední části postranních provazců jako tractus spinothalamicus a tractus spinoreticulothalamicus. Z míchy může být signál veden různými způsoby. V mozku není jen jedna specifická oblast pro vnímání bolesti, jedná se o aktivaci většího počtu struktur. Ostrá, bodavá bolest je rychle přenášena přímo do talamu (nucleus ventroposterolateralis a ventroposteromedialis). Tupá, těžce lokalizovatelná bolest je vedena do retikulární formace a odtud třetím neuronem do talamu. Emoční složka bolesti je vedena do amygdaly. Třetí (resp. čtvrtý v případě pomalé bolesti) neuron vede signál z talamu do senzorických a asociačních korových oblastí. (Basbaum et al., 2009) 6. Lokalizace metabotropních glutamátových receptorů 6.1 Synaptická lokalizace Receptory I. skupiny jsou lokalizovány převážně postsynapticky. Takové receptory často hrají důležitou roli ve zvyšování excitability postsynaptických neuronů a regulaci membránového potenciálu prostřednictvím ionotropních glutamátových receptorů. Receptory II. skupiny se nacházejí jak postsynapticky, tak i presynapticky. Receptory III. skupiny jsou presynaptické a nachází se v aktivní zóně synapse, případně v její bezprostřední blízkosti. Aktivace presynaptických receptorů vede k redukci synaptického přenosu a snížení excitability - jakožto autoreceptory redukují synaptický přenos zprostředkovaný glutamátem (Goudet et al., 2009). 6.2 Lokalizace na dráze bolesti V periferní nervové soustavě nacházíme mglur na periferních zakončeních primárních aferentních neuronů a v těle neuronů ganglií zadních kořenů míšních. Na periferních zakončeních nacházíme receptory mglur1, 2, 3 a 5 (Bhave et al., 2001, Carlton et al., 2001). Na presynaptických zakončeních těchto neuronů nacházíme receptory mglur4 a 7 (Li et al., 1997, Azkue et al., 2001). V gangliích dorzálních kořenů se vyskytují receptory mglur1, 2, 3, 5 a 8 (Carlton et al., 2007). 11

V míše se vyskytují všechny receptory kromě mglur6 a 8. Co se receptorů I. skupiny týče, mglur1 se zde nachází pouze ve splice variantě mglur1a, ale nikoli mglur1b. mglur5 se zde nachází v obou splice variantách mglur5a i mglur5b. Receptory mglur2, 3, 4 a 7 jsou také přítomny, ale v menším množství než receptory I. skupiny. (Valerio et al., 1997) V centrální nervové soustavě byla potvrzena přítomnost mglur v talamu, periakveduktální šedi i amygdale. Talamus obsahuje větší množství různých podtypů mglur byly zde povrzeny receptory mglur1, 3, 4, 5 a 7 (Neto et al., 2000). V periakveduktální šedi, která hraje v percepci bolesti rovněž významnou roli, byla zjištěna přítomnost receptorů mglur3, 5 a 8 (Azkue et al., 1997, Tamaru et al., 2001, Marabese et al., 2005). Obr.2: anatomie dráhy bolesti (upraveno podle Basbaum et al., 2009) 12

7. Metabotropní glutamátové receptory a bolest 7.1 I. skupina mglur Jednou z důležitých vlastností analgetik je, zda působí i na vnímání akutní bolesti, tedy bolesti fyziologické, sloužící k ochraně před poškozením (Varney et al., 2002). Většina analgetik účinkuje proti patologické hypersenzitivitě, ale nenarušuje vnímání akutní bolesti. Jelikož mglurs synaptický přenos spíše modulují než zprostředkovávají, mohlo by se jednat o farmakologicky zajímavý cíl. Young et al. v roce 1997 v behaviorálních testech zjistili, že (S)-CHPG, antagonista I. skupiny mglurs, je schopný snížit citlivost k mechanické i termální bolestivé stimulaci, a to jak u zdravých potkanů, tak u potkanů se zánětem indukovaným carrageenanem. Následovaly elektrofyziologické testy, při kterých byla zkoumána odpověď neuronů dorzálních rohů míšních na různé agonisty mglurs. t-ada, specifický agonista mglur5, aktivoval méně neuronů než DHPG, antagonista celé I. skupiny, což by naznačovalo že za normálního stavu je pro vnímání bolesti důležitější mglur1 (Young et al., 1997). Později byl prokázán také pokles citlivosti k bolestivé stimulaci ale nikoli k nebolestivým kožním podnětům - při podání AIDA (selektivní antagonista mglur1) a CPCCOEt (antagonista I. skupiny) (Neugebauer et al., 1999). Také redukce počtu mglur1 (bez ovlivnění množství mglur5) pomocí antisense oligonukleotidů vedla ke sníženému vnímání bolestivých podnětů, což bylo ověřeno behaviorálně i elektrofyziologicky. Vnímání nebolestivých stimulů ovlivněno nebylo (Young et al., 1998). Při behaviorálních testech MPEP (selektivní antagonista mglur5) nebyl zjištěn žádný efekt na normální vnímání bolesti (při použití mechanických i termálních stimulů), zatímco stejné dávky účinkovaly proti patologické hyperalgezii (Walker et al., 2001a). Zdá se tedy, že z receptorů I. skupiny se vnímání akutní bolesti účastní spíše mglur1. V zánětlivé bolesti hrají mglurs I prokazatelně důležitou roli. Jejich antagonisté mají dobré antinocicepční účinky lze je užít nejen pro prevenci, ale i pro léčbu zánětlivé hyperalgezie (Bhave et al., 2001). Pro studium zánětlivé bolesti se s oblibou používá formalinový test, protože během jediného experimentu lze zkoumat jak akutní bolest (první fáze testu), tak i rozvoj zánětlivé bolesti (druhá fáze testu). Již před delší dobou bylo zjištěno, že intratékální použití antagonistů I. skupiny (4CPG nebo 4C3HPG) bolest ve druhé fázi utlumuje, zatímco použití agonisty I. skupiny (DHPG) bolest v téže fázi prohlubuje (Fisher et al., 1996). V roce 2001 Bhave et al. provedli pokusy, při kterých zjistili přítomnost mglurs I. 13

skupiny na periferních neuronech. Při následném pokusu s blokací periferně podaným MPEP (selektivní antagonista mglur5) a CPCCOEt (selektivní antagonista mglur1) zjistili, že oba antagonisté blokují druhou fázi formalinového testu, a to při podání samostatně i v kombinaci. Tento výsledek má terapeutický potenciál, protože periferní podání s sebou nese menší pravděpodobnost nežádoucích účinků (Bhave et al., 2001). Při zkoumání orofaciální alodynie vyvolané subkutánním podáním interleukinu 1β byly zjištěny pozitivní antinocicepční účinky jak u MPEP a SIB1893 (specifičtí antagonisté mglur5), tak u LY367385 a CPCCOEt (specifičtí antagonisté mglur1) (Ahn et al., 2005). Naopak u zánětu žvýkacího svalu vyvolaného hořčičným olejem (esenciální olej z hořčičných semínek, obsahující allyl-isothiokyanát) podaným intramuskulárně byly zaznamenány účinky pouze u antagonisty mglur5 a u neselektivního antagonisty I. a II. skupiny, nikoli u antagonisty mglur1. Blokace mglur5 navíc zmenšila i zánět jako takový, což bylo zjištěno extravazací Evansovy modři z plazmy (Lee et al., 2006). Jiná studie ukázala, že svalovou mechanickou hypersenzitivitu v kraniofaciální oblasti lze vyvolat intramuskulárním podáním DHPG, a že tento efekt lze zablokovat předchozím podáním MPEP, ale nikoli CPCCOEt. Dále bylo zjištěno, že hypersenzitivitu lze signifikantně snížit blokací protein kinázy C (PKC), a to obou jejích isoforem, α nebo ε. Pro potenciální terapeutické účely se tedy nabízí hned tři možné cíle mglur5, PKCα a PKCε. Ve stejné studii byla předložena Western blotová analýza která ukázala, že v trigeminálních gangliích je exprimován pouze mglur5, nikoli mglur1, což je v souladu s behaviorálním výsledkem (Lee et al., 2007). U tohoto typu bolesti se tedy role jednotlivých typů receptorů liší na základě vyvolávacích mechanismů nebo cílové tkáně. Chen et al. provedli řadu pokusů, ve kterých byly bolestivé stavy vyvolávány včelím jedem. Tento model je zajímavý v tom, že narozdíl od běžných modelů lze během jediného experimentu sledovat spontánní bolest, termální a mechanickou hyperalgezii i zánětlivé reakce (např. zčervenání a otok). Je však třeba mít na vědomí, že účinky včelího jedu na organismus jsou velmi komplexní, takže se na výsledku může projevit celá řada různých vlivů. V behaviorálním pokusu zaměřeném na mglurs byl použit AIDA, antagonista obou receptorů I. skupiny. Pretreatment signifikantně omezil projevy spontánní bolesti, zatímco na mechanickou hyperalgezii neměl vliv a zrovna tak neměl vliv na vlastní zánět. Tato zajímavá neshoda vyžaduje další výzkum (Chen et al., 2010). 14

Zhu et al. zkoumali roli receptorů I. skupiny v postoperační bolesti. V obou případech měla pokusná zvířata řeznou ránu na tlapce a měřil se rozdíl mezi zatěžováním zraněné a nezraněné strany (weight bearing difference). Tento model má napodobit spontánní postoperační bolest u lidí, i když zde může být mechanický aspekt. V pokusech zaměřených na mglur5 bylo MPEP aplikováno systémově, intratékálně, intracerebroventrikulárně a intraplantárně. Všechny způsoby podání byly v různé míře účinné, z čehož vyplývá, že vnímání postoperační bolesti se účastní centrální i periferní receptory. Aby se ověřilo, že intraplantární aplikace neúčinkuje systémovou difusí, bylo MPEP aplikováno také kontralaterálně tato aplikace neměla analgetický efekt (Zhu et al., 2005). Pro pokusy týkající se mglur1 byly použity čtyři nové látky působící jako selektivní nekompetitivní antagonista (A-841720, A-794282, A-794278, a A-850002) podané systémově. Všechny tyto látky měly signifikantní účinek proti bolesti, ale nežádoucí motorické účinky se projevovaly v závislosti na použité látce již při dávce třikrát až desetkrát vyšší než je účinná dávka, což může být limitující faktor pro jejich praktické použití (Zhu et al., 2008). V modelu periferní neuropatické bolesti spojené s ligací spinálních nervů či chronickou konstrikcí sedacího nervu bylo po použití MPEP zaznamenáno zmírnění mechanické alodynie. Stejný výsledek byl v téže práci zaznamenán u modelu periferní neuropatie spojené s chemoterapií, konkrétně vyvolané pomocí vinkristinu. Tento efekt však doprovázely nežádoucí motorické účinky již při dávce třikrát větší než byla účinná dávka (Zhu et al., 2004). Osikowicz et al. zkoumali roli mglurs v neuropatii způsobené chronickou konstrikcí sedacího nervu u myši, a byla zkoumána také jejich interakci s morfinem. Podávání MPEP v závislosti na dávce zeslabovalo projevy hyperalgezie i alodynie. Kromě toho injekce MPEP třicet minut před podáním morfinu zesílila jeho účinky a při dlouhodobém podávání omezila vznik morfinové tolerance. Mechanismus tohoto účinku může vysvětlit teorie, podle které je základem morfinové tolerance stálá aktivace NMDA receptorů prostřednictvím PKC. Inhibice I. skupiny mglurs by vedla k omezení aktivity PKC, a tím i patologické aktivace NMDA receptorů (Osikowicz et al., 2008). Další zkoumanou neuropatií byla diabetická neuropatie, která může vyvolávat jak hyperalgezii, tak alodynii. Tento stav je spojen se zvýšeným přísunem glutamátu do dorzálních rohů míšních. Li et al. zkoumali roli míšních mglur1 a mglur5 na modelu diabetické neuropatie u potkana vyvolané injekcí streptozotocinu (chemická látka toxická pro buňky Langerhansových ostrůvků). U diabetických potkanů zjistili v gangliích dorzálních 15

kořenů vyšší expresi mglur5 než v kontrolní skupině, což by znamenalo více možných cílů pro MPEP či jiné antagonisty. V souladu s touto hypotézou byly výsledky elektrofyziologických testů, které byly provedeny technikou patch-clamp nahrávání z řezů míchou. Excitační postsynaptické proudy měly u diabetických potkanů vyšší amplitudu, a spontánní proudy probíhaly s vyšší frekvencí. V jejich utlumení bylo MPEP účinnější u diabetických než u kontrolních zvířat, a také procento ovlivněných neuronů bylo u diabetiků vyšší. Podání CPCCOEt nemělo signifikantní výsledky ani v jedné skupině. Výsledky týkající se mglur5 dále podpořil behaviorální test, při kterém mělo intratékální podání MPEP diabetickým potkanům pozitivní účinky proti hyperalgezii (Li et al. 2010). 7.2 II. skupina mglur Význam role receptorů II. skupiny při vnímání akutní bolesti není zcela jasný. Při elektrofyziologických testech bylo zjištěno, že agonisté II. skupiny LY379268 a LCCG1 nemají za normálních podmínek signifikantní vliv na aktivitu neuronů spinotalamické dráhy při bolestivé i nebolestivé stimulaci (Neugebauer et al., 2000). Při behaviorálních testech byl použit intraplantárně aplikovaný agonista APDC, který neovlivnil mechanickou ani termální senzitivitu (Du et al., 2008). Z těchto výsledků se zdá, že receptory II. skupiny se vnímání akutní bolesti neúčastní. Jones et al. zaznamenali signifikantní výsledky při použití agonistů LY379268 a LY389795 u hot plate testu. Antinocicepční efekt se ale objevil až při vysokých dávkách způsobujících motorický deficit, takže je možné že se nejednalo o skutečnou analgezii, ale o neschopnost adekvátně reagovat na bolestivý podnět (Jones et al., 2005). Aktivace mglurs II. skupiny v některých případech účinkuje proti zánětlivé bolesti. Jones et al. zkoumali specifické agonisty celé této skupiny, LY379268 a LY389795, v několika odlišných modelech. Oba agonisté omezili bolestivost ve druhé fázi formalinového testu, ale LY389795 takto účinkoval pouze při intracisternálním (nikoli intratékálním) podání. To by naznačovalo spíše supraspinální mechanismus účinku, což je překvapivé vzhledem k tomu, že tyto receptory jsou lokalizovány v dorzálním rohu míšním. Není však vyloučeno že se jedná o specifikum formalinového modelu, nebo o detaily provedení pokusu. U tohoto pokusu byl účinek potvrzen použitím kompetitivního antagonisty. Oba agonisté omezili termální hyperalgezii, ale ne mechanickou alodynii, po intraplantární injekci carrageenanu. Stejně tak snížili mechanickou alodynii po intraplantární 16

injekci kapsaicinu. Zdá se, že jsou spíše efektivní při odstranění termální hyperalgezie, bez ohledu na to jakým způsobem vznikla. Efekty na alodynii jsou zřejmě komplexnější, a proto působí jen u některých vyvolávacích mechanismů. Bohužel se tyto pozitivní výsledky projevily až při dávkách, které působily motorický deficit. Navíc již po čtyřech dnech užívání vznikla k jejich účinkům tolerance. Oba tyto jevy představují zásadní problém pro praktické využití (Jones et al., 2005). Vzhledem k nedostatku specifických ligandů nebylo dlouhou dobu možné spolehlivě rozlišit, zda účinky zprostředkovává mglur2 nebo mglur3. Zammataro et al. použili knockoutované myši, aby zjistili specifickou roli obou receptorů v zánětlivé bolesti. V druhé fázi formalinového testu měly výraznější odpověď mglur2 knockouty, zatímco mglur3 knockouty se nelišily od kontrolní skupiny. Podání agonistů II. skupiny nemělo u mglur2 knockoutů žádný signifikantní vliv. Lze tedy předpokládat, že analgetické účinky agonistů II. skupiny u myší zprostředkovává především mglur2 (Zammataro et al., 2011). Du et al. v roce 2008 provedli pokus, při kterém ověřili, že agonisté II. skupiny mglurs mohou působit také periferně. Pro vyvolání zánětu byl použit buďto formalin, nebo směs různých mediátorů zánětu. V obou případech způsobil intraplantárně podaný APDC zvýšení prahu pro mechanickou i termální bolestivou stimulaci. Kontralaterálně podaný APDC takovéto účinky neměl, což vylučuje možnost působení difúzí do CNS. Toto je z terapeutického hlediska významný objev, protože nabízí možnost vývoje periferně působících léků nebo systémově podávaných léků s duálním účinkem v PNS i CNS. Jelikož směs zánětlivých mediátorů vyvolala pouze termální, ale nikoli mechanickou senzitizaci, tak je zvýšení prahu pro mechanickou stimulaci překvapivé bylo opakovaně dokázáno, že receptory II. skupiny jsou účinné pouze v senzitizovaném stavu. Zatím není známý přesný mechanismus účinku proti hyperalgezii, ale jednou z možností je, že aktivace receptorů II. skupiny snižuje celkovou excitabilitu membrány, což by mohlo vést k všeobecnému snížení odpovědi na bolestivou stimulaci (Du et al., 2008). Při pokusech se včelím jedem (viz výše) byl APDC, agonista II. skupiny, účinný proti vytrvalé spontánní bolesti i proti bolesti zánětlivé. Zajímavé je, že u tohoto modelu bolesti to byla jediná skupina, která měla účinky na hyperalgezii. V obou případech byla jeho role potvrzena tím, že účinek zvrátil specifický antagonista II. skupiny, nikoli však specifický antagonista III. skupiny (Chen et al., 2010). Při výzkumu orofaciální alodynie způsobené interleukinem 1β bylo zjištěno, že subkutánně podaní agonisté II. skupiny (APDC nebo DCG4) účinkují proti vzniklé alodynii jak v místě podání IL-1β, tak proti alodynii na zrcadlové straně. Tento účinek byl odstraněn 17

použitím LY341495. Samotný LY341495 žádné účinky na bolest neměl (Ahn et al., 2005). Stejného výsledku bylo dosaženo při intracisternálním podávání těchto ligandů (Jung et al., 2006). Agonista APDC měl dobré účinky při podání kapsaicinu CFA potkanům (viz výše). Kromě behaviorálních výsledků také omezil zvýšení hladiny glutamátu v míše, což bylo zjištěno mikrodialýzou in vivo po dřívějších elektrofyziologických výsledcích je to první neurochemický výslede, který potvrzuje, že agonisté II. skupiny působí proti zvýšení koncentrace glutamátu ve spinální míše vyvolanému bolestivým stimulem (Kumar et al., 2010). Agonisté receptorů II. skupiny jsou účinní také proti neuropatické bolesti. U neuropatické bolesti vyvolané chronickou konstrikcí sedacího nervu se intratékálně podaný APDC osvědčil proti mechanické i chladové hypersenzitivitě (Fisher et al., 2002). Intraperitoneální podání LY379268 (agonista obou receptorů II. skupiny) ve stejném modelu bylo účinné proti hyperalgezii i alodynii. Zároveň jeho podání zesilovalo účinky morfinu a potlačovalo vznik morfinové tolerance, stejně jako antagonista I. skupiny (viz výše) (Osikowicz et al., 2008). V tomto modelu bolesti má intratékální podání APDC neurochemicky potvrzené účinky proti vzestupu hladiny glutamátu v míše (Kumar et al., 2010). Vzhledem k analgetickým efektům aktivace receptorů II. skupiny se nabízí možnost epigenetické modulace mglur2 pomocí inhibitorů histon deacetylázy. Exprese mglur2 v gangliích dorzálních kořenů je regulována acetylací, proto je možné inhibicí HDAC zvýšit jejich počet. Byly zkoumány dvě chemicky odlišné HDAC: MS-275 a SAHA, přičemž obě měly analgetické účinky, které byly vyrušeny použitím antagonisty II. skupiny mglurs. U této metody by nemusela vznikat tolerance, protože receptory neaktivuje agonista, ale endogenní glutamát. Další výhodou je, že HDAC účinkovaly pouze ve druhé fázi formalinového testu, takže by nedošlo k narušení vnímání akutní bolesti (Chiechio et al., 2009). Další možností jak regulovat transkripci mglur2 je použití L-acetylkarnitinu (LAC), který je již v praxi používán pro léčbu neuropatické bolesti u lidí. V buněčných kulturách bylo dokázáno, že LAC zvyšuje expresi mglur2 díky transkripční aktivaci přes jaderný faktor κb (NF-κB), kde se LAC chová jako donor acetylové skupiny. Že se skutečně jedná o účinek LAC bylo ověřeno tím, že zvýšenou transkripci mglur2 DNA zcela potlačilo podání 18

fenylesteru kyseliny kávové, který inhibuje vazbu NF-κB k DNA. Z toho vyplývá, že exprese mglur2 je regulována pomocí NF-κB, a že látky které ho acetylují (LAC i jiné) mohou působit analgeticky (Chiechio et al., 2006). 7.3 III. skupina mglur Role III. skupiny mglurs ve vnímání bolesti je stále málo popsána, částečně díky nedostatku specifických ligandů jednotlivých receptorů (Varney et al., 2002). Úloha těchto receptorů ve vnímání akutní bolesti není zcela jistá. Elektrofyziologickou studií u makaka bylo zjištěno, že použití L-AP4 (specifický agonista všech receptorů III. skupiny) snižuje odpověď na bolestivou stimulaci i u kontrolních zvířat. Behaviorální test zde nebyl proveden (Neugebauer et al., 2000). Studie provedená na potkanech za použití intratékálně podaného ACPT-I (specifický agonista III. skupiny) neukázala žádný vliv na vnímání akutní bolesti ani mechanické, ani termální (Goudet et al., 2008). Goudet et al. při zkoumání zánětlivé bolesti zjistili, že intratékální podání ACPT-I inhibuje nociceptivní chování v obou fázích formalinového testu. Z tohoto výsledku se dá usuzovat, že mglurs III. skupiny se vyskytují i na synapsích zdravých zvířat, ale spíše se projevují až u dlouhotrvající bolestivé stimulace. S tím souhlasí i výsledky u dalších modelů zánětlivé bolesti ACPT-I byl účinný také proti mechanické hyperalgezii vyvolané podáním carrageenanu a u monoartritidy (vyvolané injekcí kompletního Freundova adjuvans do kloubu). Pro ověření zda se skutečně jedná o účinky mglurs III. skupiny byl použit MAP4, selektivní antagonista této skupiny, který anti-hyperalgezické účinky odstranil. Obdobných účinků bylo dosaženo intratékálním podáním PHCCC, pozitivního alosterického modulátoru mglur4, ale není vyloučeno, že se anti-hyperalgezických účinků účastní i ostatní receptory této skupiny (kromě mglur6, který se vyskytuje pouze v sítnici) (Goudet et al., 2008). Neugebauer et al. provedli elektrofyziologické testy u makaka, kdy byla u L-AP4, specifického agonisty celé III. skupiny, zjištěna schopnost snížit mechanickou alodynii vyvolanou kapsaicinem. L-AP4 byl podán mikrodialyticky přímo do dorzálního rohu míšního a účinkoval nejen na prevenci, ale i na léčbu senzitizace. Po vymytí L-AP4 se senzitizace vrátila na původní úroveň (Neugebauer et al., 2000). L-AP4 byl účinný také proti spontánní bolesti vyvolané včelím jedem (viz výše); tento efekt byl odstraněn použitím MSOP (antagonista III. skupiny). V tomto případě nebyly účinky na hyperalgezii signifikantní, což je nečekaný výsledek vzhledem k anti- 19

hyperalgezickému působení v různých modelech zánětlivé i neuropatické bolesti se zdá, že se u agonistů mglurs III. skupiny jedná o obecný účinek. V tomto konkrétním případě se ale zdá pravděpodobnější, že se jedná o neobjevené vedlejší účinky tohoto zvláštního modelu, který má na organismus velmi komplexní účinky (Chen et al., 2010). Kromě obecných agonistů III. skupiny byl účinný také DCPG, selektivní agonista mglur8. Tato látka má 100x vyšší afinitu k mglur8 než ke zbylým mglur. Systémově podaný DCPG byl účinný v omezení zánětlivé bolesti vyvolané formalinem nebo carrageenanem, a to jak termální hyperalgesie, tak mechanické alodynie. Ve formalinovém testu působil nejen při preventivním podání, ale i při podání 15 minut po formalinové injekci. Naopak v carrageenanovém testu působil pouze při preventivním podání, dodatečné podání nemělo signifikantní výsledky. Zdá se tedy, že aktivace tohoto receptoru může inhibovat prozánětlivé a pro-nociceptivní kaskády, ale nemůže vrátit již nastalé změny v CNS. Vzhledem k lokalizaci tohoto receptoru se předpokládala možnost supraspinálních účinků, což bylo testování podáním MSOP (antagonista III. skupiny) přímo do periakveduktální šedi. Takto podaný MSOP zablokoval analgetické účinky DCPG v obou zánětlivých modelech. Dále podání samotného DCPG přímo do periakveduktální šedi vedlo v obou modelech ke zvýšení prahu bolesti, zatímco podání kombinace DCPG + MSOP takovéto účinky nemělo. Supraspinální účinky mglur8 lze tedy pokládat za ověřené, ačkoli to nevylučuje, že při systémovém podání se analgezie účastní také mglur8 lokalizované v jiných místech (Marabese et al., 2007). Aplikace DCPG má minimum vedlejších účinků. Na mechanismu jeho antinocicepčního působení se podílí i interakce mglur8 s vaniloidními receptory (Zhou et al., 2010). Při zkoumání neuropatické bolesti byl intratékálně ACPT-I účinný proti projevům mechanické hyperalgezie jak v modelu toxické neuropatie vyvolané vinkristinem, tak v modelu periferní neuropatie vyvolané chronickou konstrikcí sedacího nervu (chronic constriction injury, CCI). Tento výsledek spolu s účinky proti zánětlivé hyperalgezii nabízí možnost, že exprese receptorů III. skupiny by mohly být v bolestivých stavech upregulována podobně jako u receptorů II. skupiny (Goudet et al., 2008). Kumar et al. použili při testování změn prahů bolesti po CCI formalinový test. Intratékální podání L-AP4 bylo proti takto vyvolané bolesti účinné, což bylo dokázáno nejen behaviorálně, ale i neurochemicky podání L-AP4 omezilo zvýšení hladiny míšního glutamátu vyvolané formalinem. Vzhledem k umístění mglur4/7 na centrálních zakončeních 20

primárních aferentních neuronů se nabízí možnost, že k regulaci dochází právě zde (Kumar et al., 2010). U potkanů s CCI byl použit také systémově podaný DCPG. Tento specifický agonista mglur8 se ukázal jako účinný proti termální hyperalgezii i mechanické alodynii tři dny po operaci, ale při aplikaci sedm dní po operaci už signifikantní účinky neměl. I když se ještě nabízí možnost např. opakovaného podávání, tak se zdá, že účinky aktivace tohoto receptoru jsou podobně jako v zánětlivé bolesti spíše preventivní (Marabese et al., 2007). 21

8. Závěr Navzdory množství existujících léků představuje chronická bolest stav, u kterého řada pacientů vykazuje rezistenci na léčbu. Potenciálním cílem pro nová analgetika jsou metabotropní glutamátové receptory. Tyto receptory synaptický přenos spíše modulují než zprostředkovávají a vyskytují se v průběhu celé dráhy bolesti. Tyto vlastnosti z nich dělají zajímavý cíl pro nové léky. Z receptorů I. skupiny se jako vhodnější cíl pro terapeutické využití jeví mglur5, protože mglur1 se účastní vnímání akutní bolesti, což představuje překážku pro dlouhodobé podávání. MPEP, antagonista mglur5, se ze známých ligandů mglur jeví jako nejnadějnější pro praktické užití, a byl úspěšně testován v celé řadě bolestivých stavů. Aktivace receptorů II. skupiny vede k prokazatelné analgezii v různých modelech, ale tento efekt je bohužel spojen s nežádoucími vedlejšími účinky a především s rychlým nástupem rezistence. Pro terapeutické využití by mohla být vhodnější epigenetická regulace jejich exprese, u které rezistence nevzniká. Je známo, že aktivace mglur III. skupiny má v některých případech analgetické účinky, ale pro podrobný výzkum chybí specifické ligandy, které by umožnily zjistit přesnou roli jednotlivých receptorů. V tuto chvíli se klinickému testování nejvíce blíží ligandy mglur5, ale další studium může odhalit více terapeuticky použitelných cílů. 22

9. Seznam literatury Ahn, D.K., Kim, K.H., Jung, C.Y., Choi, H.S., Lim, E.J., Youn, D.H., Bae, Y.C. (2005) Role of peripheral group I and II metabotropic glutamate receptors in IL-1β-induced mechanical allodynia in the orofacial area of conscious rats. Pain, 118, 53-60 Azkue, J.J., Knöpfel, T., Kuhn, R., Mateos, J.M., Grandes, P. (1997) Distribution of the metabotropic glutamate receptor subtype mglur5 in rat midbrain periaqueductal grey and relationship with ascending spinofugal afferents. Neuroscience Letters, 228, 1-4 Azkue, J.J., Murga, M., Fernández-Capetillo, O., Mateos, J.M., Elezgarai, I., Benítez, R., Osorio, A., Díez, J., Puente, N., Bilbao, A., Bidaurrazaga, A., Kuhn, R., Grandes, P. (2001) Immunoreactivity for the group III metabotropic glutamate receptor subtype mglur4a in the superficial laminae of the rat spinal dorsal horn. The Journal of Comparative Neurology, 430, 448-57 Basbaum, A.I., Bautista, D.M., Scherrer, G., Julius, D. (2009) Cellular and molecular mechanism of pain. Cell, 139, 267-84 Bhave, G., Karim, F., Carlton, S.M., Gereau, R.W. (2001) Peripheral group I metabotropic glutamate receptors modulate nociception in mice. Nature Neuroscience, 4, 417-23 Bockaert, B., Pin, J.P. (1999) Molecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolutionary success. The EMBO Journal, 18, 1723-9 Carlton, S.M., Hargett, G.L., Coggeshall, R.E. (2001) Localization of metabotropic glutamate receptors 2/3 on primary afferent axons in the rat. Neuroscience, 105, 957-69 Carlton, S.M., Harget, G.L. (2007) Colocalization of metabotropic glutamate receptors in rat dorsal root ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology, 501, 780-90 Du, J., Zhou, S., Carlton, S.M. (2008) Group II metabotropic glutamate receptor activation attenuates peripheral sensitization in inflammatory states. Neuroscience, 154, 754-766 Fisher, K., Coderre, T.J. (1996) The contribution of metabotropic glutamate receptors (mglurs) to formalininduced nociception. Pain, 68, 255-63 Fisher, K., Lefebvre, C., Coderre, T.J. (2002) Antinociceptive effects following intrathecal pretreatment withselective metabotropic glutamate receptor compoundsin a rat model of neuropathic pain. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior, 73, 411-418 23

Goudet, C., Magnaghi, V., Landry, M., Nagy, F., Gereau, R.W., Pin, J.P. (2009) Metabotropic glutamate receptors and GABA in pain. Brain Research Reviews, 60, 43-56 Chen, S.H., Qu, F., He, X., Kang, S.M., Liao, D., Lu, S.J. (2010) Differential roles of peripheral metabotropic glutamate receptors in bee venom-induced nociception and inflammation in conscious rats. The Journal of Pain, 11, 321-9 Chiechio, S., Copani, A., De Petris, L., Morales, M.E.P., Nicoletti, F., Gereau, R.W. (2006) Transcriptional regulation of metabotropic glutamate receptor 2/3 expression by the NF-κB pathway in primary dorsal root ganglia neurons: a possible mechanism for the analgesic effect of L-acetylcarnitine. Molecular Pain, 2, 20 Chiechio, S., Zammataro, M., Morales, M.E., Busceti, C.L., Drago, F., Gereau, R.W., Copani, A., Nicoletti, F. (2009) Epigenetic modulation of mglu2 receptors by histone deacetylase inhibitors in the treatment of inflammatory pain. Molecular Pharmacology, 75, 1014-20 Jones, C.K., Eberle, E.L., Peters, S.C., Monn, J.A., Shannon, H.E. (2005) Analgesic effects of the selective group II (mglu2/3) metabotropic glutamate receptor agonists LY379268 and LY389795 in persistent and inflammatory pain models after acute and repeated dosing. Neuropharmacology, 49, 206-18 Jung, C.Y., Choi, H.S., Ju, J.S., Park, H.S., Kwon, T.G., Bae, Y.C., Ahn, D.K. (2006) Central metabotropic glutamate receptors differentially participate in interleukin-1β-induced mechanical allodynia in the orofacial area of conscious rats. The Journal of Pain, 7, 747-756 Kumar, N., Laferriere, A., Yu, J.S.C., Poon, T., Coderre, T.J. (2010) Metabotropic glutamate receptors (mglurs) regulate noxious stimulus-induced glutamate release in the spinal cord dorsal horn of rats with neuropathic and inflammatory pain. Journal of Neurochemistry, 114, 281-290 Lee, H.J., Choi, H.S., Ju, J.S., Bae, Y.C., Kim, S.K., Yoon, Y.W., Ahn, D.K. (2006) Peripheral mglur5 antagonist attenuated craniofacial muscle pain and inflammation but not mglur1 antagonist in lightly anesthetized rats. Brain Research Bulletin, 70, 378-385 Lee, J.S., Ro, J.Y. (2007) Peripheral metabotropic glutamate receptor 5 mediates mechanical hypersensitivity in craniofacial muscle via protein kinase C dependent mechanisms. Neuroscience, 146, 375-83 Li, H., Ohishi, H., Kinoshita, A., Shigemoto, R., Nomura, S., Mizuno, N. (1997) Localization of a metabotropic glutamate receptor, mglur7, in axon terminals of presumed nociceptive, primary afferent fibers in the superficial layers of the spinal dorsal horn: an electron microscope study in the rat. Neuroscience Letters, 223, 153-6 24

Li, J.Q., Chen, S.R., Chen, H., Cai, Y.Q., Pan, H.L. (2010) Regulation of increased glutamatergic input to spinal dorsal horn neurons by mglur5 in diabetic neuropatic pain. Journal of Neurochemistry, 112, 162-72 Marabese, I., de Novellis, V., Palazzo, E., Mariani, L., Siniscalco, D., Rodella, L., Rossi, F., Maione, S. (2005) Differential roles of mglu8 receptors in the regulation of glutamate and γ-aminobutyric acid release at periaqueductal grey level. Neuropharmacology,49, 157-166 Nagasako, E.M., Oaklander, A.L., Dworkin, R.H. (2003) Congenital insensitivity to pain: an update. Pain, 101, 213-219 Neto, F.L., Schadrack, J., Berthele, A., Zieglgänsberger, W., Tölle, T.R., Castro-Lopes, J.M. (2000) Differential distribution of metabotropic glutamate receptor subtype mrnas in the thalamus of the rat. Brain Research, 854, 93-105 Neugebauer, V., Chen, P.S., Willis, W.D. (1999) Role of metabotropic glutamate receptor subtype mglur1 in brief nociception and central sensitization of primate STT cells. Journal of Neurophysiology, 82, 272-82 Neugebauer, V., Chen, P.S., Willis, W.D. (2000) Groups II and III metabotropic glutamate receptors differentially modulate brief and prolonged nociception in primate STT cells. Journal of Neurophysiology, 84, 2998-3009 Osikowicz, M., Mika, J., Makuch, W., Przewlocka, B. (2008) Glutamate receptor ligands attenuate allodynia and hyperalgesia and potentiate morphine effects in a mouse model of neuropathic pain. Pain, 139, 117-26 Pin, J.P., Acher, F. (2002) The metabotropic glutamate receptors: structure, activation mechanism and pharmacology. Current Drug Targets CNS & Neurological Disorders, 3, 297-317 Tamaru, Y., Nomura, S., Mizuno, N., Shigemoto, R. (2001) Distribution of metabotropic glutamate receptor mglur3 in the mouse CNS: differential location relative to pre- and postsynaptic sites. Neuroscience, 106, 481-503 Valerio, A., Paterlini, M., Boifava, M., Memo, M., Spano, P. (1997) Metabotropic glutamate receptor mrna expression in rat spinal cord. Neuroreport, 8, 2695-9 Varney, M.A., Gereau, R.W. (2002) Metabotropic glutamate receptor involvement in models of acute and persistent pain: prospects for the development of novel analgesics. Current Drug Targets CNS & Neurological Disorders, 1, 283-96 Walker, K., Bowes, M., Panesar, M., Davis, A., Gentry, C., Kesingland, A., Gasparini, F., Spooren, W., Stoehr, N., Pagano, A., Flor, P.J., Vranesic, I., Lingenhoehl, K., Johnson, E.C., Varney, M., Urban, L., 25

Kuhn, R. (2001) Metabotropic glutamate receptor subtype 5 (mglu5) andnociceptive functioni. Selective blockade of mglu5 receptors in models of acute, persistent and chronic pain. Neuropharmacology, 40, 1-9 Wettschureck, N., Offermanns, S. (2005) Mammalian G proteins and their cell type specific functions. Physiological Reviews, 85, 1159-1204 Young, M.R., Fleetwood-Walker, S.M., Dickinson, T., Blackburn-Munro, G., Sparrow, H., Birch, P.J., Bountra, C. (1997) Behavioural and electrophysiological evidence supporting a role for group I metabotropic glutamate receptors in the mediation of nociceptive inputs to the rat spinal cord. Brain Research, 777, 161-9 Young, M.R., Blackburn-Munro, G., Dickinson, T., Johnson, M.J., Anderson, H., Nakalembe, I., Fleetwood-Walker, S.M. (1998) Antisense ablation of type I metabotropic glutamate receptor mglur1 inhibits spinal nociceptive transmission. The Journal of Neuroscience, 18, 10180-8 Zammataro, M., Chiechio, S., Montana, M.C., Traficante, A., Copani, A., Nicoletti, F., Gereau, R.W. (2011) mglu2 metabotropic glutamate receptors restrain inflammatory pain and mediate the analgesic activity of dual mglu2/mglu3 receptor agonists. Molecular Pain, 7, 6 Zhou, Z., Ding, Z., Hargett, G.L., Carlton, S.M. (2010) Targeting peripheral mglur8 will modulate nociception in different pain models. Neuroscience, abstract 78.8 Zhu, C.Z., Wilson, S.G., Mikusa, J.P., Wismer, C.T., Gauvin, D.M., Lynch, J.J. 3rd, Wade, C.L., Decker, M.W., Honore, P. (2004) Assessing the role of metabotropic glutamate receptor 5 in multiple nociceptive modalities. European Journal of Pharmacology, 506, 107-18 Zhu, C.Z., Hsieh, G., El-Kouhen, O., Wilson, S.G., Mikusa, J.P., Hollingsworth, P.R., Chang, R., Moreland, R.B., Brioni, J., Decker, M.W., Honore, P. (2005) Role of central and peripheral mglur5 receptors in post-operative pain in rats. Pain, 114, 195-202 Zhu, C.Z., Baker, S., El-Kouhen, O., Lehto, S., Hollingsworth, P.R., Gauvin, D.M., Hernandez, G., Zheng, G., Chang, R., Moreland, R.B., Stewart, A.O., Brioni, J.D., Honore, P. (2008) Analgesic activity of metabotropic glutamate receptor 1 antagonists on spontaneous post-operative pain in rats. European Journal of Pharmacology, 580, 314-21 26