1. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ÚVOD NITROVANÉ POLYCYKLICKÉ AROMATICKÉ UHLOVODÍKY Vznik Koloběh v přírodě...

Obsah 1. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK...8 2. ÚVOD...9 3. NITROVANÉ POLYCYKLICKÉ AROMATICKÉ UHLOVODÍKY... 10 3.1 Vznik... 10 3.2 Koloběh v přírodě... 10 3.3 Toxické účinky... 11 3.4 Osud v přírodě... 11 4. 2-NITROFLUOREN... 12 4.1 Koncentrace... 12 4.2 Vstup do organismu... 12 4.3 Metabolismus... 13 4.3.1 Vliv β-naftoflavonu na metabolismus... 14 4.3.2 Vliv antibiotika na metabolismus... 14 4.3.3 Estrogenní aktivita 2-nitrofluorenu... 15 4.3.4 Krysy bez střevní mikroflóry... 15 4.3.5 Metabolismus na izolovaných prokrvených plicích a játrech... 16 4.3.6 Aplikace poznatků na metabolismus člověka... 17 4.4 Akutní účinky 2-nitrofluorenu... 18 4.5 Genotoxické účinky 2-nitrofluorenu... 18 4.5.1 DNA adukty... 18 4.5.2 Neplánovaná syntéza DNA... 20 4.5.3 2-Nitrofluoren jako iniciátor a promoter... 21 5. ELEKTROCHEMIE DNA... 22 5.1 Rtuťové elektrody... 22 5.2 Uhlíkové elektrody... 23 6

6. ELEKTROCHEMICKÉ DNA BIOSENZORY... 25 6.1 Biosenzory na bázi uhlíku... 25 6.1.1 Sítotisková uhlíková elektroda... 25 6.1.2 Uhlíková filmová elektroda... 28 6.2 Biosenzory na bázi rtuti... 30 6.2.1 Visící rtuťová kapková elektroda... 31 6.2.2 Amalgámové elektrody... 32 7. SROVNÁNÍ POZNATKŮ O IN VIVO A IN VITRO PŘEMĚNÁCH NF... 34 8. ZÁVĚR... 36 9. LITERATURA... 37 7

1. Seznam použitých zkratek 2,7-dNF AAF ACV AF CV CFE DPV dg-c8-aaf dg-c8-af dg-n 2 -AAF DNA dsdna FAF HMDE m-agsae NF NPAHy p-agsace SPCPE SWV 2,7-dinitrofluoren 2-acetylaminofluoren voltametrie se střídavou složkou napětí 2-aminofluoren cyklická voltametrie velkoplošná uhlíková filmová elektroda diferenční pulsní voltametrie N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluoren N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-aminofluoren 3-(deoxyguanosin-N 2 -yl)-2-acetylaminofluoren deoxyribonukleová kyselina dvoušroubovicová deoxyribonukleová kyselina 2-formylaminofluoren visící rtuťová kapková elektroda rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda 2-nitrofluoren nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky leštěná stříbrná pevná amalgámová kompozitní elektroda sítotisková uhlíková pastová elektroda voltametrie s vkládaným pravoúhlým napětím 8

2. Úvod Předkládaná bakalářská práce shrnuje poznatky o dosavadním výzkumu nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků in vivo a in vitro, především pak jejich modelového zástupce, za kterého je považován 2-nitrofluoren. Ten se do ovzduší uvolňuje při nedokonalém spalování a adsorbuje se na tuhé prachové částice vyskytující se ve vzduchu. Do organismu může vstupovat cestou inhalace či konzumací kontaminované potravy. V těle potom podléhá intenzivní přeměně a jeho metabolity vykazují mutagenní a karcinogenní účinky. Výzkum byl prozatím prováděn na krysách, psech a rybách, nebo bylo ke sledování použito pouze jejich izolovaných orgánů. Zjištěné výsledky jsou ale aplikovatelné i na člověka, buňky a enzymy izolované z lidského těla dokázaly zprostředkovávat stejné metabolické reakce jako ty krysí. Metabolismus 2-nitrofluorenu může být ovlivněn změnou stavu a složení střevní mikroflóry, ale může také probíhat jinou metabolickou drahou (např. po aplikaci β-naftoflavonu či antibiotika), při které se mění poměr vzniklých mutagenních a karcinogenních produktů. Přímé mutagenní účinky vykazovaly látky, které byly především nalezeny v moči a výkalech ve formě hydroxylovaných sloučenin. Větší pozornost by ale měla být věnována metabolitům, jako je 2-acetylaminofluoren, které v těle zůstávají a vykazují genotoxické účinky. 2-Acetylaminofluoren reaguje s deoxyribonukleovou kyselinou za vzniku DNA aduktů, které mohou způsobovat tvorbu nádorů. Díky elektroaktivitě molekuly DNA mohou být její redoxní odezvy pozorovány elektrochemickými metodami. Na rtuťových elektrodách se v katodické oblasti měří redukce cytosinu a adeninu (resp. cytidinu a adenosinu), na uhlíkových elektrodách se zase sledují anodické oxidační děje adeninu a guaninu (resp. adenosinu a guanosinu). Elektrody na bázi rtuti a uhlíku byly použity k sestavování elektrochemických biosenzorů, na kterých bylo možné voltametricky měřit změny na DNA vzniklé působením 2-nitrofluorenu, jeho derivátů a metabolitů. Bylo potvrzeno, že 2-nitrofluoren i látky s ním příbuzné mají na DNA škodlivý vliv a způsobují její deformace. Nově vyvíjené elektrody a metody, které se používají při měření pomocí DNA biosenzorů (sestavených na základě těchto elektrod) nebo k detekci škodlivých látek, dávají příslib snadného a rychlého způsobu zjišťování přítomnosti toxických látek v prostředí a zkoumaní jejich potenciální nebezpečnosti pro DNA. 9

3. Nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky 3.1 Vznik Velkým problémem znečištění ovzduší a životního prostředí je nedokonalé spalování organických sloučenin, během kterého vzniká celá řada zdraví ohrožujících látek. Neopominutelným příkladem jsou nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky (NPAHy), které tvoří skupinu asi dvou set odlišných sloučenin. [1] V ovzduší se běžné vyskytují v koncentracích okolo desetin až stovek ng.m -3, tj. na hladinách až o několik řádů nižších než mateřské uhlovodíky. [2] Uvolňují se výfukovými plyny z dieselových i benzínových motorů, výrobou energie (spalování černého uhlí), cigaretovým kouřem, průmyslovou výrobou (továrny na výrobu hliníku) nebo také jako výsledek fotochemických reakcí polycyklických aromatických uhlovodíků nebo aminoderivátů polycyklických aromatických uhlovodíků s hydroxylovým radikálem. Poslední zmíněná reakce však probíhá pouze za světla. Dále mohou vznikat reakcí nedokonale spálených organických látek, které jsou představovány polycyklickými aromatickými uhlovodíky, a oxidovaného dusíku či kyseliny dusičné, která je v znečištěném ovzduší přítomna ve vysoké koncentraci. Katalýzu reakce provádí nízké ph způsobené výskytem oxidu siřičitého či oxidů dusíku v atmosféře. Z toho vyplývá, že samotné oxidy dusíku katalyzují svou vlastní reakci s polycyklickými aromatickými uhlovodíky. Oxidy dusíku jsou jedním z významných spalných produktů zodpovědných za okyselování životního prostředí s akutními účinky na lidské zdraví. [1] Teplota výrazně ovlivňuje množství NPAHů v ovzduší, v letních měsících při vyšších teplotách dochází k uvolňování těkavějších sloučenin do plynné fáze vzduchu, naopak v zimě se plynné NPAHy kondenzují na povrchu tuhých částic. Ke zvýšení koncentrace NPAHů může během zimního období docházet i díky vytápění domácností pevnými palivy. [2] 3.2 Koloběh v přírodě NPAHy jsou stálé sloučeniny setrvávající v ovzduší nejčastěji naadsorbované na prachové částečky, pomocí kterých se mohou v atmosféře rozšiřovat na velké vzdálenosti, a jsou nebezpečné pro své mutagenní a karcinogenní účinky. Suchým či mokrým atmosférickým spadem se dostávají do vody a půdy, odkud mohou být vstřebávány a akumulovány do živých organismů. Navzdory chemické stabilitě podléhají v organismu intenzivnímu metabolismu. Člověk může být vystaven působení NPAHů dvěma cestami. Přímou, která představuje vdechování 10

NPAHů navázaných na tuhé částice ve vzduchu, a nepřímou, přijímáním NPAHů v kontaminované potravě. Kontaminované potraviny (rostliny a živočichové) dostávají do svého těla NPAHy buď přímo během vývoje a růstu z vody či půdy, nebo během následné výroby a úpravy potravin, jako je grilování, uzení, pražení, sušení a pečení. [1,2] Při rozboru rakouských potravin byly nejvyšší detekované hladiny 2-nitrofluorenu a 1- a 2-nitronaftalenu zjištěny v koření, uzených potravinách, zelenině a čaji maté. Ale byla-li v blízkosti frekventované silnice vždy 6 hodin denně po dobu jednoho týdne umístěna brokolice, aby byla vystavena působení výfukových plynů s NPAHy, obsahy sledovaných NPAHů poté v jedlých částech rostliny nedosáhly detekčních limitů. Když byl na dobu osmnácti hodin na jablko aplikován roztok NPAHů, žádná sledovaná látka nepronikla do vnitřních částí ovoce, zůstaly pouze ve slupce. Zbavíme-li tedy ovoce a zeleninu slupky, redukujeme účinně konzumaci škodlivých látek. [2] 3.3 Toxické účinky NPAHy patří mezi přímé mutageny a karcinogeny, látky vykazující nebezpečné účinky, aniž by musely projít aktivací pomocí mikrosomálních enzymů. Jednotlivé NPAHy se mezi sebou svými mutagenními a karcinogenními účinky liší. Pravděpodobně je to dáno strukturní orientací nitroskupiny. Koplanární orientace je přístupná pro redukci a tím vykazuje vyšší mutagenitu, naopak kolmá orientace zajišťuje sterické krytí nitroskupiny inhibující redukci. Dalším důvodem může být interakce nitroskupiny s π-elektronovým systémem kondenzovaných aromatických kruhů, při které silná interakce znamená silnou mutagenitu. Metabolismus NPAHů může být ovlivňován spolupůsobením současně se vyskytujících polycyklických aromatických uhlovodíků, které aktivují cytochromový systém P450, a zrychlí tak metabolismus NPAHů. Mezi další ovlivňující faktory patří např. přítomnost alkoholu či stav a složení střevní mikroflóry. Jako potencionální karcinogeny indukují NPAHy vznik tumorů v orgánech (játra, střeva, ledviny, plíce, mléčné žlázy). [1] 3.4 Osud v přírodě Osud NPAHů v životním prostředí zatím není příliš znán. Jednou z nejpravděpodobnějších možností transformace je fotodegradace, která zahrnuje přeskupení nitroskupiny na arylnitrát a následnou tvorbu fenoxyradikálu eliminací nitroskupiny. Fenoxyradikály jsou dále oxidovány na chinony či nitrovány na nitrohydroxyderiváty. [1] 11

4. 2-Nitrofluoren Za modelového zástupce nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků bývá považován 2-nitrofluoren (NF; obr. 1), který se v atmosféře vyskytuje buď volný, nebo vázaný na tuhé částice rozptýlené ve vzduchu. [3] NO 2 Obr. 1 Strukturní vzorec 2-nitrofluorenu. 4.1 Koncentrace Jeho koncentrace byly v České republice v roce 2000 monitorovány metodou SPMD (trubice z polyethylenu naplněná 1 ml trioleinu, organické látky prostupují semipermeabilní membránou z okolí a koncentrují se v trioleinu). Nejvyšší množství 2,19 nanogramů NFu na gram trioleinu bylo naměřeno v Teplicích. V Ostravě se hladina pohybovala na 1,34 ng.g -1, v Prachaticích 1,22 ng.g -1 a ve Strnojedech 0,27 ng.g -1. V ostatních pozorovaných městech (Valašské Meziříčí, Průhonice, Olomouc, Staňkov) nebylo zjištěno detekovatelné množství. [2] 4.2 Vstup do organismu Do organismu člověka může NF vstupovat dvěma cestami. První je přímá a je zastoupena inhalací vzduchu s tuhými částicemi. Větší částice se postupně uvolňují do trávicí soustavy z horních částí dýchací cest a pomocí řasinkového epitelu z plic, kde byly předtím uloženy. Druhá cesta je spojena s výskytem těchto částic na produktech zemědělského původu určených ke spotřebě. Tato cesta postihuje přímo náš trávicí systém. Dalšími vedlejšími cestami, jak se může NF do organismu dostávat, je kontaminovanou vodou či konzumací ryb žijících v této vodě. Z uvedeného vyplývá, že je velmi důležité studovat působení NFu po vstupu do organismu jak ústy, tak i dýchacími cestami. [3] 12

4.3 Metabolismus Jestliže je dávka NFu podána konvenční kryse orální cestou, prvním krokem metabolismu (obr. 2 a 3) je redukce střevní mikroflórou na 2-aminofluoren (AF). AF dále podlehne acetylaci a vznikne 2-acetylaminofluoren (AAF). [3] Během výzkumů prováděných na počátku 21. století na krysách a psech byl objeven další metabolit 2-formylaminofluoren (FAF), který vzniká formylací AFu také v játrech. [4] Zde poté může docházet i k následné hydroxylaci, a objevují se tak hydroxylované podoby NFu, AAFu a FAFu, které jsou vzhledem ke své polaritě vylučovány ledvinami a trávicím systémem z těla ven především jako konjugáty glukuronové nebo sírové kyseliny. [3-5] Bylo ukázáno, že FAF v rybách vzniká z AAFu pravděpodobně tak, že FAF a AAF jsou v sebe navzájem přeměňovány přes AF. [5] Metabolity NFu se vyskytují jak v moči, tak ve výkalech, a vykazují přímé mutagenní účinky. [3] Největší podíl na močové mutagenitě mají volné hydroxylované AAFy (OH-AAF) a hydroxylované NFy (OH-NF). [6,7] Když jsou OH-AAFy z těla vylučovány v konjugované formě, nevykazují mutagenní aktivitu. [3] OH-NF má větší mutagenní účinky než mateřský NF. Nehydroxylovaný AAF je na rozdíl od OH-NF brán jako detoxikační produkt s nízkou potencionální mutagenitou. Je ale potencionálním karcinogenem. Nenalezneme ho v přírodě volně, cestou jeho vzniku je metabolismus NFu in vivo. [3] I ryby mají schopnost metabolizovat cizorodé látky. Během výzkumu ryb byla stejně jako u savců potvrzena přítomnost a aktivita enzymů potřebných pro přeměnu xenobiotik. Jaterní cytosolická aldehyd oxidasa a mikrosomální systém cytochrom P450 hrají roli při nitroredukci NFu. [5,8] Další shoda s metabolismem savců je v arylaminacetyltransferasové a formyltransferasové aktivitě jater, která katalyzuje acetylaci a formylaci aromatických aminosloučenin. Jaterní cytosol ryb prokázal schopnost deacetylace AAFu a FAFu zpět na AF, zvláště u FAFu. Rovnováha mezi formylací a deformylací je výrazně na straně deformylovaného FAFu, tedy AFu. [8] 13

2-Nitrofluoren Formamidasa Aldehyd oxidasa Cytochrom P450 Arylamin acetyltransferasa 2-Formylaminofluoren Formamidasa 2-Aminofluoren Karboxylesterasa 2-Acetylaminofluoren Cytochrom P450 Cytochrom P450 Cytochrom P450 Hydroxylované metabolity Konjugované metabolity Obr. 2 Obecné schéma metabolismu NFu po podání orální cestou (převzato z literatury [8] a přeloženo). 4.3.1 Vliv β-naftoflavonu na metabolismus Jestliže je kryse před podáním NFu aplikována dávka β-naftoflavonu, metabolické cesty (obr. 3) sice zůstávají stejné, ale mění se produkce metabolitů z kvantitativního hlediska. Vzniká značně více OH-NFů, vylučování OH-AAFů roste mírně, a tím roste i mutagenita. [3,7] β-naftoflavon navodí zvýšenou činnost cytochromů P450c a P450d. Ta může být také vyvolána městským vzduchem či látkami z cigaretového kouře, a může tak vznikat více mutagenních sloučenin, je-li člověk v životním prostředí vystaven inhalaci NFu. [7] 4.3.2 Vliv antibiotika na metabolismus Jestliže byly krysám podány antibiotika, výrazně pokleslo vylučování AFu, AAFu i FAFu a jejich hydroxylovaných derivátů. Naopak se zvýšilo množství vylučovaných OH- NFů a NFu. Z toho vyplývá, že střevní bakterie hrají důležitou funkci během reduktivního metabolismu NFu. 14

Antibiotikum u psů sehrálo stejnou roli jako u myší. Byl-li orálně psovi, který již předtím užil antibiotikum, podán AF, množství vyloučeného AAFu kleslo z 1,7 % na 0,1 % a množství FAFu se snížilo z 2,6 % na 1,4 %. To ukazuje, že střevní bakterie také katalyzují vznik acetylovaných a formylovaných derivátů. Antibiotika mají pouze malý vliv na jaterní nitroreduktasovou aktivitu, u acetylační a formylační aktivity v játrech nebyl pozorován žádný znatelný rozdíl. [4] 4.3.3 Estrogenní aktivita 2-nitrofluorenu Některé nesteroidní chemicky připravené látky mohou napodobovat biologické působení estrogenů. Tyto takzvané xenoestrogeny se mohou hromadit v životním prostředí a způsobovat rostoucí výskyt rakoviny prsu, varlat a další problémy reprodukčního systému. Byl-li NF inkubován s jaterními mikrosomy z krys, kterým byl podán 3-methylcholantren, a bylo-li přítomen NADPH, byl NF metabolicky aktivován a přeměněn na 5-OH-NF a 7-OH-NF. Extrakt z této směsi vykazoval v koncentračním rozmezí 10 5 až 10 4 mol.l 1 NFu estrogenní účinky na kvasinkách. Žádné účinky ale nebyly pozorovány, byly-li mikrosomy z čistých myší či byl-li jim předtím podán fenolbarbiturát. Množství 7-OH-NFu, které z NFu vzniká, je mnohem větší, než množství 5-OH-NFu. Právě 7-OH-NFu je přisuzována estrogenní aktivita. Na kvasinkách byl prokázán i cytotoxický efekt v koncentraci nad 10 5 mol.l 1 7-OH-NFu. [9] 4.3.4 Krysy bez střevní mikroflóry Nepřítomnost střevní mikroflóry u krys způsobuje nedostatek nitroredukcí, metabolismus (obr. 3) je prováděn oxidativní cestou a metabolity jsou jednou či dvakrát na kruhu hydroxylované nitrofluoreny, které jsou spojovány s velkým množstvím přímé mutagenity jak v moči, tak ve výkalech těchto krys ve srovnání s krysami se střevní mikroflórou. [3,10] Střevní mikroflóra tím pádem hraje svou roli ve snižování množství mutagenních metabolitů, ale je zodpovědná za nitroredukci a vznik karcinogenních AAFů. Metabolický obraz v exkretech krys bez střevní mikroflóry je odlišný od těch konvečních. NF je v jejich trávicím traktu vstřebáván, to dokazuje přítomnost metabolizovaného, ale i nemetabolizovaného, NFu v jejich moči. V moči konvečních krys můžeme nalézt pouze zpracovaný NF. Ani v moči ani ve výkalech krys bez střevní mikroflóry není detekovatelný hydroxylovaný AAF, ale bylo nalezeno celkem sedm odlišných metabolitů. Za mutagenitu vyskytující se v moči mají největší zodpovědnost 15

monohydroxylované izomery NFu (89 %), ze 40 % za ni může 9-OH-NF, z menší části přispívá také nemetabolizovaný NF (2 %) a (OH) 2 -NF (2 %). Z hlediska množství je nejvíce zastoupeným metabolitem (OH) 2 -NF (34 %). Největší metabolická cesta NF v krysách bez střevní mikroflóry tedy ústí ve vznik řady hydroxylovaných NFů, které mají větší mutagenní účinky než samotné NFy. Kvůli absenci střevní mikroflóry je do moči a výkalů vylučováno více metabolitů s přímo mutagenitou a majících zároveň značný genotoxický potenciál. [11] 4.3.5 Metabolismus v izolovaných prokrvených plicích a játrech Působení NFu cestou inhalace bylo studováno na izolovaných prokrvených plicích (obr. 3). Nezávisle na cestě, kterou je organismus vystaven působení NF, je NF přeměněn ve formu na kruhu hydroxylovaného NFu s hlavním podílem 9-OH-NF. [3,12] NF podaný intratracheální cestou projde skrz plíce do krevního oběhu a nemetabolizovaný tak může postihnout celý organismus. [3] Jestliže bylo studium prováděno na izolovaných prokrvených játrech (obr. 3) a dávka NFu byla podána intravaskulárně, bylo sice zjištěno, že je NF v játrech metabolizován na OH-NF stejně jako v plicích, ale je vylučován ve formě neškodných žlučových glukoronidů. [3] Byla-li myším podána žluč s enzymem β-glukuronidasou, která se normálně vyskytuje v lidské střevní mikroflóře, objevily se přímé mutagenní látky OH-NFy. [12] Dostává-li se tedy NF do těla cestou inhalace, v plicích podléhá metabolismu za vzniku OH-NFu nebo je v nezměněné podobě transportován do jater, zde hydroxylován na kruhu a vylučován žlučí. V tračníku je však OH-NF uvolněn přítomnou β-glukuronidasou a střevo je tak ohroženo genotoxickými účinky. [3] Volný OH-NF může být zpětně vstřebán ze střeva do krve a vyloučen ledvinami nebo se může účastnit enterohepatálního cyklu, konjugovat se v játrech a být opět vyloučen žlučí. [12,13] Jestliže byl ke studiu použit pouze krevní systém jater, ukázala se schopnost krve zpracovávat NF na 9-OH-NF a jeho izomer a oba byly zjištěny jak v plazmě tak červených krvinkách. [12] 16

Obr. 3 Shrnutí metabolismu NFu v laboratorní kryse. Orální (or) vstup od organismu, studium na izolovaných prokrvených plicích (lung) a játrech (liver) intratracheální (it) a intravaskulární (iv) vstup do organismu, vliv β-naftoflavonu (βnf) a nepřítomnosti střevní mikroflóry (germfree) na metabolismus (převzato z literatury [3]). 4.3.6 Aplikace poznatků na metabolismus člověka Data získaná výzkumem laboratorních zvířat mohou být s největší pravděpodobností aplikována i na člověka: a) redukce NPAHů na aminoderiváty polycyklických aromatických uhlovodíků je prováděna lidskou i krysí anaerobní fekální bakteriální suspenzí, b) lidská jaterní mikrosomální frakce S9 (mikrosomální frakce extraktu savčích jater s vysokým obsahem redoxních enzymů, které se podílejí na 1. fázi metabolismu xenobiotik a zprostředkovávají jejich přeměnu na reaktivní formu, jež může následně interagovat s DNA) spouští mutagenitu AFu a AAFu, c) buněčné linie lidských jaterních karcinomů mohou provádět nitroredukci i hydroxylaci na kruhu NFu, d) jaterní mikrosomální enzymatický systém je stejný u krys jako u člověka, e) lidské lymfocyty hydroxylují AAF na kruhu i na aminoskupině, f) metabolismus AAFu je prováděn stejným způsobem kulturou lidských 17

i krysích epiteliálních buněk z močového měchýře a g) po orálním podání AAFu člověku se v jeho moči vyskytovaly stejné metabolity jako u krysy. [3] 4.4 Akutní účinky 2-nitrofluorenu Akutní toxické účinky NFu byly prokázány při lokální aplikaci NFu kombinovaným s 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetátem, která u myší vyústila ve značný toxický úbytek hmotnosti. Při aplikaci NFu přes kůži se neobjevují žádné genotoxické účinky a není patrný vznik nádorů. Je to pravděpodobně určeno nízkou aktivitou nitroreduktázy v kůži. Když byl AAF vzniklý in vivo metabolismem NFu aplikovaný lokálně na kůži, neobjevil se žádný nádor. To může být vysvětleno nádorovou specificitou AAFu. [14] 4.5 Genotoxické účinky 2-nitrofluorenu 4.5.1 DNA adukty NF je potencionálním karcinogen a indukuje tvorbu nádorů v mnoha orgánech, např. v játrech, žaludku, střevě, ledvinách, plicích, mléčných žlázách, podkoží, hypofýze, ušních kanálech, nadledvinách a slinných žlázách. [3,15] Vysoké množství DNA aduktů přítomných v sliznici tlustého střeva má značnou spojitost s rakovinou tlustého střeva a konečníku. [16] Ve znečištěných prostředích se společně se střídáním ročních období mění i složení škodlivých látek přítomných v ovzduší, a tím se mění i DNA adukty lidských lymfocytů. DNA adukty se mezi sebou liší svými vlastnostmi, například opravami poškozené DNA a chemickou stálostí. Neexistuje jednotný vztah mezi odolností aduktů a tvorbou nádorů, kterou způsobují. Předpokládá se, že odolné adukty představují jakési spící poruchy, které se mohou po svém vzniku (interakce DNA s karcinogenem) dlouhodobě zakonzervovat jako mutace a mohou časem přispívat k maligní transformaci buněk a nekontrolovanému buněčnému dělení. [16] Nejkritičtějším krokem metabolismu je nitroredukce v prostředí střevní mikroflóry, která mění NPAHy na aminy a ty, nebo jejich deriváty, reagují s DNA za vzniku DNA aduktů. I když je dominantním místem nitroredukce trávící systém, může probíhat i v jiných orgánech v krysách bez střevní mikroflóry byly nalezeny DNA adukty dg-af vzniklé po nitroredukci NFu v játrech. NF i AAF mají stejný cíl v DNA a je jím deoxyguanosin (dg). 18

Po podání AAFu se tvoří DNA adukty s větší frekvencí než po dávce NFu, u krys bez střevní mikroflóry se tvoří nižší množství DNA aduktů než u konvenčních krys, vznik DNA aduktů postupně klesá v řadě kombinací konvenční krysa/dávka AFFu, krysa bez mikroflóry/dávka AAFu, konvenční krysa/dávka NFu a krysa bez mikroflóry/dávka NFu. Největší množství DNA aduktů bylo nalezeno v játrech, jak po podání NFu, tak i AAFu, byly ale také objeveny v plicích, ledvinách a srdci. [10] Na krysách bylo zjištěno, že NF vyvolává nádory v brzkých fázích po podání dávky v náchylných orgánech, jako jsou krysí játra, ledviny a přední část žaludku, ale i v těch, v kterých se nádory u krys tvoří jinak jen vzácně, jakými jsou například srdce, slezina a zadní žlázovitý žaludek. [16] NF způsobuje v největší míře vznik těchto DNA aduktů: 3-(deoxyguanosin-N 2 -yl)-2-acetylaminofluoren (dg-n 2 -AAF), N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-aminofluoren (dg-c8-af) a N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluoren (dg-c8-aaf) (obr. 4). [16,17] Byly objeveny i další DNA adukty, jejich složení ale není zatím známé. [16] Adukty dg-n 2 -AAF a dg-c8-af byly nalezeny jak po 10 dnech, tak i 11 měsících pravidelného dávkování v játrech, ledvinách a slezině. Po 10 dnech jich bylo mnohonásobně méně ve srovnání s časem 11 měsíců. Po odstranění působení NFu začaly adukty v játrech zanikat. Velmi výrazný pokles byl patrný u aduktu dg-c8-af, který po 11 měsících od odstranění působení NFu dosahoval nedetekovatelného množství. DNA adukt dg-n 2 -AAF ubýval mnohem pomaleji. [16] Částečné odstranění jater snížilo množství DNA aduktů, v játrech klesla schopnost vytvářet reaktivní látky, které potom reagují s DNA. [17] Zdá se, že je-li produkováno více přímých mutagenů v moči, klesá tvorba DNA aduktů a nádorových ložisek. Ale není možné říci, že vylučování mutagenní moči vypovídá o genotoxických rizicích látek, kterým jsme vystaveni. [17] 19

N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-aminofluoren (dg-c8-af) N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluoren (dg-c8-aaf) 3-(deoxyguanosin-N 2 -yl)-2-acetylaminofluoren (dg-n 2 -AAF) Obr. 4 Struktury DNA aduktů vznikajících při interakci metabolitů NF s DNA (převzato z literatury [16] a přeloženo). 4.5.2 Neplánovaná syntéza DNA Genotoxický efekt, který se projevuje v játrech působením NFu či AAFu, může být zkoumán i z hlediska neplánované syntézy DNA. Obě látky neplánovanou syntézu DNA vyvolávají. AAF je však silnějším iniciátorem a vyvolává stálejší přechod replikace DNA do S fáze. Neplánovaná syntéza DNA je pravděpodobně odrazem působení pouze AFu či AAFu, a tak NF musí nejprve projít nitroredukcí na amin v trávicím traktu. Bylo také ukázáno, že dávka β-naftoflavonu způsobila vylučování více OH-NFu v moči a poklesla tím také frekvence neplánované DNA syntézy. [18] 20

4.5.3 2-Nitrofluoren jako iniciátor a promoter Ve srovnání s AAFem, který je vážný potencionální karcinogen, působí NF jako středně silný iniciátor a slabý promotor při vývoji nádorových onemocnění. Může pozměnit buňky a povzbudit jejich proliferaci, ale podáme-li zvířatům NF, produkují spíše více přímých mutagenů v moči. Je možné, že genotoxický AAF je tak reaktivní, že nikdy neopustí buňku nebo tkáň bez toho aniž by zreagoval s makromolekulární látkou či podlehl detoxikaci. Látky se středně silným genotoxickým potenciálem jsou méně reaktivní, a tudíž mohou být vylučovány, aniž by prošly změnou. [13] 21

5. Elektrochemie DNA 5.1 Rtuťové elektrody DNA je elektroaktivní látkou, která je schopná se adsorbovat na rozhraní elektrody a vodného prostředí. Vkládáme-li na rtuťovou elektrodu potenciál okolo 1,45 V, dochází k ireverzibilní redukci cytosinu a adeninu (obr. 5). Guanin se ireverzibilně redukuje až při potenciálech menších než 1,6 V, ale jeho redukční pík není na elektrochemických záznamech viditelný, protože zároveň dochází při těchto negativních potenciálech k výraznému vylučování vodíku a redukční proudy guaninu jsou tímto překryty. Okolo potenciálu 0,3 V můžeme pozorovat až oxidaci 7,8-dihydrogenguaninu vzniklého redukcí guaninu. Chceme-li pozorovat redukci thyminu či uracilu na rtuti, musíme použít nevodné prostředí a značně negativní potenciály. Pomocí rtuťových elektrod jsou získávány kvalitní reprodukovatelné výsledky a tyto eletrody byly použity pro stanovení DNA jednak klasickými polarografickými metodami, voltametrií s lineárně rostoucím napětím, ale i pulsními voltametrickými metodami. Např. při diferenční pulsní polarografii se jednořetězcová DNA na povrch rtuti váže silněji a poskytuje vyšší redukční píky než dvouřetězcová DNA (dsdna). To je způsobeno menší přístupností redukovatelných skupin bází dsdna na povrchu rtuťové elektrody. Použijeme-li voltametrii se střídavou složkou napětí (ACV), v katodické oblasti můžeme pozorovat píky vykreslující adsorpční a desorpční děje DNA na elektrodě. Při potenciálu 1,2 V dochází k desorpci cukr-fosfátové kostry DNA. Je-li adsorbovaná DNA jednořetězcová, k desorpci částí molekul DNA dochází při ještě negativnějších potenciálech, a to 1,4 V. U dsdna nebyly v širokém rozmezí potenciálů pozorovány žádné strukturní změny, ale při 1,2 V docházelo k povrchové denaturaci, což je děj, při kterém na volných koncích dochází k odvíjení dvoušroubovice na povrchu elektrody. Tyto tenzametrické píky můžeme pozorovat jak na visící rtuťové kapkové elektrodě, tak na pevných amalgámových (stříbrný/platinový amalgám) elektrodách i na uhlíkových elektrodách potažených vrstvou rtuti (tzv. rtuťových filmových elektrodách). Nejlepší reprodukovatelné výsledky poskytuje visící rtuťová kapková elektroda, ale amalgamové elektrody jsou vhodnější pro konstrukci DNA biosenzorů. [19] Důvodem je především to, že během posledního desetiletí stále více rostou obavy z toxicity kapalné rtuti. Pozornost je tedy věnována vývoji pevných elektrod, jako jsou amalgámové elektrody, kompozitní elektrody, uhlíkové pastové elektrody či borem dopované diamantové elektrody. Materiály složené z amalgámu neobsahují toxickou kapalnou rtuť, a produkují tudíž zanedbatelné množství rtuťových výparů ve srovnání s kapalnou rtutí či s hmotou, která se z kapalné rtuti skládá. [20,21] 22

Obr. 5 Cyklický voltamogram oligonukleotidu s redukčním píkem cytosinu a adeninu (CA) a oxidačním píkem (G) redukčního produktu guaninu (7,8-dihydrogenguanin) naměřený na visící rtuťové kapkové elektrodě (převzato z literatury [19]). 5.2 Uhlíkové elektrody Měříme-li při pozitivních potenciálech, je vhodné použít uhlíkové elektrody a pozorovat anodické oxidační děje, které není možné pomocí rtuťových elektrod sledovat, jelikož při kladných hodnotách potenciálu dochází k elektrolytickému rozpouštění rtuti. Pozorovatelné a využívané jsou pouze oxidační píky purinových bází (guaninu a adeninu), oxidace guaninu probíhá kolem potenciálu 1,0 V, adenin se oxiduje při 1,2 V (obr. 6). Na rozdíl od rtuťových elektrod a jejich redukčních a tenzametrických píků nemají na oxidační signály vliv strukturní deformace DNA. Po interakci DNA s toxickými látkami se osvědčilo sledovat pokles oxidačního píku guaninu. Pokles obvykle způsobuje produkt reakce mezi bázemi v DNA a interagující látkou. Guaninový pík je výhodný z toho důvodu, že jeho oxidace předchází všem oxidacím dalších bází a není tak zatížen ostatními reakcemi na elektrodě. K analýze DNA můžeme použít různých konstrukčních typů uhlíkových elektrod (pevné, pastové, kompozitní, filmové apod.) a uhlík lze také nejrůzněji modifikovat. [19] 23

Obr. 6 Voltamogram oligonukleotidu s oxidačními píky guaninu (G ox ) a adeninu (A ox ) naměřený na elektrodě z pyrolytického grafitu (převzato z literatury [19]). 24

6. Elektrochemické DNA biosenzory V DNA dochází ke strukturním změnám, je-li vystavena působení genotoxických látek. Tyto změny mohou být detekovány měřením elektrochemických signálů. [19] Při in vitro zkoumání interakcí mezi genotoxickými nitroderiváty fluorenu (či jejich aminoanalogy) a DNA (používá se DNA izolovaná z buněk živočichů, např. telecího brzlíku nebo lososích či sledích spermií) byly do nynějška použity dva typy uhlíkových elektrod (sítotiskové uhlíkové pastové elektrody a velkoplošné uhlíkové filmové elektrody) a visící rtuťová kapková elektroda. Na uhlíkové elektrody je DNA nejčastěji nanášena z vodného zásobního roztoku, který je ponechán zaschnout (DNA je na povrchu udržována silnou fyzisorpcí). V případě visící rtuťové kapkové elektrody je nejběžnější využití tzv. adsorptivní přenosové rozpouštěcí techniky (díky silné adsorpci DNA na rtuťový elektrodový povrch je možné přenést elektrodu s akumulovanou DNA z roztoku, ve kterém byla rozpuštěna, do roztoku, ve kterém probíhá elektrochemické měření). [19] Těmito dvěma způsoby imobilizace DNA na povrch pracovní elektrody byly připraveny i DNA biosenzory, prostřednictvím kterých byly získány výsledky shrnuté v kapitolách 6.1 a 6.2. 6.1 Biosenzory na bázi uhlíku 6.1.1 Sítotisková uhlíková elektroda Při in vitro detekci poškození způsobených NFem a 2,7-dinitrofluorenem (2,7-dNF) byl použit elektrochemický DNA biosenzor sestavený ze sítotiskové uhlíkové pastové elektrody (SPCPE) a na něm imobilizované vrstvy dsdna pocházející z telecího brzlíku. Byly zjištěny dva druhy poškození DNA. První byla způsobena přímou interkalací nitrofluorenů do DNA a druhá radikály s krátkou dobou života, které vznikaly při elektrochemických redukcích nitroskupin. [22] Voltametrie s vkládaným pravoúhlým napětím (SWV) ukázala, že obě testované látky reagují s DNA, která je součástí povrchu elektrody SPCPE. K oxidaci guaninu dochází přibližně při potenciálu 1,0 V, k oxidaci adeninu okolo potenciálu 1,3 V. Výšky píku se po interakci DNA a látek snižují (obr. 7) dochází k interkalaci studovaných látek mezi páry bází DNA, což může mít za následek snížení počtu elektroaktivních míst schopných podléhat oxidaci. Interkalace byla zjišťována na základě použití známých redoxních indikátorů ([Cu(phen) 2 ] 2+ a [Co(phen) 3 ] 3+ ; phen reprezentuje 1,10-fenanthrolin) způsobujících interkalaci jako kompetitivních látek. Tyto látky v závislosti na iontové síle reagují prostřednictvím 25

hydrofobních interakcí s vnitřkem dsdna (interkalace) a prostřednictvím elektrostatických interakcí s negativně nabitými fosfátovými zbytky DNA (elektrostatické vázání) a mohou soutěžit o vazebná místa v DNA s nitroderiváty fluorenu. Interkalace byla vyšetřována metodou diferenční pulsní voltametrie (DPV) (obr. 8). Při koncentraci fosfátového pufru 20 mmol.l 1 byla sledována vazba zkoumaných nitrofluorenů do struktur DNA, a tím byla blokována kompetitivní interkalace redoxních indikátorů do dsdna. Odezvy píků indikátorů se snížily, znatelnější snížení bylo pozorováno u [Cu(phen) 2 ] 2+, který má větší afinitu k DNA. Při koncentraci fosfátového pufru 5 mmol.l 1 (tedy při převažující elektrostatické vazbě redoxních indikátorů) ke kompetici s nitrofluoreny prakticky nedocházelo (obr. 8). [22] Proud ( A) 12 10 8 6 4 adenin guanin 50 0 500 1000 1500 0 Potenciál (mv) 150 100 Proud ( A) guanin adenin 1 2 3 2 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Potenciál (mv) Obr. 7 Anodické odezvy bází DNA naměřené technikou SWV po inkubaci biosenzoru s 0 mol.l 1 (1), 5.10 6 mol.l 1 (2) a 1.10 5 mol.l 1 (3) NFu (převzato z literatury [22] a přeloženo). 26

-2.5 3 4 Proud ( A) -2.0-1.5-1.0-0.5 5 6 1 2 0.0 0-100 -200-300 -400-500 -600 Potenciál (mv) Obr. 8 Katodické DPV píky [Cu(phen) 2 ] 2+. Křivky 1, 3, 4 jsou zaznamenány v 5 mmol.l 1 a křivky 2, 5, 6 v 20 mmol.l 1 fosfátovém pufru. Křivky 1, 2 jsou měřeny na SPCPE, křivky 3, 5 na DNA/SPCPE biosenzoru a křivky 4, 6 na DNA/SPCPE biosenzoru po dvouminutové inkubaci v 5.10 6 mol.l 1 NFu (převzato z literatury [22] a přeloženo). Během první fáze elektrochemické redukce NFu a 2,7-dNFu se přenášejí čtyři elektrony a nitroskupina se redukuje na hydroxylaminoskupinu, a vznikají tak radikály s krátkou dobou života (Ar-NO 2 H ), které mohou reagovat s DNA a způsobovat tak její oxidativní poškození (při kolizi Ar-NO 2 H s kyslíkem jsou generovány tzv. reaktivní kyslíkové sloučeniny způsobující oxidaci guaninu na 8-oxoguanin). Jako optimální technika pro generování radikálů byla zvolena voltametrie s katodicko/anodickým cyklováním (15 cyklů) v míchaném roztoku nitrofluorenů v rozsahu potenciálů 0 až 1000 mv, která poskytuje nezbytný reakční čas, a při teplotě 36 C, která byla volena v souladu s obecnými pravidly reakční kinetiky (zvýšením teploty dosáhneme větší účinnosti). Po tomto oxidativním poškození DNA na povrchu biosenzoru bylo pozorováno zvýšení guaninového (oxidace při 0,8 V) a adeninového (oxidace při 1,1 V) píku (obr. 9), což svědčí o tom, že reaktivní radikály způsobují poškození DNA, rozevření dvoušroubovice a větší přístupnost bází pro elektrochemickou oxidaci. Navíc byl nově pozorován další anodický pík při potenciálu 0,45 V. Byl přiřazen anodické oxidaci 8-oxoguaninu, který vzniká chemickou oxidací guaninu (prostřednictvím reaktivních kyslíkových sloučenin oxidační stres). [22] 27

B 3 4 3 100 na C A Proud adenin 4 Proud 0 300 600 900 1200 1 A Potenciál (mv) 8-oxoguanin C guanin A B 2 1 0 200 400 600 800 1000 1200 Potenciál (mv) Obr. 9 Anodické DPV odezvy DNA bází na SPCPE (křivky 1, 2) a na DNA/SPCPE biosenzoru (křivky 3, 4) před (křivky 1, 3) a po (křivky 2, 4) katodicko/anodickém cyklování v roztoku 1.10 5 mol.l 1 NFu (převzato z literatury [22] a přeloženo). Aby bylo získáno celkové hodnocení elektrochemického chování testovaných látek na biosenzoru ve srovnání s chováním pouze na sítotiskové uhlíkové pastové elektrodě, byla použita technika cyklická voltametrie. Naměřená data potvrzují stejný redoxní mechanismu u obou elektrod, liší se pouze ve výšce píků. Zvýšení odezvy na biosenzoru je nejspíše potvrzením toho, že dochází k nahromadění pozorované látky uvnitř DNA vrstvy během inkubace DNA biosenzoru. [22] 6.1.2 Uhlíková filmová elektroda Velkoplošná uhlíková filmová elektroda (CFE) připravená překrytím klasické pevné pracovní elektrody vodivým kompozitním filmem (suspenze přírodního mikrokrystalického grafitu v polystyrenu) představuje velmi slibnou alternativu k nanostrukturovaným uhlíkovým elektrodám a komerčně dostupným jednorázovým sítotiskovým uhlíkovým elektrodám. Mikročástice přírodního grafitu dosahují rozměrů okolo 1000 nm, čímž se jejich velikostí blíží velikosti nanočástic, které se dnes běžně užívají v moderní elektrochemii, avšak cena tohoto grafitu je ve srovnání s komerčně dostupnými uhlíkovými nanočásticemi nepoměrně nižší. [23] 28

Mezi hlavní výhody CFE patří jednoduchá, rychlá a levná příprava, snadná mechanická obnova povrchu, při které se jen starý film otře o filtrační papír a na povrchu podkladové elektrody se vytvoří film nový, opakovatelnost měření, eliminace problémů spojených s elektrodovou historií a jednoduchá chemická modifikace. [23] Pomocí elektrochemického biosenzoru složeného z dsdna a CFE (DNA/CFE) a SWV byly sledovány změny DNA způsobené interakcí s AF a pomocí cyklické voltametrie (CV) byly studovány odezvy aniontového redoxního indikátoru [Fe(CN) 6 ] 4 /3 přítomného v roztoku; stav elektrody modifikované DNA je možné studovat pomocí komplexních aniontů, jejichž náboj jim brání v přístupu k modifikované elektrodě, protože jsou odpuzovány záporně nabitou cukr-fosfátovou kostrou dsdna (v případě poškození struktury dsdna je na cyklických voltamogramech pozorována voltametrická odezva [Fe(CN) 6 ] 4 /3 s vyšší reversibilitou a ukazující snadnější přenos náboje mezi redoxním indikátorem a modifikovanou elektrodou). [23] Použitím SWV byly detekovány dva anodické píky odpovídající oxidaci guaninu při potenciálu 1,1 V a oxidaci adeninu při potenciálu 1,4 V (obr. 10). Po působení AF na DNA se signály purinových bází posunuly k pozitivnějším potenciálům v průměru o 0,04 V (píky guaninu p 1 a p' 1 ) a 0,03 V (píky adeninu p 2 a p' 2 ) a oba píky téměř o polovinu poklesly. Tyto posuny jsou způsobeny interkalací AF do velkého či malého žlábku DNA, která způsobuje zlomy na DNA. AF se hromadí uvnitř dsdna (popř. je možné očekávat i částečný vznik kovalentního aduktu, protože byla pozorována velmi silná akumulace analytu, kterou nebylo možné rozrušit ani změnou iontové síly ani několikaminutovým oplachem DNA biosenzoru deionizovanou vodou) a tomu odpovídá zvýšená odezva biosenzoru na AF (píky p 3 a p 4 ). [23] Zlomy na dvoušroubovici DNA a odpojení DNA z elektrodového povrchu mohou být nepřímo zjištěny pomocí CV. V případě, že DNA zůstává na elektrodovém povrchu nepoškozená, voltametrická odezva [Fe(CN) 6 ] 4 /3 nemění během opakovaných měření svůj tvar. Po interakci AF s DNA voltametrické píky redoxního indikátoru vzrostly a potenciálový rozdíl mezi anodickým a katodickým píkem [Fe(CN) 6 ] 4 /3 se zmenšil, což potvrdilo desorpci DNA z povrchu elektrody vlivem vzniku zlomů ve struktuře dsdna (obr. 11). [23] 29

I [ A] 100 80 60 40 p 3 relativní odezva [%] 100 80 60 40 20 0 1 2 1 2 0 0.1 c 2-AF [mmol l -1 ] 20 p 4 p 1 p'1 p 2 p' 2 0 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 E [V] vs SCE Obr. 10 SW voltamogramy měřené na DNA/CFE biosenzoru po tříminutové inkubaci biosenzoru v 0,01 mol.l 1 HCl (černá křivka), na DNA/CFE biosenzoru po tříminutové inkubaci v 0,01 mol.l 1 HCl obsahující 1.10 4 mol.l 1 AF (červená křivka) a na CFE po tříminutové inkubaci v 0,01 mol.l 1 HCl obsahující 1.10 4 mol.l 1 AF (zelená křivka). Pokles píků p 1 (guanin) a p 2 (adenin) značí poškození DNA způsobené AF (převzato z literatury [23] přeloženo). 150 I [ A] 100 50 relativní odezva [%] 100 80 60 40 20 0 1 2 1 2 0 0.1 c 2-AF [mmol l -1 ] akumulovaný AF 0-50 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 E [V] vs SCE dopředný sken zpětný sken Obr. 11 Cyklické voltamogramy 1.10 3 mol.l 1 [Fe(CN) 6 ] 4 /3 měřené na CFE po tříminutové inkubaci v 0,01 mol.l 1 HCl (černá křivka), na DNA/CFE biosenzoru po tříminutové inkubaci v 0,01 mol.l 1 HCl (zelená křivka) a na DNA/CFE biosenzoru po tříminutové inkubaci v 0,01 mol.l 1 HCl obsahující 1.10 4 mol.l 1 AF. Změny výšky anodického (1) a katodického (2) píku značí poškození DNA způsobené AF (převzato z literatury [23] a přeloženo). 30

6.2 Biosenzory na bázi rtuti Pro zjišťování škodlivého působení NPAHů a jejich derivátů se také začaly používat biosenzory založené na elektrodách na bázi rtuti. Měření byla realizována jak na klasické visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE), tak na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě (m-agsae) a na leštěné stříbrné pevné amalgámové kompozitní elektrodě (p-agsa-ce). 6.2.1 Visící rtuťová kapková elektroda Na HMDE modifikované DNA se technikou CV sledovalo poškození DNA po interakci s NF ze změny výšky píku adeninu a cytosinu (popsány v kapitole 5.1). Pokles CA píku o 9 % byl zaznamenán v přítomnosti NF. Dá se vysvětlit degradací DNA na volné kousky dvoušroubovice, které se neudrží na povrchu elektrody, či částečnou depurinací DNA, po které volné báze adeninu v roztoku neposkytují žádný signál. [24] Technikou CV bylo také sledováno poškození DNA způsobené redukčními produkty NF. Nejúčinnější generace nitroanionových radikálů (Ar-NO 2 ) byla pozorována při katodicko/anodickém cyklování v rozmezí potenciálů 300 až 800 mv; redukcí NF během čtyřelektronové redukce vznikají radikály s krátkou dobou života a způsobují oxidativní poškození DNA. To je možné sledovat také pomocí poklesu redukčních píků adeninu a cytosinu v důsledku zlomů na DNA, jejíž části se potom uvolní z povrchu elektrody. Nitroanionový radikál může generovat prostřednictvím reakce s molekulou kyslíku další radikál (peroxidový). Cílem oxidativního poškození je nejčastěji guanin, vzniká 8-oxoguanin, který se nesprávně páruje s adeninem a ten se v dalším replikačním procesu páruje s thyminem a do DNA se začleňuje mutace. [24] Z diferenčně puslních voltamogramů byl navržen mechanismus vazby NF do DNA. Na nemodifikované HMDE poskytuje NF dobře vyvinutý voltametrický signál (obr. 12, křivka 1). Po přídavku DNA do roztoku se vytváří komplex DNA NF. Na povrch elektrody (rtuťová kapka), na kterou se DNA snadno a silně váže, se po malém přídavku DNA váže ve zvýšené míře komplex DNA NF, a tím se zvýší proudová odezva; zároveň dochází k posunu potenciálu píku k pozitivnějším hodnotám (obr. 12, křivky 2 až 8), poněvadž NF vázaný do komplexu DNA NF je snadněji redukovatelný (vliv interkalace do DNA na rozložení elektronové hustoty na molekule NF; interkalace se vyznačuje posunem potenciálu píku ke kladnějším hodnotám, naopak posun k negativnějším potenciálům je připisován elektrostatickým vazbám NF na cukr-fosfátovou kostru dsdna). Přidáme-li do roztoku další 31

množství DNA, další volný NF se váže mezi dusíkaté báze DNA, ale nově vznikající komplex DNA NF se váže na HMDE ve stále menší míře (konkurenční vazba nadbytečné DNA v roztoku), protože většina komplexu zůstává v roztoku; tím dochází ke snížení voltametrické odezvy NF (resp. celkové odezvy NF a DNA NF) (obr. 12, křivky 3 až 8). [24] I, na -150-120 7 6 5 4 3 2 1-90 8-60 -30 0-350 -400-450 E, mv -500 Obr. 12 DP voltamogramy NF (c = 1.10 5 mol.l 1 ) a komplexy DNA NF na HDME; zobrazeny jsou odezvy odpovídající hodnotám výsledné koncentrace DNA přidané do roztoku: 0 (1), 44 (2), 85 (3), 125 (4), 199 (5), 268 (6), 331 (7) a 391 µg.ml 1 (8) (převzato z literatury [24]). 6.2.2 Amalgámové elektrody Jak již bylo zmíněno dříve (kapitola 5.1), kvůli rostoucím obavám z toxicity kapalné rtuti je pozornost věnována vývoji nových pevných elektrod. Dvěma takovými, které reprezentují vhodnou netoxickou alternativu, je rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda (m-agsae) a leštěná stříbrná pevná amalgámová kompozitní elektroda (p-agsa-ce). Mezi jejich největší výhody patří mechanická odolnost, jednoduché zacházení a snadná regenerace elektrodového povrchu pomocí elektrochemického čištění. [20,21] Tyto elektrody nebyly prozatím použity k sestavení DNA biosenzorů pro detekci poškození DNA interakcí s NPAHy (resp. tento výzkum aktuálně v UNESCO laboratoři 32

elektrochemie životního prostředí při Katedře analytické chemie PřF UK Praha probíhá, zatím však bez publikačních výstupů), ale zatím jen pro jejich voltametrické stanovení. Na p-agsa-ce bylo prováděno stanovení NF technikami DCV, DPV a adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrií (AdSDPV), pro elektrodu m-agsae byly použity stejné techniky a zkoumanou látkou byl navíc také 2,7-dNF. V kyselém, neutrálním a slabě zásaditém prostředí poskytoval NF pouze jeden voltametrický pík, který odpovídá přenosu čtyř elektronů a redukci nitroskupiny na hydroxylaminoskupinu. [20,21] Na obou elektrodách také bylo pozorováno, že v silně alkalickém prostředí došlo ke snížení výšky původního píku NF a v zápornějších potenciálech se objevil nový pík z důvodu změny mechanismu redukce NF (průběh ve dvou krocích): prvním je rychlý příjem jednoho elektronu za vzniku radikálu Ar-NO 2, druhým poté tříelektronová redukce vzniklého Ar-NO 2 na Ar-NHOH (2-hydroxylaminofluoren). Díky p-agsa-ce byl při elektrochemické přeměně NF nově pozorován voltametrický pík, který neposkytovalo měření na HMDE ani na m-agsae. Pík byl objeven při aplikaci regeneračních potenciálů a odpovídá dvouelektronové redukci nitroso skupiny vzniklé při regeneračním kroku. Při použití negativnějších regeneračních potenciálů k elektrochemické regeneraci vznikal na elektrodovém povrchu 2-hydroxylaminofluoren, který byl poté vložením kladnějších potenciálů oxidován na 2-nitrosofluoren. Po ukončení regeneračního cyklu došlo k naadsorbování zbytku 2-hydroxylaminofluorenu na povrchu elektrody, ten byl poté na počátku dalšího měření oxidován na 2-nitrosofluoren a poté ihned redukován zpět jako součást voltametrického měření; tento jev by mohl být v budoucnu využit při detekci poškození DNA generovanými genotoxickými nitrosoderiváty NPAHů. [21] 2,7-dNF poskytoval na m-agsae v celé ph oblasti dva katodické píky. První odpovídá čtyřelektronové redukci jedné z nitroskupin na hydroxylaminoskupinu, druhý také čtyřelektronové redukci a vzniku hydroxylaminu z druhé přítomné nitroskupiny. [20] Se zvyšujícím ph se hodnoty píků posunovaly do oblasti negativnějších potenciálů, to může být vysvětleno předběžnou protonací testovaných látek (NF i 2,7-dNF) vedoucí ke snížení elektronové hustoty na nitroskupině a snadnějším přijetím elektronů při nižším ph. [20,21] 33

7. Srovnání poznatků o in vivo a in vitro přeměnách 2-nitrofluorenu V předchozích kapitolách byl poskytnut přehled poznatků o působení NF a jeho metabolitů na DNA. Výzkumem poškozování DNA in vivo se celosvětově zabývalo několik vědeckých týmů, především během 80. a 90. let minulého století. V publikovaných pracích byl poskytnut poměrně detailní popis nejen metabolických drah NF, ale také působení metabolitů NF na strukturu DNA. Rovněž bylo ukázáno, že elektrochemické DNA biosenzory představují jednoduše připravitelná, levná, citlivá a selektivní zařízení vhodná pro detekci poškození DNA in vitro. Přestože je zřejmé, že výzkum prováděný za takto odlišných experimentálních podmínek (in vivo versus in vitro) s sebou nese riziko nižší korelace získaných poznatků, bylo určitě velmi zajímavé poskytnout srovnání výsledků získaných oběma způsoby. Jelikož byl výzkum poškození DNA interakcí s NF a jeho metabolity pomocí elektrochemických DNA biosenzorů prováděn až v poslední době, týkají se získané poznatky především dvou sloučenin matečného NF a jeho primárního in vivo metabolitu AF. Zde jsou uvedeny poznatky, které jsou in vivo a in vitro studiím společné: 1. Při redukci NF vzniká jako redukční produkt AF. 2. Redukce NF na AF je ireversibilní proces. 3. Při přímé interakci AF s DNA vznikají silně vázané kovalentní DNA adukty typu dg-c8-af. Pomocí elektrochemických DNA biosenzorů však byly získány i další poznatky, které při in vivo studiích nelze získat (nebyly vyvinuty příslušné metody pro takovýto typ studia) nebo jim nebyla věnována patřičná pozornost. Jedná se především o tato fakta: 1. Při elektrochemické redukci NF dochází v podmínkách srovnatelných s prostředím v buňkách (základní elektrolyty o iontové síle srovnatelné s iontovou sílou fyziologického roztoku a v rozmezí ph 4,5 7,0) nejprve k tvorbě intermediátu (2-hydroxylaminofluoren), který je následně redukována na AF. 2. V prvním kroku elektrochemické redukce NF se na povrchu elektrody tvoří radikály s krátkou dobou života, které zprostředkovávají za aerobních podmínek oxidativní poškození DNA (či vznik zlomů ve vláknech dsdna), které je známo i z in vivo studií (oxidační stres). Je tedy možné, že i v živých organismech existuje riziko tohoto typu poškození DNA, které může vézt ke vzniku DNA mutací. 34

3. Přímá interakce NF s DNA způsobuje jeho interkalaci do struktury DNA. Tento DNA NF komplex by mohl při další replikaci DNA vézt rovněž ke vzniku degenerované struktury DNA, popř. by mohl replikaci DNA zcela zamezit. 4. Při přímé interakci AF s DNA byla jednak detekována interkalace AF do DNA a vznik zlomů ve struktuře dsdna, ale také detekován vznik silné vazby mezi DNA a AF, která dává tušit vzniku podobných DNA aduktů jako při interakcích in vivo (dg-c8-af). Další výzkum této tématiky v UNESCO laboratoři elektrochemie životního prostředí při Katedře analytické chemie PřF UK Praha, kterého se sama budu v budoucnosti účastnit, bude směřován ke studiu interakce DNA s dalšími in vivo metabolity NF, při kterém se počítá i s využitím modifikace povrchu elektrod příslušnými enzymy, které se v in vivo metabolismu uplatňují. Do budoucna je rovněž plánován vývoj komplexní in vitro metodiky, jež bude koncipována jako jednoduchý klinický diagnostický postup, který by měl co nejvěrněji odhadnout in vivo metabolickou dráhu nově syntetizovaných látek (např. nová protinádorová léčiva) při první fázi jejich biotransformace a zároveň poskytnout obraz o interakci prekurzoru i jeho metabolitů s DNA. Za tímto účelem budou testovány nové netoxické elektrodové materiály (v současnosti výzkum probíhá s uhlíkovými nanočásticemi, stříbrným amalgámem a kovovým bismutem), které by měly sloužit k výrobě jednorázových DNA biosenzorů. 35

8. Závěr V této bakalářské práci byly shrnuty dosavadní poznatky o jednom z nejdůležitějších markerů výskytu nitrovaných aromatických polycyklických uhlovodíků 2-nitrofluorenu. Jeho in vivo metabolismus byl prozatím zkoumán na krysách, psech a rybách. V těle člověka nebylo působení 2-nitrofluorenu prověřeno, ale do jisté míry může být metabolismus zjištěný na zvířatech na člověka aplikován; izolované lidské enzymy či bakteriální suspenze poskytovaly stejné reakce jako ty zvířecí. NF je nebezpečnou mutagenní, ale především karcinogenní látkou, jeho metabolity reagují s DNA za vzniku DNA aduktů, kterým se rovněž část této bakalářské práce věnovala. Rovněž bylo ukázáno, že elektrochemické DNA biosenzory představují možnost, jak in vitro detekovat poškození DNA způsobené 2-nitrofluorenem a produkty jeho redukční přeměny. Jelikož se ale zatím jedná o výzkum probíhající teprve několik roků (první práce byla publikována v roce 2010), byla věnována pozornost zatím pouze studiu první fáze in vivo metabolické přeměny, tedy redukční přeměně 2-nitrofluorenu na 2-aminofluoren. Při tomto studiu byla nalezena jistá shoda mezi působením 2-nitrofluorenu na DNA in vivo a in vitro, navíc bylo také detekováno poškození DNA radikály s krátkou dobou života, které je prozatím při studiích in vivo značné obtížné sledovat. Prozatímní výzkum také dává do budoucna možný příslib neinvazivního prověřování potencionálně nebezpečných látek pro DNA. 36