Laboratoř buněčné biologie PROJEKT Mnohobuněčné kvasinky Libuše Váchová ve spolupráci s laboratoří Prof. Palkové (PřFUK) Do laboratoře přijímáme studenty se zájmem o vědeckou práci Kontakt: vachova@biomed.cas.cz
Modelový organismus: kvasinka Saccharomyces cerevisiae = pekařské droždí Jednobuněčný eukaryotický mikroorganismus: Používán jako model pro studium základních buněčných procesů JEDNOTLIVÉ KVASINKOVÉ BUŇKY POPULACE KVASINKOVÉ KOLONIE Kvasinky jsou studovány na úrovni jednotlivých buněk ve třepaných kulturách Kultivace za příznivých podmínek V původním přirozeném ekosystému se kvasinky téměř nevyskytují jako jednotlivé buňky. V přírodě vytvářejí různě složité mnohobuněčné struktury Příklady: Kolonie, biofilmy
Jaké možnosti mohou buňkám poskytnout mnohobuněčné struktury? Buňky populace mohou interagovat, komunikovat a synchronizovat vývoj Buňky populace mohou diferencovat a tvořit specializované formy JEDNOTLIVÉ KVASINKOVÉ BUŇKY POPULACE KVASINKOVÉ KOLONIE Populace se může lépe adaptovat na změny prostředí Populace může být lépe chráněna před vlivy prostředí Existují procesy, které jsou specifické pro mnohobuněčné populace O jaké procesy jde??
2 typy kmenů Laboratorní kmeny Přírodní divoké kmeny S. cerevisiae S. cerevisiae Tvoří hladké kolonie vlastnosti shodné i odlišné Tvoří kolonie strukturované Kmeny čerstvě izolované z přírody Jaká je skutečnost?
Jaké vlastnosti mají populace kolonie, které je zvýhodňují ve srovnání se samostatnými buňkami? Laboratorní kmeny Jsou schopné komunikovat Signální molekula: amoniak Jsou schopné adaptovat svůj metabolismus Acidic ph ph Alkali ROS ESR ESR TCA Limitace živin Aktivní ATP mitochondrie ADP (oxidativní Pma1p fosforylace) H + ATPase H + Stressed cells (acidic phase) GC TCA TCA NH + 4 H + Ato NH H + 3 + Adapted cells (alkali phase) Kolonie na agaru s ph indikátorem žluté zbarvení kyselé ph fialové zbarvení alkalické ph vyvolané NH 3 Populace postupně vyčerpá dostupné živiny, zvyšuje se produkce ROS amoniak naindukuje v buňkách změny metabolismu, které jsou výhodné pro další přežití
Buňky jsou schopné diferencovat v rámci populace Laboratorní kmeny Vytvářejí specializované buněčné skupiny se speciálními funkcemi Příčný řez kolonií pozorování 2-fotonovým konfokálním mikroskopem 150 μm povrch agaru Pouze populace buněk v zelené oblasti kolonie produkuje specifický membránový protein, který je označen GFP Pohled na kolonii zespodu
Žijí v méně příznivých podmínkách Odlišné vlastnosti? Vnitřní struktura kolonie je odlišná Přírodní kmeny Laboratorní kmen Jsou pevně přichyceny k podkladu Přírodní kmen 100 μm 10 μm Příčný řez kolonií Oválné buňky laboratorní: celá kolonie přírodní: jen vrchní část Ve spodní části vytvářejí struktury, jakési kořínky 10 μm 10 μm
Používají dva hlavní typy ochranných mechanismů Produkují ochrannou extracelulární hmotu Přírodní kmeny Tvořena hlavně polysacharidy Příčný řez kolonií (38 h) povrch agaru pohled do povrchových vrstev kolonie skenovacím elektronovým mikroskopem 100 μm Extracelulární hmota v červené oblasti je málo propustná Zabraňuje pronikání nežádoucích látek
Přírodní kmeny Používají dva hlavní typy ochranných mechanismů Produkují a aktivují transportéry mnohočetné lékové resistence Mohou odstraňovat extracelularní toxické látky Konkrétně Pdr5p a Snq2p Příčný řez kolonií Barvení: ConA/Nile red povrch agaru 10 μm 100 μm V povrchové zeleně zbarvené oblasti kolonie jsou aktivní transportéry mnohočetné lékové resistence
Přírodní kmeny Naše představa: Oba mechanismy se doplňují Transportéry aktivně odstraňují škodlivé látky přicházející z prostředí a extracelulární hmota zabrání jejich průniku dovnitř kolonie. Populace v kolonii se může nerušeně vyvíjet a přežívat po dlouhou dobu
METODIKY Genetické a genové manipulace Microarrays - změny exprese genomu Analýza proteinů (elektroforéza, imunodetekce, HPLC) Analýza enzymů 3 6 10 13 17 22 26 31 d Pma1p 5 12 19 d Pma1p [%] 100 90 80 70 BY4742 60 50 40 Pma1p ATPase activity 30 20 0 5 10 15 [days] 20 nmol/g wet weight 1600 1400 1200 1000 800 600 400 BY4742 sok2 ARGININE Catalase activity (U/mg) 30 25 20 15 10 5 0 cytosolic catalase Ctt1p peroxisomal catalase Cta1p Superoxide dismutase activity (U/mg) 2 1 0 cytosolic superoxide dismutase Sod1p nmol/g wet weight 200 0 0 5 10 15 20 25 30 [d] 350 BY4742 300 sok2 250 200 150 100 50 GLUTAMINE S3 S5 S7 S9 S12 S14 SF6 SF7 S19 S21 S25 S28 S32 S3 S5 S7 S9 S12 S14 SF6 SF7 S19 S21 S25 S28 S32 0 0 5 10 15 20 25 30[d] Cta1p Ctt1p Cta1p Ctt1p Sod1p nmol/g wet weight 3500 3000 2500 2000 1500 1000 BY4742 sok2 ALANINE 500 0 0 5 10 15 20 25 30[d]
METODIKY Mikrobiologické techniky Konfokální a fluorescenční mikroskopie (fluorescenční proteiny, barvení) Elektronová mikroskopie
METODIKY Speciální techniky analýzy kolonií 150 μm 500 μm
Děkuji za pozornost!