TRANSFORMATION OF CHLOROBENZOIC ACIDS BY PLANT CELLS TRANSFORMACE CHLORBENZOOVÝCH KYSELIN ROSTLINNÝMI BUŇKAMI Blanka Vrchotová 1, 2), Martina Macková 1), Jan Tříska 3), Tomáš Macek 2) 1) Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, 166 28 Praha 6, e-mail:blanka.vrchotova@vscht.cz 2) Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, 166 10 Praha 6 3) Institut systémové biologie a ekologie AV ČR, v.v.i. Branišovská 5, 370 05 České Budějovice Abstract: Chlorobenzoic acids (CBAs) can release in to the environment by using pesticides in agriculture or they are intermediate in manufacture of some drugs and colors. CBAs are also products of upper bacterial PCB degradation pathway. Degradation of CBAs depends on organisms living in contaminated area, concentration and structure of CBA. The transformation of the chlorobenzoic acids was tested using plant cells of three species cultivated in vitro. Embryogenic morphologically differentiated culture of Armoracia rusticana (horseradish), amorphous callus culture of Nicotiana tabacum (tobacco) and hairy root culture of Solanum nigrum (black nightshade). Plant cells were able to transform CBAs. Effectiveness of this process depends, similarly lake in microorganisms, on specie, number of chlorine atoms and their position in CBA molecule. Methylester and hydroxyderivate of added CBA were identified by GC-MS analysis in medium after cultivation. Possible enzymatic system responsible for formation of identified intermediates can be cytochrome P450 localized in microsomes. Microrsomes isolated by differential centrifugation were able to catalyze conversion of CBAs. Acknowledgement: The work was sponsored by the grants Centrum 1M06011and a FRVŠ 1157/2008. Keywords: Chlorobenzoic acid, metabolisation, plant cells, cytochrome P450 Abstrakt Chlorbenzoové kyseliny se mohou uvolnit do životního prostředí v důsledku použití herbicidů v zemědělství, jsou meziproduktem při výrobě některých barviv a léků. V neposlední řadě vznikají jako produkty horní bakteriální dráhy odbourávání PCB. Možnost jejich odstranění a další osud v životním prostředí závisí na jejich struktuře, koncentraci a také na organismech vyskytujících se v daném ekosystému. Metabolisace chlorbenzoových kyselin byla testována na modelu rostlinných tkáňových kultur tří rostlinných druhů pĕstovaných in vitro. Embryogenní morfologicky diferencovaná kultura křenu selského (Armoracia rusticana), kalusová kultura tabáku viržinského (Nicotiana tabacum) a diferencovaná kultura typu hairy root lilku černého (Solanum nigrum). Bylo prokázáno, že rostlinné buňky metabolisují chlorbenzoové kyseliny. Účinnost tohoto procesu je závislá podobně jako u mikroorganismů na množství a poloze chlorů v molekule chlorbenzoové kyseliny a použitém rostlinném druhu. Analýza produktů transformace rostlinnými buňkami prokázala vznik methylesteru a hydroxyderivátu přidané chlorbenzoové kyseliny.
Jedním z možných enzymů zodpovĕdných za jejich vznik je cytochrom P450 lokalizovaný v mikrosomech. Mikrosomy izolované difernciální centrifugací z biomasy lilku černého byly schopné katalyzovat přemĕnu chlorbenzoových kyselin. Úvod V minulém století s rozvojem průmyslu došlo k výrobě mnoha sloučenin, které byly uměle vytvořeny člověkem. Tyto produkty byly, díky svým fyzikálním a chemickým vlastnostem, využívány v mnoha průmyslových odvětvích. Vzhledem k širokému využití těchto chemikálií došlo k jejich nekontrolovanému uvolnění do životního prostředí, kde díky své odolnosti přetrvávají. V dnešní době území kontaminovaná xenobiotiky představují závažný problém. Mezi xenobiotika, látky vytvořené člověkem a v přírodě se přirozeně nevyskytující, patří například polychlorované bifenyly, DDT, dioxiny, dibenzofurany,tnt,tce a další. V současnosti jsou k odstraňování xenobiotik z životního prostředí nejvíce využívány fyzikálně-chemické metody. Tyto techniky znamenají vytěžení kontaminované půdy a její skládkování nebo spálení při vysoké teplotě. Celý proces je velice finančně náročný a vede k devastaci zasaženého území. Ve snaze najít méně destruktivní a levnější způsoby dekontaminace se výzkum zaměřil na možnost přeměny xenobiotik přímo na zasaženém území s využitím biologických systémů (rostlin a mikroorganismů). Některé druhy mikroorganismů a rostlin jsou schopné žít a rozmnožovat se na plochách s poměrně vysokou koncentrací xenobiotik. Bylo zjištěno, že některé z těchto organismů jsou schopné degradovat nebo akumulovat kontaminanty ve svých tkáních. Chlorbenzoové kyseliny se mohou v přírodě vyskytovat v důsledku použití herbicidů v zemědělství, jsou meziproduktem při výrobě některých barviv a léků a v neposlední řadě vznikají jako produkty horní bakteriální dráhy odbourávání polychlorovaných bifenylů. Další osud a možnost jejich odstranění z životního prostředí závisí na koncentraci, struktuře a také na organismech vyskytujících se v daném ekosystému. Bakteriální metabolismus chlorbenzoových kyselin je již poměrně dobře prostudován a popsán, v případě rostlin byla určitá pozornost věnována osudu dichlorfenoxyoctové kyseliny (herbicid), avšak metabolisace dalších chlorbenzoátů popsána nebyla. Experimentální část Jako modelový systém pro studium rostlinného metabolismu vybraných chlorbenzoových kyselin byly zvoleny rostlinné tkáňové kultury tří rostlinných druhů pěstované in vitro. Rostlinné tkáňové kultury lze pěstovat za sterilních podmínek, tedy bez vlivu dalších organismů. Důležité také je, že poznatky získané z pokusů s tkáňovými rostlinnými kulturami lze díky podobnosti detoxifikačních metabolických procesů převést na celé rostliny [1]. Jednalo se o embryogenní morfologicky diferencovanou kulturu křenu selského (Armoracia rusticana K 54), diferencovanou kulturu typu hairy root lilku černého (Solanum nigrum SNC 9O) a amorfní kalus tabáku viržinského (Nicotiana tabacum WSC 38), u kterých byla primárně prokázána schopnost degradace PCB [2]. Kultivace tkáňových rostlinných kultur probíhala při počáteční koncentraci chlorbenzoové kyseliny 200 a 50 mg/l média [3]. Na začátku pokusu bylo do 250 ml Erlenmayerovy baňky inokulováno 5 g rostlinné tkáňové kultury a pěstováno při 24 C a 110 ot/min. Po třídenní předkultivaci byla do média přidána chlorbenzoová kyselina (do výsledné koncentrace 200 mg/l nebo 50 mg/l) a kultivace probíhala 14 dní při 24 C a 110 ot/min. Baňky s kulturami, které byly připraveny a kultivovány stejně, jen před přidáním chlorbenzoové kyseliny byly 20 minut povařeny na vodní lázni, sloužily jako kontrola při měření úbytku chlorbenzoové kyseliny v médiu a koncentrace v biomase.
2,4,6 tri CBA 2,3,5 tri CBA 3,5 di CBA 3,4 di CBA 2,6 di CBA 2,5 di CBA 2,4 di CBA 2,3 di CBA 4 CBA 3 CBA 2 CBA Jako kontrola pro srovnání nárůstu biomasy sloužily kultury pěstované za stejných podmínek bez přídavku chlorbenzoové kyseliny. Pravidelně byly odebírány vzorky média (1,5 ml), odstředěny při 11 000xg a v supernatantu byla měřena koncentrace chlorbenzoové kyseliny pomocí HPLC s DAD detektorem (HP 1100, USA). Eluce byla prováděna izokraticky na koloně Phenomenex LUNA C18(2) (150 mm x 2,00 mm x 5μm). Pro měření byl použit průtok mobilní faze 0,4 ml/min o složení methanol: voda s obsahem 1% (v/v) H 3 PO 4 v objemovém poměru 60:40 pro trichlorbenzoové a 55:45 pro dichlorbenzoové a monochlorbenzoové kyseliny. Typ a koncentrace chlorbenzoové kyseliny byly určovány při λ = 205 nm na základě srovnání retenčních časů a ploch píků odpovídajících příslušné chlorbenzoové kyselině s hodnotami kalibrační křivky. Ta byla sestrojena na základě měření koncentrace kalibračních roztoků příslušné chlorbenzoové kyseliny. Pro měření koncentrace chlorbenzoové kyseliny v rostlinné biomase byla použita biomasa z jedné baňky. Biomasa byla zvážena, promyta destilovanou vodou, homogenizována v tekutém dusíku, extrahována do metanolu, odstředěna (11 000xg) a zbytková koncentrace chlorbenzoátů v supernatantu byla měřena na HPLC s DAD detektorem za stejných podmínek jako vzorky média. Dále byly zjišťovány produkty v médiu a v biomase po kultivaci tkáňové rostlinné kultury s chlorbenzoovou kyselinou. V další části práce byly pomocí GC-MS identifikovány produkty rostlinného metabolismu chlorbenzoových kyselin v médiu a v rostlinné biomase po čtrnáctidenní kultivaci rostlinné tkáňové kultury s chlorbenzoovou kyselinou. Výsledky: Chlorbenzoové kyseliny byly rostlinnými tkáňovými kulturami metabolisovány s různou účinností v závislosti na rostlinném druhu, počáteční koncentraci chlorbenzoové kyseliny, poloze a počtu chlorů v molekule chlorbenzoové kyseliny. Tab 1 Procenta zůstatku chlorbenzoových kyselin v médiu při počáteční koncentraci 200 mg/l po 14 dnech kultivace. CBA chlorbenzoová kyselina, K 54 - křen selský (Armoracia rusticana), SNC 9O - lilek černý (Solanum nigrum), WSC 38 - tabák viržinský (Nicotiana tabacum) Zůstatek při počáteční koncentraci 200 mg/l po 14 dnech kultivace [%] K-54 5 ± 3 90 ± 3 82 ± 3 77 ± 5 65 ± 2 77 ± 5 66 ± 10 93 ± 3 92 ± 6 95 ± 7 90 ± 2 SNC 90 13 ± 5 91 ± 8 99 ± 6 58 ± 10 61 ± 10 65 ± 8 80 ± 5 89 ± 12 95 ± 12 88 ± 11 95 ± 2 WSC 38 88 ± 7 95 ± 6 94 ± 5 99 ± 6 79 ± 9 85 ± 4 98 ± 2 98 ± 6 100 ± 5 96 ± 9 99 ± 3
2,4,6 tri CBA 2,3,5 tri CBA 3,5 di CBA 3,4 di CBA 2,6 di CBA 2,5 di CBA 2,4 di CBA 2,3 di CBA 4 CBA 3 CBA 2 CBA Nejmenší schopnost transformace chlorbenzoových kyselin prokázala tkáňová kultura tabáku viržinského (tab 1), oproti nim buňky lilku černého prokázaly nejvyšší aktivitu ze zkoumaných druhů s mono a dichlorbenzoovými kyselinami. Při počáteční koncentraci 50 mg/l došlo při kultivaci s 2-,3-,4-, 2,3-di a 2,5-dichlorbenzoovou kyselinou k jejich úplnému vymizení z média (tab 2). Tab 2 Procenta zůstatku chlorbenzoových kyselin v médiu při počáteční koncentraci 50 mg/l po 14 dnech kultivace. CBA chlorbenzoová kyselina, K 54 - křen selský (Armoracia rusticana), SNC 9O - lilek černý (Solanum nigrum), WSC 38 - tabák viržinský (Nicotiana tabacum) Zůstatek při počáteční koncentraci 50 mg/l po 14 dnech kultivace [%] K-54 0 ± 0 76 ± 1 41 ± 9 8 ± 2 2 ± 1 4 ± 2 65 ± 8 76 ± 4 74 ± 1 57 ± 4 36 ± 4 SNC 90 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 1 0 ± 1 2 ± 2 0 ± 1 68 ± 3 86 ± 4 99 ± 2 6 ± 1 88 ± 1 Tkáňové kultury prokázaly různou účinnost při metabolizaci chlorbenzoových kyselin (obr. 1). 2-chlorbenzoová kyselina byla rostlinnou tkáňovou kulturou křene selského z média plně zmetabolisována v devátém dni, v rostlinné biomase byla maximální koncentrace v prvním dni kultivace a po čtrnáctidenní kultivaci byla koncentrace chlorbenzoové kyseliny 0,03 µg na gram biomasy. Obr. 1 Závislost koncentrace 2-, 2,5 di- a 2,3,5-trichlorbenzoové kyseliny v mediu a biomase tkáňové kultury lilku černého a křene selského na době kultivace při počáteční koncentraci chlorbenzoové kyaseliny 50 mg/l
Oproti tomu při kultivaci s tkáňovou kulturou lilku černého byla nulová koncentrace 2-chlorbenzoové kyseliny už ve třetím dni kultivace. V tomto dni byla také maximální koncentrace chlorbenzoové kyseliny v rostlinné biomase. U 2,5-dichlorbenzoové kyseliny byl pozorován podobný efekt. Metabolisace tkáňovou kulturou lilku černého byla rychlejší než kulturou křenu selského. Při kultivaci tkáňové kultury s 2,3,5-trichlorbenzoovou kyselinou došlo k úplné metabolisaci kyseliny jen u kultivace s lilkem černým. Při kultivaci s křenem selským došlo k poklesu z počáteční koncentrace 50 mg/l na 21,6 mg/l.
V médiu po kultivaci 2,3-dichlorbenzoové kyseliny a 2,4-dichlorbenzoové kyseliny s kulturou lilku černého byl identifikován methylester těchto kyselin a v rostlinné biomase po kultivaci s 2,5- dichlorbenzoovou kyselinou byl vedle 2,5-dichlorbenzoové kyseliny identifikován hydroxyderivát dichlorbenzoové kyseliny. Poděkování Tato práce byla financována z grantů Centrum 1M06011 a FRVŠ 1157/2008, GACR 203/06/0563 a MSM 6046137305. Použitá literatura [1] ESTIME, L., RIER, J. P. (2001): Disappearance of polychlorinated biphenyls (PCBs) when incubated with tissue cultures of different plant species. Buletin of Contamination and Toxicology 66: 671-677 [2] MACKOVÁ, M., MACEK, T., OTČENÁŠKOVÁ, J., BURKHARD, J., DEMNEROVÁ, K., PAZLAROVÁ, J. (1997): Biodegradation of polychlorinated biphenyls by plant cells. International Biodeterioration and Biodegradation 39/4: 317-325 [3] MURASHIGE, T., SKOOG, S. (1962): Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497