I. Blok - fluorescenční metody

Fluorescenční a radioizotopové metody v mikrobiální ekologii I. Blok - fluorescenční metody 1. P: Fluorescenční mikroskopie, její použití v limnologii, pojem primární a sekundární fluorescence, specifická vazba fluorochromů C: Příprava preparátů s nízkou fluorescencí pozadí, rozlišení chlorofylu v buňkách mikroorganismů. 2. P: Barvení fluorochromy, které se vážou na DNA, rozlišení mikroorganismů na prokaryota a eukaryota. C: Barvení DAPI (zvýraznění DNA a jader mikroorganismů) 3. P: Využití vícenásobného diferenciálního barvení fluorochromy v mikrobiální ekologii, modelový systém predátor-kořist. C: Barvení bakterií DTAF, dobarvení prvoků DAPI, stanovení rychlostí vyžírání bakterií prvoky. Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Fluorochromy Akridinová oranž (AO) - váže se na bílkoviny, RNA, DNA - excitační vlnová délka kolem 470 nm - emitované paprsky ve vlnová délce 530-650 nm, žlutozelená ažčervená DTAF [ 5-(4, 6-dichlorotriazin dichlorotriazin-2-yl) yl)-aminofluorescein] - váže se především na bílkoviny - excitační a emisní parametry velmi podobné AO - používáno pro fluorescenční značení bakteriální kořisti pohlcované fagotrofními prvoky DAPI (4,6-diamidino diamidino-2-phenyl indole) - excitační vlnová délka 360 nm - emitované paprsky kolem 490-500 nm, emitované světlo je modré - váže se především na DNA, barví jádra Primulin - excitační a emisní parametry podobné DAPI, emitované světlo v rozmezí od bílé přes žlutou a zelenou k modré - používán k počítání prvoků a ke zvýraznění jejich povrchových struktur Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Fluorescenční mikroskopie - lokalizace fluoreskujících látek nebo objektů v biologických preparátech PRINCIP - při osvětlení preparátu ultrafialovým nebo modrofialovým světlem (obecně světlem s převahou krátkých vlnových délek ) a) PRIMÁRNÍ = přirozená fluorescence, autofluorescence příklad: chlorofyl a b) SEKUNDÁRNÍ fluorescence, vyvolaná zabarvením speciálními barvivy tzv. fluorochromy - jestliže na ně posvítíme urč. vlnovou délkou, začnou fluoreskovat, váží se specificky na různé buněčné komponenty Světlo, kterým působíme - excitační vlnová délka, vyvolaná fluorescence - emisní vlnová délka (nebo spektrum) Podle směru excitačního světla 1. v procházejícím světle 2. EPIFLUORESCENCE - dopadající excitační paprsek shora, odražený (emisní) již s jinou vlnovou délkou Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Odražené světlo Procházející světlo Epifluorescence

Epifluorescence

Epifluorescence Viry Bakterie Prvoci - řasy Vířníci (0,1 100 µm)

Detritus Bacteria Microbial loop Bacteria Microbial food webs

Phototrophic bacteria 0-10 6 cells ml -1 Mikrobes in 1 ml of lake water Viruses 10 4-10 9 ml -1 Cyanobacteria 0-10 5 cells ml -1 Algae 10 2-10 4 cells ml -1 1 ml ~ 1 cm 3 Hetero- and mixotrophic flagellates 10 2-10 4 cells ml -1 Heterotrophic bacteria 10 5-10 8 cells ml -1 Hetero- and mixotrophic ciliates 0-10 4 cells ml -1

Bakterie Heterotrofní bičíkovci Pikosinice Zelení bičíkovci DAPI Zelené řasy a sinice Heterotrofní nálevníci Mixotrofní nálevníci

normální bakterioplankton (Římov) 1999 J. Nedoma 10 µm

Roklanské j. (Rachelsee, 7.9.99) 1999 J. Nedoma 20 µm

Plešné j. (6.9.99) 1999 J. Nedoma 20 µm

Prášilské j. (9.9.99) 1999 J. Nedoma 20 µm

Fluorescently labeled bacteria - FLB Tracer - 5-15% of total bacteria Dinobryon sp. Pelagostrombidium falax Ochromonas Taxon-specific uptake rates Colonial HNF

Halteria sp. Pelogohalteria viridis Attached flagellates Stylonichia sp.

Přehrada Římov, 14.6. 2000 Tracer = 14.6 % Time = 30 min 5 µm 10 µm Salpingoeca sp.

Attached choanoflagellates - Salpingoeca 10 µm

Halteria sp. Halteria sp. Pelogohalteria viridis Pelagotrombidium falax Cyclidium glaucoma Rimostrombidium brachykinetum

Cinetochylum Uptake of Synechococcus Coleps sp.

Rozvoj vláken odolných vůči predaci prvoků 0 h 24 h 48 h

LOW FISHSTOCK HIGH i i i i i i i i i i i i i i i i i Bacteria i i i i i i

Characteristické rysy predace prvoků na bakteriích 1. Selekce větších bakteriálních buněk - přednostně pohlcují větší, dělící se buňky SELEKCE 2. Rozvoj populací bakterií odolných vůči predaci i ii ii i i i i i i i i i ii i i 3. Predace prvoků na bakteriích a bakt. produkce positivně korelovány - vysoká růstová rychlost nebo aktivita vztažená na buňku za situace intenzivního žíru bakterií prvoky

Substrát Neaktivní buňky Velká biomasa Nízká aktivita! Malá biomasa Malá Vysoká aktivita!

1. Laboratorní orní studie Kontinuální kultivace bakterií s prvoky s různou potravní specializací 2. Terénní pokusy Pokusy in situ v dialyzačních pytlích - různě manipulovaná planktonní společenstva pomocí velikostní frakcionace vzorků (nádrž Římov)

Light Continuous flow system Stage - I Rhodomonas sp. exudates Inorganic P-limited medium + accompanying bacteria II / Control II / Bodo II / Urotricha Bacterivory Algivory

15 12 9 6 3 0 15 12 9 6 3 0 15 Bacteria 1.2 10 6 bacteria ml -1 10 6 bacteria ml -1 10 6 bacteria ml -1 Bact. cell volume (µm 3 ) Stage-I Bact. cell vol. Bodo - TGR 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1.2 Bact. cell volume (µm 3 ) II / Control 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Bact. cell vol. (µm 3 ) TGR (10 6 bact. ml -1 h -1 ) 12 9 6 3 0 15 12 9 6 3 0 0 2 4 6 8 10 12 days II / Bodo 2.1 1.8 1.5 Bodo 1.2 Large filaments 0.9 5 10 6 bacteria ml -1 10 4 Bodo ml -1 10 2 Urotricha ml -1 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 days 0.6 0.3 0.0 1.2 Bact. cell volume (µm 3 ) II / Urotricha 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 BET-proteobact.

Epifluorescence a analýza obrazu Vlákna (objemy a biomasy)

Ribozómy (2 podjednotky) Molekuly RNA Oligonukleotidové Sondy / Próby Úseky konzervativní 70 S 30 S 50 S Úseky specifické pro skupiny nebo druhy bakterií 16 S 23 S 5 S C G A T C A A T T G C G A C A............................................. G C T A G T T A A C G C T G T Funkce - závisí na počtu ribozómů Fluorochrom

DAPI Betaproteobacteria Overlay Bacterioplankton at the beginning of the experiment

Alpha-Proteobacteria Beta-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria Inoculation % of DAPI-stained bacteria 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 Stage-I II / Control 1 2 3 4 5 6 8 10 12 Days II / Bodo II / Urotricha 1 2 3 4 5 6 8 10 12 Days

Hybridized in food vacuoles Bodo abundance [*10 5 ml -1 ] 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 with ingested Alpha-Proteobacteria with ingested Beta-Proteobacteria 1 2 3 4 5 6 8 10 12 Days

Low quality food???? Cell-wall properties BET ALF Growth rate Predation Filament formation BET

Top-down manipulační pokus v dialyzačních pytlích, Římov Velikostní frakcionace (triplikáty) < 0.8 µm < 5 µm Nefiltrov. Bakterie & viry Bakterie, viry a bičíkovci Nefiltrovaná kontrola Inkubace: 4 dny Vzorkování: 0, 24, 48, 72, a 96 hodin

Nejnápadnější dopady pokusných manipulací: < 5 µm varianta = zvýšená predace prvoků, ZOOPLANKTON PREDACE Bakteriální produkce a změny morfologie Složení bakteriálního společenstva

< 0.8 µm < 5 µm Reservoir 0 24 48 72 96 0.0 50 Ciliates ml -1 10 3 HNF ml -1 12 10 0.4 40 30 20 10 Bacterial production Total grazing rate [10 6 bacteria ml -1 d -1 ] Mean cell volume [µm 3 ] 14 12 10 8 6 4 2 0 8 6 4 2 0 Bacterial abundance Bact. cell volume 0.3 0.2 0.1 0 24 48 72 96 Time [hours] 0 24 48 72 96 Time [hours] 0 24 48 72 96 Time [hours] 0 HNF Ciliates Bacterial production HNF - total grazing Ciliates - total grazing 10 6 bacteria ml -1

< 0.8 µm < 5 µm Reservoir 50 40 BET42a R-BT065 CF319a 30 % DAPI stained cells 20 10 0 5 4 3 2 1 90 80 GAM42a EUB338 70 0 24 48 72 96 Time (hours) 0 24 48 72 96 Time (hours) 0 24 48 72 96 Time (hours)

DAPI Beta-Proteobacteria Overlay Bakterioplankton na začátku pokusu T = 0 h

DAPI Beta-Proteobacteria 96 hodin Typická struktura vloček ve variantě < 5 µm Overlay

DAPI R-FL615 10 µm Flectobacillus cluster 72 hodin Overlay Vlákna odolná vůči predaci prvoků (< 5 µm varianta)

DAPI CF 72 hours Overlay Morphotypes of CF in grazing-resistant flocs (< 5 µm treatment)

Bacteriální buňky hybridizované přímo v potrav. Vakuolách prvoků Cyclidium glaucoma Beta-proteobacteria Bodo saltans Bodo saltans

Bakteriální buňky hybridizované přímo v potravních vakuolách bičíkovců (CARD-FISH protokol) Příklad buňky hybridizované se sondou R-BT065 častou kořistí bičíkovců v nádrži R-BT065 5 µm Naopak GRAM+ Actinobacteria negativněně selektovány bičíkovci

Přehrada Římov - vliv bakteriofágů SYBRGreen barvení TEM VIRY hostitelsky specifické Virové částice Vysoce pravděpodobný vliv na složení společenstev bakterií Podíl viditelně infikovaných bakteriálních buňek - možnost stanovit mortalitu bakterií způsobenou viry

24-36 h Selektivní predace Host-specifické viry Killing the winner (Thingstad and Lignell 1997)

Mikroautoradiografie 3 H-substrát Filtrace Bakterie Fotoemulze Expozice ve tmě Vyvolání

Mikroautoradiografie Jednotlivé buňky nebo shluky bakterií Autoradiografické stopy Bakterie přisedlé na řasách Spirilum

The composed image of microautoradiography and CARD- FISH created by image analysis (top panel). The composition consists of three images, which are shown bellow. The DAPI- and probe-images (GAM) were used to determine the relative abundance of different bacterial groups, while the proportion of bacteria taking up leucine were determined as the % of bacteria connected with black spots formed by silver grains. DAPI probe grains % of probe-defined groups of bacteria % of bacteria taking up leucine

R-BT065 Mikroautoradiografie & CARD-FISH - příjem leucinu ve variantě se zvýšenou predací prvoků na bakteriích (<5 µm) T = 0 h T = 72 h Buňky hybridizované se sondou R-BT065 - vzestup jejich relativního podílu ve společenstvu Velký růstový potenciál! - nárůst % aktivních buněk (R-BT065), > 95% aktivních při intenzivní predaci prvoky Velmi aktivní skupina!

Metody analýzy obrazu - rychlé kvantitativní stanovení organismů - rychlé proměření vybraných parametrů populace - délka, šířka, objem - stanovení obsahu určitých látek DNA vztah k rychlosti růstu RNA - vztah k proteosyntéze - kvantifikace síly fluorescenčního signálu - třídění populace podle aktivitního parametru Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Další využití fluorescenční mikroskopie - v kombinaci s analýzou obrazu přesné stanovení biomasy mikroorganismů < 1µm - imunofluorescence - genetické próby část molekuly RNA komplementární s určitým úsekem RNA na ribosomu bakterií. - enzymatické aktivity individuální buněk (řas a bakterií) Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Plešné j. (8.6.99) P limitace (Al) aktivní extracelulární fosfatázy (ELF 97 fosfát) 1999 J. Nedoma 10 µm

Plešné jezero (9.10.00) 2000 A. Štrojsová 50µm Autofluorescence fytoplanktonu, aktivní extracel. fosfatázy

ELF 97 phosphate ~ detects active phosphatase sites & phytoplankton autofluorescence @LUCIA at a species-specific level Cryptomonas Peridinium Bacterial filaments Gymnodinium Ceratium Elakatothrix Pediastrum Chlorogonium Fragillaria Cosmarium Staurastrum

ELF 97 phosphate ~ detects active phosphatase sites & phytoplankton autofluorescence @LUCIA at a population level Elakatothrix Eudorina

Cell-specific phosphatase activity measurement Brightness of ELF precipitates 4 3 2 1 0 with the image analysis system LUCIA Chlorogonium fusiforme 25 Jun 2001 736 fmol cell -1 h -1 0 5 10 15 20 25 30 min Peridinium umbonatum 1 Nov 2000 72 fmol cell -1 h -1