Adhese a růst lidských kostních buněk v kulturách na vrstvách fullerenů C 60

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Adhese a růst lidských kostních buněk v kulturách na vrstvách fullerenů C 60"

Dominik Radovan Prokop
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Adhese a růst lidských kostních buněk v kulturách na vrstvách fullerenů C 60 Lucie Bačáková, Lubica Grausová Fyziologický ústav AVČR, Praha Jiří Vacík Ústav jaderné fyziky AVČR, Řež u Prahy Václav Švorčík Vysoká škola chemicko-technologická, Praha Alexander Kromka Fyzikální ústav AVČR

Jiří Vacík Ústav jaderné fyziky AVČR, Řež u Prahy Václav Švorčík Vysoká

2 Fyziologický ústav Akademie věd ČR Odd. růstu a diferenciace buněčných populací Vídeňská Praha 4 - Krč Tel: , 2523, 2572 Fax: lucy@biomed.cas.cz

1083 142 20 Praha 4 - Krč Tel: +420 2 9644 2521,

3 Laboratoř buněčných kultur Samostatná místnost pro přípravu buněčných kultur Box s laminárním prouděním vzduchu a UV světlem Nádobky na kultivaci buněk Inkubátor (37 o C, 5% CO 2 ) Kultivační médium Laminární box Cytosafe pro práci s nanočásticemi

světlem Nádobky na kultivaci buněk Inkubátor (37 o C, 5% CO 2

4 Laboratoř buněčných kultur Horkovzdušný sterilizátor a autokláv Analyzátor počtu a životaschopnosti buněk Inverzní mikroskop s fluorescencí, digitální kamerou a analýzou obrazu

5 Metodika buněčných kultur Založení explantační metodou Založení enzymatickou disociací 2. den po nasazení (obj. 10x) 1. den po nasazení (obj. 10x) 7. den po nasazení: monolayer i multilayer, tzv. kopce a údolí (obj. 20x) 7. den po nasazení: konfluentní monolayer, dlaždicovitá morfologie (obj. 20x) Hladké svalové buňky aorty potkana Cévní endotelové buňky

den po nasazení: monolayer i multilayer, tzv. kopce a údolí (obj. 20x) 7.

6 Laboratoř imunocytochemie Imunofluorescenční barvení & Enzymatická imunosorbentní esej (ELISA) Imunofluorescence talinu, proteinu fokálních adhesí, jádra dobarvena propidium iodidem ELISA Reader Victor Absorbance (% of the value on PS) Imunofluorescence cytoskeletárního proteinu β-aktinu, jádra dobarvena barvivem Hoechst Vinculin PS TER 2S 4S 6S 8S ELISA vinkulinu, proteinu fokálních adhesí, v kostních buňkách na kompozitech polymeruhlíkové nanotuby *

Imunofluorescence cytoskeletárního proteinu β-aktinu, jádra dobarvena barvivem Hoechst 33342 200 180 160 140 120 100 80 60

7 Deposice vrstev fullerenů C 60 Kulatá mikroskopická krycí skla, Menzel Glaser, Německo Průměr 12 mm Vakuový deposiční systém Univex 300 ÚJF AVČR, Řež u Prahy Kontinuální vrstvy Tenká: 505 ± 43 nm Tlustá: 1090 ± 8 nm Mikrostrukturované vrstvy (deponované přes kovovou mřížku) Tloušťka pod oky mřížky: 484 ± 5 nm Tloušťka pod kovovými přepážkami: 158 ± 5 nm (Měřeno pomocí AFM na VŠCHT)

43 nm Tlustá: 1090 ± 8 nm Mikrostrukturované vrstvy (deponované přes kovovou mřížku) Tloušťka

8 Morfologie mikrostrukturovaných vrstev fullerenů 100 µm Kovová mřížka a odpovídající měřítko, ÚJF AVČR Optická mikroskopie, VŠCHT Praha 484±5 nm 158±5 nm Světelná mikroskopie, FgÚ AVČR, Cca 125 x 105 mikrometrů = analysa obrazu Tescan Atlas µm ± 500 µm 2, vzdálenost 50 µm

nm 158±5 nm Světelná mikroskopie, FgÚ AVČR, Cca 125 x 105 mikrometrů =

9 Morfologie lidských kostních buněk na fullerenových vrstvách Kontinuální, 505±43 nm Polystyrenová kultivační miska Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm Mikroskopické krycí sklo Kontinuální, 1090 ± 8 nm Buněčná linie MG 63 Nativní kultury v médiu DMEM+10% FTS 5. den po nasazení Inversní mikroskop Olympus IX 50, obj. 20x Digitální kamera DP 70

krycí sklo Kontinuální, 1090 ± 8 nm Buněčná linie MG 63 Nativní kultury v médiu

10 Kinetika růstu lidských kostních buněk na fullerenových vrstvách Log cell number / cm Growth curves of MG 63 cells Days after seeding Polystyrene Glass Full_thin Full_domains Full_thick

10000 1000 Growth curves of MG 63 cells 0 1 2 3 4 5 6

11 Lidské kostní buňky na mikrostrukturovaných fullerenových vrstvách % of domain area or cell number Colonization of fullerene domains by MG 63 cells Day 1 Day 3 Day 5

12 Imunofluorescenceβ 1 -integrinových adhesních receptorů Lidské kostní buňky linie MG den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm Kontinuální, 1090 ± 8 nm Inversní mikroskop Olympus IX 50 Obj. 20x Digitální kamera DP 70 Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm Mikroskopické krycí sklo

den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm Kontinuální,

13 Imunofluorescence cytoskeletárního proteinu β-aktinu v lidských kostních buňkách linie MG 63 Kontinuální, 505 ± 43 nm (obj. 20x) Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158 ± 5 nm Kontinuální, 1090 ± 8 nm Mikrostrukturovaná vrstva, obj. 100x

14 Imunofluorescence osteopontinu, markeru osteogenní diferenciace Lidské kostní buňky linie MG den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm Kontinuální, 1090 ± 8 nm Inversní mikroskop Olympus IX 50 Obj. 10x Digitální kamera DP 70 Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm Mikroskopické krycí sklo

den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm Kontinuální, 1090

15 Smáčivost fullerenových vrstev Kontaktní úhel vodní kapky: Kontinuální vrstva tenká (505 ± 43 nm): 100,6 ± 6,8 Kontinuální vrstva tlustá: (1090 ± 8 nm): 96,7 ± 1,7 Mikrostrukturovaná vrstva (484 ± 5 a 158 ± 5 nm): 95,3 ± 3,1 (Měřeno na Fyzikálním ústavu AVČR, dr. A. Kromka) Surface Energy Evaluation System (SEE System), vyroben na Masarykově universitě, Brno, máme na FgÚ AVČR

vrstva (484 ± 5 a 158 ± 5 nm): 95,3 ± 3,1 (Měřeno na Fyzikálním ústavu AV

16 Shrnutí Vrstvy fullerenů C 60 podporovaly adhesi a růst lidských kostních buněk linie MG 63 v míře podobné jako na standardních kultivačních površích (sklo, polystyren) Bylo tomu tak i přes relativně vysokou hydrofobicitu povrchu Zřejmě se příznivě uplatnila nanostruktura povrchu i jeho určitá pohyblivost způsobená migrací fullerenů Postupné mizení mikrostruktury povrchu titititititiititititititititititititititititititititititi titititititititititititititititititititititititititititit ititititititititititititiitiitititititititititititittitii ttiittiitititittitiittitiiititititititititiiiitittiitititi iitiiitittitititititititititititititititititititititititi titititititititititititititititititititititititititititit it

mikrostruktury povrchu titititititiititititititititititititititititititititititi titititititititititititititititititititititititititititit

17 The papers presented at NanoSMat07 will be selected to publish in a special issue of JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY (American Scientific Publishers). Impact factor 1.932

18 Dynamický průtokový kultivační systém Pumpa Reservoáry média Firma Oligene GmbH (nyní Provitro GmbH), Berlin Manipulace se systémem v laminárním boxu Komora se vzorkem materiálu a buněk Tube chamber pro tubulární struktury (cévní náhrady) Pumpa a Flow chamber pro planární vzorky

laminárním boxu Komora se vzorkem materiálu a buněk Tube chamber pro

19 Dynamický průtokový kultivační systém, Oligene, Německo - pokračování Perfusion chamber pro 3D porézní vzorky či vzorky ve formě prostorových sítí ( scaffolds ) Dynamický rotační kultivační systém, Synthecon, Lucembursko

vzorky či vzorky ve formě prostorových sítí (

porézní PLGA scaffold porézní Cévní endotelové buňky na

20 Dynamická kultivace a konfokální mikroskopie Lidské kostní buňky linie MG 63 na: PLGA scaffold vláknitý PLGA scaffold porézní PLGA scaffold porézní Cévní endotelové buňky na klinicky užívaných cévních náhradách Laserový konfokální mikroskop Leica

21 Tým Oddělení růstu a diferenciace buněčných populací Doc. MUDr. Vladislav Mareš, DrSc. Mgr. Martin Pařízek Mgr. Elena Filová Věra Lisá, prom. biol. MUDr. Jaroslav Chlupáč Doc. MUDr. Vladislav Mareš, DrSc. MUDr. Lucie Bačáková, CSc. Barbora Vagaská MUDr. Jaroslav Chlupáč Ivana Zajanová Ľubica Ľubica Grausová Grausová Mgr. Elena Filová Ivana Zajanová Mgr. Martin Pařízek Věra Lisá, prom biol. MUDr. Lucie Bačáková, CSc.

22 (Králík Šešulka, náš maskot)

Podobné dokumenty

1 Popis vzorku. 2 Detekční limit vyšetření. 3 Časová náročnost. 4 Zpracování vzorku. 4.1 Množství vzorku. 4.2 Odběr vzorků.

1 Popis vzorku. 2 Detekční limit vyšetření. 3 Časová náročnost. 4 Zpracování vzorku. 4.1 Množství vzorku. 4.2 Odběr vzorků. 1 Popis vzorku Podle tohoto postupu se vyšetřují vzorky různých druhů masných výrobků, ale také strojně odděleného masa. Pomocí histochemického barvení lze prokázat přítomnost kostních úlomků a na jejich