Základní principy transgenoze rostlin a její využit ití pro produkci nových odrůd Doc. RNDr. Jindřich ich Bříza, B CSc. BC AV ČR, v.v.i. a PřF JU České Budějovice
Šlechtění rostlin v neolitu umělý výběr na výsev používána semena z nejlepší ších rostlin na konci 17. st. (po poznání pohlavnosti rostlin) přibyla p druhá metoda křížení ve 20. st. pak mutační šlechtění,, využit ití tkáňových kultur a nakonec genové inženýrstv enýrství nástroje gen. inženýrstv enýrství - molekulárn rní mapování (umožň žňuje přesnp esně sledovat přenos mol. znaku v zastoupení nepřesn esně sledovatelného znaku např.. odolnosti vůčv ůči houb.. onemocnění) - transgenoze (vnáš ášení klonovaných genů do rostlinného genomu)
Šlechtění rostlin na základz kladě charakteru použit ité DNA lze rozčlenit genetické modifikace na několik n typů: i) xenogenní modifikace do rostl. genomu včleněna na syntetická DNA ii) transgenní modifikace do genomu včleněna na DNA pocházej zející z různých r často fylogeneticky velmi vzdálených druhů iii) intragenní modifikace do genomu vložen gen pocházej zející ze stejného rostlinného druhu, ale ostatní sekvence (promotor, terminátor) tor) pocházej zejí z druhů jiných, ale navzájem křižitelnýchitelných iv) cisgenní modifikace do genomu integrován n gen (kóduj dující sekvence včetnv etně jejich nativních regul. sekvencí) ) ze stejného druhu nebo druhu křižitelného
Agrobacterium tumefaciens nepřímá metoda prostřednictv ednictvím m bakterií rodu Agrobacterium přímá metoda prostřednictv ednictvím m DNA 1) Bakterie Agrobacterium tumefaciens - několik druhů půdních bakterií indukuje morfogenetické změny rostlin (rody Agrobacterium, Rhizobium, Bradyrhizobium a Azorhizobium) - bakterie rodu Rhizobium, Bradyrhizobium a Azorhizobium přeměněné v bakteroidy se stávaj vají trvalou součást stí pletiv kořenových hlízek leguminózn zních rostlin - u rodu Agrobacterium však bylo prokázáno, že e bakterie vnáš ášejí své specifické geny aža do rostlinného genomu
Agrobacterium tumefaciens - vnáš ášené geny jsou lokalizovány na bakt. plazmidu nazývaném m Ti (tumor inducing), přenp enášená část plazmidu se označuje jako T-DNA T (transferred( DNA)
Agrobacterium tumefaciens - T-DNA plazmidu Ti přinp ináší do rostl. buněk: i) geny pro nové cesty biosyntézy auxinů a cytokininů (dochází tím m k dediferenciaci rostl. buněk, takže transformovaná pletiva rostou jako nediferencované nádory - crown galls)
Agrobacterium tumefaciens ii) geny pro syntézu nádorovn dorově specifických látek l opinů případně agrocinopinů (ty slouží pro příslup slušný typ bakterií jako zdroj C, N případně P a energie; jsou vylučov ovány do okolních netransformovaných pletin a do půdy) p - zákl. typy Ti plazmidů jsou oktopinový a nopalinový,, další šími pak leucinamopinový, sukcinamopinový a kukumopinový
Agrobacterium tumefaciens rod Agrobacterium má tyto druhy: i) A. tumefaciens (infikuje několik n stovek převp evážně dvoudělo ložných druhů rostlin) ii) A. rhizogenes iii) A. rubi (způsobuje cane galls na maliníku) iv) A. vitis (infikuje vinnou révu) r v) A. radiobacter (nevirulentní,, někdy n za druh nepovažov ován) Prvním m krokem zachycení buněk A. tumefaciens na rostl. buňkách je navázání bakterií prostřednictv ednictvím m specifických bakteriáln lních receptorů typu vitronektinů.. Ty jsou kódovk dovány geny chva, chvb, psca, exoc a att umíst stěnými na bakt. chromosomu.
Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid má dva úseky nezbytné pro indukci nádorn dorů: i) T-DNA (vstupuje do rostl. buněk, geny pro vlastní integraci do hostitelské DNA nemá) ii) úsek virulence (vir oblast; obsahuje geny vedoucí k přenosu T-DNA T do rostl. buněk k a její integraci do genomu rostliny) Vir oblast mám délku 35 kb a je tvořena minimáln lně 8 operony vira, virb, virc, virg, vird, vire, virf a virh,, jež kódují zhruba 35 polypeptidů Přenos T-DNA T do rostl. buněk k indukují fenolické látky typu acetosyringonu (mj. acetovanilon, kys. sinapová, kys. lysergová, katechol, kys. ferulová). Tyto látky l jsou produkovány poraněnými nými buňkami většiny v dvoudělo ložných rostlin, ne však v buňkami většiny v rostlin jednodělo ložných.
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens Přenos T-DNA T začíná od pravé hraniční 25 bp sekvence, kde mezi 3. a 4. bázíb vznikne zlom v dolním řetězci T-DNA, T a to činností VirD1-VirD2 VirD2 endonukleázov zového komplexu. Do rostl. buňky přechp echází T-DNA v jednořet etězcové formě (T- strand) ) s navázanou molekulou VirD2 na 5` konci a asociovanými molekulami VirE2 po celé své délce (T- komplex).
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens Současn asné znalosti o integraci T-DNA T jsou spojeny do tohoto modelu: i) T-DNA T je zbavena asociovaných proteinů a je konvertována na do dvouřet etězcové molekuly replikačními nástroji hostitelské buňky ii) ) proteiny reparace DSB (Ku70, Ku80 aj.) interagují s dvouřet etězcovou DNA a asistují při i jejím m směrov rování k dvouřet etězcovým zlomům m hostitelského genomu iii) ) v tomto stádiu můžm ůže e zřejmz ejmě také docházet ke spojování několika molekul T-DNA T vedoucí nakonec k mnohačetn etné inserci T-DNAT iv) ) T-DNA T nacházej zející se v místm stě DSB hostitelské buňky je spojena s rostl. genomem ligázovým reparačním komplexem
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens T-DNA plasmidu Ti - nopalinová z jediného úseku - oktopinová z levé a pravé části s meziúsekem sekem,, jenž neobsahuje žádné geny a vstupuje do rostl. genomu fakultativně
Agrobacterium tumefaciens - společné geny T-DNA T nopalinových a oktopinových plazmidů Ti tvoří tzv. jádro j (core( core) ) T-DNAT - u oktopinových plazmidů je jádro j tvořeno levým úsekem T-T DNA (T L -DNA) - geny očíslovo slovány podle velikosti jimi kódovank dované mrna Gen 1 (iaam)) kódujek tryptofanmonooxygenázu pro první stupeň nové biosyntetické dráhy auxinů Gen 2 (iaah)) kóduje k indolylacetamidhydrolázu pro druhý stupeň nové syntézy auxinů Gen 3 (ocs)) kóduje k oktopinsyntázu pro syntézu oktopinu z argininu a pyruvátu Gen 4 (ipt)) kóduje k izopentenyltransferázu zu pro první stupeň syntézy cytokininů Gen 5 kóduje produkt účastnící se nové syntézy auxinů
Agrobacterium tumefaciens Gen 6a kóduje transportní protein pro sekreci opinů Gen 6b kóduje protein účastnící se nové syntézy cytokininů Gen 7 jeho funkce zatím m neznámá Nopalinová T-DNA mám vlevo od core genů 6 genů (a, b, c, d, e, acs), kde jenom o posledním m je známo, že e kóduje k syntézu agrocinopinů,, funkce ostatních je neznámá. Pravá část oktopinových plasmidů (T R -DNA) obsahuje 5 genů (0` aža 4`). Geny 1` a 2` se podílej lejí na syntéze manopinu,, 0` na syntéze agropinu,, funkce ostatních je zatím m neznámá. T-DNA je vymezena vysoce konzervativními přímými p repeticemi o délce d 25-28 28 bp,, jež se nazývají pravá (B R ) a levá hranice (B L ).
Agrobacterium rhizogenes 2) Bakterie Agribacterium rhizogenes - vnáš ášené geny jsou lokalizovány na bakt. plazmidu nazývaném Ri (root inducing) - transformovaná pletiva rostou jako kořeny (hairy( roots) - základními typy Ri plazmidů jsou manopinový a agropinový
Agrobacterium rhizogenes - hairy roots jsou schopny proliferace in vitro na médiu m bez růstových látekl - z obou typů transformovaných pletiv (crown( galls, hairy roots) mohou diferencovat transformované nebo i netransformované výhony
Agrobacterium rhizogenes - k diferenciaci dochází u hairy roots nikoliv z kořenových špiček, ale ze starší části kořene - téměř všechny kmeny A. rhizogenes mají 3 komponenty Ri plazmidu: i) malý (Mr( Mr~90 MD) s geny pro utilizaci opinů ii) ) velký (Mr( Mr~150 MD) s další šími geny pro využit ití opinů a pro využit ití agrocinopinů iii) kointegrovaný vzniklý spojením m předchp edcházejícíchch - T-DNA manopinových plazmidů je tvořena jedním úsekem, agropinových dvěma (T L a T R ) úseky oddělených segmentem, který do rostlinných buněk k nevstupuje - geny na T L -DNA: celkem asi 18, z nichž 4 (rola( rola, rolb, rolc, rold) ) podrobně prostudovány působí zvýšen ení senzitivity k auxinům
Agrobacterium rhizogenes - geny na T R -DNA: nejdůle ležitější jsou geny pro syntézu auxinů, homologní s geny 1 (iaam( iaam) ) a 2 (iaah( iaah) ) v T-DNA T A. tumefaciens, a geny pro syntézu agropinu a nedávno objeven analog genu rolb z T L -DNA
Vektory Pro využit ití bakterií Agrobacterium jako vektorů transgenů je třeba odstranit původnp vodní geny a místo m nich (tj. mezi hraniční sekvence T-DNA) T vložit geny, které chceme do rostl. genomu integrovat. A) Intermediárn rní (kointegrativní)) vektory - intermediárn rní vektor je malý plazmid s krátkými úseky s levou a pravou hraniční sekvencí,, mezi nimiž jen vložen zájmový gen a gen selekční - je schopen replikace v E. coli,, nikoliv však v v agrobakteriu - po vnesení do agrobakteria (transformací nebo konjugací) ) se trvale udrží jen v buňkách, ve kterých došlo k rekombinaci mezi homologními mi sekvencemi Ti plazmidu a intermediárn rního vektoru
Vektory
Vektory
Vektory B) Binárn rní vektory - jejich konstrukce založena na skutečnosti, že e schopnost indukovat nádor n mám i Ti plazmid,, který je rozdělen na dva menší ší: i) jeden obsahuje úsek virulence, ale nikoliv T-DNA, T a počátek replikace pro agrobakterium (Ti plazmid zbavený T-DNA) T ii) ) druhý obsahuje T-DNA T a počátek replikace pro agrobakterium (vektorový plazmid); mám vhodná restrikční místa pro inzerci cizorodé DNA - příkladem kmene A. tumefaciens nesoucí Ti plazmid bez T-T DNA je kmen LBA4404, jenž obsahuje plazmid zvaný pal4404, odvozený od Ti plazmidu ptiach5 delecí T- DNA úseku
Vektory
Vektory - jedním m z prvních binárn rních vektorů byl v r. 1984 pbin19, který byl v r. 1987 vylepšen en doplněním m o reportérový rový gen za vzniku pbi121 - tyto dva vektory a jejich deriváty jsou stále nejpopulárn rnější (v letech 2000-2007 2007 byly použity v pracech zabývajících ch se transformací vyšší šších rostlin ve 40 % případp padů)
Vektory
Vektory - za posledních 20 let byla vyvinuta řada systémů binárn rních vektorů,, ovšem díky d omezení velikosti vkládan dané DNA nesou vedle selekčního genu jen 1-21 2 geny zájmovz jmové - toto omezení je dáno d monocistronickou expresí eukaryotních ORF, což vede ke značné velikosti vkládan dané DNA a komplikuje klonovací postupy - v r. 2005 byl publikován n modulárn rní vektorový systém psat, který umožň žňuje vložen ení až 7 ORF do jedné T-DNA a jež je založen na tzv. homing (naváděcích) ch) endonukleázách ch; ; ty rozpoznávaj vají velmi raritní sekvence (např.. I-SceI SceI 18 bázovou b sekvenci, která se teor.. vyskytuje každých 7 x 10 10 bp) - binárn rní vektor obsahuje 6 různých r raritních sekvencí a přes p různé expresní kazety psat jsou do nich bez komplikací vkládány jednotlivé zájmové geny
Vektory
Vektory C) Superbinárn rní vektory - vektory, které vedle T-DNA T obsahují ještě některé z genů vir oblasti - využívá se poznatku, že e některn které z produktů vir genů vykazují dávkový efekt, tj. čím m více v je těchto t produktů v buňce přítomno, tím t m většív je účinnost transformace - tyto vektory hrály v pol.. 90. let stěž ěžejní úlohu při p i rozšiřov ování spektra druhů transformovatelných agrobakteriem o obiloviny
Nepřímá transformace používá se agrobakterium s vhodným binárn rním (superbinárním)) vektorem z akceptorové rostliny se používaj vají různé orgány resp. pletiva: listové disky, dělod ložní listy, stonky explantát se kultivuje s bakteriemi agrobakteria v řádech minut aža dní a pak se přenese p na médium m obsahující selekční agens, antibiotikum pro eliminaci agrobakteria a růstové látky (RL) v poměru vedoucím m k organogenezi (vzniku prýtů) na selekčním m médiu m bez RL pak prýty zakořen ení a obvykle ponesou stabilně integrovaný transgen (ověř ěření PCR a Southernovou hybridizací)
Nepřímá transformace
Nepřímá transformace při i transientní (dočasné) in planta expresi dojde k případnp padné expresi v rostl. buňce během b několika n hodin aža dní a záhy odezní ověř ěřování funkčnosti nosti konstruktů,, rychlá jednorázov zová produkce velkého množstv ství produktu jedna z metod pro indukci transientní exprese využívá agrobakterium agroinfiltrace - tekutá kultura agrobakteria s binárn rním m vektorem se vakuově nebo pomocí inj.. stříka kačky ky infiltruje do listu
Nepřímá transformace další metody pro transientní expresi: - mikroprojektily zlata nebo wolframu o velikosti zhruba 1 μm m s navázanou plazmidovou DNA; vnáš ášejí se buď ručním m přístrojem p Helios Gene Gun přímo na živé rostlině nebo do oddělených explantátů ve vakuové komoře e (PDS-1000 He); limitující je předevp edevším m vysoká vstupní investice
Nepřímá transformace další metody pro transientní expresi: - virové vektory,, v nichž je zájmový z gen vložen do virového genomu; ; obzvláš áště účinný je sytém magnifection,, ve kterém m virové replikony nesoucí zájmový gen jsou naklonovány ny do T-DNA T a do rostliny jsou vnáš ášeny již zmíněnou nou agroinfiltrací; ; během b množen ení viru je zájmový z gen exprimován spolu s virovými geny, což vede k masivní produkci požadovan adovaného produktu
Přímá transformace různé metody začaly aly být vyvíjeny jako alternativa k agrobakteriové transgenozi pro druhy, u nížn Agrobacterium nefungovalo jako první vznikla metoda transformace protoplastů (PP) - omezeno na druhy se zvládnutou regenerací PP - DNA přijp ijímána endocytózou zou,, k její stimulaci lze použít t buď PEG nebo elektroporaci - DNA lze do jader PP vložit mikroinjekcemi biolistika (biologická balistika listika) - jde o bombardování buněk k nebo pletiv mikropartikulemi (~1 μm) zlata nebo wolframu, na nichž je navázan zaná plazmidová DNA
Přímá transformace - jen 7-107 % mikroprojektilů pronikne alespoň do epidermis, ale je třeba t proniknout aža do buněk k mezofylu; pokud se tak stane, jen u 5 % z těchto t buněk k se projektil dostane až do jádra, j ale většina v (95-98 98 %) těchto t buněk k po zásahu stejně odumírá - pokud se mikroprojektil s DNA dostane aža do jádra j a buňka zásah přežije, p je frekvence integrece vnesené DNA do jaderné DNA (alespoň) ) u tabáku značně vysoká (u tabáku 10-100 100 integrací na jeden výstřel - 0,5 mg Au s 0,8 μg g DNA) vsakování roztoku DNA dehydratovanými rostl. pletivy - metoda stále studována a optimalizována (není pro rutinní transgenozi)
Přímá transformace přenos zprostředkovaný liposomy (lipofekce) - uvnitř liposomů roztok DNA, aplikováno na zralá pylová zrna, lze použít t na PP - úspěšných prací poskrovnu přenos zprostředkovaný alginátovými mikrokapičkami kami - umožň žňuje přenos p velmi velkých fragmentů DNA do PP, a to navíc c s řádově větší transformační účinností než PEG
Přímá transformace technologie transformace pylu i) biolistika jednobuněč ěčného pylu - jednobuněč ěčné mikrospory jsou bombardovány v G1 fázi, f po dozrání mikrospor je pyl použit k opylení in vivo a semena testována na selekčním m médium
Přímá transformace ii) biolistika mikrospor nebo nezralých pylových zrn reprogramovaných stresem k tvorbě sporofytu - embryogenní mikrospory či i nezralá pylová zrna jsou transformována na a vzniklé embryogenní buňky dávajd vají vznik haploidnímu embryu a rostlinám m (diploidizace( spontánn nně či chem.. indukována) na)
Cisgenoze Cisgenoze je definována na jako přenos p genů s jejich nativními regulačními sekvencemi metodami genového inženýrstv enýrství z druhu přirozenp irozeně křižitelného nebo z druhu téhot hož. Jde téžt o vytvořen ení nových transformačních protokolů bez použit ití (bakteriáln lních) selekčních markerů u generativně množených druhů kotransformací,, u vegetativně množených druhů odstranitelnými selekčními geny nebo použit itím m vektorů bez markerových genů (marker-gene-free vectors). Díky tomu by na takto geneticky upravené rostliny nemuselo být nahlíženo jako na GMO, ale jako na klasickými metodami vyšlecht lechtěné odrůdy dy se všemi v legislativními dopady a s příznivým míněním m m veřejnosti. ejnosti.
Cisgenoze V praxi bude cisgenoze vhodná zvláš áště pro rezistentní šlechtění vegetativně množených vysoce heterozygotních plodin (brambory, jabloně), kde zdrojem genů rezistence jsou příbuzné plané druhy.
Využit ití GM plodin GM crops are not the problem, but part of the solution to sustainably feeding 9 billion people. (Professor Giles Oldroyd,, Senior Plant Scientist,, John Innes Centre, UK) Do roku 2030 je třeba t celosvětov tově zvýšit výrobu potravin nejméně o 50 %, což se nedá zvládnout pouze klasickými šlechtitelskými postupy. Genetické modifikace budou tedy muset být jednou z technologií,, jak se s tímto t požadavkem úspěšně vyrovnat.
Využit ití GM plodin Přes legislativní problémy v určitých částech světa plocha GM plodin stále roste, protože e přinp inášejí vyšší zisk pěstitelp stitelům m a vyšší užitnou hodnotu spotřebitel ebitelům.
Využit ití GM plodin Drtivá většina v současnosti v praxi využívaných vaných GM plodin nese geny tolerance k herbicidům m (HT) nebo geny pro tvorbu δ-endotoxinu z B. thuringiensis (BT).
Využit ití GM plodin Z hlediska plodin vede sója s následovann sledovaná kukuřic icí a bavlníkem.
Využit ití GM plodin Podíl l nejrozší šířenějších GM plodin na jejich celkové světov tové produkci:
Využit ití GM plodin Přehled zemí s povoleným polním m pěstovp stováním m viz obr.:
Využit ití GM plodin Přicházející GM plodiny: i) kukuřice s genem pro fytázu (Čína) podstatná část fosforu ve zralých obilovinách a olejninách je obsažena ve formě fytátu tu; ; vzhledem k tomu, že monogastrická zvířata mají málo střevn evní fytázy zy,, je jejich využit ití fosforu z obilovin a olejnin omezené a fytát,, který není zvířaty využit, je vylučov ován n v hnoji a způsobuje problémy se znečištěním m prostřed edí; ; kyselina fytová dále můžm ůže e snížit biologickou dostupnost další ších prvků Ca a Zn ii) kukuřice se sníženým obsahem fytátu tu v semeni (USA, Pioneer Hi-Bred International) iii) Bt rýže e se zvýšenou rezistencí vůči i zavíje ječům m (Čína)( iv) SmartStax kukuřice (Monsanto( Monsanto,, 2010) nese 8 různých r transgenů (2 pro rezistenci k glyfosátu resp. glufosinátu tu) ) a 6 genů BT směrovaných proti různým r živočišným škůdcům
Využit ití GM plodin v) kukuřice se zvýšenou odolností vůči i suchu (Monsanto( Monsanto); očekávané tržní zavedení 2012 vi) geny zlepšuj ující nutriční vlastnosti plodin sója se zvýšeným obsahem 3-ω3 mastné kyseliny - kyseliny stearidonové (Monsanto), která je stabilnější než rybí tuk a v lidském či i zvířec ecím m těle t je konvertována na na polynenasycené 3-ω mastné kyseliny s příznivým p účinkem na vaskulárn rní systém vii) zlatá rýže e 2 2 s velmi vysokým obsahem β-karoténu bude zavedena 2012
Využit ití GM plodin Příklad vývoje GM plodin firmou Monsanto
Využit ití GM plodin
Využit ití GM plodin
Využit ití GM plodin
Využit ití GM plodin
Využit ití GM plodin Perspektivní GM plodiny: i) rajčata ata s genem Bs2 z papriky pro rezistenci vůčv ůči Xanthomonas sp.. v polních podmínk nkách ii) rajčata ata rezistentní vůči Phytophtora infestans s geny rezistence z planých druhů rajčat at iii) rajčata ata se zvýšenou odolností k bakteriáln lním m chorobám m (vč. Ralstonia solanacearum) ) s genem efr z arabidopsis iv) banánovn novník k je nyní devastován n chorobou sigatoga způsobovanou houbou Mycosphaerella fijiensis téměř vešker kerá světov tová produkce banánů je tvořena extrémn mně citlivou odrůdou dou Cavendish; žádný GM rezistentní banánovn novník ještě není hotov, ale několik n nadějných postupů je testováno
Využit ití GM plodin Perspektivní GM plodiny: v) rajčata ata s výrazně vyšší šším m (3x) obsahem antioxidantů (antokyanů a flavonolů) ) díky d expresi dvou genů pro transkripční faktory z hledíku (purple tomato)
Využit ití GM plodin Perspektivní GM plodiny: vi) zvýšen ení účinnosti příjmu p N rostlinami k omezení hnojení a znečišťov ování povrchových i spodních vod alaninaminotransferasa je slibným kandidátem; v delší ším horizontu je žádoucí vytvořit GM plodin se schopností vytvořit symbiotický vztah s dusík k fixujícími bakteriemi leguminóz vii) zavedení rezistence vůčv ůči i rzi trávn vní (Puccinia graminis) ) do pšenice; geny rezistence jsou dostupné v planých druzích, ze kterých budou klonovány ny a vneseny do kultivarů pšenice
Důvody využit ití GM plodin umožní nutné zvýšen ení světov tové produkce potravin přes p pokles rozlohy obdělávateln vatelné půdy umožní produkci potravin na půdách p dosud pro zemědělskou produkci nevhodných (sucho, zasolení) redukují environmentáln lní dopady rostlinné zemědělsk lské výroby snižov ováním m počtu pesticidních ch ošeto etření a tím t snižov ováním m potřeby fosilních paliv na jednotku produkce redukují spotřebu paliv díky d aplikaci úspornějších metod obdělávání půdy zlepšuj ují nutriční hodnotu potravin a krmiv zlepšuj ují vlastnosti surovin pro průmyslov myslové využit ití umožní zvýšit produkci rostl. hmoty jakožto obnovitelného zdroje energie