Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Vliv macerace na antiradikálovou aktivitu moštů révy vinné (Bakalářská práce) Vedoucí bakalářské práce: Ing. Mojmír Baroň Ph.D. Vypracoval: Jan Strýček Lednice 2014
Prohlašuji, ţe jsem práci na téma Vliv macerace na antiradikálovou aktivitu moštů révy vinné vypracoval samostatně a veškeré pouţité prameny a informace uvádím v seznamu pouţité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, ţe se na mojí práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a ţe Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a uţití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, ţe před sepsáním licenční smlouvy o vyuţití díla jinou osobou (subjektem) si vyţádám písemné stanovisko univerzity, ţe předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to aţ do jejich skutečné výše. V Lednici dne: -------------------------------------------- Podpis
Rád bych poděkoval mému vedoucímu Ing. Mojmíru Baroňovi, Ph.D. za odborné vedení práce, Ing. Michalu Kumštovi za pomoc při zpracování, měření a vyhodnocování vzorků a mé rodině za podporu a inspiraci při vypracování této práce.
Obsah Obsah...6 1. Úvod...9 2. Teoretická část... 10 2.1. Sloţení hroznu... 10 2.1.1. Sloţení hroznu slupka... 10 2.1.2. Sloţení hroznu duţnina... 10 2.1.3. Sloţení hroznu - semena... 10 2.1.4. Sloţení hroznu třapina... 11 2.2. Vývojové fáze hroznu... 11 2.2.1. 1. vývojová fáze bobule... 11 2.2.2. 2. vývojová fáze bobule... 12 2.2.3. 3. vývojová fáze bobule... 12 2.3. Biochemické sloţení hroznu, popis a rozdělení fenolických látek... 13 2.3.1. Biochemické sloţení hroznu... 13 2.3.2. Popis fenolických látek... 15 2.3.3 Rozdělení polyfenolických látek... 15 2.4. Macerace hroznů... 20 2.4.1. Macerace bílých hroznů... 21 2.4.2. Macerace modrých hroznů při výrobě rosé vín... 22 2.4.3. Macerace modrých hroznů při výrobě červených vín... 22 2.4.4. Teplota a čas... 22 2.4.5. Kryomacerace... 23 2.4.3. Thermoflash macerace... 23 2.4.4. Karbonická macerace... 24 6
2.5 Antiradikálová aktivita a volné radikály... 24 2.5.1 Antiradikálová aktivita... 24 2.5.2. Volné radikály... 25 2.6. Antioxidanty... 28 2.6.1. Vysokomolekulární enzymové antioxidační systémy... 28 2.6.2. Vysokomolekulární neenzymové antioxidanty... 29 2.6.3. Nízkomolekulární přírodní antioxidanty... 30 2.6.4. Antioxidační aktivita fenolických látek v hroznech révy vinné... 31 3. Cíl práce... 33 4. Praktická část... 34 4.1. Ampelografická charakteristika pouţitých odrůd... 34 4.2. Stanovištní podmínky... 34 4.3. Materiál a metody... 35 4.3.1 Stanovení celkového obsahu flavanolů... 35 4.3.2. Stanovení antiradikálové aktivity... 36 4.3.3. Stanovení celkových antokyanů a optické hustoty při 280, 320, 360, 520 nm (OD 280, OD 320, OD 360, OD 520 )... 36 4.3.4. HPLC stanovení kyselin a cukrů... 36 4.3.5 Stanovení ph... 37 4.3.6 Stanovení titrovatelných kyselin... 37 4.3.7. Refraktometrické stanovení cukernatosti... 37 4.4. Výsledky práce... 37 4.4.1. Optická hustota při vlnové délce OD 280 nm POLYFENOLY Sauvignon 2013... 38 4.4.2. Optická hustota při vlnové délce OD 320 nm KYSELINA KAFTAROVÁ Sauvignon 2013... 39 4.4.3. Optická hustota při vlnové délce OD 360 nm FLAVANOLY Sauvignon 2013... 41 7
4.4.4. Optická hustota při vlnové délce OD 520 nm ANTOKYANY Sauvignon 2013... 42 4.4.5. katechinů Sauvignon 2013... 43 4.4.6. Obsah měřených látek u odrůdy Neuburské... 44 4.4.7. Porovnání výsledků antiradikálové aktivity... 46 4.4.8. Hodnota ph a titrovatelných kyselin... 47 4.5. Diskuze... 48 5. Závěr... 50 6. Souhrn... 51 7. Summary... 52 8. Seznam pouţité literatury... 53 9. Seznam grafů, tabulek a obrázků... 58 8
1. Úvod Víno a hrozny jsou součástí naší potravy a našeho ţivota od počátků lidské existence. Svědčí o tom 7 10 tisíc let staré důkazy z míst, jako je syrský Damašek, libanonský Byblos, Gruzie a Arménie. Révu vinnou můţeme zařadit mezi nejčastěji kultivované druhy ovoce na světě. Hrozny révy vinné obsahují fenolické látky, které jsou důleţité z hlediska vinohradnického, vinařského, ale i marketingového a navíc mají pozitivní vliv na lidské zdraví. Mnoho studií dokázalo, ţe fenolické látky a jejich příjem v potravě sniţují riziko výskytu závaţných onemocnění, například kardiovaskulární a nádorová onemocnění. Pozitivní účinky pití vína jsou připisovány alkoholu, jeho vliv je ovšem menšinový, daleko významnější jsou pro lidský organismus fenolické látky. Mezi fenolické látky patří flavonoidy. Jedná se o produkty metabolismu rostlin. Jsou náchylné na jednoelektronové redoxní reakce. Flavonoidy mají antioxidační, antikarcinorcinogenní, protizánětlivé účinky a také zpomalují stárnutí tkání. Jsou řazeny mezi přírodní antioxidanty a společně s některými látkami dokáţou reagovat kyslíkovými radikály. Jednou z nejvíce známých hypotéz je tzv. francouzský paradox. Tato hypotéza se opírá o zjištění, ţe strava Francouzů je bohatá na nasycené tuky, ale Francouzi pijí také téměř ke kaţdému jídlu červené víno, kterému je připisováno téměř třikrát menší riziko vzniku kardiovaskulárních onemocnění neţ ve Spojených státech amerických, kde lidé ve stravě přijímají méně nasycených tuků, ale nevypijí tolik červeného vína. Obsah fenolických látek v hroznech a poté i ve víně je závislý na mnoha faktorech. Jednak závisí na odrůdě révy vinné, ale také závisí na přírodních podmínkách, kde se réva pěstuje světlo, teplo, sráţky, půda. Důleţitým faktorem je také technologie výroby vína macerace a luhování látek obsaţených v hroznech do moštu. 9
2. Teoretická část 2.1. Složení hroznu Hlavní věcí, o kterou nám u révy vinné jde, jsou hrozny. Je to základní surovina pro výrobu vína. Skládá se z bobulí a třapiny. Bobule se skládá ze slupky, duţiny a semen. Kaţdá z těchto součástí je svým chemickým sloţením výjimečná a má značný vliv na chemické sloţení budoucího moštu a vína. Jednotlivé části mohou být různě zastoupené, záleţí na odrůdě, stupni zralosti a také na ekologických podmínkách (FARKAŠ, 1973). 2.1.1. Složení hroznu slupka Slupka hroznu je tvořena kutikulou, epidermis a hypodermis. Slupka můţe tvořit 8-20% hmotnosti bobule. Ve slupce jsou obsaţeny cukry, kyseliny, sekundární produkty metabolismu (fenolické látky), například antokyany, taniny a aromatické látky (PAVLOUŠEK, 2011). 2.1.2. Složení hroznu dužnina Duţnina tvoří aţ 75 85 % z celkové hmotnosti bobule a je sloţena z velkých mnohoúhelníkovitých tenkostěnných buněk (PAVLOUŠEK, 2011). Duţnina je rozdělena na dvě části vnitřní, tuţší, obsahující cévní svazky a vyţivující rostlinu a vnější, šťavnatější (STEIDL, 2002). V duţnině jsou obsaţeny cukry, především glukóza a fruktóza. Dále obsahuje kyseliny, z těch organických jsou nejvýznamnější kyselina vinná a kyselina jablečná, z anorganických to je kyselina fosforečná. Další součástí duţniny jsou kationty, nejvýznamnější je draslík, vápník, sodík a zinek. Duţnina obsahuje i sekundární metabolity aromatické (vonné) látky a u specifických odrůd (barvířek) také antokyanová barviva. V duţnině najdeme i dusíkaté sloţky, v duţnině je obsaţeno pouze 20 25 % z celkového obsahu dusíku v bobulích, hlavními dusíkatými sloţkami jsou amonné ionty, aminokyseliny a bílkoviny. V neposlední řadě zde najdeme i vitaminy a minerální látky (PAVLOUŠEK, 2011). 2.1.3. Složení hroznu - semena Semena se nachází uvnitř duţniny. Jejich původní zelená barva se během zrání mění do hněda, semena sesychají. Semena tvoří maximálně 6 % celkové hmotnosti bobule. Jedná se o významný zdroj fenolických látek (20 55 %), díky tomu mají velký 10
význam pro kvalitu modrých hroznů, respektive červených vín (PAVLOUŠEK, 2011). Macerací a nakvášením rmutu se vyluhování fenolických látek podporuje. V semenech je obsaţen i olej, obsahující glyceridy kyseliny palmitové, stearové a dále třeba linolové. Dalšími látkami, které jsou obsaţeny v semenech, jsou minerální látky, uhlohydráty, celulóza a bílkoviny (KENNEDY et al., 2002). 2.1.4. Složení hroznu třapina Třapina tvoří 3 5 % hmotnosti hroznu, její chemické sloţení záleţí na odrůdě, stupni zralosti a klimatických podmínkách. Mladé třapiny jsou zelené a mají vysoký obsah vody (aţ 90 %), starší třapiny uţ tolik vody neobsahují (35 %). V třapinách je obsaţeno i malé mnoţství cukru, kyselina vinná a jablečná a ve větší míře také třísloviny (COOMBE, 2002). 2.2. Vývojové fáze hroznu 2.2.1. 1. vývojová fáze bobule 1. vývojová neboli růstová fáze trvá 45 65 dnů a začíná po odkvětu révy vinné. V té době dochází ve slupce i duţnině k dělení a prodluţování buněk. V prvních 14 dnech se počet buněk v duţnině znásobí třikrát, ve slupce aţ sedmkrát. V následujících týdnech se tyto buňky zvětšují do objemu (PAVLOUŠEK, 2011). Během této fáze je ve všech částech bobule dominantní chlorofyl. Uvnitř bobule se odehrává vysoká metabolická aktivita, charakterizovaná vyšší respirací a rychlou akumulací kyselin. Tuto fázi můţeme označit také jako bylinný růst bobule (PAVLOUŠEK, 2011). V počátku této fáze vytváří hydroxyskořicové kyseliny, které se nachází v duţnině i slupce bobulí. Tyto kyseliny jsou prekurzory těkavých fenolů, vznikajících během výroby vína (PAVLOUŠEK, 2011). Důleţitým faktem pro kvalitu hroznů určených pro výrobu červených vín je také hromadění taninů, představovaných monomerními flavan 3 oly (KENNEDY et al.., 2002). Dalším důleţitým faktem je akumulace aminokyselin, minerálních látek a některých aromatických látek karotenoidy, methoxypyraziny. 11
2.2.2. 2. vývojová fáze bobule Tato fáze, v zahraniční literatuře označovaná, jako lagphase, u nás označovaná jako fáze pomalého růstu. Během ní jsou velikostní a hmotnostní změny minimální, za to se více mění chemické sloţení bobule. U bobule můţeme pozorovat pozvolné zaměkání a také zprůsvitnění slupky. Délka této fáze je 8 15 dnů, je závislá na odrůdě, stanovišti, nástupu a délce trvání fenofáze (PAVLOUŠEK, 2011). 2.2.3. 3. vývojová fáze bobule Pro tuto fázi, kterou můţeme nazvat druhou růstovou fází nebo také fází dozrávání bobulí, je charakteristické hromadné zaměkání a vybarvování bobulí. Bobule se v této fázi mění z původně malé, tvrdé, kyselé bobule s nízkým obsahem cukru v bobuli větší, sladší, měkčí, barevnější, voňavější a s niţším obsahem kyselin. Toto období a vývoj bobulí během něj rozhoduje o kvalitě hroznů pro výrobu vína. Intenzita respirace se v této době sniţuje a naopak roste enzymatická aktivita. Období trvá 35 55 dnů. Dochází během něj k akumulaci cukrů, aminokyselin, minerálních látek a fenolů a naopak se sniţuje obsah kyseliny jablečné, která je prodýchána na oxid uhličitý a cukry. Pokles kyseliny jablečné je závislý především na klimatických podmínkách v daném ročníku (PAVLOUŠEK, 2011). Během zaměkání do bobulí začínají proudit cukry. Transportním cukrem je sacharóza, která se do bobulí dostává během zrání. Poté je enzymem invertázou rozštěpena na glukózu a fruktózu (ROBINSON a DAVIES, 2000). Akumulace látek po zaměkání probíhá i u antokyanů. U vonných látek dochází ke sniţování obsahu například methoxypyrazinů, přeměňují se karotenoidy na C 13 norisoprenoidy, začínají se tvořit monoterpeny, vonné thioly a těkavé fenoly (PAVLOUŠEK, 2011). Dalším důleţitým faktorem při vývoji bobule je teplota. Její vliv na velikost bobule je nejvýraznější v první a třetí vývojové fázi. Optimální teplota pro růst a vývoj bobulí je v rozpětí 22 26 C, teploty niţší neţ 15 C a naopak vyšší neţ 35 C negativně ovlivňují velikost bobule, která je způsobena špatným hospodařením s vodou a také jsou negativně ovlivněny biochemické procesy uvnitř bobulí (DUNLEVY et al., 2009). 12
2.3. Biochemické složení hroznu, popis a rozdělení fenolických látek 2.3.1. Biochemické složení hroznu Organické kyseliny Kyseliny, stejně jako cukry, vznikají asimilací z vody a oxidu uhličitého. Jejich obsah v hroznech je závislý na odrůdě, ročníku, zralosti a stanovišti. První kyselinou, která vzniká při dozrávání hroznů, je kyselina jablečná, následována kyselinou vinnou. Dalšími organickými kyselinami, ovšem s daleko menšími koncentracemi v hroznu jsou kyselina citronová, jantarová, glukonová a další (STEIDL, 2002). Organické kyseliny a jejich obsah v hroznech přímo i nepřímo ovlivňují postup výroby vína a určuje i jeho organoleptickou kvalitu (PAVLOUŠEK, 2011). Kyselina vinná Jedná se o nejdůleţitější kyselinu v hroznech, moštu i víně. Je obsaţena ve všech částech hroznu. Po zrání hroznů se jiţ netvoří, změna jejího obsahu souvisí s obsahem draslíku v půdě. V dobrých ročnících se hodnota kyseliny vinné pohybuje v rozmezí 6 12 g.l -1 v závislosti na odrůdě. (KRAUS a kol., 1997) Kyselina jablečná Druhá nejvýznamnější organická kyselina, hned po kyselině vinné. Je to nejdynamičtěji se měnící kyselina. Je obsaţena v bobulích, třapinách i listech révy vinné. Kyselina jablečná je méně stálá neţ kyselina vinná, protoţe je méně odolná proti vlivům kyslíku při vyšších teplotách a vysokém ph (FARKAŠ, 1973). Kyselina jablečná je oxidována na fruktózu a glukózu, tyto sacharidy se dále vyuţívají, jako zdroj uhlíku a energii pro dýchání. Tyto cukry nezvyšují cukernatost bobulí (PAVLOUŠEK, 2011). Kyselina citronová Tato kyselina je stálá během celého procesu zrání. Nachází se uţ v nezralých bobulích, její obsah bývá od 0,5 do 1 g.l -1 (RIBÉREAU-GAYON, 2006). 13
Ostatní kyseliny Mezi další kyseliny patří například kyselina jantarová, která se v hroznech objevuje v mnoţství 0,2 g.l -1 a její mnoţství během dozrávání klesá. Další minoritní kyselinou je kyselina glykolová, je přítomná v nezralých bobulích, oxidací se rozpadá na kyselinu šťavelovou, která se v hroznech vyskytuje ve formě vápenatých solí (FARKAŠ, 1973). Dusíkaté látky V bobulích se dusík vyskytuje v anorganické a několika organických formách. Jeho obsah se moštu se pohybuje v rozmezí 100 1200 mg/l. Hlavními sloţkami dusíkatých sloučenin jsou aminokyseliny, bílkoviny a amonné ionty. Obsah a sloţení dusíkatých látek přímo působí na kvalitu moštu a později vína, protoţe má vliv na správnou činnost kvasinek a tvorbu vonných látek ve víně, protoţe aminokyseliny jsou velmi důleţitými prekurzory aromatických (vonných) látek; aminokyselinový profil podmiňuje aroma vína, zejména u aromaticky nevýrazných odrůd. K nejzastoupenějším aminokyselinám patří arginin a prolin. Vysoký obsah prolinu je zřejmě spojen s delšími obdobími sucha ve vinicích. Kvasinkami vyuţívanou formou dusíkatých látek pro výţivu jsou amonné ionty. Jejich přítomnost v moštu má přímý vztah k dusíku, který je révou vinnou přijímán ve vinici. Hnojení dusíkem, například z organické hmoty způsobuje vyšší podíl amonných iontů v bobulích (PAVLOUŠEK, 2011). Další důleţitou součástí výţivy kvasinek jsou vedle dusíku vitamíny. Pro alkoholovou fermentaci jsou nejdůleţitější vitamín B 1 (thiamin), B 3 (biotin) a pantotenová kyselina (MOLDES, 2003) Minerální látky Minerální látky jsou přijímány z půdy hlavně kořenovým systémem, minoritně listovou plochou a ovlivňují vývojové a růstové pochody a fyziologické děje. Další parametr, který je minerály ovlivňován, je extrakt, který spoluodpovídá za plnost chuti. Minerální látky působí na organoleptické vlastnosti vína, to znamená vůni, chuťovou svěţest, barvu a celkový chuťový dojem (PAVLOUŠEK, 2011). Minerály vápníku, draslíku, hořčíku a sodíku mají velký význam pro látkovou výměnu a úspěšné kvašení moštu. Vysoký obsah draslíku v půdě a tím i vysoký obsah draslíku v bobulích způsobuje vysokou hodnotu ph, která můţe být pro víno nebezpečná. 14
2.3.2. Popis fenolických látek Jsou to látky, které se vyskytují v běţných potravinách, v současné době je známo přes 8000 polyfenolických látek. Jsou řazeny k sekundárním metabolitům rostlin (Handique a Baruah 2002). Ze strukturního hlediska jsou tvořeny jedním nebo i více aromatickými nebo heterocyklickými řetězci, a to buď kondenzovanými, nebo spojenými alifatickým řetězcem (KLEJDUS, 2004). K nejdůleţitějším vlastnostem polyfenolických látek patří antioxidační, redukční a chelatačníschonosti. Z vinařského hlediska, nebo celkově potravinářského, je nejdůleţitější jejich schopností ovlivňovat organoleptické vlastnosti vína či potravin, proto jsou vyuţívány jako barviva, vonné a chuťové látky. Ne všechny polyfenolické látky ve víně, i kdyţ je jich většina, pochází z hroznů. Najdou se totiţ i takové látky, které mají svůj původ ve dřevě (sudu), které bylo pouţito při výrobě vína. V lidském těle napomáhají, jako antioxidanty. Jsou důleţité v prevenci při různých onemocněních, například při rakovině prsu, prostaty, tlustého střeva, plic a konečníku, při kardiovaskulárních onemocněních a Alzheimerově a Parkinsonově chorobě, zároveň dokáţí sniţovat hladinu LDL cholesterolu. Člověk by měl během dne přijmout aţ 1 g polyfenolických látek (JONES, 1998). 2.3.3 Rozdělení polyfenolických látek Hydroxyskořicové kyseliny Jsou to nejdůleţitější látky bílých odrůd, které velmi lehce podléhají oxidaci, tudíţ jsou zodpovědné za hnědnutí moštu a vína. V bobulích hroznů se vyskytují jako estery kyseliny vinné. K nejdůleţitějším a zároveň nejznámějším kyselinám patří kyselina kávová, kumarová, ferulová, sinapová, skořicová a p-kumarová, těchto šest kyselin má C6 C3 kostru. Je vysoce pravděpodobné, ţe všechny rostliny obsahují, alespoň tři z nich. (WILFRED, 2006) 15
O OH HO O OH CH3O O OH HO HO kyselina skořicová kyselina kávová kyselina ferulová Obrázek 1: Hydroxyskořicové kyseliny Zdroj: Trna a Táborská, 2011 Hydroxybenzoové kyseliny Ve víně se tyto kyseliny vyskytují menšinově, v hroznech se vykytují ve formě glykosidů a esterů (gallové a elagické taniny), (PAVLOUŠEK, 2011). Mezi hlavní zástupce patří kyselina galová, vanilinová a syringová. Tyto kyseliny jsou tvořeny C6 C1 kostrou.(luštinec a ŢÁRSKÝ, 2005) Deriváty kyseliny galové, vznikající esterifikací polyhydroxylovými sloučeninami, nejběţněji jednoduchými sacharidy, se nazývají taniny. Hydrolyzované taniny dělíme na galické a elagické.elagické taniny se vyluhovávají ze dřeva, elagickáacida je součástí ligninové stavby dřeva. Za pomoci enzymatických procesů jsou tyto taniny hydrolyzovány ze dřeva. (FRAGA, 2010) Stilbeny Stilbeny jsou látky, které jsou produktem fenylpropanoidacetátové dráhy, jsou produkovány jako reakce na různé situace chorobu, poškození, stres. Tyto látky se v rostlinách příliš nevyskytují a z toho důvodu je lidská strava na jejich obsah velmi chudá. Stilbeny se vyskytují ve dvou formách volné nebo vázané jako glykosidy (Šmidrkal a kol., 2011). V poslední době můţeme pozorovat zvýšený zájem o tyto látky, hlavně kvůli resveratrolu (TRNA a TÁBORSKÁ, 2011). Resveratrol je fytoalexín, který se nachází v hroznech minimálně ve čtyřech formách, a to jako: trans a cis-resveratrolnebo jako jeho glukosid: trans a cis-piceid. Resveratrol má velice silné antioxidační účinky, pro porovnání: je 5 krát silnější neţ betakaroten, 20 - krát silnější neţ vitamín C a 50 krát silnější neţ vitamín E. Je velice důleţitý tím, ţe zabraňuje nadměrnému sráţení krve, čímţ poskytuje ochranu proti kardiovaskulárním chorobám, zpomaluje postup arteriosklerózy, protoţe brání oxidaci arteriálního plaku, dále je důleţitý při blokování procesů, které vedou ke vzniku, růstu a 16
šíření zhoubných rakovinných onemocnění, sniţuje hladinu zlého LDL cholesterolu a naopak zvyšuje tvorbu dobrého HDL cholesterolu. Jak uţ jsem uvedl, zabraňuje nadměrnému sráţení krve, tudíţ je i prevencí proti trombóze, pomáhá při onemocnění astmatem. Další z jeho pozitivních vlastností jsou protizánětlivé, antibakteriální, antialergické, protoţe neutralizuje vylučování histaminu. Je dokázané, ţe sniţuje riziko vzniku demence, Alzheimerovy choroby. Dále se vyuţívá jako účinný kosmetický preparát, protoţe brání předčasnému stárnutí pokoţky a obnovuje kolagenové vlákna, udrţuje pruţnost pokoţky (JANG, 1997). Obsah resveratrolu v hroznech se můţe zvýšit lehkým napadením plísní Botrytis, ale zase hrozen silně napadený, obsahuje daleko méně resveratrolu neţ úplně zdravý, to je způsobeno enzymem, zvaným lakáza, který je produkován houbou v reakci na antimykotickou schopnost resveratrolu. Obsah resveratrolu je u bílých odrůd daleko menší neţ u modrých. Je to způsobeno tím, ţe jeden z prekurzorů trans-resveratrolu je p-coumaroyl-co-a, coţ je předchůdce antokyanů. (KÖNIG et al., 2009) Flavonoidy Z fyziologického hlediska jsou vlastnosti flavonoidů poměrně málo známé. Flavonoidy jsou nejzastoupenější skupinou sekundárních metabolitů vyšších rostlin. Jsou identifikovány v listech, květech a plodech nejrůznějších druhů rostlin (JONES, 1998). Do dneška bylo identifikováno okolo 5000 těchto látek (VELÍŠEK, 2009). Z výţivového hlediska jsou flavonoidní látky pozitivní pro lidské zdraví. Fungují velice dobře jako účinné antioxidanty. Kromě antioxidačního účinku dosahují flavonoidy i účinku opačného - prooxidačního. Jako prooxidanty působí v molekule flavonoidů zejména vázané ionty kovů, jako jsou ionty ţelena, mědi, niklu a molybdenu (ŠVEJCAR, 1986). Další funkcí těchto sekundárních metabolitů je schopnost sniţovat riziko vzniku srdečních a cévních onemocnění a aterosklerózy. Preventivně také působí proti oxidaci LDL-cholesterolu, protizánětlivě, antibakteriálně, antiprostaticky a vazodilatačně (ZLOCH, 2011). Z chemického hlediska jsou flavonoidy látky odvozené od flavanu, který je tvořen 2H-chromenem substituovaným v poloze C2 fenylovou skupinou. Jedná se o uspořádání C6-C3-C6. Benzenové jádro A je tvořeno ze tří malonoyl-coa molekul a 17
benzenové jádro B pochází ze p-kumaroyl-coa. Na kruhu A dochází v poloze meta k hydroxylaci. Šestičlenný heterocyklus s kyslíkem je odvozen nejčastěji od pyranu. Kruh C je mono-, di-, polyhydroxylovaný a můţe obsahovat i metyleterové skupiny (Vermerris a Nicholson, 2006). Běţně bývají všechny tři kruhy substituované hydroxynebo methoxyskupinami a jednotlivé deriváty se od sebe liší pouhým stupněm substituce a oxidace (VELÍŠEK, 2009). Rostlinné flavonoidy se vyskytují v rostlinách jak volné, tak vázané. Majoritní význam ovšem mají vázané flavonoidy ve formě glykosidů, jejichţ cukerná sloţka je tvořena D-glukzou, D-galaktzou, L-arabinzou, nebo jinými sacharidy. Glykosyl můţe být do molekuly flavonoidů zapojen i vícekrát, popřípadě můţe být substituován hydroxylovými kyselinami (ŠVEJCAR, 1986). Flavonoidy dělíme do několika skupin na flavanoly, flavanony, flavony, flavonoly, proantokyanidiny, antokyanidiny a izoflavony, které se od sebe liší strukturou, výskytem a funkcí. Obsah flavonoidů se vyjadřuje v mg/100 g. Flavonoly Flavonoly jsou polyfenolické látky, které se nacházejí ve slupce bobulí vinné révy (Vitisvinifera). Potravinářsky důleţité flavonoly mají hydroxyskupinu navázanou v polohách C3, C5, C7 a C4 (VELÍŠEK, 2009). Nejvýznamnější flavonolyjsou3- glykosidymyricetinu, kemferolu, izohamnetinu a kvercetinu, například myricetin 3- glukosid, kemferol 3-glukosid, izohamnetinglukosid, myricetinglukuronid, kemferolglukuronid, kemferol galaktosid apod. (ANDERSEN a MARKHAM, 2006). Červené odrůdy se obecně vyznačují vyšším zastoupením těchto flavonoidů, oproti tomu bílé odrůdy se kromě niţšího obsahu celkových flavonolů vyznačují absencí myricetinu. Ostatní flavonoly jako například taxifolin jsou ve srovnání s předešlými méně významné a typická je pro ně i menší intenzita zabarvení (RIBÉREAU-GAYON, 2000). Kvercetin je odvozen od flavonu, pouze jinak hydrolyzovanou strukturou. V sedmdesátých létech 20. století byl zkoumán jeho výskyt v rostlinách a jeho vliv na léčbu rakoviny, především tlustého střeva. Dalšími pozitivními vlastnostmi jsou protizánětlivé, antiaterosklerotické a protisráţlivé účinky. V přirozené formě je kvercetin sám o sobě neaktivní, k jeho aktivaci dochází aţ po přidání kvasinek do moštu. Přirozenou cestou k tomuto ději dochází působením střevní mikroflóry v lidském těle (JONES, 1998). 18
Kvercetin můţeme izolovat z cibule, šalotky, česneku, pórku. Na celou řadu flavonoidních látek je bohatá také kapusta, zelí a kedluben. Kvercetin se vyskytuje nejenom ve volné formě, ale také jako glykosid (kvercetin-3-o-glukosid a kvercetin-3-o-rhamnosid). Dalším významným glykosidem je rutin, působí na propustnost a pruţnost krevních kapilár (TRNA a TÁBORSKÁ, 2011). Ten se vyskytuje nejenom v bobulích, ale i v listech révy vinné. (VELÍŠEK, 2009) Flavanoly Flavan 3- oly se v rostlinách objevují ve formě monomerů, oligomerů a polymerů. Nejvýznamnějšími flavanoly ve víně jsou katechiny a vyskytují se zde, jako volné i jako kondenzované. Po kondenzaci přes mezistupně o-chinonů jsou katechiny společně s bílkovinami schopny vytvářet zákaly, které můţou být vratné i nevratné (ŠVEJCAR, 1986). Katechiny jsou u révy vinné obsaţeny ve slupce a semenech. Největší význam mají katechiny, epikatechiny a epikatechin 3 gallát (ANDERSEN a MARKHAM, 2006). Koncentrace katechinů ve víně také zodpovídá za jeho hnědnutí během jeho stárnutí. Katechiny ve víně jsou stejnou účinnou látkou, jako je v zeleném čaji. Katechiny se vyskytují také v černém čaji, ale v polovičním mnoţství neţ u zeleného čaje, to je ovlivněno fermentací, dále se vyskytují ve švestkách a jablcích. Pro katechiny jsou typické jejich antioxidační účinky. Dobře působí proti ukládání tuku (JONES, 1998), sniţuje riziko vzniku srdečních a cévních onemocnění (BURIN, 2010). Antokyany Antokyany nebo také antokyaniny jsou barviva, které se vyskytují ve vakuolách slupek modrých hroznů nebo jejich duţnině (barvířky), jsou to glykosidy různých aglykonů, které se nezývají antokyanidiny. Struktura antokyanidinů byla odvozena od flavyliového kationt. Základ barviv modrých odrůd tvoří:delfinidin, cyanidin, petunidin, peonidin a malvidin, tyto látky (antokyanidiny) se mezi sebou liší počtem a polohou hydroxylových a methoxylových skupin. 19
Antokyany se vytváří v hroznech během zrání hroznů a jejich mnoţství obsaţené v bobulích se liší v závislosti na ročníku, pěstitelských podmínkách a extrahování v průběhu výroby. Antokyany se vyskytují v hroznech ve formě glykosidů na barevnou sloţku AGLYKON jsou navázané jednoduché cukry glukóza, arabinóza, galaktóza a další. Hlavním antokyanem v bobulích je malvidin 3 glukosid, tento antokyanidin byl v roce 1959 popsán, jako hlavní antokyanové barvivo, dále to jsou delfinidin 3 glukosid, cyanidin 3 glukosid, peonidin 3 glukosid a petunidin 3 glukosid (SANDLER, 2003). Tyto látky můţou být ovšem dále acylovány pomocí kyseliny kávové, kyseliny octové na cukr nebo kyseliny p kumarové, coţ stabilizuje v mladých vínech barevné pigmenty. Důleţitou výjimkou v rámci acylovaných pigmentů tvoří odrůda Rulandské modré (Pinot Noir), která má zcela jedinečné sloţení těchto acylovaných pigmentů oproti jiným odrůdám. Toto jedinečné sloţení zodpovídá za slabší barevnost vín této odrůdy. Za slabší barevnost můţe částečně zodpovídat také ph, polymerizace antokyanů s taniny anebo síření vín (SANDLER, 2003). V interspecifických odrůdách a v odrůdách Vitisvinifera L. se vyskytují tyto monoglukosidy: malvidin 3 glukosid, delfinidin 3 glukosid, cyanidin 3 glukosid, peonidin 3 glukosid a petunidin 3 glukosid. U divokých druhů Vitisspp. a u některých PIWI odrůd se vyskytují diglukosidické barviva, především malvidin 3,5 diglukosid. Další moţností formy výskytu antokyanových barviv ve víně jsou estery monoglukosidů s kyselinami: octovou, kávovou a kumarovou (PAVLOUŠEK, 2011). 2.4. Macerace hroznů Předfermentační macerace při nízkých teplotách (vodný roztok) zvyšuje mnoţství antokyanů a flavanolů ze slupek a duţiny, zatímco postfermentační macerace (alkoholový roztok) zvyšuje proantokyanidiny jako výsledek rozšířené macerace ze semen (MORRENO-ARRIBAS et al., 2009). 20
Při teplotách kolem 20 C dochází k aktivaci enzymů a postupné změně viskozity. Pektinázy nám umoţňují snadnější lisování zejména odrůd s pevnější slupkou, usnadňují odkalování moštů, zvyšují extrakci barevných a aromatických látek. Rozhodnutí o aplikaci macerace při výrobě vína je závislé na mnoha faktorech, především na na vyzrálosti hroznů, jejich ph, obsahu kyselin. Doba macerace se pohybuje nejběţněji v rozmezí 6 20 hodin (FARKAŠ, 1998). O délce trvání macerace se můţeme rozhodnout také v závislosti na odrůdě a aromatických látkách, které daná odrůda obsahuje. Muškátové odrůdy Muškát moravský, Muškát Ottonel, Irsai Oliver Délka macerace krátká (max. 6 hodin) Tramínové odrůdy Tramín červený, Pálava Délka macerace 6-12 hodin Ostatní odrůdy 2007) Sauvignon, Ryzlink rýnský, Ryzlink vlašský Délka macerace můţe být delší neţ 12 hodin (GEHEROVÁ, 2.4.1. Macerace bílých hroznů Bílá vína jsou obecně vyráběna s niţším obsahem fenolických látek, neţ je tomu u vín červených. Výjimku mohou tvořit vína vyrobená z hroznů bílých aromatických odrůd, kde můţe krátkodobá studená macerace rmutu podpořit intenzivnější odrůdový výraz. Studená macerace podporuje uvolnění aromatických prekurzorů, ovocných tónů, některých fenolických látek, které přispívají k větší tělnatosti vína. Současně můţe dojít k extrakci neţádoucích hořkých, trpkých a bylinných tónů. Vyváţené extrakce ţádoucích aromatických látek a neţádoucích tónů dosáhneme kontrolou teploty a doby macerace. U bílých vín bylo dosaţeno dobrých výsledků při teplotě macerace v rozmezí 10 15 C a době 3 24 hodin. Macerací se zvyšuje extrakt, ph, celkových polyfenolů a sníţením obsahu kyselin, především kyseliny vinné (PEINADO et al., 2004). Delší 21
doba kontaktu slupek s moštem před fermentací také pozitivně ovlivňuje rozpouštění minerálních i organických solí, které jsou obsaţeny v pevných částech bobule. Nejlepších výsledků je dosahováno krátkou dobou macerace, naopak u odrůdy Chardonnay bylo dosaţeno nejlepších výsledků šestnáctihodinovou macerací, v tomto případě mělo víno lepší aroma a bylo bez vyššího obsahu trpkých a hořkých látek (RIBÉRAU GAYON, 2006). 2.4.2. Macerace modrých hroznů při výrobě rosé vín Rosé vína jsou známá především svojí ovocností, niţší barvou, lehčí strukturou. Barevný odstín a aromatika jsou hlavními faktory při hodnocení růţových vín. Barva růţových vín a také mladých červených vín je tvořena monomery antokyanů, které se nachází v horních částech hypodermálních buněčných vrstvách slupek, a to buď volně ve vakuolách nebo v antokyanoplatech (PUÉRTOLAS et al., 2011). Délka macerace při výrobě rosé vín nemá významný vliv na hustotu, obsah alkoholu, obsah kyselin, ph, atd. 2.4.3. Macerace modrých hroznů při výrobě červených vín Mezi zaţité zvyky při výrobě červených vín patří zařazení macerace hroznů. Macerací hroznů dosáhneme vyšší extrakce barviv, taninů ze semen bobulí. To je zvláště vhodné pro odrůdy s niţší barevností a niţším obsahem fenolických látek. Dobrým příkladem je Rulandské modré. Studenou macerací je dosahováno vyšší extrakce ve vodném prostředí rozpustných látek. Kontakt pevných a tekutých částic je také lepší z důvodu, ţe vznikající a k hladině stoupající oxid uhličitý nenadnáší pevné částice a není, tak rychle na povrchu tvořen matolinový koláč. 2.4.4. Teplota a čas Největší vliv na průběh macerace má délka doby macerace a teplota macerace. Míra extrakce je velice často přímo úměrná těmto dvou faktorům. Pokles je většinou způsoben dlouhou macerací, díky vysráţení nebo degradací luhovaných látek. Krátká studená macerace minimalizuje extrakci flavonoidů (trpkost a hořkost), která ale po rychlém uvolnění neflavonoidů do moštu, probíhá snáze (J ACKSON, 2008). 22
Obrázek č. 2 Flavonoidní (A) a neflavonoidní (B) fenolický obsah moštu Chardonnay v průběhu různých maceračních teplot (teploty jsou uvedeny v C) Zdroj: Jackson, 2008 2.4.5. Kryomacerace Jedná se o techniku naleţení podchlazeného rmutu v prostředí bez přístupu vzduchu. Podstatou kryomacerace je ochlazení rmutu přibliţně na 5 C a udrţování inertního prostředí v chladící nádobě po několik hodin nebo i dní. Tento proces se děje bez přítomnosti alkoholu ve rmutu, takţe dochází k extrakci látek rozpustných ve vodě. Při kryomaceraci u modrých hroznů nám jde především o vyluhování taninů a monomerů antokyanů, které polymerizují v procesu kopigmentace a kondenzace. Ve víně se tak stabilizuje, zintenzivňuje a posiluje barva (BOULTON, 2001). Pouţití kryomacerace zajišťuje větší stabilitu vín proti oxidaci a intenzivnější odrůdové aroma (CARILLO et al., 2011). 2.4.3. Thermoflash macerace Tato technika je většinou vyuţívána u napadených, nezdravých hroznů, protoţe se u ní eliminuje dlouhodobý kontakt moštu se slupkami. Při thermoflash maceraci dochází, po zahřátí rmutu, k rychlejšímu vyluhování barviv a taninů (STEIDL, 2002). Jsou dvě techniky nebo postupy při thermoflash maceraci: 23
První technika spočívá v ohřevu rmutu na 50 55 C, 2 hodiny se nechá rmut odstát, ochladí se a poté se lisuje. Druhá technika spočívá v ohřevu rmutu na teplotu 70 C na dobu několika minut, následně je rmut ochlazen a lisován. Ohřátím rmutu na vyšší teploty dojde ke zničení a inaktivování enzymů a kvasinek, které se poté do moštu dodávají (STEIDL, 2002). 2.4.4. Karbonická macerace Tato metoda je velice málo vyuţívaná. Samotný proces spočívá v naplnění nádrţe neporušenými hrozny, v nádrţi je přítomen oxid uhličitý. Ten je bobulemi absorbován a do nádrţe musí být neustále doplňován. V popraskaných bobulích začíná probíhat alkoholová fermentace, ve zbytku neporušených hroznů probíhá proces macerace uvnitř bobulí, tvoří se malé mnoţství alkoholu kolem 2 %. Takto vyrobená vína jsou určena k rychlé spotřebě a nejsou vhodná k archivaci (DAN YI YANG, 2006). Během tohoto procesu je odbourávána kyselina jablečná, která se rozkládá na pyruvát a na etanol výsledek glykolýzy (DAN YI YANG, 2006). Během karbonické macerace vzniká mnoţství vyšších alkoholů a poměrně sloţitým procesem i kyselina succinová a shikimová. Tyto dvě kyseliny jsou hlavními a typickými prekurzory vonných látek (KRAUS, 2008). 2.5 Antiradikálová aktivita a volné radikály 2.5.1 Antiradikálová aktivita Tvoření volných radikálů je pevnou součástí aerobního procesu metabolismu a lidské tělo mu musí čelit pomocí antiradikálové aktivity. Volný radikál z chemického hlediska jakákoliv molekula, atom, iont s nepárovým elektronem ve valenční vrstvě, který je schopný, alespoň krátkodobě, sám existovat. Aerobní neboli oxidativní stres se projevuje jako nějaká nemoc. Jedná se o narušení rovnováhy mezi mnoţstvím volných radikálů (prooxidantů) a antioxidační aktivitou, ve prospěch prooxidantů (SIES, 1991). Běţně je tento poměr vyrovnaný, ale ideální poměr by měl být 1:3, ve prospěch antioxidantů (HŘEBÍČKOVÁ, 2009). Tato rovnováha můţe být samozřejmě i v opačném poměru, kdy dochází ke zvyšování produkce reaktivních forem dusíku a kyslíku (po podání léků nebo chemikálií), nebo při sníţení hladiny antioxidantů. Pokud 24
trvá doba oxidativního stresu příliš dlouho, můţe vést k poškození buněk a některé můţou dojít aţ do stádia buněčné smrti. Reaktivní formy kyslíku a dusíku (RONS) jsou z buněk odstraňovány činností superoxiddismutasy (SOD), glutathionperoxidasy a katalasy. Oxidativní stres a s ním spojené reaktivní metabolity se velmi silně podílí na vzniku a rozvoji mnoha nemocí (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, rakovina, a další), (NICHOLLS and BUDD, 2000). Antiradikálové obranné mechanismy Antioxidační obranný mechanismus je stejně důleţitý, jako mechanismus, který chrání lidské tělo před reaktivními dusíkovými metabolity, např. peroxynitrit. Lidský organismus vyuţívá 3 typy obranných mechanismů: 1. Obrana při něm se organismus brání nadměrné produkci RONS, například vychytáváním přechodných kovů z reaktivních molekul (transferin, feritin), anebo regulací aktivity enzymů, které tvoří RONS 2. Zachycení a odstranění radikálů tyto látky jsou označovány jako vychytavače (scavengers) superoxiddismutasa, lapače (trapers) - vitamin E a zhášeče (quenchers) - β-karoten 3. Reparace systémy, které z těla odstraňují poškozené molekuly z organismu (DLUGOŠOVÁ et al., 2004) 2.5.2. Volné radikály Superoxidový radikál Má zároveň oxidační i redukční vlastnosti. Při disputaci (reakci dvou superoxidů), kdy jedna molekula superoxidu poskytuje elektron druhé tzn. superoxid zároveň oxiduje i redukuje a produkty této reakce jsou voda a peroxid vodíku. O 2 - + O2 - + 2H + O2 + H 2 O 2 Ve vodním prostředí probíhá reakce velice rychle, v lidském organismu je reakce navíc ještě urychlována enzymem superoxiddismutásou. 25
Peroxid vodíku Není to klasický zástupce radikálů, vzniká dismutací ze superoxidu (za účasti enzymu superoxiddismutásy) nebo přímo z kyslíku. Za přítomnosti Fe 2+ a Cu + je jeho aktivita násobena. Peroxid vodíku se poté redukuje: Fentonova reakce: H 2 O 2 + Fe 2+ HO + OH - + Fe 3+ Kyselina chlorná Tato kyselina je syntetizována fagocyty (hlavně neutrofilními granulocyty, pomocí enzymu myeloperoxidasy). H 2 O 2 + Cl - + H + HClO + H 2 O Jedná se o velice silný oxidant, který je organismem vyuţíván pro své silné mikrobicidní účinky. Oxid dusnatý Molekula oxidu dusnatého je velice jednoduchá, ale i přesto hraje důleţitou roli v lidském organismu. Jedná se hlavní signální molekulu neuronů, imunitního systému a důleţitou funkci má i ve vnitřní straně cév. Působí uvnitř buněk, které jej produkují, nebo proniká buněčnými membránami a ovlivňuje ostatní okolní buňky. Koncentrace NO in vivo je nízká. V těle je syntetizovaný, sloţitým enzymovým mechanismem, který je katalyzován syntasou oxidu dusnatého (NOS). Oxid dusný patří mezi radikály, ale s většinou bio molekul, včetně kyslíku reaguje velice pomalu. Rychle proniká do krve a zde je průběţně vychytáván v červených krvinkách. V organismu působí ve třech funkčních oblastech, odpovídajících přítomnosti jeho syntéz (ŠTÍPEK, 2000). A) v CNS a v autonomním nervovém systému B) v imunitním systému C) v cévní soustavě 26
Peroxynitrit Peroxynitrit (OONO - ) je toxický. V organismu vzniká reakcí oxidu dusnatého a superoxidu. Jedná se také o oxidační činidlo. NO + O 2 - OONO - Pro peroxynitrit nejsou vhodné fyziologické podmínky (ph 7), in vivo reaguje a aminokyselinou tyrozinem, ze které odštěpuje hydroxylovou i aminovou skupinu. Funkce volných radikálů v těle člověka a jejich vliv na vývoj nemoci Zdroje volných radikálů můţeme rozdělit na exogenní a endogenní, protoţe se do organismu můţou dostat zvnějšku nebo je můţe tělo tvořit samo (patologicky i fyziologicky). Exogenní zdroje volných radikálů: UV záření, modré světlo ((léčba hyperbilirubinémie u novorozenců) Vysoký obsah škodlivých látek ve vzduchu (doprava, tepelné elektrárny, průmyslová výroba) Intoxikace (polychlorované bifenyly, chloroform, alkohol) Kouření Potrava Endogenní zdroje volných radikálů: Rozpad mikrofágů a fagocytů (záněty, popáleniny) Vznik kyseliny močové (při úrazech, pooperačních stavech) Zvýšený metabolismus estrogenů Syntéza prostaglandinů Hyperglykémie Autooxidace thiolů 27
Některé volné radikály působí na lidský organismus pozitivně, ovšem jen za určitých podmínek. Jiné radikály jsou škodlivě působící. Příznivé účinky volných radikálů: Usmrcování a bakterií a parazitů makrofágy Usmrcování nádorových buněk T buňky Osteoklasty remodelace kostí Průnik spermií do vajíčka Škodlivé účinky volných radikálů: Peroxidace membránových a nemembránových lipidů Oxidativní poškození DNA a RNA Oxidativní poškození sacharidů 2.6. Antioxidanty 2.6.1. Vysokomolekulární enzymové antioxidační systémy Superoxiddismutasy SOD byla poprvé zjištěna a objevena v roce 1969 profesory Freedvichem a McCordem. Uvádí se, ţe tento enzym je stejně starý jako přeměna redukční atmosféry na oxidační. Patří mezi metaloenzymy, je katalyzátorem dismutace superoxidu na molekulární kyslík a peroxid vodíku. Díky SOD enzymu probíhá reakce rychleji (aţ o 4 řády), neţ samovolná reakce. A) CuZnSOD Cu 2+ (katalytická funkce), Zn + (stabilizační funkce); jedná se o velmi stabilní enzym, který katalyzuje při ph 4,5 9,5, nachází se hlavně v cytosolu B) MnSOD rozšířen u bakterií, zvířat a rostlin, fylogeneticky starší; nachází se v matrix mitochondrií C) FeSOD enzym, zjištěný u bakterií a rostlin, nezjištěn u ţivočišných buňkách D) EC-SOD extracelulární SOD, objeven u ţivočichů; obsahuje ionty mědi a zinku, má stejnou funkci, jako CuZnSOD, výskyt ve štítné ţláze, vázán také na laminární povrch endotelových buněk 28
Glutathionperoxidázy Peroxidasy odstraňují peroxid vodíku pomocí oxidace jiného substrátu (obsahující SH skupinu). SH 2 + H 2 O 2 S + 2H 2 O Cytosolová GSH glutathionperoxidasa (cgpx) v organismu spolupracuje s katalasou při odstraňování peroxidu vodíku z organismu Fosfolipidhydroperoxid-GSH-peroxidasa (PHGPx) - účinně zabraňuje neenzymové lipidové peroxidaci tak, ţe redukuje α-tokoferol na příslušný hydroxyperoxid a ten je následně enzymem PHGPx oxidován na GSH (ŠTÍPEK et al., 2000) Kromě těchto dvou uvedených enzymů existují u člověka ještě další dvě glutationperoxidasy (gastrointestinální, plazmatická). Glutathiontransferázy Tyto enzymy, obsaţené v cytosolu, katalyzují konjugační reakci, při, které je sulfhydrolová skupina (GSH) navázána na elektrofilní organickou látku; chrání organismus před peroxidací lipidů Katalasa Enzym, který katalyzuje rozklad peroxidu vodíku na vodu a kyslík. Kataláza má jedno z nejvyšších čísel přeměny ze všech enzymů jedna molekula katalasy dokáţe převést na vodu a kyslík, během jediné sekundy, několik milionů molekul peroxidu vodíku 2.6.2. Vysokomolekulární neenzymové antioxidanty Mezi vysokomolekulární neenzymové antioxidanty patří například ţelezo a měď. Jsou přítomny v syntéze enzymů a jiných proteinů, které jsou důleţité pro dýchání, přenos kyslíku a některé redoxní reakce. Mohou však znamenat potenciální riziko, kvůli své schopnosti jednoelektronového transferu (z ţelezitého kationtu ţeleznatý kationt, z měďnatého měďný kationt). Mnoho proteinů dokáţe vázat tyto kovy a dokáţe měnit jejich oxidoredukční vlastnosti, tak, ţe tyto kovy přestanou slouţit jako katalyzátory radikálových reakcí. Mezi tyto proteiny můţeme zařadit transferin, 29
laktoferin, feritin. Transferin je součástí součástí krevní plazmy, laktoferin se nachází v leukocytech. Tyto proteiny váţou trojmocné ţelezo a zabraňují tím vstupu trojmocného ţeleza do Fentonovy reakce. Feritin má feroxidasovou aktivitu umoţňuje skladovat nitrobuněčné ţelezo. Dvojmocné ţelezo po vstupu do feritinu oxiduje na trojmocné. Toto ţelezo je zde uloţeno do té doby, neţ ho uvolní silně redukující látka (urát, thiol), (HALLIWELL and GUTTERIDGE, 1999). 2.6.3. Nízkomolekulární přírodní antioxidanty Kyselina askorbová vitamín C Kyselina askorbová se vyskytuje ve čtyřech různých stereoisomerech, ovšem pouze kyselina L askorbová vykazuje biologickou aktivitu. Askorbová kyselina je syntetizována všemi fototrofními rostliny z D manózy. Kyselina askorbová je důleţitým kofaktorem enzymů, které katalyzují bio syntézu kolagenu a proměnu dopaminu na noradrenalin. Z hlediska chemického se jedná o redukční činidlo, schopnost askorbátu redukovat ţelezitý kationt na ţeleznatý, je důleţitá při jeho vstřebávání ve střevech, ale zároveň i nebezpečné protoţe se v této formě účastní Fentonovy reakce (KADIISKA et al., 1995). Antioxidační vlastnosti kyseliny askorbové spočívají v redukci anorganických i organických radikálů (O - 2, HO 2, HO, RO 2, NO 2 ). Je paradoxní, ţe vitamín C můţe být antioxidant i prooxidant (PORTER, 1995) Doporučená denní dávka je 60 mg. Ve vinařství se pouţívá jako aditivum, které můţe sníţit dávku oxidu siřičitého. Po delším skladování vína s přídavkem vitaminu C, dochází k oxidaci daného vína. Vitamín E Vitamín existuje ve formě 8 izomerů, které se strukturně podobají benzen-6-olu, ze kterých je biologicky nejúčinnější α tokoferol. Vzniká spolu s vitaminem K, plastochinony a ubichinony z kyseliny šikimové. α tokoferol je lipofilní antioxidant, který u eukaryot působí jako ochrana nenasycených mastných kyselin před volnými radikály. Společně s β karotenem a koenzymem Q chrání integritu a strukturu bio membrán buněčné (cytosolové) membrány (plasmalemi), ale hlavně chrání membrány buněčných organel (jádra, mitochondrií, lysozomů, endoplazmatického retikula). 30
Jedná se o vitamín, který je rozpustný v tucích. Adekvátní denní příjem vitaminu E působí, jako prevence proti oxidaci lipidů bio membrán. Vitamin E zpomaluje stárnutí organismu, působí preventivně proti kardiovaskulárním chorobám a nádorovým onemocněním (rakovině). Hlavními zdroji tohoto vitaminu jsou ořechy, listová zelenina a rostlinné oleje. 2.6.4. Antioxidační aktivita fenolických látek v hroznech révy vinné V hroznech je obsaţeno mnoho důleţitých látek, např. vitamíny, minerály, cukry a fytochemikálie. K nejdůleţitějším fytochemikáliím patří polyfenolické látky. Mezi fenolické látky patří antokyany, flavanoly, flavonoly, stilbeny a fenolické kyseliny. V dnešní době se svět a odborníci věnují výzkumu fenolických látek a jejich vlivu na lidské zdraví (XIA et al, 2010) Tab č.1 Biologická aktivita fenolických látek z hroznů Fenolická látka Resveratrol Kvercetin Katechin Flavonol Prokyanidin Antokyanin Kyselina gallová Epikatechin Biologická aktivita vychytávání volných radikálů, zvýšení plazmatické hladiny NO, regulace metabolismu lipidů; ochrana proti membránové oxidaci antibakteriální, zvýšení plazmatické hladiny NO antikarcinogenní, vychytávání volných radikálů, protizánětlivý, antibakteriální vychytávání volných radikálů antikarcinogenní, vychytávání volných radikálů, protizánětlivý, antioxidační vychytávání volných radikálů, antibakteriální, antioxidační, vychytávání volných radikálů antibakteriální 31
Tabulka č. 2 Antioxidační aktivita z extraktů hroznů a odpadu při výrobě vína Zdroj Semena hroznů Mošt Červené víno Ovocná šťáva (hrozen+pomeranč+meruňka Bílé víno Hroznová semena zbavená tuku Extrakt z hroznových semen Koncentrát dietní vlákniny z bílých hroznů Antioxidační aktivita Snížení oxidace LDL cholesterolu v plazmě Snížení oxidačního stresu v séru Ochrana proti membránové oxidace Saccharomyces cerevisiae vyvolaná peroxidem vodíku Ochrana mitochondrií, ochrana před oxidačním stresem vyvolánym peroxidem vodíku Ochrana před zvýšenou hladinou cholesterolu a proti zanešení aorty tukem Snižování oxidačního stresu, zvyšování hladiny GSH a ATP Konzervační látky pro rybí maso a oleje Antioxidační aktivity v oleji pro polynenasycené mastné kyseliny 32
3. Cíl práce Cílem této bakalářské práce bylo soustředit se na obsaţené fenolické látky v moštech révy vinné, vyhodnotit data z pokusu, který byl součástí práce, a soustředit se na vliv fenolických látek a antioxidantů na lidské zdraví. V teoretické části bylo cílem popsat a rozdělit fáze vývoje hroznu, biochemické sloţení hroznu, fenolické a zdraví prospěšné látky obsaţené v moště a jejich vliv na lidský organismus. V praktické části bylo úkolem na základě laboratorních měření sledovat změnu základních analytických hodnot moštů cukernatost, ph, obsah titrovatelných kyselin a také změny hodnot antiradikálové aktivity, optické hustoty, katechinů. Hrozny pouţité při této práci pocházely z katastru Velkých Bílovic, které se nachází ve velkopavlovické vinařské podoblasti. Po naměření hodnot bylo hlavním cílem získat přehled z dostupných vědeckých zdrojů o změnách obsahu fenolických látek, hodnot antiradikálové aktivity a antioxidační aktivity v průběhu zpracování a macerace hroznů. 33
4. Praktická část 4.1. Ampelografická charakteristika použitých odrůd Neuburské je bílá moštová odrůda. S vysokou pravděpodobností se jedná o semenáč vyplavený v okolí Wachau v Rakousku řekou Dunaj. Tuto odrůdu můţeme povaţovat za typickou pro středoevropskou vinařskou oblast, zejména pro Rakousko a Českou republiku. Odrůda raší na konci dubna, kvete ve druhé dekádě června, zaměkání nastává v polovině srpna, dozrává v druhé polovině září aţ začátkem října. Poţadavky na stanoviště jsou střední, dobře se jí daří ve svaţitých, dobře situovaných polohách, které jsou chráněné proti větru. Rodí dobře na chudších, sušších i silně vápenatých půdách. Odolnost vůči chorobám je nízká aţ velmi nízká. Sauvignon je také bílá moštová odrůda. Jedná se o starou odrůdu z okolí Bordeaux, nebo vinařských oblastí kolem řeky Loiry. V poslední době, na základě informací získaných genetickou analýzou, se uvádí, ţe vznikla kříţením odrůd Chenin Blanc x Tramín. Pěstuje se téměř ve všech vinařských regionech a zemích na celém světě. U nás se začala rozšiřovat v 50. letech 20. století. Odrůda raší ve druhé aţ třetí dekádě dubna, kvete v první polovině června, zaměkání můţeme pozorovat v polovině srpna. Sauvignon dozrává koncem září nebo začátkem října. Poţadavky na polohu jsou vysoké. Potřebuje dobré polohy ve vyšších částech svahů, které jsou chráněny proti mrazu. Dobře snáší i méně úrodné kamenité a písčité půdy. Nevyhovují jí půdy extrémně suché, ale i naopak extrémně vlhké, z důvodu hnití hroznů. Odrůda je málo aţ velmi málo odolná vůči chorobám (PAVLOUŠEK, 2008). 4.2. Stanovištní podmínky Hrozny byly vypěstovány v katastru Velkých Bílovic, ve viniční trati Dlouhá hora, kde jsou vinice orientovány na jihozápad a jedná se mírný svah. Jedná se o trať s úrodnou černozemí na spraši, s příznivým vodním reţimem. Vinice je zatravněna obřádek a obhospodařována v reţimu integrované produkce. Vedení je hesensko-rýnské na 2 taţně po 9 očkách, při sponu 3,0 x 0,9 m. Vinice v trati Přední hora je orientována také jihozápadně a také se jedná o mírný svah. Je zde karbonátová černozem na slínitých a jílovitých substrátech, těţká půda s lehčí ornicí a těţkou spodinou, občas převlhčená. Vinice je obhospodařována v reţimu integrované produkce, je obřádek zatravněna. Vedení je hesensko-rýnské, na 2 taţně po 7 očkách, při sponu 2,6 x 0,9 m. (ČAPKA, 1996) 34
4.3. Materiál a metody Po ručním sběru byly hrozny ošetřeny disiřičitanem draselným v dávce 30 mg/kg hroznů, poté zpracovány na mlýnkoodstopkovači a rmut byl skladován v 50 l platových kanystrech. U odrůdy Sauvignon byly prováděny 2 varianty, jedna chlazená PET lahví se zmrzlou vodou, druhá nechlazená. U chlazené varianty se teploty pohybovaly v rozmezí 6 7,5 C, u nechlazené varianty v rozmezí 11 13 C. U Neuburského byla provedena pouze nechlazená varianta, teplota se pohybovala v rozmezí 11 13 C. Ihned po zpracování byly odebrány první vzorky po 0 hodinách macerace, do kaţdé lahvičky bylo přidáno několik kapek tekutého oxidu siřičitého. Při odběru kaţdého vzorku po 0, 2, 4, 8, 12, 24, 48 hodinách byla sledována teplota a před odběrem byl rmut promíchán a po odběru byly všechny vzorky okamţitě zamraţeny. Tab. č. 3 Cukernatost hroznů při sběru, datum sběru a průměrná teplota během macerace Odrůda/varianta Cukernatost [ NM] Datum sběru Průměrná teplota během macerace [ C] Sauvignon/nechlazená 20 26.9.2013 12,23 Sauvignon/chlazená 20 27.9.2013 7,11 Neuburské/nechlazená 18 5.10.2013 12,50 4.3.1 Stanovení celkového obsahu flavanolů Koncentrace celkových flavanolů byla stanovena pomocí metody zaloţené na reakci p - dimethylaminocinnamaldehydu (DMACA). Na rozdíl od jiných metod zde nedochází k interferenci s antokyany a navíc je zde zajištěna vyšší citlivost a selektivita. Do mikrozkumavky Eppendorf o objemu 1,5 ml obsahující 980 μl roztoku činidla 0,1% DMACA a HCl s koncentrací mmol.l -1 v metanolu bylo přidáno 20 μl vzorku, směs byla protřepána a ponechána 12 minut při laboratorní teplotě. Poté byla změřena absorbance při 640 nm proti slepému pokusu připravenému stejným způsobem, jen místo vzorku byl přidán ředicí pufr. Koncentrace celkových flavanolů byla vypočtena z kalibrační křivky za pouţití katechinu, jako standardu (10-200 mg.l-1) Výsledky jsou vyjádřeny ve formě mg.l -1 ekvivalentů katechinu. 35