MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITAV BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA ÚSTAV AGROCHEMIE, PŮDOZNALSTVÍ, MIKROBIOLOGIE A VÝŽIVY ROSTLIN

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITAV BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA ÚSTAV AGROCHEMIE, PŮDOZNALSTVÍ, MIKROBIOLOGIE A VÝŽIVY ROSTLIN STANOVENÍ INDIKÁTOROVÝCH MIKROORGANIZMŮ PRO PÍSKY Z ČISTÍREN ODPADNÍCH VOD DIPLOMOVÁ PRÁCE Vedoucí práce: Mgr. Monika Szostková, Ph.D. Vypracoval: Bc. Pavel Hudeček BRNO 2010

2

3

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení indikátorových mikroorganizmů pro písky z čistíren odpadních vod vypracoval samostatně a použil jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne.. podpis diplomanta...

Na tomto místě bych chtěl poděkovat Mgr. Monice Szostkové, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a připomínky při zpracování diplomové práce.

ANOTACE Hudeček P.: Stanovení indikátorových mikroorganizmů pro písky z čistíren odpadních vod Diplomová práce se zabývá stanovením indikátorových mikroorganizmů pro písky z čistíren odpadních vod a vychází ze sledování zastoupení jednotlivých skupin mikroorganizmů ve vzorcích písků odebíraných na čistírnách odpadních vod v Jihomoravském kraji. Cílem diplomové práce bylo zpracovat literární rešerši, v níž budou shrnuty poznatky na dané téma, experimentálně vyhodnotit zastoupení indikátorových mikroorganizmů ve vzorcích písku, výsledky experimentů zpracovat ve formě tabulek a grafů, vyhodnotit výsledky experimentů a porovnat výsledky s literaturou formou diskuze. Z výsledku mikrobiálních analýz z devíti vybraných čistíren odpadních vod v Jihomoravském kraji vyplynulo, že vzorky čistírenských písků vykazovaly odlišné množství organického podílu. Z hlediska výskytu koliformních bakterií nevyhovovala jedna třetina vzorků normou stanoveným mikrobiálním kritériím pro použití kalů kategorie II na zemědělské půdy, naopak z hlediska výskytu enterokoků a fekálních koliformních bakterií vyhovovaly kritériím všechny vzorky čistírenských písků. Ve vzorcích se nacházel vysoký podíl organické hmoty, což znamená, že díky odstraňování čistírenských písků na skládky dochází k předčasné eliminaci této organické hmoty ze systému. Klíčová slova: Čistírna odpadních vod, písky, kaly, indikátorové mikroorganizmy

ANNOTATION Hudeček P.: Determinating of indicator-microorganisms for sands from the Wastewater treatment plants The dissertation is concerned with the determinating of indicator-microorganisms for sands from the SCP and is educed from monitoring the apportionment of single groups of microorganisms in the sand samples from the SCP in district South Moravia. To elaborate a literary research completing knowledges in this theme, experimentally evaluate the apportionment of indicator microorganisms in sand samples, elaborate tables and diagrams from the results of experiments, evaluate the experiment results and compare them with the technical literature by discuss these were the ambitions of the thesis. The results of microbial analysis from nine specied SCP (in district South Moravia) brought the knowledge that the SCP sand samples showed different masses of organic proportion. Seen as the coliphorm bacteries occurence, one third of samples did not comply with normed microbial criterions for appliance of sewage sludges cat. II on agricultular soils. In opposite, seen as the enterococci and the fecal coliphorm bacteries occurence all the samples complied with the criterions. There was a high proportion of organic mass found in the samples, what means the praecox elimination of this organic mass from the system is realised thanks the retrieving the SCP sands to dumping grounds. Keywords: Wastewater treatment plants, sands, sewage sludges, indicatormicroorganisms

OBSAH: 1 ÚVOD... 10 2 CÍL PRÁCE... 12 3 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY... 13 3.1 Legislativa týkající se odpadních vod... 13 3.2 Odpadní voda... 16 3.3 Čistírny odpadních vod (ČOV)... 18 3.3.1 Procesy v čistírně odpadních vod... 20 3.3.2 Mechanické čištění odpadních vod... 22 3.3.3 Lapáky písku... 22 3.4 Význam biologie v technologii čištění odpadních vod... 26 3.5 Mikrobiologie odpadních vod... 28 3.5.1 Čeleď Enterobacteriaceae... 30 3.5.1.1 Koliformní bakterie... 31 3.5.1.2 Nekoliformní bakterie... 32 3.5.2 Enterokoky... 34 4 MATERIÁL A METODY... 36 4.1 Kultivační půdy a roztoky... 36 4.2 Přístrojové vybavení... 40 4.3 Materiál... 40 4.4 Odběr vzorků... 41 4. 5 Metody mikrobiálních analýz... 43 4.5.1 Příprava výchozí suspenze... 43 4.5.2 Stanovení termotolerantních koliformních bakterií... 44 4.5.3 Stanovení enterokoků... 44 4.5.4. Stanovení fekálních koliformních mikroorganizmů... 44 4.5.5 Stanovení Salmonella sp... 45 4.5.5.1 Neselektivní předpomnožení... 45 4.5.5.2 Selektivní pomnožení... 45 4.5.5.3 Vyočkování a identifikace... 45 4.5.5.4 Interpretace výsledků... 46 4.5.5.5 Vyhodnocení... 46

4.6. Enterotest 24 (Pliva Lachema)... 47 5 VÝSLEDKY A DISKUZE... 49 6 ZÁVĚR... 60 7 LITERATURA... 61 8 SEZNAM OBRÁZKŮ... 65 9 SEZNAM TABULEK... 65 10 SEZNAM GRAFŮ... 66

1 ÚVOD Diplomová práce se zabývá stanovením indikátorových mikroorganizmů pro písky z čistíren odpadních vod a vychází ze sledování zastoupení jednotlivých skupin mikroorganizmů ve vzorcích písků odebíraných na čistírnách odpadních vod v Jihomoravském kraji. Z hlediska platné legislativy, především zákona o odpadech č. 185/2001 Sb., kterou se stanoví Katalog odpadů, ve znění pozdějších předpisů, je písek z lapáku písku podle přílohy č. 1 této vyhlášky zařazen v katalogu odpadů pod názvem odpady z lapáku písku a číslem 19 08 02 jako odpad ostatní (O) a tak je s pískem také nakládáno. A to i přes to, že tento odpad může vykazovat minimálně jednu z nebezpečných vlastností uvedených v příloze č. 2 zákona č. 185/2001 Sb. nebo obsahovat jednu ze složek, které činí odpad nebezpečným ve smyslu přílohy č. 5 zákona č. 185/2001 Sb. Touto vlastností je infekčnost. Proto byly písky z čistíren odpadních vod podrobeny mikrobiologickým rozborům (Vítěz a kol., 2009). Jelikož není problematika zpracování písku z čistíren odpadních vod legislativně zpracována, vycházelo se při mikrobiologických analýzách z pravidel pro nakládání z čistírenskými kaly a to z prováděcí vyhlášky č. 382/2001 Sb., o podmínkách použití upravených kalů na zemědělské půdě. V této vyhlášce jsou stanoveny technické podmínky pro použití kalů na zemědělské půdy, limitní koncentrace vybraných rizikových látek v kalech a půdě včetně mikrobiologických kritérií. Tato vyhláška stanovuje přípustná množství indikátorových mikroorganizmů. Jedná se o termotolerantní koliformní bakterie, enterokoky a Salmonella sp. Tab. 1: Přípustná množství indikátorových mikroorganizmů Kategorie kalů Přípustné množství mikroorganizmů (KTJ*) v 1 gramu sušiny aplikovaných kalů Termotolerantní Enterokoky Salmonella sp. koliformní bakterie I. < 10 3 < 10 3 negativní nález II. 10 3 10 6 10 3 10 6 nestanovuje se 10

Vysvětlivky k tabulce č.1: Kategorie I - kaly, které je možno obecně aplikovat na půdy využívané v zemědělství při dodržení ostatních ustanovení této vyhlášky. Kategorie II kaly, které je možno aplikovat na zemědělské půdy určené k pěstování technických plodin a na půdy, na kterých se nejméně 3 roky po použití čistírenských kalů nebude pěstovat polní zelenina a intenzivně plodící ovocná výsadba a při dodržení zásad ochrany zdraví při práci a ostatních ustanovení vyhlášky. Odpadová politika EU potlačuje ukládání odpadů na skládky a podporuje předcházení vzniku odpadů, jejich minimalizaci a recyklaci. Produkci kalů nelze zabránit, pouze lze výběrem technologie zmenšit jeho množství. Požadavkem je takové využití nebo zpracování kalů, které je přijatelné pro životní prostředí, udržitelné a ekonomicky únosné. Zpracování kalů obvykle stojí více než polovinu celkových nákladů na čištění odpadních vod (www.mzp.cz/cz/kaly_cistiren_odpadnich_vod). K aktuálním problémům většiny čistíren odpadních vod patří efektivní, nezávadný a levný způsob zneškodnění a využití čistírenských kalů. Jednou z možností je jejich využití k hnojení a zúrodňování zemědělských půd, což poukazuje na možnost, jak efektivně využít stabilizovaných, hygienicky nezávadných čistírenských kalů (Hýblerová, 2005). Cílem diplomové práce je tedy stanovení indikátorových mikroorganizmů ve vzorcích písků z čistíren odpadních vod a posouzení jejich vhodnosti pro další využití, jako je například aplikace písků z čistíren odpadních vod do půdy. 11

2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je: Zpracovat literární rešerši, v níž budou shrnuty poznatky na dané téma. Experimentálně vyhodnotit zastoupení indikátorových mikroorganizmů ve vzorcích písku. Výsledky experimentů zpracovat ve formě tabulek a grafů. Vyhodnotit výsledky experimentů. Porovnat výsledky s literaturou formou diskuze a shrnout je v závěru práce. 12

3 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 3.1 Legislativa týkající se odpadních vod Obecným cílem státní politiky v oblasti vod je vytvořit podmínky pro udržitelné hospodaření s omezeným vodním bohatstvím České republiky. To znamená soulad požadavků všech forem užívání vodních zdrojů s požadavky ochrany vod a vodních ekosystémů, při současném zohlednění opatření ke snížení škodlivých účinků vod. Hlavní zásady státní politiky v oblasti vod pak vycházejí z tzv. Rámcové směrnice EU o vodní politice, dalších směrnic z oblasti voda a z obnovené strategie EU pro udržitelný rozvoj (http://www.mzp.cz/cz/voda). Mezi základní legislativní nástroje zabývající se odpadními vodami v České republice patří: Zákon č. 254/2001 Sb., o vodách a o změně některých zákonů (vodní zákon) Zákon č. 477/2001 Sb., o obalech a o změně některých zákonů(zákon o obalech) který vymezuje povinnosti při nakládání s čistírenskými kaly Nařízení vlády ČR č. 61/2003 Sb. o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění povrchových vod a odpadních vod, náležitostech povolení k vypouštění odpadních vod do vod povrchových a do kanalizací a o citlivých oblastech Vyhláška MŽP ČR č. 293/2002 Sb. o poplatcích za vypouštění odpadních vod do vod povrchových Vyhláška č. 110/2005 Sb., kterou se mění vyhláška Ministerstva životního prostředí č. 293/2002 Sb., o poplatcích za vypouštění odpadních vod do vod povrchových V současnosti je hlavním nástrojem pro ochranu vod v České republice zákon č. 254/2001 Sb., o vodách a o změně některých zákonů (vodní zákon). Účelem tohoto zákona je chránit povrchové a podzemní vody, stanovit podmínky pro hospodárné využívání vodních zdrojů a pro zachování i zlepšení jakosti povrchových a podzemních vod, vytvořit podmínky pro snižování nepříznivých účinků povodní 13

a sucha a zajistit bezpečnost vodních děl v souladu s právem Evropských společenství a také přispívat k ochraně vodních ekosystémů a na nich přímo závisejících suchozemských ekosystémů. Tento zákon charakterizuje odpadní vody v 38 následovně: Odpadní vody jsou vody použité v obytných, průmyslových, zemědělských, zdravotnických a jiných stavbách, zařízeních nebo dopravních prostředcích, pokud mají po použití změněnou jakost (složení nebo teplotu), jakož i jiné vody z nich odtékající, pokud mohou ohrozit jakost povrchových nebo podzemních vod. Odpadní vody jsou i průsakové vody z odkališť, s výjimkou vod, které jsou zpětně využívány pro vlastní potřebu organizace, a vod, které odtékají do vod důlních, a dále jsou odpadními vodami průsakové vody ze skládek odpadu. Zákon č. 477/2001 Sb., o obalech a o změně některých zákonů (zákon o obalech) vymezuje povinnosti při nakládání s čistírenskými kaly. Kal je nevyhnutelným odpadem při čištění odpadních vod. Zpracování těchto vod je navrženo tak, aby odstraňovalo nežádoucí složky z vody a koncentrovalo je do objemově nevýznamného vedlejšího proudu - kalu. Kal může také obsahovat přebytečnou biomasu z biologického čištění. Cílem úpravy kalů je zabránit nepříznivým dopadům na životní prostředí a lidské zdraví. Koncentrace prospěšných i znečišťujících složek v kalu (a zdravotní rizika s nimi spojená) závisí na počáteční kvalitě odpadní vody a na úrovni požadované technologie, která zaručí dosažení kvalitativních požadavků na vyčištěnou odpadní vodu. Legislativně je problematika kalů upravena vyhláškou č. 382/2001 Sb., Vyhláška Ministerstva životního prostředí o podmínkách použití upravených kalů na zemědělské půdě (http://www.mzp.cz/cz/kaly_cistiren_odpadnich_vod), která v 1 vymezuje technické podmínky použití upravených kalů na zemědělské půdě následovně: nejpozději do 48 hodin od umístění kalů na zemědělskou půdu musí být kaly zapraveny do půdy; potřeba dodání živin do půdy na pozemku určeném k umístění kalů musí být doložena výsledky rozborů agrochemických vlastností půd uvedenými v evidenčním listu využití kalů v zemědělství podle přílohy č. 1; nesmí se použít více než 5 tun sušiny kalů na jeden hektar v průběhu 3 po sobě následujících let. Toto množství může být zvýšeno až na 10 tun sušiny kalů v průběhu 5 po sobě následujících let, pokud použité kaly obsahují méně než polovinu limitního množství každé ze sledovaných rizikových látek a prvků. 14

Přesné stanovení dávky sušiny se vypočte ze zjištěného obsahu dusíku. Dávka dusíku dodaného v kalech nesmí překročit 70 % celkového potřebného množství dusíku pro hnojenou plodinu. Dávka kalů (množství a doba užití) se řídí i požadavkem rostlin na živiny s přihlédnutím k přístupným živinám a organické složce v půdě, jakož i ke stanovištním podmínkám; dávka kalu stanovená podle podmínek uvedených v odstavci c) je na pozemek aplikována v jedné agrotechnické operaci a v jednom souvislém časovém období za příznivých fyzikálních a vlhkostních podmínek; minimální obsah sušiny kalu pro tlakové zapravení do půdy radlicovými aplikátory je 5 %, minimální obsah sušiny kalu pro aplikaci mechanickými rozmetadly organických hnojiv je 18 % (vyhláška č. 382/2001 Sb.). Technické normy: V České republice se technickou normalizací zabývá Český normalizační institut a normy jsou řazeny v seznamu dle šestimístného třídícího znaku včetně mezinárodních norem ISO a EN zaváděných do soustavy ČSN. Počátek technické normalizace ve vodním hospodářství byl v šedesátých letech minulého století. Technické normy vodního hospodářství byly zařazovány do tříd 01, 13, 73 a 83. Od roku 1986 jsou normy vodního hospodářství zařazovány do třídy 75. V roce 1975 vznikl Evropský výbor pro normalizaci (CEN), který zpracovává a vydává evropské normy (EN). Česká republika je řádným členem CEN od roku 1997 a od tohoto roku je povinna zavádět EN do soustavy ČSN. K 31.12. 1993 byla ukončena platnost oborových norem (ve vodním hospodářství existoval soubor 50 oborových norem) a převedení oborových norem na ČSN nebylo možné, proto vznikly odvětvové technické normy vodního hospodářství (TNV). TNV obsahují např. požadavky na navrhování vodohospodářských staveb a zařízení, názvosloví, provozní a manipulační řády aj. (http://eagri.cz/public/eagri/file/30385/ _6_Technicka_normalizace.pdf). 15

3.2 Odpadní voda Dle zákona č. 254/2001 Sb. o vodách jsou odpadní vody vody použité v obytných, průmyslových, zemědělských, zdravotnických a jiných stavbách, zařízeních nebo dopravních prostředcích, pokud mají po použití změněnou jakost (složení nebo teplotu), jakož i jiné vody z nich odtékající, pokud mohou ohrozit jakost povrchových nebo podzemních vod. Odpadní voda je voda, jejíž kvalita byla zhoršena lidskou činností. Znečištění vody může být tvořeno rozpuštěnými nebo nerozpuštěnými látkami, za znečištění se ale považuje i například tepelné nebo radioaktivní znečištění. V naprosté většině případů musí být odpadní voda před vypuštěním do vodotečí čištěna. Odpadní voda se silným rozložitelným organickým znečištěním bývá vodou polysaprobní. Podle saprobního indexu se dá odhadovat míra znečištění odpadních vod. K přesnému stanovení znečišťujících látek však slouží chemické rozbory (http://cs.wikipedia.org/wiki/ Odpadní_voda). Odpadní vody se dělí na tři hlavní skupiny, na vody: splaškové; městské; průmyslové. Podskupinu tvoří odpadní vody ze zemědělství a chovu zvířat. Ve velkých a malých městech obytného charakteru převládají odpadní vody splaškové, v malých městech průmyslového charakteru to může být naopak. Splaškové odpadní vody (splašky): Jsou to odpadní vody z domácností, hygienických zařízení, objektů společného stravování, ubytování apod. (Porter, 2009). Do této kategorie spadají i odpadní vody z obecní, resp. městské vybavenosti (školy, úřady, restaurace a hotely apod.), které mají obdobný charakter jako odpadní vody z domácností. Většina této vody po použití odtéká do kanalizace (Vítěz a Groda, 2008). 16

Městské odpadní vody: Jsou směsí splašků a průmyslových odpadních vod, popř. vody dešťové a jiné vody (např. z čištění ulic a veřejných prostranství) odváděné veřejnou kanalizací (Porter, 2009). Průmyslové odpadní vody: Jsou vody použité a znečištěné ve výrobním procesu (včetně vod chladících), které jsou ze závodu vypouštěny a pro daný proces jsou již nepoužitelné. Řadí se mezi ně i odpadní vody ze zemědělství (Porter, 2009). Jedná se o odpadní vody vypuštěné do veřejné kanalizace z průmyslových závodů. Tyto vody musí být před vypuštěním ze závodu do veřejné kanalizace upraveny tak, aby vyhovovaly provoznímu řádu kanalizace, respektive byly čistitelné technologií komunální ČOV. Obecně však platí, že by průmyslové odpadní vody měly být odděleny a čištěny v samostatných průmyslových ČOV. Bohužel v minulosti byly takové vody, často s obsahem toxických látek (např. těžké kovy, pesticidy apod.) běžně vypouštěny do kanalizace a to často bez ohledu na možnosti koncové ČOV. V současnosti je vyvíjen odborný, ale i ekonomický tlak na oddělení takovýchto vod od veřejné kanalizace. Množství průmyslových odpadních vod je nutné stanovit individuálně dle typu a technologie výroby (Vítěz a Groda, 2008). Dále se odlišuje dešťová odpadní voda jako voda z atmosférických srážek vtékající do stoky nebo do recipientu (Porter, 2009). Dešťová odpadní voda: Jedná se o vody odváděné z intravilánu obce veřejnou kanalizací. Veřejné kanalizace mohou být jednak oddílné, které odvádí odděleně (samostatným potrubím) vody splaškové a jiným samostatným potrubím vody dešťové (dešťovou kanalizací), jednak jednotné, jimiž je odváděna jak splašková, tak i dešťová voda jednou stokou na ČOV (Vítěz a Groda, 2008). Vody balastní: Jedná se především o podzemní vody, které se dostávají netěsnostmi do kanalizace. Bohužel dosti často se jedná i o povrchové toky zaústěné do kanalizačního systému (v minulosti se běžně různé potůčky zaúsťovaly do kanalizace bez ohledu na to, že se jedná v zásadě o čistou vodu). Balastní vody mají negativní vliv na proces čištění 17

odpadních vod, protože nařeďují splašky a odpadní vody ochlazují. Balastní vody bohužel představují značné procento celkových odpadních vod, což platí hlavně u starších systémů stavěných často s nedostatečnou projektovou dokumentací (Vítěz a Groda, 2008). 3.3 Čistírny odpadních vod (ČOV) Čistírna odpadních vod je zařízení, ve kterém dochází k čištění odpadních vod. Setkáváme se s nimi jednak v blízkosti různých provozů, kde slouží k čištění průmyslových vod, odpadních vod ze zemědělské výroby a dále u měst a obcí, kde čistí vody komunální a smíšené, tedy komunální s průmyslovými (http://cs.wikipedia.org/ wiki/ Čistička_odpadních_vod). Obr. 1: Diagram čistíren odpadních vod (http://en.wikipedia.org/wiki/sewage_treatment) Vysvětlivky: Pretreatment předběžná úprava; Overflow - přítok; Air vzduch; Scum - kal; Trash - odpad; Secondary - sekundární; Aeration - provzdušňování; Primary - primární; Sludge digestion vyhnívání kalu; Dryer - sušička; Dry sludge finishing konečná úprava suchého kalu; Methane metan. 18

Čistírny mohou být mnoha typů. Rozdělují se hlavně podle velikosti a typu čistírenského procesu. Nejčastějším typem používaných ČOV v ČR je mechanicko - biologická čistírna odpadních vod. Zvláštním případem může být např. čistírna radioaktivního odpadu (http://cs.wikipedia.org/wiki/čistička_odpadních_vod). Obr. 2: ČOV Brno Modřice letecký snímek Rozdělení ČOV dle kapacity (m 3 /den): domovní 0-50 m 3, EO 1-50 malé - 51-500 m 3 nebo 500-1 000 m 3, EO 51-500 nebo 501-5 000 střední 1 000-2 000 m 3 nebo 2 000-20 000 m 3, EO 5 001-10 000 nebo 10 001-100 000 velké víc jak 20 000 m 3, EO víc jak 100 000 (http://www.bvk.cz/o-spolecnosti/odvadeni-a-cisteni-odpadnich-vod/cov-brnomodrice/) 19

3.3.1 Procesy v čistírně odpadních vod Základní metody čištění odpadních vod: Pro čištění komunálních odpadních vod se v současné době využívá mnoho různých postupů. V zásadě je však lze rozdělit do několika základních skupin: Mechanické čištění Fyzikálně-chemické čištění Biologické čištění Účelem čištění odpadních vod je tedy mechanicky odstranit větší část nerozpuštěných látek obsažených v odpadních vodách a fyzikálně chemickými a především biologickými způsoby rozložit látky rozpuštěné tak, aby bylo dosaženo takových zbytkových koncentrací znečišťujících látek na odtoku z ČOV, které nebudou představovat významnou zátěž pro recipient. Těmto požadavkům musí být přizpůsobena technologická linka čistírny (Vítěz a Groda, 2008). Obr 3:. Stupně čištění odpadních vod (autor) Velké čistírny kombinují většinou všechny dostupné čisticí procesy (mechanické, biochemické a chemické procesy). Čistírna odpadních vod funguje jako předčištění a dočištění probíhá v recipientu tj. v přirozeném vodním toku. V rámci čistírny jsou zřizovány další objekty na likvidaci vzniklých kalů a látek jako jsou kalová a plynová hospodářství (http://cs.wikipedia.org/wiki/čistička_odpadních_vod). 20

Proces čištění odpadních vod musí být účinný, ekonomicky přijatelný a nenáročný na spotřebu energie. Proces čištění můžeme rozdělit do tří stupňů: mechanické (cezení, usazování, centrifugace, flotace, filtrace) chemické (čiření, neutralizace, oxidace x redukce, sorpční procesy, extrakce, výměna iontů, odpařování, spalování) biologické (aerobní - biologické filtry, aktivace, stabilizace; anaerobní - mechanizace) Příklad čistírenského procesu Odpadní voda je do čistírny přiváděna kanalizační sítí. Pokud je ČOV posazena výš než potrubí na přítoku, předsazuje se přečerpávací stanice odpadních vod. Mechanický stupeň Na přítoku do čistírny prochází voda mechanickým stupněm. Nejprve jsou využity česle, kde dochází k odstranění hrubých nečistot. Tento hrubší odpad bývá skladován, nebo spalován při vyšších teplotách. Následuje lapák písku, kde je z vody odstraněn písek jdoucí na skládku. Další částí mechanického stupně je I. sedimentace. Odpadní voda je zde rozdělena na 3 frakce. Na dno sedimentuje tzv. surový kal, který je odčerpáván a odváděn do anaerobního stupně. Uprostřed se nachází mechanicky vyčištěná voda obsahující pouze 10 % nečistot. Tato voda postupuje do biologického (aerobního) stupně. Zcela na povrchu se nachází lehké usazeniny, které jsou shrnovány a skladovány či páleny. Biologický aerobní stupeň Do tohoto stupně vstupuje voda po mechanickém vyčištění. Principem je využití aerobních bakterií, které ve svém metabolizmu odbourají 99 % organického znečištění vody. Mezi hlavní procesy tohoto stupně patří mineralizace, kde se v procesu aerobní respirace odbourávají uhlíkaté organické látky za vzniku CO 2 a vody. Další částí mineralizace je amonifikace, kdy dojde k odbourání dusíkatých organických látek na amonné ionty. Dalšími procesy jsou nitrifikace (přeměna amonných iontů na dusičnany), imobilizace, a detoxikace. Takto zpracovaná voda vstupuje do II. sedimentace. Zde vzniká čistá voda, která opouští čistírnu a aktivovaný kal. Aktivovaný kal je následně využit v anaerobním stupni (přebytečný aktivovaný kal) nebo k zaočkování biologického stupně (vratný aktivovaný kal). 21

Biologický anaerobní stupeň Tento stupeň se vyskytuje hlavně u větších čistíren. Je zde využíváno přebytečného aktivovaného kalu jako zdroje živin pro anaerobní bakterie, které produkují různé plyny. Tyto plyny jsou čištěny a označují se jako bioplyn. Bioplyn využije čistírna k ohřevu vlastních vyhnívacích nádrží nebo na produkci energie. Zbylý kal, tzv. vyhnilý, neboli anaerobně stabilizovaný kal se zpracovává a využívá jako hnojivo a nebo je likvidován (http://cs.wikipedia.org/wiki/čistička_odpadních_vod). 3.3.2 Mechanické čištění odpadních vod V mechanické části čistírny odpadních vod se z přiváděných odpadních vod odstraňují pouze takové nečistoty, které se vlivem větší měrné hmotnosti, než má odpadní voda, usazují u dna nebo při menší měrné hmotnosti mohou vyplouvat k hladině. Základními jednotkami mechanického čištění odpadních vod jsou: česle, síta, lapáky písku, popř. tuků a olejů, usazovací nádrže. Dle fyzikálních vlastností nečistot obsažených v odpadní vodě a podle požadovaného stupně čištění vody se určuje rozsah mechanického čištění - zda budou navrhovány všechny nebo jen některé jednotky mechanického čištění (Štícha a kol., 1970). Čistící proces je započat hrubým předčištěním prostřednictvím lapáků štěrku a česlí. Dále voda prochází přes podélné lapáky písku a následně je přečerpána do usazovacích nádrží. Usazovací nádrže tvoří poslední mechanický stupeň, sedimentuje zde primární kal, který je odčerpáván na gravitační zahuštění v kruhové nádrži. Takto je zahušťován i sekundární biologický kal, vzniklý v biotechnologické části čištění (http://www.gate2biotech.cz/biotechnologicke-postupy-pri-cisteni-odpadnich-vod/). 3.3.3 Lapáky písku Lapáky písku slouží k zachycování hmot minerálního původu s větší měrnou hmotností, než má odpadní voda. V lapáku písku se převážně zachycuje písek splavený z ulic, parků, vozovek, který větší unášecí síla ve stoce stačí dopravit až k čistírně. Lapákem písku se podstatně zlepšuje čistící proces, neboť: písek se nedostane do strojních součástí v čistírně; 22

písek ani kal nejsou znehodnocovány (písek utváří s kalem pevnou usazeninu) (Štícha a kol., 1970). Obr. 4: Lapák písku pohon mostového shrabováku (http://www.fsid.cvut.cz/cz/u218/peoples/hoffman/predmety/covp/cov/cov%20t roja/covtroja1.htm) Odpadní voda obsahuje kromě organických látek také těžký inertní materiál jako jsou popílky, škvára, skořápky, úlomky kostí a také značné množství písku (především u jednotné stokové soustavy). Množství a složení písku, zachyceného z odpadních vod, kolísá ve značném rozsahu podle typu kanalizační soustavy, druhu vpustí a způsobu udržování stokové sítě, typu odlehčovacích komor a poměru ředění, podle povrchové úpravy a sklonu odkanalizovaného území, klimatických podmínek, vlastností půdy, konstrukce a stavu kanalizačního systému, podílu a charakteru průmyslových odpadních vod a podle typu a funkce lapáku písku (www.water.fce.vutbr.cz/ zamestnanci/hlavinek/download/cisteni_ov/prednasky/cov_02.pdf). V lapácích písku se zachycují sunuté a unášené minerální látky. Průměrně písek obsahuje 10 až 20 % sušiny, ve které bývá asi 50 % organických látek. Na osobu je uváděno množství: 5-12 litrů písků za rok, u jednotné kanalizace však může být objem i podstatně větší. Lapáky písku jsou zařízení, která slouží k zachycování písku a minerálních částic s takovou účinností, aby byla zajištěna ochrana dalších objektů a zařízení ČOV. Lapák písku je navržen tak, aby byly zachyceny částice do velikosti zrn 0,2 až 0,25 mm (Vítěz a Groda, 2008). 23

Typy lapáků písku: Lapáky písku můžeme rozdělit: a) dle způsobu odstraňování písku: ručně strojně b) dle směru průtoku písku: horizontální lapáky písku: komorový a štěrbinový (z důvodu obtížné automatizace vyklízení se dnes již prakticky nepoužívají). vertikální lapáky písku: vírový lapák písku, provzdušňovaný lapák písku Horizontální lapáky písku Komorový lapák písku Představitelem této skupiny je podélný usazovací žlab s akumulačním prostorem na zachycování písku. Navrhuje se pro odpadní vody obsahující pouze minerální částice, za předpokladu, že průtok je neměnný. Protože však v čistírnách průtok během dne kolísá, je nutno navrhovat vždy několik paralelních žlabů vedle sebe. Stálou požadovanou rychlost lze ve všech žlabech udržet Parshallovým žlabem, který umisťujeme na společném odtokovém žlabu. Štěrbinový lapák písku Skládá se ze žlabu obdelníkového nebo trojúhelníkového průřezu, jehož dno má takový sklon, aby i za nejmenších průtoků neklesla rychlost pod 0.15 m/s a za největších průtoků nepřekročila hodnotu 0.4 m/s. Dno žlabu je vyřešeno příčnými nebo podélnými štěrbinami, kterými písek propadá do boční šachty, odkud se těží ručně nebo se čerpá mamutkou (www.water.fce.vutbr.cz/zamestnanci/hlavinek/download/cisteni_ OV /prednasky/cov_02.pdf). Vertikální lapáky písku Odpadní voda se přivádí na dno lapáku a odtud stoupá určitou vzestupnou rychlostí. Rychlost nesmí být větší než rychlost, kterou jsou vynášena nejmenší písková zrna. Částice zachycené v lapáku se odstraňují strojně. Půdorys vertikálního lapáku písku bývá kruhový, v některých případech je navržen čtvercový profil. Tento typ lapáku se dnes běžně používá na menších ČOV do cca 20 000 EO. 24

Vírový lapák písku Vírový lapák písku je navržen na základě využití odstředivé síly, pomocí níž je možno od sebe oddělit látky s různou hustotou. Odpadní voda je přiváděna tangenciálně do válcové nádrže, písek je vynášen na obvod nádrže a vířivým pohybem vody je strhávána na dno kuželovité prohlubně odkud se těží čerpadlem. Běžně se používá u ČOV střední velikosti 10 000 až 100 000 EO (Vítěz a Groda, 2008). Obr. 5: Vírový lapák písku (http://www.fsid.cvut.cz/cz/u218/peoples/hoffman/predmety/covp/cov/foto- COV/Kralupy17-COV%20virovy%20lapac%20pisku.jpg) Provzdušňovaný lapák písku Jedná se o horizontální žlab, v němž se příčná cirkulace vytváří umělým provzdušněním podél jedné strany žlabu. Jejich hlavní výhodou je nezávislost na kolísání průtoku a předčištění odpadní vody. I tento lapák písku se běžně používá na středních a velkých ČOV. Je vysoce účinný a zároveň umožňuje vyflotování plovoucích látek, především tuků na hladinu odkud mohou být odstraněny. Jeho určitou nevýhodou je že při aeraci lapáku dochází současně k biochemickým procesům a rozkladu organického substrátu, což může způsobovat určité problémy při denitrifikaci. Z tohoto důvodu se nedoporučuje jeho instalace na malé ČOV do cca 5 000 EO. Vyklízení vertikálních a vírových lapáků písku probíhá v cyklech pomocí mamutky, nebo ponorného kalového čerpadla. Výtlak hydrosměsi je zaústěn do pračky písku, zde dochází důsledkem řízeného proudění k dokonalému odloučení plovoucích nečistot od sedimentu, který je ze spodní části nádoby dopravován šnekovým dopravníkem. Při 25

pohybu písku ve šnekovém dopravníku dochází současně k jeho odvodnění. Zařízení je doplněn o přívod prací užitkové vody ve spodní části nádoby a promícháváním, sloužící k dalšímu vypírání biologického a minerálního podílu znečištění z usazujícího se sedimentu. Tím se dosáhne dokonalejšího odstranění nečistot. Vypraný písek je možné dále využit zejména ve stavebnictví (Vítěz a Groda, 2008). 3.4 Význam biologie v technologii čištění odpadních vod Biologický stupeň je nezbytnou součástí celkového procesu čištění odpadních vod. V současné době je jedním z nejrozšířenějších způsobů biologického čištění odpadních vod je aktivace nebo také tzv. aktivační proces. Aktivním činidlem v tomto procesu je funkční polokultura kultivovaná nejčastěji ve formě vloček tzv. aktivovaného kalu. Základem této polokultury jsou bakterie, přítomny jsou jednobuněčné organizmy (např. bičíkovci, nálevníci) a mnohobuněčné organizmy (např. vířníci, háďátka). V menší míře je zde možné nalézt i některé zástupce hub, plísní apod. (Dohányos a kol., 1998). Velký význam v biologii čištění odpadních vod má kalové hospodářství. Hodnocení kvality kalů je založeno na stanovení aktuálního počtu přítomných indikátorových organizmů v kalu. Indikátorem se rozumí endogenní mikroorganizmus daného vzorku, který je snadno analyzovatelný a reprezentuje vysokou rezistenci k desinfekci kalů, avšak jejich koncentrace musí mít vztah k ostatním patogenům. Mikroorganizmus je považován za indikátorový, když splňuje následující kritéria: Musí být odolný k procesům ošetření. Musí se dát kvalifikovat a identifikovat jednoduchými, přesnými, opakovatelnými a nepříliš nákladnými metodami. musí být přítomen v dostatečně vysokých počtech, aby byla zajištěna přesnost analýzy. Musí být schopen přežít stresy prostředí při úpravě stejně jako další potenciální patogeny (Raclavská, 2007). 26

Legislativní opatření pro hodnocení biologických rizik kalů z čistíren odpadních vod jsou založena především na: Určení indikátorových mikroorganizmů. Metody stanovení indikátorových mikroorganizmů. Určení limitů pro hodnocení. Stanovení metod a technologických podmínek pro hygienizaci. Stanovení způsobu jejich využití, likvidace nebo možného dalšího nakládání. V kalech a upravených kalech se mohou nacházet viry, bakterie, prvoci nebo helminti, kteří jsou potenciálně patogenní pro člověka a zvířata. Volba indikátorových mikroorganizmů v různých zemích vychází ze dvou základních přístupů. Jednak jsou určovány podle jejich předpokládané odolnosti k vnějším podmínkám a dále na základě jejich potenciální patogenity (Raclavská, 2007). Bakterie rodu Salmonella Bakterie rodu Salmonella jsou jako indikátorový mikroorganizmus přijímány na celém světě (EU v připravovaných materiálech, USA, Kanada, Austrálie, Nový Zéland). Rozdílné jsou pouze její přípustné limity. V USA, Francii a Itálii jsou stanoveny maximální počty salmonel v kalech pro použití na zemědělské půdě, v některých státech (Dánsko, ČR a Polsko) bakterie rodu Salmonella v kalech aplikovaných na zemědělskou půdu nesmějí být přítomny vůbec. Koliformní termotolerantní bakterie Tato skupina bakterií je poměrně často používána jako indikátorová pro sledování kvality kalů z komunálních čistíren odpadních vod, které jsou používány na zemědělské půdě. Limity pro tyto skupiny bakterií jsou stanoveny například v Lucembursku, ČR, Dánsku a v USA. V připravované legislativě EU je tento limit stanoven tak, že počty bakterií Escherichia coli nesmí přesáhnout 1000 KTJ v 1g sušiny kalu. 27

Vajíčka parazitických červů a cysty a oocysty patogenních prvoků Vajíčka a cysty těchto organizmů jsou v některých zemích legislativě zavedeny jako indikátorové organizmy (USA, Polsko, Francie, Lucembursko). Je prokázáno, že vajíčka a cysty jsou citlivé na teplotu, takže pokud jsou na ČOV dodržovány technologické parametry, pak vajíčka a cysty nepřežívají. Sporulující bakterie Sporulující bakterie mají vysokou odolnost proti stresům vyvolaným vnějšími vlivy a jsou tedy proto považovány za vhodné indikátory fekálního znečištění. Sporulující klostridia jsou v současné době indikátorovými bakteriemi pro balenou pitnou vodu podle směrnice EU. O jejich zavedení pro posouzení nezávadnosti kalů z komunálních ČOV uvažuje kromě EU i Austrálie, Nový Zéland, Irsko apod. EU předpokládá stanovení klostridií jako alternativu ke stanovení E.coli a zavádí limit 3000 endospór v 1g sušiny kalu (Raclavská, 2007). 3.5 Mikrobiologie odpadních vod V roce 1855 bylo zjištěno, že cholera a tyfové onemocnění bylo způsobeno kontaminací pitné vody splašky fekálního původu. Do té doby se neprováděly mikrobiologické rozbory v souvislosti se sledováním jakosti pitné vody a vody určené ke koupání. Teprve na základě této události byl vznesen požadavek preventivních mikrobiologických stanovení a to pomocí jednoduchých, spolehlivých a rychlých metod detekce mikroorganizmů. Indikátorové mikroorganizmy mohou ohrozit lidské zdraví. Jsou řazeny do skupin koliformní bakterie, intestinální streptokoky (enterokoky) a sulfát redukující klostridie, např. Clostridium perfringens. Tyto organizmy jsou fekálního původu a vyskytují se v čerstvých fekáliích (Bezděková, 2008). V domácí odpadní vodě jsou téměř vždy přítomny patogenní mikroorganizmy (Tab. 2). Je to proto, že značný počet patogenních mikroorganizmů může být vyloučen infikovanými jedinci. Koncentrace střevních patogenů v surové odpadní vodě závisí na: výskytu infekce ve společnosti; společensko-ekonomickém stavu populace; ročním období; 28

spotřebě vody na jednu osobu (Gerba, 2000). Tab. 2: Typické mikroorganizmy nacházející se v neupravené domácí odpadní vodě (upraveno Metcalf a Eddy, 1991) Organizmy Koncentrace (KTJ/g sušiny) Celkové koliformní 10 5-10 6 Fekální koliformní 10 4-10 5 Fekální streptokoky 10 3-10 4 Enterokoky 10 2-10 3 Shigella sp. Přítomný Salmonella sp. 10 0-10 2 Clostridium perfingens 10 1-10 3 Giardia-cysty 10-1 -10 2 Cryptosporidium-cysty 10-1 -10 1 Hlísti (vajíčka) 10-2 -10 1 Enteroviry 10 1-10 2 Tab. 3: Výskyt mikroorganizmů v kalech (KTJ/g sušiny) (upraveno dle Raclavská, 2007) Druh Organizmus Primární kal Přebytečný kal Viry Enterické viry 10 2 10 4 3 x 10 2 Bakteriofágy 10 5 - Bakterie Celkové koliformní 10 8 10 9 7 x 10 8 Termotolerantní 10 7 10 8 8 x 10 6 koliformní Enterokoky 10 6 10 7 2 x 10 2 Salmonella sp. 10 2 10 3 - Clostridium sp. 10 6 - Mycobacterium 10 6 - tuberculosis Protozoa Giardia sp. 10 2 10 3 10 2 10 3 Helminty Ascaris sp. 10 2 10 3 10 3 Trichuris vulpis 10 2 < 10 2 Toxocara sp. 10-10 2 3 x 10 2 29

3.5.1 Čeleď Enterobacteriaceae Doména Bacteria, kmen Proteobacteria, třída Gammaproteobacteria, řád Enterobacteriales. Jsou kosmopolitně rozšířené, nacházíme je v půdě, vodě, ovoci, zelenině, zrnech, kvetoucích rostlinách a stromech, na živočiších včetně člověka. Existuje značná rozmanitost v jejich ekologii, rozmezí hostitele, či patogenitě (Sedláček, 2007). Obr. 6: Čeleď Enterobacteriaceae (Bezděková, 1998) Enterobakterie čeleď Enterobacteriaceae jsou z pohledu klinické mikrobiologie nejdůležitější čeledí gramnegativních tyčinek a možná bakterií vůbec. Mají však velký význam i pro jiná mikrobiologická odvětví, neboť mnohé jsou vděčným modelovým objektem (např. Escherichia coli). Většina enterobakterií se přenáší cestou fekálně-orální. Rozdíly však existují: někde (salmonelóza) jde především o přenos potravinami, jinde (úplavice) spíše o nemoci špinavých rukou, a u některých (E. coli) nelze vyloučit ani občasný vzdušný přenos (Votava, 2003). Jsou to gramnegativní rovné tyčky, nepohyblivé nebo pohyblivé peritrichálními bičíky, netvoří endospory ani cysty. Fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní, mající jak respiratorní tak fermentatorní typ metabolizmu. Většina druhů má růstové 30

optimum při 37 C. Okyselují glukózu i řadu jiných cukrů i cukerných alkoholů, většinou jsou oxidáza-negativní a většinou i kataláza-pozitivní (Sedláček, 2007). 1. 2. 3. Obr. 7: Zástupci čeledi Enterobacteriaceae (Alexander a Strete, 2000) Vysvětlivky: 1. Salmonella typhimurium 2. Escherichia coli (vlevo) a Shigella flexneri (vpravo) 3. Escherichia coli (vlevo) a Salmonella typhymurium (vpravo) 3.5.1.1 Koliformní bakterie Zástupci koliformních mikroorganizmů patří k fyziologické flóře tlustého střeva obratlovců. Jsou to relativně rezistentní mikroorganizmy. Mimo organizmus přežívají velmi dlouho ve vlhkém prostředí, ve výkalech, odpadní vodě, kalu a v pitné vodě. E. coli se proto používá jako indikátor fekálního znečištění. Většina těchto kmenů je za běžných podmínek nepatogenní. Za určitých okolností nabývají úlohy vyslovených patogenů, zejména při invazi do orgánů souvisejících se střevním traktem (Sedláček, 1978). Koliformní bakterie jsou gramnegativní nesporulující tyčinky z čeledi Enterobacteriaceae, schopné růst a fermentovat laktózu za současné tvorby kyseliny, popř. aldehydu při 37 C za aerobních či fakultativně anaerobních podmínek v selektivním prostředí žlučových solí (či jiných povrchově aktivních látek s podobnými, růst inhibujícími vlastnostmi). Nevykazují cytochromoxidázovou aktivitu. Fekální (nebo přesněji termotolerantní) koliformní bakterie jsou ty koliformní bakterie, které si ponechaly svoje růstové a fermentační vlastnosti i ve 44 C (Baudišová, 1998). 31

Za koliformní jsou všeobecně považovány rody Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella ( metoda detekuje i nekoliformní bakterie např. Serratia). Metoda stanovení koliformních bakterií se používá jako indikace účinnosti úpravy vody či dodatečné kontaminace (Říhová Ambrožová, 2007). Citrobacter freundii Escherichia coli. Klebsiella sp. Obr. 8: Příklady koliformních bakterií (http://en.wikipedia.org/wiki/coliform_bacteria) Kontaminace způsobená přítomností celkových koliformních bakterií indikuje nedostatečnou dezinfekci pitné vody. Skupina celkových koliformních bakterií zahrnuje další podskupiny organizmů (obr. 6) (Bezděková, 2008). 3.5.1.2 Nekoliformní bakterie Salmonella sp. je rod gram-negativních baktérií z čeledi Enterobacteriaceae, jehož zástupci způsobují onemocnění člověka a zvířat. Jedná se vesměs o pohyblivé, rychle rostoucí bakterie, nenáročné na podmínky prostředí. Mezi nejvýznamnější onemocnění člověka způsobené salmonelami patří břišní tyfus, břišní paratyfus a salmonelóza z potravin. Dělí se na víc než 25OO sérotypů, které se liší hlavně antigeny O a H. Zdrojem jsou hlavně ptáci. Přenáší se především masem a vejci (http://cs.wikipedia.org/wiki/salmonella). 32

Obr. 9: Salmonella typhimurium, snímek z elektronového mikroskopu (http://cs.wikipedia.org/wiki/salmonella) Mezi hlavní faktory, které salmonelám umožňují obrovské rozšíření v přírodním a antropogenním prostředí, patří jejich přizpůsobivost většině prvků životního prostředí, vodě, půdě, vzduchu, rostlinstvu, živočišstvu a odpadům. Tato schopnost přežívat ve všech elementech přirozeného, ale i umělého prostředí a přizpůsobit se i podmínkám, které vytváří člověk svou činností, má pro epidemiologii a epizootologii těchto bakterií a pro pochopení jejich všudypřítomnosti mimořádný význam. Zvláštní úlohu má voda, do níž jsou salmonely vypouštěny a jí pak šířeny k pravým nebo potenciálním hostitelům (Rosický a kol., 1994). Obr. 10: Salmonella (http://en.wikipedia.org/wiki/salmonella) Voda všeho druhu je základním elementem pro existenci salmonel mimo hostitele; v ní se udržují i velmi dlouhou dobu. Pro sladkou vodu se udává rozmezí od 2 41 dnů, pro slanou až 24 32 dnů, v kapkách vody se mají údajně udržet 87-200 dnů (Rosický a kol., 1994). 33

Odpadní a stočné vody dlouho udržují při životě nejrůznější sérovary salmonel. Otevřené vodní nádrže některých systémů čistíren odpadních vod mohou být zdrojem salmonelóz pro naletující ptactvo. V ČOV s kapacitou přibližně 70 000 m 3 denně bylo zjištěno, že příliv salmonel do ČOV závisí hlavně na kvalitativním složení přitékající odpadní vody. Nejlépe se dařilo salmonelám v aktivačním kalovém bazénu, kde obohacování kyslíkem vytvářelo zřejmě dobré ekologické podmínky pro jejich přežívání. Čistírenské kaly obsahují bohatství salmonel, které stojí v popředí zájmu, neboť jsou to obligátně patogenní fekální mikroorganizmy (Rosický a kol., 1994). Pro hnojení čistírenskými kaly, máme-li se vyhnout epidemiologickým komplikacím a napadení užitkových zvířat salmonelami, musíme brát v úvahu tato fakta: Procentuální a kvantitativní kontaminaci kalů salmonelami. Ovlivnění zátěže salmonelami aerobní stabilizací. Přežívání salmonel. Za jednoznačně prokázaný se považuje infekční řetězec pro salmonely: odpadní voda čistírenské kaly rostlina užitkové zvíře (Rosický a kol., 1994). 3.5.2 Enterokoky Enterokoky jsou obligátní součástí střevní mikroflóry a jejich přítomnost svědčí o čerstvém fekálním znečištěním prostředí. Význam enterokoků jako indikátorů fekálního znečištění potvrzuje jejich prokázaná patogenita. Důkaz enterokoků ve vzorcích je považován za indikátor čerstvého fekálního znečištění, poněvadž se na rozdíl od koliformních bakterií neudrží delší dobu v prostředí (Sedláček, 1978). Intestinální enterokoky (streptokoky) jsou grampozitivní koky, které často tvoří diplokoky (jejich dělení probíhá pouze v jedné rovině, což je důležité pro mikrobiologickou kontrolu). Jsou citlivé vůči změnám vnějšího prostředí, proto se ve vodě velmi vzácně pomnožují a přežívají zde krátkou dobu. Jsou odolné vůči dezinfekčním prostředkům, např. chloru, proto také indikují nedostatečnou dávku dezinfekčního prostředku. Převládající počet kmenů tzv. fekálních streptokoků náleží k druhům Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus avium (syn. Enterococcus). Stanovení enterokoků (obr. 2) je založeno na kultivaci v médiích obsahujících azid sodný (potlačuje růst přídavné mikroflóry) a TTC (umožňuje 34

vznikem červeného formazanu diferenciaci kolonií enterokoků od jinak zbarvených kolonií ostatních druhů) (Říhová Ambrožová, 2007). Obr. 11: Suspektní kolonie enterokoků (Říhová Ambrožová, 2007) 35

4 MATERIÁL A METODY Jelikož není problematika zpracování písku z čistíren odpadních vod legislativně zpracována, vycházelo se při mikrobiologických analýzách z pravidel pro nakládání s čistírenskými kaly a to z prováděcí vyhlášky č. 382/2001 Sb., o podmínkách použití upravených kalů na zemědělské půdě, ve znění pozdějších předpisů. 4.1 Kultivační půdy a roztoky Při mikrobiálních analýzách byly použity následující kultivační půdy a roztoky: mfc agar Slanetz-Bartley agar Endo agar Xylózo-lysin-deoxychálátový agar (XLD-agar) Agar s fenolovou červení a briliantovou zelení Tlumivá peptonová voda Půda se seleničitanem a cystinem Půda s chloridem hořečnatým a malachytovou zelení (půda RV) 1. mfc agar (Merck KGaA) Tab. 4: Složení mfc agaru (Matějů, 2001): Tryptose nebo biosate 10,0 g Proteose pepton č. 3 nebo polypepton 5,0 g Kvasniční extrakt 3,0 g NaCl 5,0 g Laktóza 12,5 g Žlučové sole č.3 nebo směs žlučových solí 1,5 g Anilínová modř 0,1 g Alkalický roztok kyseliny rosolvé 10 ml Agar 12,0-15,0 g * Voda Do 1000 ml * dle ztužovací schopnosti agaru 36

Při mikrobiální analýze bylo použito komerčně dostupné dehydratované médium. 41,6 g média bylo rozpuštěno v 800 ml destilované vody. Vzniklý roztok se vařil na vodní lázni do rozpuštění. Po rozpuštění bylo přidáno 6 ml kyseliny rosolové a následně se vařilo ještě minutu. Vzniklé médium bylo přelito do sterilních plastových Petriho misek. 2. Slanetz-Bartley agar (Merck KGaA) Tab. 5: Složení SlB agaru (Matějů, 2001): Tryptose 20,0 g Kvasniční extrakt 5,0 g Glukóza 2,0 g Hydrogenfosforečnan draselný 4,0 g Azid sodný 0,4 g Agar 8,0 18,0 g * voda 1000,0 ml * závisí na viskozitě agaru 33,4 g komerčně dostupného média bylo rozpuštěno v 800 ml destilované vody a následně vařeno na vodní lázni do rozpuštění. Vzniklé médium bylo přelito do sterilních plastových Petriho misek. 3. Endo agar (Merck KGaA) 39 g komerčně dostupného média bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Následně proběhla 15 minut sterilizace při 121 C (250 kpa) v autoklávu. Vzniklé médium bylo přelito do sterilních plastových Petriho misek. Tab. 6: Složení Endo agaru: Masový pepton Laktóza Siřičitan sodný Hydrogenfosforečnan draselný Basický fuchsin Agar Voda 10,0 g 10,0 g 2,5 g 3,5 g 0,5 g 15,0 g 1000 ml 37

4. Fyziologický roztok Pro přípravu fyziologického roztoku bylo použito 5,1 g NaCl, který byl rozpuštěn v 600 ml destilované vody. 5. Xylózo-lysin-deoxychálátový agar (XLD-agar) (Merck KGaA) Tab. 7: Složení XLD-agaru: D(+)xylóza L(+)-Lyzin Deoxycholát sodný Kvasniční extrakt Fenolová červeň Sacharóza Laktóza Chlorid sodný Thiosíran sodný Citrát železitý Agar Voda 3,5 g 5,0 g 2,5 g 3,0 g 4,0 g 7,5 g 7,5 g 5,0 g 6,8 g 0,8 g 13,0 g 1000 ml 55 g komerčně dostupného média bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Následně proběhla 15 minut vodní lázeň při 100 C. Vzniklé médium bylo přelito do sterilních plastových Petriho misek. 6. Agar s fenolovou červení a briliantovou zelení (Merck KGaA) Tab. 8: Složení agaru s fenolovou červení a briliantovou zelení: Masový extrakt ve formě prášku 5,0 g Pepton 10,0 g Kvasničný extrakt ve formě prášku 3,0 g Hydrogenfosforečnan disodný 1,0 g Dihydrogen fosforečnan sodný 0,6 g Agar 12,0 g laktóza 10,0 g Sacharóza 10,0 g Fenolová červeň 0,09 g Briliantová zeleň 0,5 g voda 1000 ml 38

52 g komerčně dostupného média bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody ve vodní lázni. Následně proběhla 15 minut sterilizace při 121 C (250 kpa) v autoklávu. Vzniklé médium bylo přelito do sterilních plastových Petriho misek. 7. Tlumivá peptonová voda (Merck KGaA) Tab. 9: Složení tlumivé peptonové půdy: Pepton Chlorid sodný Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát Dihydrogenfosforečnan draselný voda 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g 1000 ml 16,1 g komerčně dostupného média bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Následně proběhla 15 minut sterilizace při 121 C (250 kpa) v autoklávu. Vzniklé médium bylo přelito do sterilních plastových Petriho misek. 8. Půda se seleničitanem a cystinem (Merck KGaA) Tab. 10: Složení půdy se seleničitanem a cystinem: Trypton 5,0 g Laktóza 4,0 g Hydrogenfosforečnan disodný 10,0 g dodekahydrát Hydrogenseleničitan sodný 4,0 g L-cystin 0,1 g Hydroxid sodný 5,0 g Kvasničný extrakt 1,5 g voda 1000 ml 23 g komerčně dostupného média bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody a vařeno při 100 C 15 minut. Vzniklé médium bylo přelito do sterilních Erlenmayerových baněk. 39

9. Půda s chloridem hořečnatým a malachytovou zelení (půda RV) (Merck KGaA) Tab. 11: Složení půdy RV: Trypton Chlorid sodný Dihydrogenfosforečnan draselný Chlorid hořečnatý hexahydrát Šťavelan malachitové zeleně Voda 4,5 g 7,2 g 1,4 g 14,0 g 0,04 g 1000 ml 41,8 g komerčně dostupného média bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody a převedeno po 10 ml do zkumavek, které se následně sterilizovali v autoklávu 15 minut při 121 C (250 kpa). 4.2 Přístrojové vybavení Při mikrobiálních analýzách bylo použito následující vybavení: autokláv vařič třepačka kahan termostat 37 C a 44 C 4.3 Materiál Erlenmayerova baňka 250 ml filtrační papír skleněné nálevky Petriho misky plastové špičky Wassermanovy zkumavky s víčkem automatické pipety nastavitelné 100-1000 µl fixa skleněné sterilní L-tyčinky v kádince s etanolem 40

4.4 Odběr vzorků Analyzovaný materiál tvořily vzorky písku z čistíren odpadních vod odebrané na 9 čistírnách odpadních vod v Jihomoravském kraji (Tetčice, Střelice, Zbraslav, Ořechov, Blansko, Boskovice, Letovice, Jedovnice, Náměšť nad Oslavou) a odběr vycházel z ČSN-ISO 10381-6:1998 Kvalita půda Odběr vzorků- část 6. Z každé čistírny byly odebrány v průměru 3 vzorky v letech 2008 a 2009 (tab. 13). Do laboratoře byly vzorky transportovány ve sterilních vzorkovnicích při teplotě 5 C, následně byly zváženy, byla stanovena jejich sušina, ztráta žíháním a provedena mikrobiologická analýza. Postupy odběru vzorků kalů a půdy a metody jejich analýzy stanoví vyhláška ministerstva životního prostředí č. 382/2001 Sb. Cílem mikrobiálních analýz bylo posoudit zastoupení indikátorových mikroorganizmů v jednotlivých vzorcích písků z čistíren odpadních vod. Tab. 12: Technické informace o jednotlivých ČOV ČOV Kanalizace Lapák štěrku Lapák písku Tetčice jednotná 0 Vertikální kruhový Střelice jednotná 0 Vertikální kruhový Separace, praní písku Huber-RO SF 4 Fontána s prací vodou Huber-RO 5c Fontána bez praní Umístění Za česlemi Před česlemi Zbraslav jednotná 0 Integrovaný, Huber-RO 5c Za česlemi Ořechov jednotná 0 Vertikální Za česlemi kruhový Blansko jednotná 0 Vírový In Eko Za česlemi Boskovice jednotná 1 Vírový Fontána Za česlemi s prací vodou Letovice jednotná 0 Provzdušňovaný není Za česlemi Jedovnice jednotná 0 Vírový není Za česlemi Náměšť nad Oslavou jednotná 0 Vertikální s provzdušněním Fontána s prací vodou Za česlemi 41