ÈASOPIS PRO MODERNÍ PSYCHIATRII

SUPPLEMENTUM 3, 2001 PSYCHIATRIE ÈASOPIS PRO MODERNÍ PSYCHIATRII MINIKONFERENCE CENTRA NEUROPSYCHIATRICKÝCH STUDIÍ 20. 6. 2001 PØEHLEDNÁ SDÌLENÍ ROÈNÍK 5 www.tigis.cz/psychiat/index.htm www.pcp.lf3.cuni.cz/psychiatrie www.casopis-psychiatrie.cz/psychiat/index.htm ISSN 1211-7579 EXCERPOVÁNO V BIBLIOGRAPHIA MEDICA ÈECHOSLOVACA INDEXOVÁNO V EMBASE - EXCERPTA MEDICA

CENTRUM NEUROPSYCHIATRICKÝCH STUDIÍ - MILNÍK ÈESKÉHO LÉKAØSKÉHO VÝZKUMU Výrazem pohybu, ke kterému došlo koncem 20. století v oblasti neurovìd, a také toho, že i v Èeské republice se podaøilo soustøedit síly, které svìtový vývoj sledují a formují, jakési centrum excelence kolem neurofyziologických, neurochemických a psychiatrických studií, je významná státní podpora, jaké se èeským badatelùm dostalo v podobì projektu Ministerstva školství, mládeže a tìlovýchovy LN00B122 s názvem Centrum neuropsychiatrických studií (CNS). Centrum je pøíslibem integrovaného výzkumného proudu v oblasti neuropsychiatrických studií, jenž by mohl vyústit v aktualizovanou podobu nìkdejší vìdecko-výzkumné základny rezortu zdravotnictví, totiž ve svébytnou neurovìdní instituci odpovídající souèasnému trendu aplikace neurovìdního výzkumu v neuropsychiatrických klinických disciplínách. Pøidìlení projektu právì Psychiatrickému centru Praha a jeho spolupracujícím institucím je souèasnì významným úspìchem tìch, kdo vytvoøili dostateèné podmínky pro realizaci tak nároèného úkolu, zejména odborníkùm, kteøí v daných oblastech pracují a obstáli v silné domácí konkurenci. Cíle projektu Cílem projektu je studium neurobiologické podstaty nejzávažnìjších duševních onemocnìní schizofrenie a afektivních poruch. Výzkumná témata jsou øešena simultánnì pomocí modelù základního výzkumu, modelù neurokognitivních, funkèních zobrazení mozku, neuroendokrinologických a elektrofyziologických modelù, s klinickým ovìøením a aplikacemi. Tím navrhovaná koncepce naplòuje ideovou pøedstavu vznikajících výzkumných center: integraci víceoborového základního a klinického výzkumu s klinickými aplikacemi. Došlo tak k soustøedìní a tìsné spolupráci špièkových odborníkù z rùzných oblastí, kteøí øeší jedno téma. Odvozeným cílem je posílení výzkumného potenciálu èeské vìdy v oblasti neuropsychiatrie a její participace na svìtovém výzkumu. V oblasti základního výzkumu projekt pøináší pùvodní data o souvislosti glutamátergního systému a schizofrenie. Na molekulární, bunìèné i systémové úrovni studujeme modulaci NMDA typu glutamátových receptorù neurosteroidy i dalšími látkami. Na animálních modelech studujeme koncepci schizofrenie jako dùsledku neurovývojového poškození. Tato koncepce bude dále rozvíjena testováním základních biochemických a patofyziologických hypotéz schizofrenního onemocnìní, a to i z hlediska neurokognitivních funkcí. Mìøitelným dùsledkem neurokognitivního deficitu jsou odlišnosti ve výsledcích kognitivních testù, které obrážejí neurofyziologický substrát pro vìtšinu schizofrenních a afektivních pøíznakù. V pøípadì schizofrenních onemocnìní je navíc ovlivnìní kognitivního deficitu považováno za dùležitý terapeutický cíl. V etiopatogenezi neurokognitivního deficitu je nejèastìji zmiòována role jednotlivých neurotransmiterových systémù (glutamát, GABA, serotonin, dopamin) a dysfunkce (dyskonekce) rùzných oblastí mozku (fronto-striato-talamo-kortikálních okruhù). Výzkum Centra neuropsychiatrických studií se podílí na integraci studia informaèního zpracování s psychopatologií a etiologickými faktory. Tento výzkum je metodologicky zajištìn spojením testování kognitivních funkcí s neuroendokrinologickými testy (kvantifikace neurotransmise) a s funkèním zobrazením regionální aktivity mozku (PET, SPECT, fmr). Výsledky integrovaného pøístupu budou dále ovìøovány jak základním výzkumem, tak klinickou aplikací. Oddìlení základního výzkumu Centra neuropsychiatrických studií vypracuje animální modely chování, které jsou obdobou humánního kognitivního processingu. V tìchto modelech bude testována role neurotransmise i vliv zmìny modulárního uspoøádání mozku (napø. léze frontálních nebo hipokampálních oblastí). Klinická složka Centra neuropsychiatrických studií bude testovat výsledky výzkumu v diagnostickém rozhodovacím procesu, v terapii, v predikci a vyústìní duševních chorob. Cílem výzkumu Centra neuropsychiatrických studií v oblasti neuroendokrinních regulací je nalézt odpovìï na otázku, zda abnormální neuroendokrinní regulace je pøímou souèástí patofyziologických mechanismù a možnou pøíèinou onemocnìní, nebo zda je odrazem narušené funkce centrálního nervového systému. V neuroendokrinním modelu testujeme pøedevším serotoninový receptorový systém. Role serotoninu (5-HT) v etiopatogenezi schizofrenie a afektivních poruch je stále v centru pozornosti. Stimulaèní èi inhibièní neuroendokrinní testy sledují odezvu hladin hormonù, jejichž sekrece je kontrolována serotoninem (napø. kortizol, prolaktin). Tato odezva odráží funkèní senzitivitu 5-HT receptorù. Metodou, kterou jsme si osvojili, sledujeme aktivitu serotoninu u nemocných se schizofrenií, depresí i u zdravých dobrovolníkù po podání agonistù 5-HT receptorù (fenfluraminový test). Dosavadní výsledky našeho výzkumu o vztahu mezi reaktivitou serotoninových receptorù a terapeutickou odpovìdí u schizofrenie byly publikovány v domácích i mezinárodních impaktovaných èasopisech. V dalším výzkumu sledujeme vztah mezi experimentálnì sníženou aktivitou serotoninu a zmìnami psychopatologie a kognitivních funkcí u schizofrenie. Editorial 1

Editorial V souèasné dobì má náš tým unikátní možnost pracovat se všemi zobrazovacími metodami. Od roku 1995 spolupracovalo Psychiatrické centrum Praha se SPECT laboratoøí Ústavu nukleární medicíny VFN. Bìhem této doby jsme získali zkušenosti s vyšetøením pacientù s diagnózou schizofrenie, afektivních poruch a OCD pomocí radiofarmaka 99m TcHMPAO (exametazin). Od roku 1999 spolupracujeme s oddìlením Magnetické rezonance IKEM, kde vyšetøujeme pomocí funkèní magnetické rezonance (fmr) a magnetické rezonanèní spektroskopie (MRS) pacienty s diagnózou schizofrenie. V roce 1999 jsme rovnìž navázali spolupráci s PET centrem v nemocnici Na Homolce, kde zaèala probíhat spoleèná pilotní studie u pacientù s diagnózou schizofrenie. Tím byl vytvoøen základ širšího multidisciplinárního týmu schopného integrovat dostupné funkèní zobrazovací metody a zasadit je do širšího kontextu ostatních výzkumných neuropsychiatrických metod. Centrum ovìøuje hypotézy o strukturních a funkèních korelátech kognitivních zmìn, neurobiochemických zmìn a klinických pøíznakù u schizofrenie a afektivních poruch. K tìmto korelátùm patøí jak zmìny regionálního krevního prùtoku mozkem v souvislosti s funkèní zátìží a psychopatologií, tak PET mapy receptorových populací s využitím znaèených ligandù èi koncentrace biologicky aktivních látek a indikátorù zjiš ovaných magnetickou rezonanèní spektroskopií (N-acetylaspartát aj.). K pochopení neurobiologického základu duševních poruch významnì pøispívá studium fyziologie a patologie spánku, nebo témìø všechna neuropsychiatrická onemocnìní se buï pøímo projevují poruchou spánku a bdìní, anebo jsou tìmito poruchami doprovázena. Pøitom poruchy vigility pøedstavují jeden z mála psychických projevù, které lze pomìøovat objektivními vyšetøovacími metodami. Dostupnost spánkové laboratoøe, která funguje v Psychiatrickém centru Praha, a stoupající úroveò jejího technického vybavení je dalším významným faktorem pro budoucí výzkum. Pøes své psychiatrické zamìøení je spánkový výzkum mezioborový a jeho kvalita do znaèné míry vyžaduje rozsáhlou spolupráci v široké oblasti neurovìd. Vyšetøení za standardních podmínek v denní dobì má za úkol sledovat spontánní kolísání bdìlosti. Podle pracovní hypotézy pokles, vzestup a kolísání vigility souvisejí s psychickým stavem vyšetøované osoby. Pøedpokládá se, že bude možno objektivizovat zmìny dané vlivem úzkosti èi psychomotorického útlumu. V první fázi výzkumu pùjde o nalezení vhodných neurofyziologických indikátorù, v další fázi o zjištìní jejich korelace s psychickými pøíznaky a s výsledky léèby. Podle pracovní hypotézy jsou nìkterá onemocnìní mozku provázena zmìnou vigility, která zhoršuje jejich pøíznaky. Pøedpokládá se, že nemocní s neuropsychiatrickými poruchami jeví známky snížené bdìlosti v denní dobì, pøípadnì v souvislosti s poruchou noèního spánku. Snížená bdìlost snižuje schopnost využívat zbývající intelektuální kapacitu. Cílem vyšetøení je zjistit, do jaké míry tato insuficience ovlivòuje nemocné s rùznými diagnózami psychotických poruch pokud jde o intenzitu pøíznakù a prùbìh èi prognózu. Témata výzkumu Hlavním tématem oddìlení patofyziologie mozku je testování glutamátergní hypotézy schizofrenie. Hypotéza: Je glutamátergní deficit èi zmìny citlivosti NMDA receptorù na pozadí rozvoje pøíznakù, které slouží jako zvíøecí model schizofrenního onemocnìní? V návaznosti na tuto hypotézu studují pracovníci FgÚ AVÈR modulaci NMDA typu glutamátových receptorù. Hlavním tématem oddìlení zobrazovacích metod je hledání funkèních a strukturálních korelátù psychopatologie z hlediska informaèního zpracování. Hypotéza: Souvisí dosud nacházené zmìny regionální perfuze mozku s definovanými zmìnami (kognitivními defekty) a pøíznaky u hlavních psychiatrických poruch? Hlavním tématem oddìlení klinické neurofyziologie je studium architektury spánku a zmìn vigility v korelaci jak s psychotickými poruchami (schizofrenie), afektivními poruchami (deprese), organickými poruchami (demence), tak v korelaci s pøíslušnými léèebnými modalitami (zmìny architektury spánku a zmìny vigility pøi léèbì neuroleptiky, atypickými antipsychotiky a antidepresivy). Hypotéza 1: Narušenou architekturu spánku lze specificky ovlivòovat psychofarmaky. Hypotéza 2: Kolísání vigility je diagnostickým a prognostickým markerem duševních poruch. Hlavním tématem oddìlení aplikovaného výzkumu je ovìøení serotoninové hypotézy psychotických poruch, nalezení neurokognitivních korelátù psychotických a afektivních poruch, nalezení prediktorù terapeutické odpovìdi na podskupiny antipsychotik, ovìøení prediktorù vyústìní chorobného procesu a integrace všech uvedených modelù v klinických aplikacích. Hypotéza 1: Serotoninová a glutamátergní hypotéza schizofrenie pøedstavují integrovaný model, který vysvìtluje jak kognitivní poruchy u tohoto onemocnìní, tak výskyt hlavních pøíznakù. Hypotéza 2: Neuroendokrinními testy (FF-test) lze odlišit dobré reaktory na klasická, resp. atypická antipsychotika. Hypotéza 3: Strukturní a funkèní zmìny mozku korelují s kognitivními poruchami a klinickými pøíznaky. Lze je interpretovat z hlediska serotoninové a glutamátergní hypotézy rozvoje schizofrenního onemocnìní. 2 Hlavní pøínos projektu Hlavním pøínosem projektu je integrace neurofyziologických, neurochemických, strukturálních, kognitivních, neuroendokrinologických a klinických modelù hlavních duševních poruch s využitím u nás ojedinìlé výzkumné základny v oblasti psychiatrie a neurovìd. Hlavním výstupem budou jak publikace v mezinárodních impaktovaných èasopisech, tak klinické aplikace v: a) diagnostickém rozhodovacím procesu, b) studiu prediktorù klinické odpovìdi na terapii,

c) prognóze a vyústìní neuropsychiatrických onemocnìní, d) prevenci a urèení rizikových faktorù neuropsychiatrických onemocnìní. Bez vzniku Centra by nebylo možno organizaènì a ekonomicky zajistit a úzce integrovat špièkové odborníky z rùzných oblastí (AVÈR, 3. LFUK, PCP, PET centra Na Homolce a IKEM) kolem jednoho tématu z oblasti neuropsychiatrie. Editorial Harmonogram projektu Projekt je realizován paralelnì a koordinovanì ve 4 oddìleních (viz schéma): patofyziologie mozku (teoretický výzkum), zobrazovacích metod (fmr, MRS, SPECT, PET a neuropsychologické a kognitivní testy), klinické neurofyziologie (EEG a spánková laboratoø) a aplikovaného výzkumu (neuroendokrinní testy, vztah serotoninového a glycidového metabolizmu, klinické studie beztryptofanové diety, studie terapeutické úèinnosti antipsychotických a antidepresivních modalit, predikce terapeutické odpovìdi a vyústìní choroby, psychometrika). Centrum neuropsychiatrických studií Organizaèní schéma Höschl øeditel PCP Š astný Horáèek Matoušek Mohr základní výzkum zobrazovací metody klin. neurofyz. klinický výzkum Rokyta Mareš Bìlohlávek Tintìra 3. LFUK Vyklický PET Homolka IKEM FgÚ AVÈR Stav k 1. 5. 2001 celkem 35 pracovníkù Koordinátor projektu: RNDr. Daniela Øípová, CSc. Bìhem prvního roku se podaøilo dobudovat laboratorní zázemí (akreditace zvíøetníku), shromáždit literární rešerše k jednotlivým projektùm a provést pilotní studie, jejichž výsledky pøináší toto supplementum. Ve druhém roce se vyhodnotí celková strategie výzkumu na základì pilotních a validizaèních studií a bude dokonèen plán integrace výzkumu jednotlivých složek Centra. Ve 3. 5. roce se nasbírají data v uvedených projektech a zaène vyhodnocování a prezentace výsledkù. V 6. roce se dokonèí vyhodnocování a interpretace výsledkù. Na základì výsledkù bude vytyèena strategie výzkumu na dalších minimálnì 5 let. Za priority bude považováno jak testování novì vzniklých hypotéz, tak klinické využití výsledkù v léèbì (rozšíøení diagnostiky o psychometrická kritéria z oblasti kognitivních funkcí, specifikace vzorcù strukturních a funkèních zmìn u duševních poruch, využití predikce terapeutické odpovìdi k zavedení racionální terapie s ohledem na patogenezu onemocnìní, zlepšení prognostické role lékaøe aj.). Podíl Centra na studijních programech Centrum je vybudováno pøedevším na studijních programech lékaøského doktorandského (PGS) studia. Jak Psychiatrické centrum Praha (PCP), tak FgÚ AVÈR a 3. LFUK jsou školicími pracovišti PGS. CNS je nyní základnou PGS, jejichž poèet se pohybuje mezi 10 20. Centrum se tak stalo významným školicím místem v oblasti neuropsychiatrie. Minikonference CNS Supplementum PSYCHIATRIE, které držíte v ruce, pøináší pod redakèním vedením doc. MUDr. F. Š astného, CSc. první výsledky èinnosti Centra tak, jak zaznìly na plenární Minikonferenci 20. 6. 2001. Vìøím, že poskytnou dostateèný pøehled o práci celého týmu. Zároveò jsou pøíslibem výsledkù, které budou in extenso zasílány do renomovaných mezinárodních èasopisù. prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., MRCPsych. vedoucí Centra neuropsychiatrických studií 3

PSYCHIATRIE Roèník 5, 2001, Supplementum 3 Èasopis pro moderní psychiatrii Redakèní rada: Šéfredaktor Prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., MRCPsych 3. LF UK a Psychiatrické centrum Praha Zástupce šéfredaktora Prof. MUDr. Jan Libiger, CSc. Psychiatrická klinika LF UK, Hradec Králové Èlenové Martin Alda, MD, FRCP(C) Associate Professor, Department of Psychiatry Dalhousie University, Halifax Richard Balon, MD, FAPA Professor of Psychiatry Wayne State University University Psychiatric Center, Detroit Matthias Dose, MD Bezirkskrankenhaus Taufkirchen, Taufkirchen Paul Grof, MD, PhD, FRCP(C) Professor of Psychiatry University of Ottawa, Ottawa Prim. MUDr. Ladislava Janoušková Nemocnice Na Homolce, Praha Prof. Dr. med. Siegfried Kasper Klinische Abteilung für Allgemeine Psychiatrie, Wien MUDr. Filip Španiel Psychiatrické centrum Praha Doc. PhDr. Jiøí Kožený, CSc. Psychiatrické centrum a 3. LF UK Praha PhDr. Alena Palèová Psychiatrické centrum Praha MUDr. Ján Pavlov Praško Psychiatrické centrum Praha Prof. MUDr. Richard Rokyta, DrSc. Ústav normální, patologické a klinické fyziologie, 3. LF UK Praha Norman Sartorius, MD, PhD, FRCPsych Professor of Psychiatry Hôpitaux Universitaires de Genève a 3. LF UK Praha Prim. MUDr. RNDr. Jan Sikora, CSc. Psychiatrická léèebna Praha 8 - Bohnice Prof. MUDr. Jaromír Švestka, DrSc. Psychiatrická klinika LF MU Brno Prim. MUDr. Ivan Tùma, CSc. Psychiatrická klinika LF UK Hradec Králové Jan Volavka, MD, PhD Professor of Psychiatry Nathan Kline Institute, Orangeburg New York OBSAH EDITORIAL... 1 OBSAH... 4 PØEHLEDNÉ ÈLÁNKY M. Dorda, K. Vlèek, H. Chodounská, L. Vyklický Jr.: Neurosteroidy - - mechanizmus pùsobení a možnosti užití v klinické praxi... 5 F. Š astný, L. Pliss, V. Bubeníková: Úloha N-acetyl-aspartyl-glutamátu v modelu schizofrenie... 10 P. Mareš: Vývojové zmìny citlivosti mozku na excitaèní aminokyseliny... 15 A. Yamamotová, M. Pometlová, R. Rokyta: Spoleèné mechanizmy bolesti a stresu... 18 M. Kopeèek: Zobrazovací metody v psychiatrii... 23 PÙVODNÍ PRÁCE K. Èervená, L. Linhartová, M. Matoušek: Ukazatelé vigility u deprese a úzkosti... 29 J. Horáèek, M. Kopeèek, L. Linhartová, O. Bìlohlávek, D. Janeba, F. Španiel, T. Hájek: Regionální metabolizmus mozku a pøíznaky schizofrenie. Studie pozitronové emisní tomografie (PET)... 32 L. Motlová, F. Španiel, I. Vaòurová, J. Klaschka: Rodinná psychoedukace u pacientù s první atakou schizofrenie... 37 INFORMACE... 40 CONTENTS EDITORIAL... 1 CONTENTS... 4 REVIEWS M. Dorda, K. Vlèek, H. Chodounská, L. Vyklický Jr.: Neurosteroids - - Mechanism of Action and Potential Therapeutic Use... 5 F. Š astný, L. Pliss, V. Bubeníková: Role of N-Acetyl-Aspartyl- -Glutamate in Schizophrenia Model... 10 P. Mareš: Developmental Changes in the Sensitivity to Excitatory Amino Acids... 15 A. Yamamotová, M. Pometlová, R. Rokyta: Common Mechanisms of Pain and Stress... 18 M. Kopeèek: Neuroimaging in Psychiatry... 23 ORIGINAL PAPERS K. Èervená, L. Linhartová, M. Matoušek: Sleep Indicators in Depression and Anxiety... 29 J. Horáèek, M. Kopeèek, L. Linhartová, O. Bìlohlávek, D. Janeba, F. Španiel, T. Hájek: Regional Brain Metabolism and Symptoms of Schizophrenia. Positron Emission Tomography (PET) Study... 32 L. Motlová, F. Španiel, I. Vaòurová, J. Klaschka: Family Psychoeducation Following First Epizode Schizophrenia... 37 INFORMATION... 40 Obsah Zástupce vydavatele Ing. Veronika Sedláèková s.r.o. Na titulní stranì: Logo Centra neuropsychiatrických studií Frontpage: Logo of the Centre of Neuropsychiatric Studies 4

NEUROSTEROIDY MECHANIZMUS PÙSOBENÍ A MOŽNOSTI UŽITÍ V KLINICKÉ PRAXI NEUROSTEROIDS - MECHANISM OF ACTION AND POTENTIAL THERAPEUTIC USE MILOSLAV DORDA 1, KAMIL VLÈEK 1, HANA CHODOUNSKÁ 2, LADISLAV VYKLICKÝ JR. 1 1 Fyziologický ústav AV ÈR 2 Ústav organické chemie a biochemie SOUHRN Neurosteroidy jsou pøirozenì se vyskytující látky, které ovlivòují nìkteré funkce centrální nervové soustavy. Cílem tohoto èlánku je podat pøehled o molekulárních mechanizmech, kterými neurosteroidy ovlivòují excitabilitu neuronù pùsobením na receptorech pro neuropøenašeèe, a dále ukázat na možnosti využití tìchto látek pøi léèbì nìkterých duševních a nervových chorob. Klíèová slova: glutamátové receptory, GABA receptory, iontové kanály, neurosteroidy SUMMARY Neurosteroids, naturally occurring compounds, affect the function of the central nervous system. The aims of the present paper are to review the molecular mechanisms by which neurosteroids affect neuronal excitability by interacting with neurotransmitter receptors, and to show the potential therapeutic use of neurosteroids in some psychiatric and neurological disorders. Key words: glutamate receptor, GABA receptor, ion channels, neurosteroids Úvod Neurosteroidy jsou látky, které vznikají v nervové tkáni a pùsobí na membránových receptorech pro neuropøenašeèe (primární struktura nìkterých pøirozenì se vyskytujících neurosteroidù je znázornìna na obr. 1). V literatuøe se setkáme též s termínem neuroaktivní steroidy, který je používán pro látky, které mají podobné úèinky, ale nevznikají v nervové tkáni, jako napø. testosteron nebo alphaxalon. Neurosteroidy pùsobí v centrálním nervovém systému rychle, zpravidla bìhem milisekund až sekund. Na rozdíl od pùsobení neurosteroidù je klasická aktivita steroidních hormonù zprostøedkována vazbou steroidu na nitrobunìèné receptory, které po translokaci komplexu steroidní hormonreceptor do jádra ovlivòují genovou transkripci. Jedním z charakteristických rysù tohoto pùsobení je dlouhá doba (hodiny až dny), která je nezbytná k vyvolání úèinku (McEwen, 1991; Lambert et al., 1995; Baulieu, 1997; Mc- Kenna et al., 1999; Hatina a Reischig, 2000). Rychlé pùsobení steroidù je známé od 40. let, kdy objev anestetického vlivu steroidních hormonù (Selye, 1941) vedl k pozdìjšímu vývoji anestetika alphaxalonu. Vliv neurosteroidù na receptory pro neuropøenašeèe byl objeven v 70. letech pøi hledání mechanizmu pùsobení alphaxalonu (Smaje, 1976). Následné studie ukázaly, že alphaxalon potencuje odpovìdi GABA A receptorù a že øada steroidních látek ovlivòuje excitabilitu neuronù nejen modulací inhibièních GABA A receptorù, ale i dalších ionotropních receptorù pro neuropøenašeèe. Interakce neurosteroidù s ionotropními receptory je pravdìpodobnì molekulárním podkladem jejich vlivu na chování a úèinku v experimentálních modelech lidských onemocnìní. Pøehled nejèastìjších neurosteroidù a jejich metabolizmus Mezi neurosteroidy, které mají specifický úèinek na iontové kanály nervových bunìk, patøí pøedevším pregnenolon a dehydroepiandrosteron. Pregnenolon se vyskytuje v mozku nejen jako nekonjugovaný steroid, ale také jako ester kyseliny sírové (pregnenolon sulfát) a ester vyšších mastných kyselin (Robel et al., 1987). U samcù dospìlých potkanù dosahuje koncentrace pregnenolonu øádovì 100 pmol v gramu mozkové tkánì. Vyšší hladiny byly zjištìny v hypotalamu, nižší hladina v mozkové kùøe (Hu et al., 1987). Analýza pokusù s adrenalektomií a kastrací ukazuje, že syntéza pregnenolonu probíhá v centrálním nervovém systému nezávisle na jeho periferních zdrojích (Baulieu, 1998). Enzym, který štìpí boèní øetìzec cholesterolu za vzniku pregnenolonu (P-450 scc ), je lokalizován v mitochondriích a u dospìlých laboratorních potkanù se nachází pøedevším v myelinizovaných èástech mozku (Le Goascogne et al., 1987). Tvorba pregnenolonu i dalších neurosteroidù z cholesterolu byla prokázána u oligodendrocytù a astrocytù (Kabbadj et al., 1993). V oligodendrocytech je pregnenolon metabolizován na dehydroepiandrosteron, pro- 5

O CH 3 CH 3 O CH 3 CH 3 CH 3 O OH CH 3 H CH 3 H CH 3 H H H H H H H HO HO HO H H H allopregnanolon pregnanolon 5α-tetrahydrodeoxykortikosteron Obrázek 1: Struktura nìkterých neurosteroidù 6 gesteron a 21-OH-pregnenolon, které mohou být dále konjugovány. Výsledky øady studií dokládají, že syntéza neurosteroidù probíhá de novo také v neuronech. To bylo prokázáno u Purkyòových bunìk mozeèku, pyramidových a granulárních bunìk hipokampu, u senzorických neuronù dorzálních míšních ganglií a u motoneuronù (Usui et al., 1995; Compagnone a Mellon, 1998; Tsutsui a Ukena, 1999). V nervové tkáni jsou pøítomny enzymové systémy, které se podílejí nejen na tvorbì, ale i na rychlé degradaci biologicky aktivních neurosteroidù. Mezi hlavní degradaèní enzymy patøí neuronální sulfatáza (Iwamori et al., 1976). Tento enzym konvertuje sulfatované neurosteroidy na jejich nesulfatové analogy, které mají jinou biologickou úèinnost (Park-Chung et al., 1994). Molekulární mechanizmy pùsobení neurosteroidù Vliv neurosteroidù na inhibièní receptory aktivované GABA a glycinem Kyselina γ-aminomáselná (GABA) je hlavním inhibièním neuropøenašeèem v centrálním nervovém systému, aktivujícím iontové kanály propustné pro chloridové ionty (Moss a Smart, 2001). Ionotropní GABA receptory se èlení na základì jejich farmakologických vlastností a podjednotkového složení do dvou základních skupin: GABA A a GABA C receptory (Bormann, 2000). Ionotropní GABA receptory jsou pentamery tvoøené kombinací podjednotek osmi známých tøíd: α (šest izoforem), β (tøi izoformy), γ (tøi izoformy), δ, ε, θ, π a ρ (po jediné izoformì). Funkèní vlastnosti GABA receptorù, jejich syntéza, stabilizace v membránì a internalizace jsou prùbìžnì regulovány víceúrovòovými bunìènými systémy (Moss a Smart, 2001). Do dynamické modulace funkce GABA A receptorù jsou zapojeny nìkteré neurosteroidy. Pregnenolon sulfát snižuje odpovìdi GABA A receptorù (Gee et al., 1988; Majewska, 1992). Pøi studiu rekombinantních receptorù tvoøených podjednotkami α, β a γ bylo zjištìno, že pregnenolon sulfát vyvolává napì ovì nezávislou blokádu GABA A receptorù se stejnì rychlým nástupem pøi otevøených i zavøených kanálech, pøièemž nedochází ke zmìnì afinity receptoru pro agonistu (Akk et al., 2001). Další práce ukázala, že v hipokampálních neuronech potkanù pregnenolon sulfát snižuje maximální odpovìdi vzniklé aktivací GABA receptorù, urychluje jejich deaktivaci a desenzitizaci (Shen et al., 2000). Jiné neurosteroidy, jako napøíklad allopregnanolon a tetrahydrodeoxykortikosteron naopak úèinnì potencují odpovìdi vzniklé aktivací GABA A receptorù a zvyšují úèinnost inhibièního synaptického pøenosu v rùzných oblastech mozku (Lambert et al., 1995). Efekt allopregnanolonu na GABA receptory je odlišný v rùzných èástech nervového systému (Gee a Lan, 1991), což je pravdìpodobnì zpùsobeno odlišným podjednotkovým složením tìchto receptorù (Belelli et al., 1996). Pøekvapivým zjištìním je protichùdný úèinek nízkých a vysokých koncentrací exogennì aplikovaného agonisty (GABA) na kultivovované hypofyzárních buòky pøi souèasném pùsobení allopregnanolonu nebo jeho 5β-stereoizomeru pregnanolonu. Pøi nízkých koncentracích agonisty mají neurosteroidy potenciaèní vliv na odpovìdi, kdežto pøi vysokých koncentracích je tlumí (Le Foll et al., 1997; Poisbeau et al., 1997). Inhibice vyvolaná pregnenolon sulfátem nebo jinými inhibièními steroidy je nezávislá na souèasné aplikaci potencujících neurosteroidù, což svìdèí o tom, že na GABA receptorech existují dvì odlišná vazebná místa pro neurosteroidy (Park-Chung et al., 1999). Allopregnanolon ovlivòuje nejen postsynapticky lokalizované GABA receptory, ale pravdìpodobnì i presynapticky uložené receptory, které øídí uvolòování váèkù s GABA bìhem synaptického pøenosu. Tomu nasvìdèují výsledky pokusù, v nichž byla provedena analýza miniaturních inhibièních postsynaptických proudù, které vznikají spontánním uvolòováním GABA ze synaptických zakonèení. Allopregnanolon, v souladu s jeho postsynaptickým úèinkem, ovlivòoval èasový prùbìh miniaturních inhibièních postsynaptických proudù, ale také zvyšoval jejich frekvenci, což nasvìdèuje též jeho presynaptickému pùsobení (Haage a Johansson, 1999). Progesteron je prvním neurosteroidem, jehož úèinek byl studován na glycinovém receptoru. Na kultivovaných míšních neuronech tento neurosteroid vyvolává èásteènou inhibici glycinových receptorù s polovièní úèinnou koncentrací 16 µm. Progesteron se váže na receptor do vazebného místa odlišného od místa pro glycin. Podobný inhibièní úèinek na glycinový receptor má i nìkolik dalších steroidù, jako jsou deoxykortikosteron, kortikosteron, 17α-OH-progesteron a pregnenolon sulfát, narozdíl od 3β-allopregnanolon sulfátu a allopregnanolon sulfátu, které jsou neúèinné (Wu et al., 1990; Wu et al., 1997; Belelli et al., 1999). Vliv neurosteroidù na excitaèní receptory aktivované glutamátem Excitaèní pùsobení glutamátu na neurony centrální nervové soustavy obratlovcù se uskuteèòuje aktivací tøí odlišných typù ionotropních glutamátových receptorù. Ty jsou selektivnì aktivovány α-amino-3-hydroxy- 5-metyl-4-izoxazolpropionátem (AMPA receptory), kainátem (kainátové receptory) a N-metyl-D-aspartátem

(NMDA receptory), pøehled viz (Turecek a Vyklicky, 1997; Abdrachmanova, 1999; Dingledine et al., 1999). Sulfatované neurosteroidy selektivnì modulují aktivitu ionotropních glutamátových receptorù. Neurosteroidy mohou modulovat NMDA receptory jak pozitivnì, tak negativnì (Wu et al., 1991; Park-Chung et al., 1997), v pøípadì AMPA/kainátových receptorù byla nalezena pouze negativní modulace (Yaghoubi et al., 1998). Klonováním genù a následnou expresí bylo zjištìno, že AMPA receptory jsou pravdìpodobnì tetramery tvoøené kombinací podjednotek oznaèovaných GluR1 GluR4, a že kainátové receptory jsou tvoøené podjednotkami GluR5 GluR7, KA1 a KA2 (Hollmann a Heinemann, 1994). Wu et al. (1991) ukázali, že pregnenolon sulfát inhibuje odpovìdi vyvolané aktivací AMPA receptorù. Farmakologické studie, v nichž byl zkoumán vliv pregnenolon sulfátu na rekombinantní AMPA/kainatové receptory tvoøené GluR1, GluR3 nebo GluR6 podjednotkami, naznaèily, že pregnenolon sulfát snižuje maximální odpovìdi indukované agonistou, aniž by ovlivnil EC 50, což je v souladu s pøedstavou nekompetitivního mechanizmu jeho inhibice (Yaghoubi et al., 1998). Ve stejné práci autoøi ukázali, že maximální míra inhibice vyvolaná pregnenolon sulfátem je stejná pro receptory tvoøené podjednotkami GluR1 nebo GluR3, které jsou silnì inhibovány, na rozdíl od receptorù tvoøených GluR6, které jsou ovlivnìny pregnenolon sulfátem jen málo. Tyto výsledky ukazují, že existují teoretické pøedpoklady pro nalezení látek, které by specificky pùsobily na AMPA/kainatových receptorech rùzného podjednotkového složení. Na NMDA receptorech je negativní a pozitivní alosterický vliv neurosteroidù zprostøedkován specifickými vazebními místy, která jsou odlišná jak mezi sebou, tak od modulaèních míst pro spermin, redox, glycin, Mg 2+, MK- 801 a arachidonovou kyselinu (Park-Chung et al., 1997). Nativní NMDA receptory jsou heteromultimerní proteinové komplexy, jejichž funkèní a farmakologické vlastnosti jsou ovlivnìny podjednotkovým složením receptoru, který vzniká kombinací podjednotek NR1, NR2A-D a NR3A (Turecek a Vyklicky, 1997; Dingledine et al., 1999). Jednou z mála látek, která má podjednotkovì vázané pùsobení na NMDA receptorech, je ifenprodil, který inhibuje pouze receptory obsahující podjednotku NR2B (Williams, 1993). Vzhledem ke zcela zásadní úloze NMDA receptorù pro èinnost centrální nervové soustavy lze oèekávat, že i nové látky s farmakologickým úèinkem na tìchto receptorech budou podjednotkovì specifické. Tomu nasvìdèují nìkteré výsledky, které dokazují, že pregnenolon sulfát by mohl být prototypem látek, které mají podjednotkovì vázané pùsobení na NMDA receptorech. Tyto domnìnky se opírají o následující zjištìní: (a) odlišná míra potenciace vyvolaná pregnenolon sulfátem u rùzných neuronálních typù (od 80 % do 281 %) (Wu et al., 1991; Bowlby, 1993; Yaghoubi et al., 1998; Abdrachmanova et al., 2001), (b) pokusy na rekombinantních receptorech (Yaghoubi et al., 1998; Ceccon et al., 2001) a (c) nález selektivní potenciace pouze u receptorù urèitých funkèních vlastností (Abdrachmanova et al., 2001). Podjednotkovì vázané pùsobení inhibièních neurosteroidù na NMDA receptorech, jako jsou napø. pregnanolon sulfát, allopreganolon sulfát a další, nebylo zatím prokázáno (Wu et al., 1991; Park-Chung et al., 1997). Studium vlivu neurosteroidù na úèinnost excitaèního synaptického pøenosu naznaèuje, že pregnenolon sulfát, v souladu s jeho vlivem na izolované NMDA receptory, zvyšuje amplitudu a prodlužuje dobu trvání excitaèních postsynaptických proudù vzniklých aktivací tìchto receptorù na motoneuronech potkana (Abdrachmanova et al., 2001). Pøekvapivým zjištìním bylo, že ve stejných pokusech pregnenolon sulfát a pregnanolon sulfát neovlivòovaly amplitudu excitaèních postsynaptických proudù zprostøedkovanou AMPA receptory. Pøestože pregnanolon sulfát znaènì inhiboval izolované NMDA receptory, nemìl vliv na amplitudu ani dobu trvání proudù vzniklých aktivací synaptických NMDA receptorù. Dùvody pro tyto rozdíly nejsou jasné, dá se však spekulovat o tom, že glutamátové receptory uložené v synaptické a mimosynaptické oblasti jsou rùznì citlivé k modulaènímu vlivu neurosteroidù. Vliv neurosteroidù v centrální nervové soustavì není omezen pouze na iontové kanály aktivované neuropøenašeèi. Pregnenolon, pregnenolon sulfát, pregnanolon, allotetrahydrokortikosteron a dehydroepiandrosteron sulfát inhibují napì ovì závislé vápníkové kanály, a to již ve velmi nízkých koncentracích (Ffrench-Mullen a Spence, 1991). Dá se proto pøedpokládat, že se neurosteroidy tímto mechanizmem uplatòují i pøi presynaptické kontrole uvolòování neuropøenašeèe. Potenciální využití neurosteroidù k léèbì neurologických a psychiatrických onemocnìní Na zvíøecích modelech epilepsie bylo prokázáno, že nìkteré neurosteroidy vykazují antikonvulzivní úèinky, které se do znaèné míry pøekrývají s úèinky klasických antiepileptik (pro pøehled viz Rogawski a Porter, 1990; Gasior et al., 1999). Neurosteroidy mají vliv jak na jednotlivé záchvaty, tak na léèbu status epilepticus, a to jak samy, tak v kombinaci s klasickými antiepileptiky. Neurosteroidy jsou vysoce úèinné v pøedcházení epileptických záchvatù vyvolaných kokainem (Gasior et al., 1997). Pøedbìžné výsledky naznaèují, že tolerance organizmu k antikonvulzivnímu úèinku neurosteroidù nevzniká ani po dlouhodobém podávání. Díky slibným výsledkùm v animálních modelech epilepsie jsou nìkteré preparáty neurosteroidù již ve stadiu klinických zkoušek (Monaghan et al., 1997). Výsledky pokusù na zvíøatech i preklinických testù naznaèují, že neurosteroidy by mohly být úèinnou alternativou souèasných anxiolytik. Úzkost snižují nejen nìkteré pøirozenì se vyskytující metabolity progesteronu, jako jsou pregnanolon a allopregnanolon, ale i syntetické analogy, jako je napø. ganaxolon, který je úèinnìjší než diazepam (Beekman et al., 1998). U neurosteroidù nebyly v preklinických pokusech pozorovány poruchy pamìti, které pùsobí problémy bìhem podávání anxiolytik ze skupiny benzodiazepinù a nìkterých antiepileptik (Vivian et al., 1997). Behaviorální studie ukázaly snížení agresivity myších samcù po podání fluorovaného analogu allopregnanolonu podobnì jako po aplikaci benzodiazepinù (Slavikova et al., 2001). Neurosteroidy by mohly být využity i k léèbì nespavosti. Pøirozený steroid progesteron a jeho derivát allopregnanolon zkracují dobu potøebnou k navození spánku a prodlužují dobu non-rem fáze spánku (Lancel et al., 1996). Obì látky takto pùsobí ve velmi nízkých koncentracích, takže je možné, že hrají roli i v pøirozené regulaci spánku (Barbaccia et al., 1997). Neurosteroidy zvyšují délku úsekù nepøerušovaného non-rem spánku, která je považována u lidí za ukazatel kvality spánku, a navíc nezpùsobují kompenzaèní snížení délky non-rem spánku po odeznìní farmakologicky navozeného prodloužení non-rem spánku (Edgar et al., 1997). Nìkteré výsledky dokládají možnost využití neurosteroidù v léèbì drogové závislosti. Ve zvíøecích modelech 7

8 alkoholické závislosti allopregnanolon snižuje riziko epileptických záchvatù (Devaud et al., 1995). Ganaxolon, látka snižující úzkost, by mohl být použit ke snížení intenzity abstinenèních pøíznakù místo dosud používaných benzodiazepinù (Beekman et al., 1998). Pøes slibné výsledky dosavadních pokusù, jsou další testy nezbytné k tomu, aby plnì objasnily spektrum možností využití neurosteroidù v klinické praxi, vèetnì jejich použitelnosti pøi léèbì dalších onemocnìní, jako jsou poruchy pamìti (Vallee et al., 1997) a neurodegenerace (Weaver et al., 1997). Závìr Pochopení molekulárních mechanizmù funkce centrální nervové soustavy je jedním z krokù, které mohou pøispìt k poznání komplexních pochodù, vedoucích ke vzniku nervových a duševních chorob. Pøirozenì se vyskytující neurosteroidy pøedstavují perspektivní skupinu látek, která se vyznaèuje výrazným modulaèním vlivem na receptorech pro neuropøenašeèe v centrální nervové soustavì. Tyto úèinky na organizmus je pøedurèují jako možná anxiolytika, antiepileptika, analgetika, anestetika, látky zlepšující pamì a zabraòující excitotoxicitì. Doufejme, že se neurosteroidy a jejich syntetické analogy uplatní v brzké dobì též v klinické praxi pøi léèbì závažných neurologických a duševních chorob. Triviální názvy, zkratky a systematické chemické názvy užívané pro neurosteroidy Allopregnanolon: (3α5αTHP); 3α,5α tetrahydroprogesteron; 3α-hydroxy-5α-pregnan-20-on Allopregnanolon sulfát: (3α5αS); 20-oxo-5α-pregnan- 3α-yl sulfát Allotetrahydrokortikosteron: (THCC); 3α,11β,21-trihydroxy-5α -pregnan-20-on Dehydroepiandrosteron: (DHEA); 3β-hydroxyandrost-5-en-17-on Dehydroepiandrosteron sulfát: (DHEAS); 17-oxoandrost-5-en-3β-yl sulfát Pregnanolon: (3α5βTHP); 3α,5β-tetrahydroprogesteron; 3α-hydroxy-5β-pregnan-20-on Pregnanolon sulfát: (3α5βS); 20-oxo-5β-pregnan-3α-yl sulfát Pregnenolon: 3β-hydroxypregn-5-en-20-on Pregnenolon sulfát: (PS); 20-oxopregn-5-en-3β-yl sulfát Tetrahydrodeoxykortikosteron: (THDOC); 3α,21-dihydroxy-5α-pregnan-20-on Podìkování Práce byla podporována Grantovou agenturou Èeské republiky (grant è. 309/00/1654, 203/01/0084) a Grantem Ministerstva kultury, mládeže a vzdìlávání (LN00B122). LITERATURA MUDr. Ladislav Vyklický Jr., DrSc. Fyziologický ústav AV ÈR Vídeòská 1083 142 20 Praha 4 Abdrachmanova G, Chodounska H, Vyklicky L. Effects of steroids on NMDA receptors and excitatory synaptic transmission in neonatal motoneurons in rat spinal cord slices. Europ Neurosci 2001; In press. Abdrachmanova G, V. Vlachova, K. Vlèek, L. Vyklický. Glutamátem aktivované iontové kanály a excitaèní synaptický pøenos. Psychiatrie 1999;2:33 40. Akk G, Bracamontes J, Steinbach JH. Pregnenolone sulfate block of GABAA receptors: mechanism and involvement of a residue in the M2 region of the. J Physiol 2001;532:673 684. Barbaccia ML, Roscetti G, Trabucchi M, Purdy RH, Mostallino MC, Concas A, Biggio G. The effects of inhibitors of GABAergic transmission and stress on brain and plasma allopregnanolone concentrations. Brit Pharmacol 1997;120:1582 1588. Baulieu EE. Neurosteroids: a novel function of the brain. Psychoneuroendocrinology 1998;23:963 987. Baulieu EE. Neurosteroids: of the nervous system, by the nervous system, for the nervous system. Recent Prog Horm Res 1997;52:1 32. Beekman M, Ungard JT, Gasior M, Carter RB, Dijkstra D, Goldberg SR, Witkin JM. Reversal of behavioral effects of pentylenetetrazol by the neuroactive steroid ganaxolone. Pharmacol Exp Ther 1998;284:868 877. Belelli D, Lambert JJ, Peters JA, Gee KW, Lan NC. Modulation of human recombinant GABAA receptors by pregnanediols. Neuropharmacology 1996;35:1223 1231. Belelli D, Pistis M, Peters JA, Lambert JJ. The interaction of general anaesthetics and neurosteroids with GABA(A) and glycine receptors. Neurochem Int 1999;34:447 452. Bormann J. The ABC of GABA receptors. Trends Pharmacol Sci 2000;21:16 19. Bowlby MR. Pregnenolone sulfate potentiation of N-methyl-Daspartate receptor channels in hippocampal neurons. Mol Pharmacol 1993;43:813 819. Ceccon M, Rumbaugh G, Vicini S. Distinct effect of pregnenolone sulfate on NMDA receptor subtypes. Neuropharmacology 2001; 40:491 500. Compagnone NA, Mellon SH. Dehydroepiandrosterone: a potential signalling molecule for neocortical organization during development. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:4678 4683. Devaud LL, Purdy RH, Morrow AL. The neurosteroid, 3 alphahydroxy-5 alpha-pregnan-20-one, protects against bicucullineinduced seizures during ethanol withdrawal in rats. Alcohol, Clin Exp Res 1995;19:350 355. Dingledine R, Borges K, Bowie D, Traynelis SF. The glutamate receptor ion channels. Pharmacol Rev 1999;51:7 61. Edgar DM, Seidel WF, Gee KW, Lan NC, Field G, Xia H, Hawkinson JE, Wieland S, Carter RB, Wood PL. CCD-3693: an orally bioavailable analog of the endogenous neuroactive steroid, pregnanolone, demonstrates potent sedative hypnotic actions in the rat. Pharmacol Exp Ther 1997;282:420 429. Ffrench-Mullen JM, Spence KT. Neurosteroids block Ca2+ channel current in freshly isolated hippocampal CA1 neurons. Eur J Pharmacol 1991;202:269 272. Gasior M, Carter RB, Goldberg SR, Witkin JM. Anticonvulsant and behavioral effects of neuroactive steroids alone and in conjunction with diazepam. J Pharmacol Exp Ther 1997;282:543 553. Gasior M, Carter RB, Witkin JM. Neuroactive steroids: potential therapeutic use in neurological and psychiatric disorders. Trends Pharmacol Sci 1999;20:107 112. Gee KW, Bolger MB, Brinton RE, Coirini H, McEwen BS. Steroid modulation of the chloride ionophore in rat brain: structure-activity requirements, regional dependence and mechanism of action. J Pharmacol Exp Ther 1988;246:803 812. Gee KW, Lan NC. Gamma-aminobutyric acida receptor complexes in rat frontal cortex and spinal cord show differential responses to steroid modulation. Mol Pharmacol 1991;40:995 999. Haage D, Johansson S. Neurosteroid modulation of synaptic and GABA-evoked currents in neurons from the rat medial preoptic nucleus. J Neurophysiol 1999;82:143 151.

Hatina J, Reischig J. Hormonální regulace transkripce - specificita a regulace hormonální odpovìdi a dùsledky jejího porušení. Èesk Fysiol 2000;49:99 115. Hollmann M, Heinemann S. Cloned glutamate receptors. Annu Rev Neurosci 1994;17:31 108. Hu ZY, Bourreau E, Jung-Testas I, Robel P, Baulieu EE. Neurosteroids: oligodendrocyte mitochondria convert cholesterol to pregnenolone. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:8215 8219. Iwamori M, Moser HW, Kishimoto Y. Steroid sulfatase in brain: comparison of sulfohydrolase activities for various steroid sulfates in normal and pathological brains, including the various forms of metachromatic leukodystrophy. J Neurochem 1976;27:1389 1395. Kabbadj K, el-etr M, Baulieu EE, Robel P. Pregnenolone metabolism in rodent embryonic neurons and astrocytes. Glia 1993;7:170 175. Lambert JJ, Belelli D, Hill-Venning C, Peters JA. Neurosteroids and GABAA receptor function. Trends Pharmacol Sci 1995;16:295 303. Robel P, Bourreau E, Corpechot C, Dang DC, Halberg F, Clarke C, Haug M, Schlegel ML, Synguelakis M, Vourch C, et al. Neurosteroids: 3 beta-hydroxy-delta 5-derivatives in rat and monkey brain. J Steroid Biochem 1987;27:649 655. Rogawski MA, Porter RJ. Antiepileptic drugs: pharmacological mechanisms and clinical efficacy with consideration of promising developmental stage compounds. Pharmacol Rev 1990;42:223 286. Selye H. Anesthetic Effect of Steroid Hormones. Proc Soc Exp Biol Med 1941;46:116 121. Shen W, Mennerick S, Covey DF, Zorumski CF. Pregnenolone sulfate modulates inhibitory synaptic transmission by enhancing GABA(A) receptor desensitization. J Neurosci 2000;20:3571 3579. Slavikova B, Kasal A, Uhlirova L, Krsiak M, Chodounska H, Kohout L. Suppressing aggressive behavior with analogs of allopregnanolone (epalon). Steroids 2001;66:99 105. Smaje JC. General anaesthetics and the acetylcholine-sensitivity of cortical neurons. Br J Pharmacol 1976;58:359 366. Lancel M, Faulhaber J, Holsboer F, Rupprecht R. Progesterone induces changes in sleep comparable to those of agonistic GABAA receptor modulators. Amer J Physiol 1996;271: E763 772. Le Foll F, Castel H, Louiset E, Vaudry H, Cazin L. Multiple modulatory effects of the neuroactive steroid pregnanolone on GABAA receptor in frog pituitary melanotrophs. J Physiol 1997;504:387 400. Le Goascogne C, Robel P, Gouezou M, Sananes N, Baulieu EE, Waterman M. Neurosteroids: cytochrome P-450scc in rat brain. Science 1987;237:1212 1215. Majewska MD. Neurosteroids: endogenous bimodal modulators of the GABAA receptor. Mechanism of action and physiological significance. Prog Neurobiol 1992;38:379 395. McEwen BS. Non-genomic and genomic effects of steroids on neural activity. Trends Pharmacol Sci 1991;12:141 147. McKenna NJ, Lanz RB, O Malley BW. Nuclear receptor coregulators: cellular and molecular biology. Endocr Rev 1999;20:321 344. Monaghan EP, Navalta LA, Shum L, Ashbrook DW, Lee DA. Initial human experience with ganaxolone, a neuroactive steroid with antiepileptic activity. Epilepsia 1997;38:1026 1031. Tsutsui K, Ukena K. Neurosteroids in the cerebellar Purkinje neuron and their actions (review). Int J Mol Med 1999;4:49 56. Turecek R, Vyklicky L, Jr. NMDA podtyp glutamátového receptoru. Èesk Fysiol 1997;46:122 133. Usui M, Yamazaki T, Kominami S, Tsutsui K. Avian neurosteroids. II. Localization of a cytochrome P450scc-like substance in the quail brain. Brain Res 1995;678:10 20. Vallee M, Mayo W, Darnaudery M, Corpechot C, Young J, Koehl M, Le Moal M, Baulieu EE, Robel P, Simon H. Neurosteroids: deficient cognitive performance in aged rats depends on low pregnenolone sulfate levels in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:14865 14870. Vivian JA, Barros HM, Manitiu A, Miczek KA. Ultrasonic vocalizations in rat pups: modulation at the gamma-aminobutyric acida receptor complex and the neurosteroid recognition site. Pharmacol Exp Ther 1997;282:318 325. Weaver CE, Jr., Marek P, Park-Chung M, Tam SW, Farb DH. Neuroprotective activity of a new class of steroidal inhibitors of the N-methyl-D-aspartate receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:10450 10454. Moss SJ, Smart TG. Constructing inhibitory synapses. Nat Rev Neurosci 2001;2:240 250. Park-Chung M, Malayev A, Purdy RH, Gibbs TT, Farb DH. Sulfated and unsulfated steroids modulate gamma-aminobutyric acida receptor function through distinct sites. Brain Res 1999;830:72 87. Park-Chung M, Wu FS, Farb DH. 3 alpha-hydroxy-5 beta-pregnan- 20-one sulfate: a negative modulator of the NMDA-induced current in cultured neurons. Mol Pharmacol 1994;46:146 150. Park-Chung M, Wu FS, Purdy RH, Malayev AA, Gibbs TT, Farb DH. Distinct sites for inverse modulation of N-methyl-D-aspartate receptors by sulfated steroids. Mol Pharmacol 1997;52:1113 1123. Poisbeau P, Feltz P, Schlichter R. Modulation of GABAA receptormediated IPSCs by neuroactive steroids in a rat hypothalamohypophyseal coculture model. J Physiol (Lond) 1997;500:475 485. Williams K. Ifenprodil discriminates subtypes of the N-methyl-Daspartate receptor: selectivity and mechanisms at recombinant heteromeric receptors. Mol Pharmacol 1993;44:851 859. Wu FS, Gibbs TT, Farb DH. Inverse modulation of gammaaminobutyric acid- and glycine-induced currents by progesterone. Mol Pharmacol 1990;37:597 602. Wu FS, Gibbs TT, Farb DH. Pregnenolone sulfate: a positive allosteric modulator at the N-methyl-D- aspartate receptor. Mol Pharmacol 1991;40:333 336. Wu FS, Chen SC, Tsai JJ. Competitive inhibition of the glycineinduced current by pregnenolone sulfate in cultured chick spinal cord neurons. Brain Res 1997;750:318 320. Yaghoubi N, Malayev A, Russek SJ, Gibbs TT, Farb DH. Neurosteroid modulation of recombinant ionotropic glutamate receptors. Brain Res 1998;803:153 160. 9

ÚLOHA N-ACETYL-ASPARTYL-GLUTAMÁTU V MODELU SCHIZOFRENIE ROLE OF N-ACETYL-ASPARTYL-GLUTAMATE IN SCHIZOPHRENIA MODEL FRANTIŠEK Š ASTNÝ 1, 2, LIOUDMILA PLISS 2, VÌRA BUBENÍKOVÁ 1, 2 1 Psychiatrické centrum Praha a 3. lékaøská fakulta Univerzity Karlovy, Praha 2 Fyziologický ústav Akademie vìd Èeské republiky, Praha SOUHRN Dysfunkce glutamátergní neurotransmise je jedením z hlavních etiopatogenetických aspektù neurovývojové hypotézy schizofrenie. Nálezy snížených hladin glutamátu a abnormální exprese NMDA typu glutamátového receptoru v nìkterých oblastech mozku schizofrenikù jsou v souladu s touto hypotézou. Naopak mnohem ménì vyjádøené zmìny v expresi jednotlivých podtypù metabotropního glutamátového receptoru kontrastují se zvýšenými hladinami N-acetyl-aspartyl-glutamátu (agonista podtypu 2/3) v prefrontální kùøe a v hipokampu pacientù se schizofrenií. Tato diskrepance je pøedmìtem diskuze a dalšího ovìøování na animálním modelu schizofrenie. Klíèová slova: neurovývojová hypotéza schizofrenie, glutamátergní dysfunkce, N-acetyl-aspartyl-glutamát SUMMARY Dysfunction of glutamatergic neurotransmission belongs to main etiopathogenic features of neurodevelopmental hypothesis of schizophrenia. Previous findings of lowered levels of glutamate and abnormal expression of NMDA-type of glutamate receptors in schizophrenic brain are in agreement with this hypothesis. However, minimal or no changes in the expression of metabotropic glutamate receptors disagree with elevated levels of N-acetyl-aspartyl-glutamate (agonist of subtype 2/3) in the prefrontal cortex and hippocampus of patients with schizophrenia. This discrepancy is discussed and further verified in animal model of schizophrenia. Key words: neurodevelopmental hypothesis of schizophrenia, glutamatergic dysfunction, N-acetyl-aspartyl-glutamate 10 Neurovývojová hypotéza schizofrenie a dysfunkce glutamátergního systému mozku Je nepochybné, že v patogenezi schizofrenie hrají významnou úlohu kromì genetických faktorù i faktory epigenetické (Brzustowicz et al., 2000). V prenatálním období reprezentují rizikové faktory prostøedí pøedevším hypoxie plodu nebo pøenos infekce, v perinatálním období je to pøedevším asfyxie novorozence a v postnatálním období také podvýživa a èasný sociální stres (Ellenbroek and Cools, 1998; Tsuang, 2000). Dùsledkem pùsobení jednoho nebo více tìchto faktorù je vznik drobného mozkového poškození, na jehož podkladì se postupnì rozvíjí øada zmìn, vèetnì èasné dysfunkce glutamátergního systému mozku (Coyle, 1996). První podporou pro tuto hypotézu byl nález významnì snížených hladin glutamátu v mozkomíšní tekutinì schizofrenikù v porovnání se zdravými jedinci (Kim et al., 1980). Pøestože tento nález nebyl pozdìji jednoznaènì potvrzen (Perry, 1982), již døíve známá skuteènost, že nekompetitivní antagonisté N-metyl-Daspartátového (NMDA) typu ionotropního glutamátového receptoru (iglur) zpùsobují u zdravých jedincù krátkodobé zmìny chování a u stabilizovaných schizofrenikù vedou k akutní manifestaci pøíznakù nemoci, udržela tuto hypotézu v popøedí zájmu i v následujícím desetiletí (Lodge et al., 1982; Javitt a Zukin, 1991). Oprávnìnost této hypotézy dále potvrdila existence vztahu mezi hypofunkcí glutamátergního systému a epizodickou hyper- a hypoaktivitou dopaminergní neurotransmise v prefrontální kùøe v souvislosti s dysfunkcí mezokortikálního dopaminového vstupu (Carlsson a Carlsson, 1990). Zvýšená dopaminergní aktivita a souèasná dysfunkce glutamátergních neuronù v prefrontální mozkové kùøe jsou dávány do souvislosti s poruchami pracovní pamìti (Romanides et al., 1999). Na úrovni neuronální membrány je vzájemný vztah obou neurotransmiterových systémù doložen pøímou inhibicí NMDA receptoru dopaminem (Castro et al., 1999) a inhibièním vlivem glutamátu na uvolòování dopaminu (Wu et al., 2000). Vzhledem k tomuto existujícímu vztahu proto nepøekvapuje, že nìkteré látky ze skupiny klasických neuroleptic a antipsychotik II. generace, kromì inhibice nìkterého z dopaminových receptorù podskupiny D 2, souèasnì interagují i s NMDA receptorem (Banerjee et al., 1995; Shim et al., 1999). V pøípadì haloperidolu je tato interakce dokonce vysoce selektivní pro NR1/NR2B podjednotkové složení NMDA receptoru (Gallagher et al., 1998). Pøitom není bez zajímavosti, že právì tyto dvì podjednotky jsou rozdílnì exprimovány v nìkterých oblastech mozku schizofrenikù (Gao et al., 2000). V animálním modelu pak snížení exprese NR1 podjednotky na 5% kontrolní hodnoty je provázeno zmìnami chování tìchto zvíøat (hyperlokomoce, stereotypie a sociální deficit), které mohou být pøíznivì ovlivnìny haloperidolem a clozapinem (Mohn et al., 1999).

Neurovývojová hypotéza schizofrenie a dysfunkce NMDA receptoru úzce souvisejí s otázkou omezené neurodegenerace v prenatálním, perinatálním nebo i v èasnì postnatálním období vývoje (Lieberman, 1999). Pøehledné práce Harrisona (1999) a Powerse (1999) pak odkazují na øadu nálezù svìdèících pro diskrétní zmìnu v hustotì neuronù v nìkterých oblastech mozku, jejich zmenšenou velikost, èásteènou disorganizaci a omezenou dendrifikaci v hipokampu a ve fronto-entorino-parahipokampálních oblastech mozkové kùry schizofrenikù. Studium histopatologických ukazatelù neurodegenerace však neprokázalo pøetrvávající astrogliózu, aktivaci mikroglie nebo axonální poškození (Arnold et al., 1998). To však nevyluèuje úèast programované (apoptotické) smrti neuronù na tomto procesu (Yuan a Yankner, 2000), a to vzhledem k jeho odlišné morfologické a metabolické charakteristice v porovnání se zánikem neuronù mechanizmem bunìèné nekrózy (tab. 1). V porovnání s nekrózou není Tabulka 1: Zmìny provázející nekrotický nebo apoptotický typ bunìèné smrti nekróza apoptóza morfologie metabolizmus morfologie metabolizmus povrchová bunìèná zbobtnalá nespecifické svraštìlá externalisace membrána zmìny fosfatidylserinu cytoplazma nespecifické aktivace mírná aktivace zmìny destrukèních kondenzace kaspázového enzymù systému mitochondrie zbobtnalé uvolnìní nespecifické pomalý pokles cytochromu C; zmìny membránového rychlý pokles potenciálu membránového potenciálu jádro nespecifické nespecifické heterokonden- specifické zmìny štìpení DNA zace; štìpení DNA marginalizace; mezi nucleosegmentace zómy do úsekù jádra 180 185 bp rozpad buòky tvorba silná zánìtlivá tvorba slabá zánìtlivá bunìèné drti odpovìï apoptotických odpovìï tìlísek apoptotický zánik neuronù provázen významnìjší aktivací mikroglie a astrocytù. To souvisí se skuteèností, že neurony zanikající mechanizmem apoptózy se rozpadají do vìtšího poètu apoptotických tìlísek, jejichž fagocytóza aktivovanými makrofágy potlaèuje v tìchto buòkách sekreci prozánìtlivých faktorù. Z vývojového hlediska inhibice NMDA receptoru fencyklidinem, MK-801 nebo ketaminem významnì zvyšuje regionální zánik neuronù mechanizmem apoptózy, s perinatálním maximem ve frontální a cingulární mozkové kùøe (Ikonomidou et al., 1999). V mozeèku je obdobného maxima dosaženo až v èasném postnatálním období (Monti a Contestabile, 2000). V souèasnosti však zùstává nezodpovìzenou otázkou, zda inhibicí NMDA receptoru podmínìný úbytek neuronù v uvedených oblastech vyvíjejícího se mozku je zpùsoben snížením cytoplazmatické hladiny volného Ca 2+ a následným snížením jejich migraèní a cytodiferenciaèní aktivity (Hirai et al., 1999), nebo sekundární up-regulací NMDA receptoru, která je provázena zmìnou jeho podjednotkového složení a následnì i zvýšenou citlivostí tìchto neuronù vùèi excitotoxickému poškození (Williams et al., 1992; Wilson et al., l998). Souèasnì se zmìnìnou expresí NMDA receptoru byla prokázána i zvýšená exprese podtypu 5 metabotropního glutamátového receptoru (mglur), který dále potencuje odpovìdi zprostøedkované NMDA receptorem (Bandrowski et al., 2001). Není bez zajímavosti, že obdobné zvýšení exprese tohoto podtypu mglur bylo prokázáno v prefrontální kùøe pacientù se schizofrenií (Meador-Woodruff a Healy, 2000). Neuropatologické zmìny zpùsobené inhibicí NMDA receptoru doprovázejí zmìny v chování jedince charakterizované poruchou senzorimotorického vstupu. Existenci této poruchy dokládájí zmìny v prepulzní inhibici úlekové reakce na akustický podnìt, pozorované v animálním modelu schizofrenie od 3. postnatálního týdne vývoje potkana (Martinez et al., 2000). Avšak u dospìlých jedincù nikoliv jednorázové, ale teprve opakované podání MK-801 zpùsobilo významnou prepulzní inhibici této úlekové reakce (Schulz et al., 2001). Uvedený animální model mùže být srovnáván s obdobným deficitem v prepulzní inhibici této reakce, který byl pozorován u pacientù se schizofrenií. Receptory pro glutamát a jejich exprese v mozku schizofrenikù Glutamátové receptory pøítomné v membránách nervových bunìk lze rozdìlit do dvou velkých podskupin podle toho, zda jsou vázány na receptorovì øízené iontové kanály v povrchových membránách nervových bunìk a podílejí se tak na transmembránových pøesunech iontù (viz pøehled Abdrachmanová et al., 1999) nebo jsou spøaženy s G-proteiny a následnì ovlivòují metabolickou aktivitu nervové buòky (viz pøehled Varney a Suto, 2000). V souvislosti s tìmito funkèními zmìnami hovoøíme proto v prvním pøípadì o ionotropních (iglur) a ve druhém pak o metabotropních glutamátových receptorech (mglur). Nedávná pozorování ukázala, že zmìny v hustotì obou uvedených typù glutamátových receptorù jsou v mozku schizofrenikù malé nebo zcela chybí v porovnání s vhodnými kontrolami (Weinberger, 1999; Gao et al., 2000; Goff, 2000; Meador-Woodruff a Healy, 2000). V pøípadì iglur to platí pøedevším o NMDA senzitivní vazbì [ 3 H]glutamátu, zatímco pro nonnmda receptor AMPA nebo kainátového (KA) typu byl prokázán vzestup vazby v prefrontální kùøe a její pokles v hipokampu, a to pøedevším v CA2 oblasti (Gao et al., 2000; Goff, 2000). Zmìny ve vazbì glutamátu jsou alespoò èásteènì podmínìny zvýšenou nebo sníženou expresí nìkterých podjednotek v uvedených typech iglur. V pøípadì AMPA receptoru byla prokázána významnì zvýšená exprese podjednotky GluR1 ve frontální kùøe a snížení exprese GluR2 v neuronech oblasti CA3/4 hipokampu u pacientù se schizofrenií. Je známo, že pøítomnost 11

12 GluR2 v tetra- nebo pentamerech AMPA receptoru snižuje propustnost tohoto receptorovì øízeného iontového kanálu pro Ca 2+. Snížená exprese této podjednotky proto vede ke zvýšenému vstupu Ca 2+ a podmiòuje tak zvýšení vulnerability tìchto neuronù vùèi excitotoxickým podnìtùm (Goff, 2000). Funkèní význam provázejícího snížení exprese KA1 podjednotky v neuronech frontální kùry není v souèasné dobì jasný. Navzdory témìø nezmìnìné hustotì NMDA receptorových míst v prefrontální kùøe a v hipokampu schizofrenikù, podjednotkové složení tohoto receptoru vykazuje významné rozdíly v porovnání s vhodnými kontrolami. Je to pøedevším zvýšené zastoupení NR2D podjednotky v extrasynapticky se nacházejících NR1/ NR2D oligoheteromerech NMDA receptoru (Akbarian et al., 1996), které podmiòuje jejich malou citlivost vùèi blokádì iontového kanálu Mg 2+. S tím souvisí jejich snazší aktivovatelnost glutamátem, pøi jejich nízké vodivosti a pomalé deaktivaci (Cull-Candy et al., 2001). Zvýšená exprese této podjednotky, stejnì jako zvýšená exprese podjednotky NR2B v nìkterých oblastech hipokampu schizofrenikù (Gao et al., 2000), podmiòující zvýšenou citlivost NR1/NR2B receptorù vùèi polyaminùm, svìdèí pro kompenzaèní vzestup citlivosti tohoto typu receptoru vùèi nìkterým ligandùm, pøedevším pak vùèi glutamátu. Tento vzestup citlivosti je nutný i vzhledem ke snížené expresi NR1 podjednotky, která je ubikvitnì zastoupena v NMDA receptoru (Gao et al. 2000; Goff, 2000). NR1 podjednotka odpovídá za vytváøení správných oligoheteromerù NMDA receptoru s NR2 podjednotkami a za jejich stabilitu v povrchové membránì (García-Gallo et al., 2001). Na rozdíl od NR2 podjednotek, které obsahují vazebné místo pro glutamát, NR1 podjednotka tvoøí glycinové vazebné místo, které je v mozku schizofrenikù sníženì exprimováno (Gao et al., 2000; Goff, 2000). Dùsledkem je snížená afinita rekognièního místa pro glutamát, kterou lze èásteènì zvýšit podáváním glycinu a jeho analogù (D-serin, D-cykloserin) pacientùm se schizofrenií (Faber et al., 1999). Tímto mechanizmem glycin také snižuje výdej dopaminu v podkorových oblastech mozku, který je zvýšen v dùsledku hypofunkce NMDA receptoru (Javitt et al., 1999). Podobný vliv na hypofunkci NMDA receptoru vykazuje i aktivace podtypu 2/3 mglur (Moghaddam a Adams, 1998). V jakém vztahu k tomuto nálezu jsou zvýšené hladiny N- acetyl-aspartyl-glutamátu (NAAG), agonisty obou uvedených podtypù skupiny II mglur, které byly zjištìny v prefrontální kùøe a v hipokampu schizofrenikù (Tsai et al., 1995), není nejasné. Dùsledkem aktivace obou podtypù mglur je inhibice aktivity adenylcyklázy a tím i snížení úrovnì fosforylací v buòce. Ve vztahu ke schizofrenii se pøedpokládá úèast tìchto podtypù mglur v patofyziologii této psychózy, nikoliv však na úrovni jejich exprese (Richardson-Burns et al., 2000). Výjimku èiní jen zvýšená exprese podtypu 5 ze skupiny I mglur v nìkterých podoblastech orbitofrontální kùry u pacientù se schizofrenií (Meador-Woodruff a Nealy, 2000), která mùže být ve vztahu k potenciaci odpovìdí zprostøedkovaných iglur (Bandrowki et al., 2001). N-acetyl-aspartyl-glutamát a jeho úloha v glutamátergní dysfunkci N-acetyl-aspartyl-glutamát (NAAG) je kyselý neuropeptid, jehož submilimolární až milimolární koncentrace byly nalezeny v mozku savcù a èlovìka (Pouwels a Frahm, 1997; Neale et al., 2000). Je lokalizován pøedevším v populacích korových a podkorových neuronù, které používají glutamát, noradrenalin, dopamin a GABA jako pøenašeèe nervového vzruchu (Coyle, 1997). Je pøítomen v neuronech tvoøících nìkterá spojení ve zrakové a nigrostriatální dráze, stejnì jako v aferentním vstupu do mozeèku a do páteøní míchy. V tìchto neuronech je syntézován, transportován do jejich nervových zakonèení a akumulován v synaptických váècích, kde je èasto pøítomen spoleènì s glutamátem. Elektrický podnìt vede k výlevu NAAG ze synaptických váèkù do synaptické štìrbiny, a to Ca 2+ -dependentním mechanizmem. NAAG potom interaguje s mglur skupiny II (podtyp 2/3) v pre-, postsynaptické nebo gliální membránì. V nízkých milimolárních koncentracích se váže i do NMDA receptoru, a to s výraznou preferencí pro oligoheteromery NR1/NR2D typu (Neale et al., 2000). Ze synaptické štìrbiny je ale rychle odstraòován, a to (1) transportem protonù spøaženým pøenašeèem, nebo je (2) hydrolyzován glutamátkarboxypeptidázou II (NAALADasa) na glutamát a N-acetyl-aspartát (obrázek 1). Obì aminokyseliny jsou pak odpovídajícími pøenašeèi transportovány zpìt do nervových bunìk. Zatímco glutamát se tak dostává do jejich neurotransmiterového nebo metabolického poolu, NAA mùže být dále hydrolyzován nebo je využit pøi tvorbì myelinu. Obrázek 1: Úloha NAAG jako pøenašeèe/modulátoru vzruchové aktivity v CNS

V synaptické štìrbinì z NAAG uvolnìný glutamát mùže dále fungovat jako neurotransmiter, a proto se také o tomto neuropeptidu uvažuje jako o jeho zásobní formì. Do souvislosti s tím je dávána i NAAG nepøímo podmínìná neurotoxicita (Thomas et al., 2000). Prokázali jsme však, že i NAAG sám mùže pùsobit degeneraci nìkterých populací neuronù ve vybraných podoblastech hipokampu (Pliss et al., 2000). Poškození hipokampálních neuronù vede k jejich neapoptotickému zániku a mùže být potlaèeno souèasným podáním kompetitivních i nekompetitivních antagonistù NMDA receptoru. Pøitom jsme prokázali, že neurodegeneraci pùsobí NAAG sám a nikoliv produkty jeho hydrolýzy (Pliss et al., 2001). NAAG podmínìná neurodegenerace, kterou jsme pozorovali po intracerebroventrikulární infuzi nízkých milimolárních množství tohoto neuropeptidu, postihuje více než 10 % neuronù v gyrus dentatus a v presubiculu. Tato regionální preference souvisí s pøítomností NR2D podjednotky v NMDA oligoheteromeru v povrhové membránì zde pøítomných interneuronù (Goebel a Poosch, 1999). To vysvìtluje, proè NMDA receptor na tìchto GABAergních interneuronech je 10 citlivìjší na pùsobení NAAG než na pyramidálních buòkách hipokampu (Coyle, 1997). Poškození a zánik tìchto interneuronù souvisí s tím, že iontové kanály øízené tímto typem NMDA receptoru nejsou blokovány Mg 2+, vykazují velmi pomalou deaktivaèní kinetiku a nižší inhibici nekompetitivními antagonisty. To vede k protrahovanému vzestupu volného Ca 2+ v cytoplazmì, k následné dysfunkci mitochondrií a k poklesu metabolické aktivity buòky, jehož výše rozhodne o tom, zda buòka vstoupí do programované smrti, nebo zanikne nekrózou (Nicholls a Ward, 2000). Na rozdíl od mozku dospìlého jedince je NMDA receptor s NR2D podjednotkou mnohem více zastoupen v nìkterých podkorových oblastech a v mozkovém kmeni v prùbìhu perinatálního a èasnì postnatálního období (Wenzel et al., 1996). Jeho pøechodnì zvýšená exprese je soubìžná s pøechodnì vyššími tkáòovými koncentracemi NAAG a pravdìpodobnì souvisí s rychlou morfologickou a funkèní diferenciací neuronù v tìchto oblastech mozku. Nelze však vylouèit, že právì v èasném postnatálním období vysoké koncentrace NAAG v intersticiální tekutinì mozku, a zvláštì po jeho exogenním podání, mohou být pøíèinou zvýšeného zániku neuronù mechanizmem neurodegenerace, jak jsme to pozorovali u dospìlých experimentálních zvíøat (Pliss et al., 2000). Pro tento pøedpoklad by svìdèily i zmìny v chování mladých potkanù po infuzi NAAG 12. postnatální den pozorované pøed a po dosažení pohlavní dospìlosti (Bubeníková, nepublikovaná pozorování). Závìr Uvedené nálezy potvrzují, že NAAG je endogenním ligandem pro NMDA typ iglur s exprimovanou NR2D podjednotkou a agonistou pro podtypy 2/3 mglurii. Souèasná pozorování provedená na animálním modelu svìdèí pro úèast tohoto neuropeptidu v morfogenetických a funkèních aktivitách vyvíjejícího se mozku. Zùstává však pøedmìtem dalšího studia, øešeného v rámci projektu CNS, prokázat kauzální vztah mezi døíve popsaným zvýšením hladin NAAG v frontotemporální kùøe a v hipokampu schizofrenikù a námi pozorovaným zánikem neuronù a následnými zmìnami chování jedince v prùbìhu jeho postnatálního vývoje. Tato práce byla podpoøena projektem MŠMT LN00B122. LITERATURA doc. MUDr. František Š astný, CSc. Psychiatrické centrum Praha Ústavní 91 181 03 Praha 8 Bohnice E-mail: stastny@pcp.lf3.cuni.cz Abdrachmanová G, Vlachová V, Vlèek K, Vyklický L,Jr. Glutamátem aktivované iontové kanály. Psychiatrie 1999;3(Suppl 2):33 40. Akbarian S, Sucher NJ, Bradley D, Tafazzoli A, Trinh D, Hetrick WP, Potkin SG, Sandman CA, Bunney WE,Jr, Jones EG. Selective alterations in gene expression for NMDA receptor subunits in prefrontal cortex of schizophrenics. J Neurosci 16;1996:19 30. Arnold SE, Trojanowski JQ, Gur RE, Blackwell P, Han L-Y, Choi C. Absence of neurodegeneration and neuronal injury in the cerebral cortex in a sample of elderly patients with schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 1998;55:225 232. Bandrowski AE, Aramakis VB, Moore SL, Ashe JH. Metabotropic glutamate receptors modify ionotropic glutamate responses in neocortical pyramidal cells and interneurons. Exp Brain Res 2001;136:25 40. Banerjee SP, Zuck LG, Yablonsky-Alter E, Lidsky TI. Glutamate agonist activity: implications for antipsychotic drug action and schizophrenia. NeuroReport 1995;6:2500 2504. Brzustowicz LM, Hodgkinson KA, Chow EWC, Honer WG, Bassett AS. Location of a major susceptibility locus for familial schizophrenia on chromosome 1q21-q22. Science 2000;288:678 682. Carlsson M, Carlsson A. Interactions between glutamatergic and monoaminergic systems within the basal ganglia implications for schizophrenia and Parkinson s disease. TINS 1990;13:272-276. Castro NG, de Mello MCF, de Mello GG, Aracava Y. Direct inhibition of the N-methyl-D-aspartate receptor channel by dopamine and (+)-SKF38393. Br J Pharmacol 1999;126:1847 1855. Coyle JT. The glutamatergic dysfunction hypothesis for schizophrenia. Harvard Rev Psychiatry 1996;3:241 253. Coyle JT. The nagging question of the function of N- acetylaspartylglutamate. Neurobiol Disease 1997;4:231 238. Cull-Candy S, Brickley S, Farrant M. NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. Curr Opinion Neurobiol 2001;11:327 335. Ellenbroek BA, Cools AR. The neurodevelopmental hypothesis of schizophrenia: clinical evidence and animal models. Neurosci Res Comm 1998;22:127 136. Faber NB, Newcomer JW, Olney JW. Glycine agonists. What can they teach us about schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 1999;56:13 17. Gallagher MJ, Huang H, Lynch DR. Modulation of the N-methyl- D-aspartate receptor by haloperidol: NR2B-specific interactions. J Neurochem 1998;70:2120 2128. García-Gallo M, Renart J, Díaz-Guerra M. The NR1 subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor can be efficiently expressed alone in the cell surface of mammalian cells and is required for the transport of the NR2 subunit. Biochem J 2001;356:539 547. Gao X-M, Sakai K, Roberts RC, Conley RR, Dean B, Tamminga CA. Ionotropic glutamate receptors and expression of N-methyl- D-aspartate receptor subunits in subregions of human hippocampus: effect of schizophrenia. Am J Psychiatry 2000;157:1141 1149. Goebel DJ, Poosch MS. NMDA receptor subunit gene expression in the rat brain: a quantitative analysis of endogenous mrna levels 13

of NR1 Com NR2A, NR2B, NR2C, NR2D and NR3A. Mol Brain Res 1999;69:164 170. Goff DC. Glutamate receptors in schizophrenia and antipsychotic drugs. In: Lidow MS, ed. Neurotransmitter receptors in actions of antipsychotic medications. Boca Raton: CRC Press, 2000;121 136. Harrison PJ. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain 1999;122:593 624. Hirai K, Yoshioka H, Kihara M, Hasegawa K, Sakamoto T, Sawada T, Fushiki S. Inhibiting neuronal migration by blocking NMDA receptors in the embryonic rat cerebral cortex: a tissue culture study. Dev Brain Res 1999;114:63 67. Pliss L, FitzGibbon T, Balcar VJ, Š astný F. Neurotoxicity of NAAG in vivo is sensitive to NMDA antagonists and mglur II ligands. NeuroReport 2000;11:3651 3654. Pliss L, Bubeníková V, Š astný F. Characterization of hippocampal neurodegeneration after intracerebroventricular administration of N-acetyl-aspartyl-glutamate. Psychiatrie 2001;5 (Suppl 2):102 104. Pouwels PJW, Frahm J. Differential distribution of NAA and NAAG in human brain as determined by quantitative localized proton MRS. NMR in Biomedicine 1997;10:73 78. Powers RE. The neuropathology of schizophrenia. J Neuropath exp Neurol 1999;58:679 690. Ikonomidou C, Bosch F, Miksa M, Bittigau P, Vöckler J, Dikranian K, Tenkova TI, Stefovska V, Turski L, Olney JW. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science 1999;283:70 74. Javitt DC, Balla A, Sehrsen H, Lajtha A. Reversal of phencyclidineinduced effects by glycine and glycine transport inhibitors. Biol Psychiatry 1999;45:668 679. Javitt DC, Zukin SR. Recent advances in the phencyclidine model of schizophrenia. Am J Psychiatry 1991;148:1301 1308. Kim JS, Kornhuber HH,Schmid-Burgk W, Holzmuller B. Low cerebrospinal fluid glutamate in schizophrenic patients and a new hypothesis of schizophrenia. Neurosci Lett 1980;20:379 382. Lieberman JA. Is schizophrenia a neurodegenerative disorder? A clinical and neurobiological perspective. Biol Psychiatry 1999;46:729 739. Lodge D, Anis NA. Effects of phencyclidine on excitatory amino acid activation of spinal interneurons in the cat. Eur J Pharmacol 1982;77:203 204. Martinez ZA, Halim ND, Oostwegel JL, Geyer MA, Swerdlow NR. Ontogeny of phencyclidine and apomorphine-induced startle gating deficits in rats. Pharmacol Biochem Behav 2000;65:449 457. Meador-Woodruff JH, Healy DJ. Glutamate receptor expression in schizophrenic brain. Brain Res Rev 2000;31:288 294. Moghaddam B, Adams BW. Reversal of phencyclidine effects by a group II metabotropic receptor agonist in rats. Science 1998;281:1349 01352. Mohn AR, Gainetdinov RR, Caron MG, Koller BH. Mice with reduced NMDA receptor expression display behaviors related to schizophrenia. Cell 1999;98:427 436. Monti B, Contestabile A. Blockade of the NMDA receptor increases developmental apoptotic elimination of granule neurons and activates caspases in the rat cerebellum. Eur J Neurosci 2000;12:3117 3123. Neale JH, Bzdega T, Wroblewska B. N-Acetylaspartylglutamate: the most abundant peptide neurotransmitter in the mammalian central nervous system. J Neurochem 2000;75:443 452. Nicholls DG, Ward MW. Mitochondrial membrane potential and neuronal glutamate excitotoxicity: mortality and millivolts. TINS 2000;23:166 174. Perry TL. Normal cerebrospinal fluid and brain glutamate levels in schizophrenia patients and a new hypothesis of glutamatergic neuronal dysfunction. Neurosci Lett 1982;28:81 85. Richardson-Burns SM, Haroutunian V, Davis KL, Watson SJ, Meador-Woodruff H. Metabotropic glutamate receptor mrna expression in the schizophrenic thalamus. Biol Psychiatry 2000;47:22 28. Romanides AJ, Duffy P, Kalivas PW. Glutamatergic and dopaminergic afferents to the prefrontal cortex regulate spatial working memory in rats. Neuroscience 1999;92:97 106. Shim SS, Grant ER, Singh S, Gallagher MJ, Lynch DR. Actions of butyrophenones and other antipsychotic agents at NMDA receptors: relationship with clinical effects and structural considerations. Neurochem Int 1999;14:167 175. Schulz B, Fendt M, Pedersen V, Koch M. Sensitization of prepulse inhibition deficits by repeated administration of dizocilpine. Neuropharmacology 2001;40:1240 1248. Tsai G, Passani LA, Slusher BS, Carter R, Baer L, Kleinman JE, Coyle JT. Abnormal excitatory neurotransmitter metabolism in schizophrenic brains. Arch Gen Psychiatry 1995;52:829 836. Thomas AG, Vornov JJ, Olkowski JL, Merion AT, Slusher BS. N- Acetylated α-linked acidic dipeptidase converts N- acetylaspartylglutamate from a neuroprotectant to a neurotoxin. Clin Pharmacol Exp Ther 2000;295:16 22. Tsuang M. Schizophrenia: genes and environment. Biol Psychiatry 2000;47:210 220. Varney MA, Suto CM. Discovery of subtype-selective metabotropic glutamate receptor ligands using functional HTS assays. Drug Discovery Today 2000;1:20 26. Weinberger DR. Cell biology of the hippocampal formation in schizophrenia. Biol Psychiatry 1999;45:395 402. Wenzel A, Villa M, Mohler H, Benke D. Developmental and regional expression of NMDA receptor subtypes containing the NR2D subunit in rat brain J Neurochem 1996;66:1240 1248. Williams K, Dichter MA, Molinoff PB. Up-regulation of N-methyl- D-aspartate receptors on cultured cortical neurons after exposure to antagonists. Mol Pharmacol 1992;42:147 151. Wilson MA, Kinsman SL, Johnston MV. Expression of NMDA receptor subunit mrna after MK-801 treatment in neonatal rats. Dev Brain Res 1998;109:211 220. Wu Y, Pearl SM, Zigmond MJ, Michael AC. Inhibitory glutamatergic regulation of evoked dopamine release in striatum. Neuroscience 2000;96:65 72. Yuan J, Yankner BA. Apoptosis in the nervous system. Nature 2000;407:802-809. 14

VÝVOJOVÉ ZMÌNY CITLIVOSTI MOZKU NA EXCITAÈNÍ AMINOKYSELINY DEVELOPMENTAL CHANGES IN THE SENSITIVITY TO EXCITATORY AMINO ACIDS PAVEL MAREŠ Fyziologický ústav Akademie vìd Èeské republiky, Praha SOUHRN Vyšší citlivost nezralého mozku byla pùvodnì prokázána pro neurotoxické úèinky excitaèních aminokyselin (kyseliny glutamové, asparagové a jejich agonistù). Jako další ukazatel je možno použít vývoj epileptogenních úèinkù tìchto aminokyselin. Silnìjší køeèové pùsobení v nezralém mozku než v mozku dospìlém bylo opakovanì prokázáno pro kyselinu kainovou. Rozdíl v citlivosti mezi nezralým a zralým mozkem je daleko výraznìjší pøi podání N-metyl-D-asparagové kyseliny (NMDA). Padesátiprocentní køeèová dávka NMDA je u 7denních mláïat o dva øády nižší než u dospìlých potkanù. Podobné zmìny citlivosti lze prokázat i pøi studiu antikonvulzivních úèinkù antagonistù excitaèních aminokyselin, speciálnì tìch, které pùsobí na NMDA typ receptorù, jak jsme prokázali na modelu generalizovaných tonicko-klonických záchvatù vyvolaných pentylentetrazolem. Vývoj úèinku antagonistù na jiný model epileptické následné výboje vyvolané elektrickým dráždìním mozkové kùry není tak jednoznaèný. To mùže být dáno pozdìjším vyzráváním talamokortikálního systému, který tento typ záchvatu generuje. Klíèová slova: excitaèní aminokyseliny, ontogeneze, epileptický záchvat, antikonvulzivní pùsobení, NMDA receptory SUMMARY Immature brain exhibits a high sensitivity to excitatory amino acids (glutamic acid, aspartic acid and their agonists) as was shown using neurotoxic effects as a measure. Epileptogenic action may be also used to quantify the efficacy of these amino acids. Stronger convulsant effects in the developing brain (in comparison with mature brain) were repeatedly demonstrated for kainic acid and especially for N-methyl-D-aspartate (NMDA). A 50%-convulsant dose of NMDA in 7-day-old rat pups was shown to be two orders lower than in adult animals. An anticonvulsant action of excitatory amino acid antagonists namely those acting on NMDA type of receptors exhibit similar changes in sensitivity using generalized tonic-clonic seizures induced by pentylenetetrazol as a model. An action of the antagonists against epileptic afterdischarges elicited by stimulation of the cerebral cortex is not so equivocal; this difference might be due to a relatively late development of thalamocortical system generating this type of epileptic seizures. Key words: excitatory amino acids, ontogenesis, epileptic seizures, anticonvulsant action, NMDA receptors Neurotoxické úèinky glutamátu jsou známé již dlouhou dobu (Olney, EHEH1971; Choi, 1988). Témìø stejnì dlouho je známa také jeho mediátorová funkce a spoleènì s aspartátem je považován za hlavní excitaèní mediátor v savèím mozku. Pùsobí na 3 typy ionotropních receptorù (N-metyl-D-aspartátové = NMDA, AMPA a kainátové) a na 3 typy receptorù metabotropních. Na základì znalostí úèinkù tìchto mediátorù byla formulována excitotoxická hypotéza: accumulation of the excitatory amino acid transmitters, glutamate and aspartate, in the extracellular space, as the result of increased synaptic release and reduced cellular uptake, produces excitotoxic injury through excessive activation of excitatory amino acid receptors (McDonald a spol., 1992). Tento excitotoxický mechanizmus se uplatòuje v patologických stavech jako je hypoxie-ischemie (Beneviste a spol., 1984) a dlouhotrvající epileptické záchvaty (Sloviter, 1983). To bylo prokázáno nejenom v dospìlém, ale i ve vyvíjejícím se mozku (Ikonomidou a spol., 1989a). Agonisté všech tøí typù ionotropních receptorù (NMDA, AMPA a kainát) vyvolávají poškození centrálního nervového systému. Nejdøíve to bylo prokázáno pro kainát (Shinozaki a spol., 1970; Olney a spol., 1974; Nadler a spol., 1978), pozdìji pro NMDA (Stewart a spol., 1986) a AMPA (Morgan, 1987). Vývoj citlivosti mozku na neurotoxický úèinek tìchto tøí látek je rùzný. Zatímco kainát nevyvolá akutní neuronální poškození v prvních tøech postnatálních týdnech života laboratorních potkanù, jak bylo prokázáno pro striatum (Capochiaro a Coyle, 1978) a hipokampus (Ben-Ari a spol., 1981; Sperber a spol. 1992), excitotoxický úèinek NMDA, AMPA a quisqualátu (agonisty AMPA receptorù a souèasnì agonisty I. typu metabotropních glutamátových receptorù) je zøetelný již v prvním týdnu po narození a citlivost mláïat je vyšší než citlivost dospìlých zvíøat (Guiramand a spol. 1989; Ikonomidou a spol., 1989b; Hattori a spol., 1990; McDonald a Johnston, 1990; Young a spol., 1990; Johnston, 1995). Nejvìtší citlivost se projevuje kolem 10. dne po narození, s nevelkým rozdílem mezi NMDA a AMPA (McDonald a spol., 1988,1992). Je zøejmé, že efekt excitaèních aminokyselin pøedstavuje patogenetický mechanizmus poškození nezralého centrálního nervového systému rùznými noxami (hypoxií-ischemií - Puka-Sundwall a spol., 1996; epileptickým statem Wasterlain a Sankar, 1993; aminooxyoctovou kyselinou McDonald a Schoepp, 1993; malonátem Greene a Greenamyre, 1995). Rozvoj poškození je velmi rychlý, nukleární magnetickou rezonancí byl prokázán již za 15 min po injekci NMDA do mozkových komor (Verheul a spol., 1993). 15

16 Agonisté všech typù ionotropních receptorù pro excitaèní aminokyseliny mají silné epileptogenní úèinky. Kainát vyvolává epileptické záchvaty již u 7denních potkanních mláïat (Cherubini a spol., 1983; Albala a spol. 1984; Ben-Ari a spol., 1984; Velíšková a spol., 1988), pøièemž citlivost pomalu klesá s vìkem (Velíšková a spol., 1988). N-metyl-D-aspartát je vysoce úèinný na raných stadiích postnatálního vývoje (10denní Schoepp a spol., 1990, nebo 7denní mláïata Mareš a Velíšek, 1992) a jeho epileptogenní efekt prudce klesá s vìkem 50 % køeèová dávka pro dospìlé potkany je o dva øády vyšší než pro 7denní mláïata (Mareš a Velíšek, 1992). D,L-Homocysteová kyselina, jejímž hlavním, ale ne jediným mechanizmem úèinku je agonistické pùsobení na NMDA receptory (Turski, 1989), vyvolává epileptické záchvaty po systémovém podání také již u 7denních mláïat a její úèinnost klesá s vìkem, i když ne tak dramaticky jako v pøípadì NMDA (Mareš a spol., 1997). Homocystein je také schopen vyvolat záchvaty již u 7denních potkanù, ale nejvyšší úèinnost jsme pozorovali ve 3. týdnu života (Kubová a spol., 1995). To je pravdìpodobnì dáno vývojovým posunem úèinnosti od NMDA k nonnmda receptorùm (Folbergrová, 1997). To potvrzují i naše dosud nepublikovaná data s ovlivnìním korových následných výbojù homocysteinem a NMDA, kde efekt obou látek je shodný u 12denních, ale ne u 25denních mláïat potkanù. Vyšší citlivost nezralého mozku lze prokázat i pøi sledování antikonvulzivního úèinku antagonistù excitaèních aminokyselin. Na modelu záchvatù generalizovaných tonicko-klonických køeèí vyvolaných podkožním podáním pentylentetrazolu jsme prokázali vyšší úèinnost NMDA antagonistù u mladších vìkových skupin ve srovnání s dospìlými potkany (kompetitivní antagonisté, 2-amino-7-fosfonoheptanová kyselina (Velíšek a spol. 1990) a CGP 40116 (Haugvicová a Mareš, 1998), nekompetitivní antagonista dizocilpin (MK-801, Velíšek a spol., 1991)). Proto jsme již v rámci výzkumného programu Centra neuropsychiatrických studií studovali úèinek tøí uvedených antagonistù v jiném modelu epileptických záchvatù epileptických následných výbojù, vyvolaných elektrickým dráždìním mozkové kùry u volnì pohyblivých mláïat laboratorního potkana s implantovanými elektrodami. I zde jsme nalezli vyšší citlivost mladších vìkových skupin, výsledky ale nebyly tak jednoznaèné jako u modelu pentylentetrazolového (pøipravováno do tisku). Tento rozdíl by mohl být zpùsoben pozdìjším vyzráváním talamokortikálního systému, který je generátorem tohoto typu experimentálního epileptického záchvatu. Antagonisté NMDA receptoru nevykazují vyšší úèinnost jenom ve svém pozitivním pùsobení, ale i pøi nežádoucích úèincích, jak jsme prokázali pøi sledování efektù dizocilpinu a CGP 40116 na motoriku mláïat (Mikulecká a Mareš nabídnuto do tisku). Všechny uvedené výsledky jednoznaènì svìdèí pro vyšší citlivost nezralého centrálního nervového systému na agonisty i antagonisty receptorù pro excitaèní aminokyseliny, zejména NMDA typu. Otevøenou otázkou zùstávají dlouhodobé dùsledky tìchto látek na vyvíjející se mozek. Program, který budeme realizovat v rámci Centra neuropsychiatrických studií, je zamìøen na vývoj citlivosti mozkové kùry na antagonisty excitaèních aminokyselin. V souèasnosti studujeme vliv NMDA antagonisty dizocilpinu na korové interhemisferické evokované potenciály a jejich potenciaci párovými podnìty a potenciaci frekvenèní. Tento rukopis vznikl za podpory Centra neuropsychiatrických studií, project LN00B122. LITERATURA prof. MUDr. Pavel Mareš, DrSc. Fyziologický ústav AV ÈR Vídeòská 1083 142 20 Praha 4 E-mail: maresp@biomed.cas.cz Albala BJ, Moshé SL, Okada R. Kainic acid-induced seizures: A developmental study. Dev Brain Res 1984;13:139 148. Ben-Ari Y, Tremblay E, Riche D, Ghilini G, Naquet R. Electrographic, clinical and pathological alterations following systemic administration of kainic acid, bicuculline or pentylenetetrazole: Metabolic mapping using the deoxyglucose method with special reference to pathophysiology of epilepsy. Neuroscience 1981;6:1361 1391. Ben-Ari Y, Tremblay E, Berger M, Nitecka L. Kainic acid seizure syndrome and binding sites in developing rats. Dev Brain Res 1984;14:284 288. Beneviste H, Drejer J, Schousboe A, Diemer NH. Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by cerebral microdialysis. J Neurochem 1984;43:1369 1374. Capochiaro P, Coyle JT. Ontogenetic development of kainate neurotoxicity: correlates with glutamatergic innervation. Proc Natl Acad Sci USA 1978;75:2025 2029. Cherubini E, De Feo MR, Mecarelli O, Ricci GF. Behavioral and electrographic patterns induced by systemic administration of kainic acid in developing rats. Dev Brain Res 1983;9:69 77. Choi DW. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1988;1:623 634. Folbergrová J. Anticonvulsant action of both NMDA and non- NMDA receptor antagonists against seizures induced by homocysteine in immature rats. Exp Neurol 1997;145:442 450. Greene JG, Greenamyre JT. Characterization of the excitotoxic potential of the reversible succinate dehydrogenase inhibitor malonate. J Neurochem 1995;64:430 436. Guiramand J, Sassetti I, Recasens M. Developmental changes in the chemosensitivity of rat brain synaptosomes to excitatory amino acids, estimated by inositol phosphate formation. Int J Dev Neurosci 1989;7:257 266. Hattori H, Wasterlain CG. Excitatory amino acids in the developing brain: ontogeny, plasticity, and excitotoxicity. Pediat Neurol 1990;6:219 228. Haugvicová R, Mareš P. Anticonvulsant action of a NMDA receptor antagonist CGP 40116 varies only quantitatively during ontogeny in rats. Fundam clin Pharmacol 1998;12:521 525. Ikonomidou C, Price MT, Mosinger JL, Frierdich G, Labruyere J, Shahid Salles K, Olney JW. Hypobaric-ischemic conditions produce glutamate-like cytopathology in infant rat brain. J Neurosci 1989a;9:1693 1700. Ikonomidou C, Mosinger JL, Salles KS, Labruyere J, Olney JW. Sensitivity of the developing rat brain to hypobaric/ischemic damage parallels sensitivity to N-methyl-D-aspartate neurotoxicity. J Neurosci 1989b;9:2809 2818. Johnston MV. Neurotransmitters and vulnerability of the developing brain. Brain Dev 1995;17:301 306. Kubová H, Folbergrová J, Mareš P. Seizures induced by homocysteine in rats during ontogenesis. Epilepsia 1995;36:750 756.

Mareš P, Velíšek L. N-Methyl-D-aspartate (NMDA)-induced seizures in developing rats. Dev Brain Res 1992;65:185 189. Mareš P, Folbergrová J, Langmeier J, Haugvicová R, Kubová H. Convulsant action of D,L-homocysteic acid and its stereoisomers in immature rats. Epilepsia 1997;38:767 776. McDonald JF, Silverstein FS, Johnston MV, Neurotoxicity of N-methyl-D-aspartate is markedly enhanced in developing rat central nervous system. Brain Res 1988;459:200 203. McDonald JF, Johnston MV. Physiological and pathophysiological roles of excitatory amino acids during central nervous system development. Brain Res Rev 1990;15:41 70. McDonald JF, Trescher WH, Johnston MV. Susceptibility of brain to AMPA induced excitotoxicity transiently peaks during early postnatal development. Brain Res 1992;583:54 70. McDonald JF, Schoepp DD. Aminooxyacetic acid produces excitotoxic brain injury in neonatal rats. Brain Res 1993;624:239 244. Morgan IG. AMPA is a powerful neurotoxin in the chicken retina. Neurosci Lett 1987;79:267 271. Nadler JV, Perry BW, Cotman CW. Intraventriculr kainic acid preferentially destroys hippocampal pyramidal cells. Nature 1978;271:676 677. Olney JW. Glutamate-induced neuronal necrosis in the infant mouse hypothalamus: An electron microscopic study. J Neuropathol Exp Neurol 1971;30:75 90. Olney JW, Rhee V, Ho OL. Kainic acid: A powerful neurotoxic analogue of glutamate. Brain Res 1974; 77:507 512. Puka-Sundvall M, Gilland E, Bona E, Lehmann A, Sandberg M, Hagberg H. Development of brain damage after neonatal hypoxiaischemia: excitatory amino acids and cysteine. Metab Brain Dis 1996;11:109 123. Schoepp DD, Gamble AY, Salhoff CR, Johnson BG, Ornstein PL. Excitatory amino acid-induced convulsions in neonatal rats mediated by distinct receptor subtypes. Eur J Pharmacol 1990;182:421 427. Shinozaki H, Konishi S. Action of several anthelmintics and insecticides on rat cortical neurons. Brain Res 1970;24: 368 371. Sloviter RS. Epileptic brain damage in rats induced by sustained electrical stimulation of perforant path. I. Acute electrophysiological and light microscopic studies. Brain Res Bull 1983;10:675 697. Sperber EF, Stanton PK, Haas K, Ackermann RF, Moshé SL. Developmental differences in the neurobiology of epileptic brain damage. Epilepsy Res 1992;Suppl.9:67 81. Stewart GR, Price MT, Olney JW, Hartman BK, Cozzari C. N- methylaspartate: An effective tool for lesioning basal forebrain cholinergic neurons of the rat. Brain Res 1986;369:377 382. Turski WA. Homocysteic acid: Convulsant actions of stereoisomers in mice. Brain Res 1989;479:371 373. Velíšek L, Kusá R, Kulovaná M, Mareš P. Excitatory amino acid antagonists and pentylenetetrazol-induced seizures during ontogenesis: I. The effects of 2-amino-7-phosphonoheptanoate. Life Sci 1990;46:1349 1357. Velíšek L, Verešová S, Pobišová H, Mareš P. Excitatory amino-acid antagonists and pentylenetetrazol-induced seizures during ontogenesis: II. The effects of MK-801. Psychopharmacology 1991;104:510 514. Velíšková J, Velíšek L, Mareš P. Epileptic phenomena produced by kainic acid in laboratory rats during ontogenesis. Physiol Bohemoslov 1988;37:395 405. Verheul HB, Palazs R, Berkelbach van der Srenkel JW, Tulleken CAF, Nicolay K, van Lookeren Campagne M. Temporal evolution of NMDA-induced excitotoxicity in the neonate rat brain measured with 1 H nuclear magnetic resonance imaging. Brain Res 1993;618:203 212. Wasterlain CG, Sankar R, Excitotoxicity and the developing brain. In: Avanzini G, Fariello R, Heinemann U, Mutani R, eds. Epileptogenic and Excitotoxic Mechanisms. London: John Libbey Co, 1993;135 151. Young RSK, Petroff OAC, Novotny EJ, Jr, Wong M. Neonatal excitotoxic brain injury. Dev Neurosci 1990;12:210 220. 17

SPOLEÈNÉ MECHANIZMY BOLESTI A STRESU COMMON MECHANISMS OF PAIN AND STRESS ANNA YAMAMOTOVÁ, MARIE POMETLOVÁ, RICHARD ROKYTA 3. LF UK, Ústav normální, patologické a klinické fyziologie, Praha SOUHRN Bolest je považována za specifický stresor, který aktivuje stejné mozkové struktury jako i jiné nebolestivé stresory. Souèástí stresové reakce je i aktivace descendentního antinocicepèního systému, který v závislosti na intenzitì stresu tlumí bolest cestou opioidní nebo neopioidní analgezie. Endogenní okruhy modulující bolest mohou pùsobit synergicky nebo se mohou vzájemnì potencovat. Složitost dynamických vztahù mezi pøenosem bolesti a jejím tlumením vyplývá také z toho, že vedle descendentního inhibièního systému existuje i descendentní facilitaèní systém. Výsledný efekt modulace bolesti vždy závisí na vzájemném pomìru inhibièních a facilitaèních vlivù. Pro ovlivnìní stresu a bolesti je testována látka TH-1212. Klíèová slova: antinocicepce, bolest, stres SUMMARY Pain can be considered a specific stressor activating the same brain structures as other non-nociceptive stressors. On the other hand, stress has been found to be a powerful activator of descending antinociceptive system, which is mediated by opioid or non-opioid mechanisms in dependency on the stressor intensity. These pain-modulating networks can cooperate synergically or potentiate themselves. Nevertheless, endogenous pain-modulating circuitry is not fixed; besides an inhibitory control there exists a descending facilitatory system. The final effect of pain modulation depends on a balance between inhibitory and facilitatory inputs. We performed a pilot study testing the modulation of stress and pain by new substance TH-1212. Key words: antinociception, pain, stress 18 Mechanizmy stresu Funkènost a integrita organizmu je zajiš ována homeostatickými mechanizmy, které neustále kontrolují stav vnitøního prostøedí, aby nevyboèil z fyziologicky pøijatelných mezí. Je-li organizmus vystaven extrémní situaci, musí existovat takový regulaèní systém, který je schopen i v pozmìnìných podmínkách zabezpeèit vzájemnou integritu dùležitých funkcí. Spouštìcím centrem stresové odpovìdi je aktivace paraventrikulárních a supraoptických jader hypotalamu produkujících kortikotropin releasing hormon (CRH), vazopresin a oxytocin. Zatímco aferentace supraoptických oxytocinových neuronù je relativnì chudá, zahrnuje pøedevším nebolestivou somatosenzorickou a viscerální aferentaci a descendentní aferentaci ze struktur limbického systému, pro spouštìní CRH obsahuje tato aferentace všechny senzorické modality vèetnì transmise bolesti (Sawchenko et al., 1996). Zpracováním stresového podnìtu je zahájena kaskáda dìjù, spoèívající v postupné aktivaci hypotalamo-hypofyzární-nadledvinové osy. Ve své podstatì se jedná o koaktivaci dvou rozdílných, vzájemnì se ovlivòujících systémù: hypotalamo-hypofyzárního-kortizolového systému a sympato-adreno-medulárního systému. Aktivace sympatického nervového systému je dùsledkem aktivace noradrenergních neuronù v locus coeruleus mozkového kmene a v posteromediálním hypotalamu, který je nadøazeným centrem sympatického nervového systému. Hlavním mediátorem stresové odpovìdi je noradrenalin. Mezi paraventrikulárním jádrem uvolòujícím CRH a noradrenergním locus coeruleus existuje vzájemná pozitivní zpìtná vazba, CRH stimuluje tvorbu noradrenalinu a noradrenalin podnìcuje tvorbu CRH, oba však zároveò tlumí svou vlastní produkci (Stanford, 1995). Na uvolòování CRH se podílejí rovnìž acetylcholin a serotonin, naopak GABA a opioidy jeho sekreci inhibují. V adenohypofýze CRH stimuluje tvorbu proopiomelanokortinu (POMC), jenž je spoleèným prekurzorem adrenokortikotropního hormonu (ACTH) a β-endorfinu. ACTH v kùøe nadledvin podnìcuje tvorbu kortikosteroidních hormonù, pøedevším kortizolu. Intenzita stresové odpovìdi je do znaèné míry závislá na zpìtnovazebných regulaèních mechanizmech. Klasická glukokortikoidová (kortizolová) zpìtná vazba spoèívá v inhibici tvorby ACTH a CRH. Novìji bylo zjištìno, že kortizol mùže inhibovat i noradrenergní neurony, a tak oslabit jejich stimulaèní vliv na produkci CRH (Pacák et al., 1995). U nìkterých typù stresu je stresová odpovìï potencována arginin-vazopresinem, který podobnì jako CRH stimuluje tvorbu ACTH. Zpìtnovazebná inhibice je zajiš ována vedle glukokortikoidové cesty také cestou neglukokortikoidovou. Podílejí se na ní pøedevším atriový natriuretický faktor (ANF), který pøímo mùže inhibovat CRH neurony a adrenomedulin. Adrenomedulin je peptid produkovaný døení nadledvin a cévním endotelem, snižuje cévní odpor a pøispívá ke snižování krevního tlaku. Pøi stresu adrenomedulin inhibuje tvorbu jak kortizolu tak i ACTH (Khan et al., 1999).

Mechanizmy stresové analgezie Experimentálnì vyvolaná bolest se používá jako specifický model stresu (napø. u zvíøat footshock elektrická stimulace pøedních nebo zadních konèetin bez možnosti uniknout, u lidí èasto používaný chladový stres cold pressor test, který zároveò slouží modelem bolesti i stresu). Bolest je tedy silným stresorem a stres je zároveò velmi úèinným aktivátorem antinocicepèního systému mozku (obr. 1). V závislosti na jeho intenzitì jsou ovlivòovány MOZKOVÁ Mozková kùra KÙRA THALAMUS thalamus AMYGDALA amygdala HYPOTHALAMUS hypothalamus PAG BOLEST bolest STRES stres Obrázek 1: Schéma pøedstavuje propojení nejdùležitìjších mozkových struktur spoleèné cesty stresu, bolesti a antinocicepce. Silnými èarami na levé stranì jsou vyjádøeny paralelní aferentní vstupy do oblastí iniciujících stresovou odpovìï (hormonální, vegetativní, afektivní, motorickou). Spoje z hypotalamu do periaqueduktální šedi (PAG) aktivují descendentní antinocicepèní systém, který na míšní úrovni tlumí pøenos bolesti a zároveò oslabuje stresovou reakci (vyznaèeno teèkovanì). buï opioidní nebo neopioidní mechanizmy. Experimenty na zvíøatech ukazují, že stresy o menší intenzitì vyvolávají opioidní analgezii (napø. plavání v teplé vodì, pøerušované plavání, elektrická stimulace zadních konèetin), zatímco silné nebo chronické stresy (plavání ve studené vodì, nepøerušované plavání, stimulace pøedních konèetin) aktivují neopioidní analgezii, pøi níž zøejmì hrají dùležitou roli excitaèní aminokyseliny a NMDA receptory (Mogil et al., 1993; Terman et al., 1984). V tabulce 1 jsou uvedeny nìkteré metody (nebo stavy) vyvolávající opioidní nebo neopioidní analgezii u zvíøat a u èlovìka. Opioidní analgezii lze oslabovat antagonistou opioidních receptorù naloxonem, vzniká na ni tolerance, podobnì jako na opakovanou aplikaci morfia, se kterým také vykazuje zkøíženou toleranci (Akil et al., 1976; Mayer a Hayes, 1975). Naproti tomu neopioidní analgezie je vùèi naloxonu necitlivá, avšak mùže být oslabena antagonistou NMDA receptorù MK 801. Výskyt opioidních neuronù v mozku lze rozdìlit do tøí funkèních okruhù, nigrostriátového a mezolimbického dopaminergního systému, hypotalamo-hypofyzární osy a descendentního antinocicepèního systému (Mansour et al., 1995). Pøi stresu se aktivují všechny tøi oblasti, poslední zmínìná však hraje významnou roli pøedevším v modulaci bolesti. Spoleèná koneèná cesta obou systémù tlumících bolest je descendentní systém antinocicepce, který zahrnuje støední mozek, prodlouženou míchu a míchu. Hierarchicky nejvyšším centrem je periaqueduktální šeï v mezencefalu (PAG). Pøi elektrické stimulaci, aplikaci morfinu nebo mikroinjekci glutamátu do této oblasti (pøedevším do její ventrální èásti) lze vyvolat velmi silnou analgezii. Z periaqueduktální šedi vedou neurony do rapheálních jader v mozkovém kmeni (ncl. raphe magnus, ncl. reticularis magnocelularis, ncl. reticularis gigantocelularis), která jsou hlavním zdrojem mozkového serotoninu. Descendentní projekèní vlákna serotoninových neuronù vytváøejí synapse na neuronech v zadních rozích míšních, kde konèí axony senzitivních neuronù vedoucích bolest. V míše mùže serotonin buï inhibovat uvolòování excitaèních mediátorù glutamátu nebo substance P, nebo excitovat velmi èetné enkefalinové neurony. Enkefaliny utlumí mechanizmem presynaptické inhibice uvolòování glutamátu nebo substance P ze senzorického nervového zakonèení. Protože serotoninová jádra dostávají aferentaci i prostøednictvím kolaterál ze spino-retikulo-talamické dráhy vedoucí bolest, existuje zde potenciální možnost, že by se mohla bolest podílet na své vlastní inhibici (Price, 1988). Složitost systému zpracovávajícího a modulujícího bolest spoèívá i v tom, že vedle inhibièního descendentního systému existuje i descendentní facilitaèní systém, jehož aktivace pøispívá ke vzniku sekundární hyperalgezie. Primární hyperalgezie vzniká v místì poranìní, sekundární hyperalgezie souvisí s poranìnou tkání, ale vzniká v nepoškozené oblasti pøilehlé k poranìní. Projevuje se nárùstem excitability spinálních neuronù, která je dùsledkem centrální senzitizace. Existují dùkazy, že na této senzitizaci se podílejí descendentní vlivy ze supraspinálních oblastí. Inhibièní a facilitaèní vlivy mohou být produkovány ze stejných míst mozkového kmene, pøedevším z rostrální ventromediální prodloužené míchy (RVM) (Ren et al., 2000). Obecnì elektrická stimulace o nízké intenzitì nebo nízká koncentrace glutamátu a neurotenzinu facilituje spinální nocicepci, zatímco elektrická stimulace o vysoké intenzitì a vysoká koncentrace tìchto látek na tìchže místech inhibuje spinální nocicepci (Sandkühler, 1996; Urban a Gebhart, 1999). Tento duální vliv zøejmì zahrnuje anatomicky odlišné spinální dráhy. Vysokointenzitní stimulace nebo vysoké koncentrace glutamátu aplikované do RVM inhibují spinální nocicepèní transmisi pøes descendentní projekèní dráhy dorzolaterálního svazku a aktivují pøedevším míšní cholinergní a monoaminergní receptory. Naproti tomu facilitaèní vlivy z RVM, vyvolané stejnými podnìty, se projekují pøes ventrolaterální svazek a jsou zprostøedkovány spinálními serotoninovými a CCK receptory (Zhuo a Gebhart, 1991). Elektrická stimulace PAG vyvolává analgezii v pøípadì, že je stimulována její ventrální èást. Tato stimulací navozená analgezie je zprostøedkována uvolnìním endogenních opiátù. Jestliže se stimuluje dorzální nebo laterální èást PAG, analgetický efekt je zprostøedkován neopioidními látkami kanabinoidy (Walker et al., 1999). Kanabinoidy vyvolávají analgezii snížením nebo utlumením spinálních a talamických odpovìdí na bolestivou stimulaci. Rovnìž i mikroinjekce kanabinoidù do PAG produkuje analgezii. Tyto nálezy vedou k úvaze, že endogenní kanabinoidy v zadních a laterálních èástech PAG mohou být dùležitou komponentou neopioidní analgezie. Stimulace stejných èástí PAG vyvolává uvolòování anandamidu, tj. endogenního kanabinoidu (Devane et al., 1992). Pøi intradermální aplikaci 19