PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD



Podobné dokumenty
VYUŽITÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE PRO DETEKCI ÚČINNOSTI FILTRACE BAKTERIÍ V PROCESECH ČIŠTĚNÍ ODPADNÍCH VOD

ONLINE BIOSENZORY PŘI HLEDÁNÍ KONTAMINACE PITNÉ VODY

Principy a instrumentace

ALTERNATIVNÍ PŘÍSTUPY K RYCHLÉ DETEKCI MIKROBIÁLNÍ KONTAMINACE PITNÝCH VOD

Laboratorní testování na přítomnost koliformních bakterií, psychrotrofních a termorezistentních mikroorganismů a sporotvorných anaerobních bakterií

SIGRIST BactoSense Unikátní přenosný průtokový cytometr pro monitoring mikrobiologické kvality vody

Oxidační účinek ferátů na autotrofní a heterotrofní mikroorganismy

Přístroje na doúpravu pitné vody z hlediska mikrobiologie MUDr. Markéta Chlupáčová Státní zdravotní ústav, Praha

Praktický kurz Praktický kurz monitorování apoptózy a autofágie u nádorových prostatických buněk pomocí průtokové cytometrie

Příloha č. 1 k MP č. 04/14. Datum účinnosti. Identifikace metody (SOP) Zk.č. 1 M-CH 01 Stanovení teploty ČSN

Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD

Nové metody v průtokové cytometrii. Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

Fluorescenční mikroskopie

Dana Baudišová. Mikrobiologický rozbor podle novely vyhlášky o pitné vodě

APLIKACE FOTOAKTIVNÍCH NÁTĚRŮ S FTALOCYANINY PRO ZVÝŠENÍ KVALITY PROSTŘEDÍ ÚPRAVEN PITNÉ VODY

Dana Baudišová. Novinky v mikrobiologii vody 2016

ON-LINE KVANTIFIKACE SINIC V SUROVÉ VODĚ

Protokol o zkoušce. : ALS Czech Republic, s.r.o. : Jan Dostál. : Zákaznický servis : Provozovna Dubá

Dana Baudišová. Novinky v mikrobiologii vody 2014

Mikrobiální kontaminace sedimentů. Dana Baudišová

F l u o r e s c e n c e

Moderní metody stanovení mikroorganismů

Základní mikrobiologický rozbor vody

Příloha č.: 1 ze dne: je nedílnou součástí osvědčení o akreditaci č.: 250/2012 ze dne:

ČSN EN ISO ČSN ISO ČSN EN ISO 6579, kromě bodu

Další vývoj mikroskopických ukazatelů v pitné vodě s ohledem na zavádění posouzení rizik

Monitoring mikrobiologického oživení v provozu demineralizační linky na elektrárně Ledvice

ČEVAK a.s. Laboratoř Mánesova 41/6, České Budějovice

P r a c o v n í n á v r h. VYHLÁŠKA ze dne 2013, o nákladech dodatečné kontroly. Předmět úpravy

VYBRANÉ PATOGENNÍ BAKTERIE V SEDIMENTECH. Dana Baudišová, Andrea Benáková

MOŽNOSTI VYUŽITÍ ALTERNATIVNÍCH METOD PŘI ŘEŠENÍ VÝJIMEČNÝCH STAVŮ MIKROBIÁLNÍ KONTAMINACE

Protokol o zkoušce. : ALS Czech Republic, s.r.o. : Jan Dostál. : Zákaznický servis : Provozovna Dubá

Chemila, spol. s r.o. Chemická a mikrobiologická laboratoř Za Dráhou 4386/3, Hodonín

Jméno a příjmení: Datum odevzdání protokolu:

METODY VYŠETŘOVÁNÍ BUNĚČNÉ IMUNITY. Veřejné zdravotnictví

Membránové ČOV. Radek Vojtěchovský

Státní zdravotní ústav Expertní skupina pro zkoušení způsobilosti POSKYTOVATEL ZKOUŠENÍ ZPŮSOBILOSTI AKREDITOVANÝ ČIA

Příloha č.: 1 ze dne: je nedílnou součástí osvědčení o akreditaci č.: 96/2012 ze dne:

VYUŽITÍ SCREENINGOVÝCH MIKROBIOLOGICKÝCH TESTERŮ HACH LANGE

Několik metodických poznámek ke stanovení chlorofylu-a pomocí ČSN ISO 10260

NÁVOD PRO STANOVENÍ ŽIVOTASCHOPNÝCH MIKROORGANISMŮ V BIOAEROSOLECH MONITORING VNITŘNÍHO PROSTŘEDÍ V MATEŘSKÝCH ŠKOLKÁCH 2016

ODSTRAŇOVÁNÍ KYANIDŮ Z MODELOVÝCH VOD

Aplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse

Vliv dešťových srážek na mikrobiologickou kvalitu koupacích vod

Protokol o zkoušce. : ALS Czech Republic, s.r.o. : Jan Dostál. : Zákaznický servis : Provozovna Dubá

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi

Obecné zásady interpretace výsledků - mikrobiologie vody

Státní zdravotní ústav Expertní skupina pro zkoušení způsobilosti POSKYTOVATEL ZKOUŠENÍ ZPŮSOBILOSTI AKREDITOVANÝ ČIA

Státní zdravotní ústav Expertní skupina pro zkoušení způsobilosti POSKYTOVATEL ZKOUŠENÍ ZPŮSOBILOSTI AKREDITOVANÝ ČIA

Státní zdravotní ústav Expertní skupina pro zkoušení způsobilosti POSKYTOVATEL ZKOUŠENÍ ZPŮSOBILOSTI AKREDITOVANÝ ČIA

Různé metody hodnocení kvantit fytoplanktonu, fixace vzorků podle taxonomické skupiny a účelu. & Masarykova Univerzita

Vodovody a kanalizace Přerov, a.s. Laboratoř pitných vod Šířava 482/21, Přerov I - Město, Přerov

Obsah. Zprávu vypracovali: RNDr. Jaroslav Šašek, Mgr. Petr Pumann, Ivana Jahnová, Alena Dvořáková

Plán programů zkoušení způsobilosti/externího hodnocení kvality (PT/EHK) na rok 2015

Protokol o zkoušce. : ALS Czech Republic, s.r.o. : Jan Dostál. : Zákaznický servis : Provozovna Dubá

Legislativa vody. Pitná, teplá, rekreační, užitková, odpadní

Hodnocení současného stavu zásobování pitnou vodou ve Zlínském kraji z pohledu hygienika

PT#V Mikrobiologický rozbor vody

VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ PLOTNOVÝCH METOD

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Základy stanovení mikroskopického obrazu ve vodě - úvod Petr Pumann

Funkční testy: BasoFlowEx Kit FagoFlowEx Kit

Vodohospodářské laboratoře, s.r.o.

N Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie

LRR/BUBCV CVIČENÍ Z BUNĚČNÉ BIOLOGIE 3. TESTY ŽIVOTASCHOPNOSTI A POČÍTÁNÍ BUNĚK

Studentská PARDUBICE.

Téma: Testy životaschopnosti a Počítání buněk

Číslo rozboru: Místo odběru: Obec Limit /nejistota +/- Fyzikální a chemické ukazatele:

Zkoušky: Laboratoř je způsobilá aktualizovat normy identifikující zkušební postupy. Laboratoř je způsobilá provádět samostatné vzorkování.

Hodnocení rozborů vody v přírodních koupalištích

PT # V / 3 / 2011 MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR VODY PROGRAM ZKOUŠENÍ ZPŮSOBILOSTI LABORATOŘÍ PRAHA, SRPEN 2011

Protokol o zkoušce. : ALS Czech Republic, s.r.o. : Jan Dostál. : Zákaznický servis : Provozovna Dubá

Odběr vzorků pro mikrobiologickou analýzu ČSN EN ISO : RNDr. Jaroslav Šašek SZÚ Praha

Úvod do potravinářské legislativy Lekce 7-1: mikrobiologické požadavky na potraviny

Kultivační metody stanovení mikroorganismů

Protokol o zkoušce. : ALS Czech Republic, s.r.o. : Jan Dostál. : Zákaznický servis : Provozovna Dubá

Protokol o zkoušce. : ALS Czech Republic, s.r.o. : Jan Dostál. : Zákaznický servis : Provozovna Dubá

koliformní bakterie KTJ/100ml ČSN EN ISO /A Escherichia coli KTJ/100ml ČSN EN ISO /A

Povodí Vltavy, státní podnik vodohospodářská laboratoř České Budějovice Pražská tř. 490/90, České Budějovice

Profil vod ke koupání - Písník Lhota Souhrn informací o vodách ke koupání a hlavních příčinách znečištění

MORAVSKÁ VODÁRENSKÁ, a.s. Oddělení kontroly kvality vody Dolní novosadská, Olomouc

Součástí semináře bylo praktické procvičování účastníků ve vzorkování kalů pro stanovení mikrobiologických ukazatelů.

Kohoutek J. 1, Babica P. 1, Bláha L. 1, Maršálek B. 1

Přístroje v hematologické laboratoři

Využití membránových technologií při úpravě vody na vodu pitnou

FILTRACE VODY NANOTEXTILIÍ

Průtoková cytometrie

Problematika provozu chladicích věží poblíž obytné zástavby ( , 18. konference Zdraví a životní prostředí, Milovy)

Čištění odpadních vod z malých zdrojů znečištění:

Stanovení mikroskopického obrazu ve vodě

Mikrobiologické požadavky. Kamila Míková

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014

MIKROBIOLOGIE ŠEDÝCH VOD

Baudišová D. Metody analýz koupacích vod v České republice

KATALOG PRODUKTŮ PRO FILTRACI A SEPARACI Mikrofiltrace

Analýza buněčných populací pomocí průtokové cytometrie

Vodohospodářské inženýrské služby, a.s. Laboratoř VIS Křížová 472/47, Praha 5

Identifikace zkušebního postupu/metody (ČSN ) SOP 552 (ČSN EN ISO 7027) SOP 520 (ČSN EN ISO ) SOP 507 (ČSN ISO ) SOP 508

AQUATEST a.s. Zkušební laboratoře. Co znamenají naměřené hodnoty v pitné vodě?

Transkript:

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD 1* P. Mikula, 1 B. Maršálek 1 Botanický ústav Akademie věd ČR, Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie, Lidická 25/27, 602 00 Brno * premysl.mikula@centrum.cz

Hygienické požadavky na (pitnou) vodu cílem zajištění odpovídající hygienické kvality vody s ohledem na: a) možnou kontaminaci organickými polutanty b) možnou kontaminaci těžkými kovy c) možný výskyt cyanotoxinů d) výskyt potenciálně patogenních mikroorganismů legislativa upravující mikrobiologické požadavky na kvalitu vod: a) vyhl. 252/04 Sb. (ve znění 187/05 Sb. resp. 293/06 Sb.) požadavky na pitnou vodu b) vyhl. 275/04 Sb. zdravotní nezávadnost balených vod (ve znění 404/06 Sb.) c) nař. vlády 61/03 Sb. (ve znění 229/07 Sb., resp. 23/11 Sb.) - přípustná znečištění povrchových a odp. vod d) ČSN 757143 - požadavky na jakost vody určené na závlahu

Kultivační techniky kultivace různých druhů mikroorganismů na živných půdách (základní, selektivní, diagnostické, selektivně diagnostické atd.) kultivovatelnost mikroorganismů vyjádřena v KTJ na ml (Kolonie Tvořící Jednotky na ml) - celkové počty (kultivovatelných) mikroorganismů (CPM) dle české legislativy při 22 resp. 36 o C [KTJ/ml] inkubace po dobu 72 resp. 48 hodin (ČSN EN ISO 6222) - termotolerantní koliformní bakterie m-fc agar - 44 o C, inkubace 24 hodin (ČSN EN ISO 9308-1) - E. coli Endo agar - 37 o C /72 hod. (ČSN EN ISO 9308-1) - enterokoky Slanetz-Bartley agar - 37 o C, kultivace 48 (72) hod. (ČSN EN ISO 7899-2)

Kultivační techniky Výhody: standardizace definované podmínky analýzy nenáročné provedení nízká cena analýzy možnost zaměření na potenciální patogeny Nevýhody: časová náročnost/ pomalost (výsledky analýzy známy v horizontu dní) většina mikroorganismů (bakterií) není kultivovatelná - obtížně kultivovatelné druhy - VBNC bakterie (Viable But Non-Culturable) nadbytek nutrientů v médiích výsledky kultivací vzdáleny realitě

Průtoková cytometrie stanovení celkového počtu (tzn. kvantifikace) a fyziologického stavu buněk v suspenzi vzorku na základě jejich fluorescenčních (optických) charakteristik fluorescence následkem excitace jisté látky světlem o určité vlnové délce emitováno světlo o vlnové délce vyšší komponenty průtokového cytometru: - fluidika - optika - elektronika optické charakteristiky částic (buněk) po průchodu paprskem excitačního světla (laserem) snímány pomocí detektorů - forward scatter (FSC) - side scatter (SSC) - fluorescenční parametry (FL1-FLx)

Průtoková cytometrie Obr. 1) Princip průtokové cytometrie schéma. zdroj: http://flow.csc.mrc.ac.uk/?page_id=302

Průtoková cytometrie celkové počty mikroorganismů (bakterií) (TCCs) - po obarvení vzorků barvivem vázajícím se na intracelulární nukleové kyseliny (SYBR Green I, SYTO 9, SYTO 13, DAPI, Hoechst 33342) obsah nukleových kyselin HNA bakterie (High Nucleus Acid content) vs. LNA bakterie (Low Nucleus Acid content) metabolická aktivita 5,6 -carboxyfluorescein diacetát (CFDA) respirační aktivita cyanoditolyl-tetrazoliumchlorid (CTC) integrita buněčné membrány - bakterie: duální barvení SYBR Green I + propidiumjodid (PI) PI s výraznou červenou fluorescencí selektivně proniká pouze do buněk s poškozenou membránou (tj. mrtvých ) - sinice (zelené řasy) SYTOX Green

Průtoková cytometrie Obr. 2) Bakteriální společenstva ve vzorku pitné vody barveném barvivem SYBR Green I. Ve vzorku detekovány jak bakterie s vysokým obsahen nukleových kyselin (HNA), tak bakterie s nízkým obsahem nukleových kyselin (LNA). (Prest et al., 2013)

Průtoková cytometrie Obr. 3) Stanovení membránové integrity sinic Microcystis aeruginosa na počátku experimentu (A) a po 24 hodinové expozici peroxidem vodíku (B) ve vzorcích barvených barvivem SYTOX Green. Cyanobakterie s intaktní membránou lokalizovány v regionu SYTOX-, buňky s poškozenou membránou pak v regionu SYTOX+ (Mikula et al., 2012)

Průtoková cytometrie Obr. 4) Hodnocení antibakteriálních účinků různých druhů ftalocyaninů na bakterii Escherichia coli za spolupůsobení světla (horní řada) a ve tmě (spodní řada). Intaktní bakterie lokalizovány v regionu live, bakterie s poškozenou membránou pak v regionu dead. Vzorky obarveny pomocí duálního barvení SYBR Green I + propidiumjodid (Mikula et al., unpublished data)

Výhody: Průtoková cytometrie zvyšující se dostupnost přístrojového vybavení rychlost měření (výsledky analýzy známy ještě v den měření) možno měřit různé druhy parametrů v originálním vzorku - více informací o fyziologickém stavu mikroorganismů (bakterií, sinic, řas) online monitoring - fluorescenční fingerprinting mikrobiálních společenstev (Hammes et al., 2012; Prest et al., 2013) vysoká citlivost měření real-time flow cytometry - možnost kontinuálního měření dynamiky mikrobiálních procesů v čase (Arnoldini et al., 2013)

Průtoková cytometrie Nevýhody: vyšší vstupní náklady (v poslední době však náklady na pořízení přístroje výrazně klesají) praktická nemožnost rozlišení konkrétních rodů/druhů mikroorganismů přítomných ve vzorku detekční limit přístroje (většinou v řádech set až tisíců buněk na ml)

Průtoková cytometrie a její využití v analýze vod stanovení vlivu chlorace na životaschopnost sinic Microcystis aeruginosa (Daly et al., 2007) stanovení vlivu chemicky a elektrochemicky dávkovaného chloru na životaschopnost bakterií Escherichia coli resp. Legionella beliardensis (Wang et al., 2010) stanovení vlivu působení oxidačních činidel používaných ve vodárenství na fyziologický stav bakteriálních společenstev pitné vody (Ramseier et al., 2011) stanovení účinností nanovlákenných materiálů určených pro filtraci vod (Mikula et al., 2012) stanovení vlivu stagnace vody ve vodovodním řadu na její mikrobiologickou kvalitu (Lautenschlager et al., 2010) Pozn. Použitá literatura dostupná u autora prezentace.

Průtoková cytometrie současnost a perspektivy kvantifikace buněk bakterií pomocí průtokové cytometrie schválena švýcarským Federálním úřadem pro veřejné zdraví (FOPH) jako doporučená metoda pro analýzu mikrobiální kvality pitných vod další evropské státy budou pravděpodobně v brzké době následovat vzhledem k některým nevýhodám (na jejichž odstranění se intenzivně pracuje) nelze ještě v nejbližší době očekávat rutinní využívání průtokové cytometrie v analýzách vod, již teď je však zřejmé, že se jedná o velmi vhodnou alternativu použitelnou v kombinaci s jinými analytickými metodami (kultivační techniky, PCR-DGGE, analýza ATP)

Děkuji Vám za pozornost!