Funkční testy: BasoFlowEx Kit FagoFlowEx Kit

Transkript

1 Mgr. Martin Čonka EXBIO Praha, a.s. Funkční testy: BasoFlowEx Kit FagoFlowEx Kit

2 Funkční testy napodobení biologický procesů in vitro nehrozí nebezpečí ohrožení pacienta v průběhu testování možná analýza i vzácných populací buněk nízká spotřeba testovaného materiálu jednoduché použití těžké standardizovat biologická variabilita vzorků

3 BasoFlowEx Kit Účel použití Souprava je určena pro stanovení příčinného alergenu, který je odpovědný za vyvolání alergické reakce zprostředkované specifickými IgE protilátkami. Vyšetření se provádí pomocí průtokového cytometru v lidské periferní krvi antikoagulované heparinem. Regulační status: CE-IVD

4 BasoFlowEx Kit Princip Principem testu je vyvolání aktivace bazofilů in vitro v přítomnosti sensitizujícího alergenu a následné měření expozice aktivačního znaku CD63 (LAMP-3, lysosome-associated membrane protein-3) na buněčném povrchu pomocí monoklonální protilátky. Bazofily jsou ve směsi leukocytů identifikovány monoklonální protilátkou specifickou proti antigenu CD203c (ENPP-3, ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3).

5 BasoFlowEx Kit Degranulace bazofilů CD203c IgE alergen CD203c CD63 CD63 granule Expozice antigenu CD63 na povrchu bazofilů koreluje s uvolněním histaminu.

6 BasoFlowEx Kit Složení (100 testů = 100 zkumavek) Lyofilizovaný stimulační pufr 5 ks Lyofilizovaný stimulant pozitivní kontroly 2 ks Koktejl protilátek anti-cd63/fitc + anti-cd203c/pe 1 ks Lyzační roztok 1 ks Návod k použití (EN+CZ+SK verze)

7 BasoFlowEx Kit Příprava vzorků 10 µl alergenu µl stimulačního pufru 100 µl heparinové krve inkubace při 37 C - pozor na čas značení 20 µl koktejlu protilátek lyze erytrocytů centrifugace resuspendování buněk v PBS měření na průtokovém cytometru

8 BasoFlowEx Kit Analýza naměřených dat Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorek stimulovaný alergenem

9 BasoFlowEx Kit Analýza naměřených dat

10 BasoFlowEx Kit Doporučení CD63 FITC vysoké nastavení PMTV MFI pozitivní kontroly v minimálně předposlední dekádě, ne však až na osu CD203c PE vysoké nastavení PMTV (MFI) pozor na vysokou kompenzaci správné kompenzace falešně pozitivní negativní kontrola zobrazení leukocytů CD63 FITC vs. CD203c PE kontrola destiček lyze erytrocytů jen s přiloženým lyzačním činidlem jinak hrozí vysoký background kontaminace CD203c gatu destičkami nahrát dostatečný počet basofilů

11 FagoFlowEx Kit Účel použití FagoFlowEx Kit je určený pro vyšetření fagocytární aktivity neutrofilních granulocytů měřením respiračního (oxidačního) vzplanutí po jejich stimulaci bakteriemi E. coli v lidské periferní krvi s heparinem pomocí průtokové cytometrie. Regulační status: CE-IVD

12 FagoFlowEx Kit Princip Po ingesci bakterií je ve fagocytech aktivována NADPH-oxidáza, která spustí respirační vzplanutí. Vznikající chlornan uvnitř fagocytů silně oxiduje dihydrorhodamin 123 (DHR123) na fluorescenční produkt rhodamin 123, který je detekován průtokovým cytometrem (kanál pro FITC). V případě defektu myeloperoxidázy, kdy nevzniká chlornan jako terminální produkt respiračního vzplanutí, je dihydrorhodamin 123 oxidován v menší míře ostatními reaktivními meziprodukty respiračního vzplanutí, což se projeví sníženou intenzitou fluorescence stimulovaných granulocytů. Pozitivní kontrolu představuje vzorek, který je inkubován s PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate), který spustí respirační vzplanutí i bez adheze a ingesce patogenu granulocytem.

13 FagoFlowEx Kit Princip E. coli stimulation NADPH-oxidase activation NADPH-ox. NADPH + O 2 NADP O 2 superoxid anion H 2 O 2 MPO HO HOCl dihydrorhodamin 123 rhodamin 123

14 FagoFlowEx Kit Složení (100 testů = 100 zkumavek) Lyofilizované E. coli 5 ks Lyofilizovaný stimulant pozitivní kontroly 5 ks Lyofilizovaný DHR123 5 ks Lyzační roztok 1 ks Návod k použití (EN+CZ+SK verze)

15 FagoFlowEx Kit Příprava vzorků 10 µl E. coli + 50 µl heparinové krve 10 µl DHR123 inkubace při 37 C - pozor na čas lyze erytrocytů 50 µl lyzačního roztoku inkubace 5 minut při laboratorní teplotě lyze erytrocytů 1 ml dest. vody inkubace 10 minut při laboratorní teplotě měření na průtokovém cytometru ve standardizovaném časovém rámci

16 FagoFlowEx Kit Analýza naměřených dat Negativní kontrola Vzorek s E. coli Pozitivní kontrola

17 FagoFlowEx Kit Analýza naměřených dat

18 FagoFlowEx Kit Analýza dat SI HIGH = 125 SI LOW = 13,9

19 FagoFlowEx Kit Analýza naměřených dat Chronická granulomatóza (CGC) SI HIGH = 6,72 SI LOW = ~ 2,5 Negativní kontrola Vzorek s E. coli

20 FagoFlowEx Kit Analýza naměřených dat Hypogamaglobulinémie kojenců SI = 4,18 Negativní kontrola Vzorek s E. coli Pozitivní kontrola

21 FagoFlowEx Kit Doporučení pozor na preanalytickou fázi - svozy dodržet standardizovaný časový rámec měření FL1 vysoké nastavení PMTV - MFI pozitivní kontroly v minimálně předposlední dekádě, ne však až na osu hodnota SI indexu závisí na: velikosti lineární oblasti FL1 kanálu u každého typu cytometru jiné používání čerstvého či zamrazeného DHR123 každá laboratoř by si měla nastavit hranici SI indexu podle svých výsledků záchyt více jak o 70% nižší SI než jsou obvyklé hodnoty v laboratoři

22 Děkuji za pozornost