Nové metody v průtokové cytometrii. Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

Transkript

1 Nové metody v průtokové cytometrii Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

2 Průtoková cytometrie Analytická metoda využívající interakce částic a záření. Technika se vyvinula z počítačů částic Počítače částic Průtokové cytometry sortéry buněk Měřená data Fyzikální vlastnosti přímý rozptyl (forward scatter, FSC) velikost buněk boční rozptyl (side scatter, SSC) granularita buněk Chemické vlastnosti Fluorescence Vazbou fluorochromu na monoklonální protilátku Využití chemické látky, která má fluorescenční vlastnosti

3 Fluorescence E* E 1 Excitační záření 488 nm Vysoce nestabilní stav, doba existence s Emisní záření 575 nm excitovaný stav E1 stav E 0 Molekula phycoerytrinu

4 Základní metody Stanovení CD znaků CD3+ T-lymfocyty CD3+ CD4+ Th lymfocyty CD3+ CD8+ Tc lymfocyty CD3- CD19+ B lymfocyty CD3- CD16+ CD56+ NK buňky HLA-Dr aktivované T lymfocyty Funkční testy granulocytů Sledujeme produkci kyslíkových radikálů (granulocyty) 1,2,3 dyhydroxirodamin (nefloreskuje) 1,2,3 rodamin (intenzivní fluorescence) Funkční test lymfocytů Sledujeme změny v buněčném cyklu po inkubaci s mitogenem hodnotí se změna intenzity fluorescence propidium jodidu vázaného na DNA Aktivační test bazofilů Sledujeme změny v expresy aktivačního znaku CD63 Neaktivní bazofily znak neexprimují na povrch. granulocyty monocyty lymfocyty debris

5 Stanovení intracelulární produkce cytokinů Cytokiny se stanovují intracelulárním značením v endoplazmatickém retikulu. Funkce endoplazmatického retikula je blokována přídavkem momensimu. Pro stanovení se s výhodou používají separované buňky.

6 Stanovení kvantitativní exprese CD znaků Stanovení zle provést pouze u monoklonálních protilátek konjugovaných s phycoerytrinem (PE). (vazba protilátky s fluorochromem v poměru 1:1) Při stanovení se měří (MIF) střední hodnota intenzity fluorescence Pro stanovení jsou nutné speciální kalibrační kuličky s přesně známým počtem molekul PE. Kalibrační kuličky pro PE Obsah molekul PE

7 Stanovení fosforylovaných molekul Díky vývoji monoklonálních protilátek zle sledovat jak fosforylované tak základní formy molekul. Stanovení je nutné provádět v přítomnosti metanolu. - Blokuje funkci fosfatáz -Perforuje buněčnou membránu Je nutné používat fluorochomy, které jsou vysoce stabilní (Alexa-Fluoro).

8 Stanovaní potenciálu mitochondriálních membrán Využívá se vlastností barviva JC-1, které mění emisní spektrum v závislosti na náboji na membráně mitochondrií. Díky měření zle získat informace o počátečních stadiích apoptózy. Agregace

9 Příklady měření potenciálu JC-1 aktivita spermií kontrola vzorek aktivita hematopoetických buněk kontrola vzorek

10 Stanovení intracelulární koncentrace Ca2+ Využívá se stanovení s Indo-1-AM, který je po transportu do cytoplazmy buněk rozkládán esterázami na Indo-1, které reaguje s vápenatými ionty. Intenzita fluorescence při 405 nm je přímo úměrná koncentraci iontů vápníku kontrolní vzorek zamrazené buňky IF 405/ Zdroj: Aktivace ATP čas [s]

11 Stanovení intracelulárního ph Využívá se stanovení s 5(6)-karboxyfluorescein ester, který je po transportu do cytoplazmy buněk rozkládán esterázami na karboxyfluorescein, který reaguje s H +. Intenzita fluorescence je přímo úměrná koncentraci H + ph. Graf závislosti intracelulárního ph na době kryokonzervace buněk. N: ph = 7,32 STC: ph = 7,30 LTC: ph = 7,21

12 Stanovení počtu dělení buněčné kultury 5 (6-)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester proniká do cytosolu buněk kde je za pomoci esteráz přeměňován na CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester), který se kovalentně váže na bílkoviny cytosolu buněk. Po odstranění zdroje CFDA, při každém dělení buňky dojde k poklesu intenzity fluorescence o ½.

13 Využití měření CFSE Kontrolní vzorek lymfocyty Lymfocyty aktivované PHA za přítomnosti mezenchymálních kmenových buněk Lymfocyty aktivované PHA

14 Cytotoxický test pro NK buňky Je založen na inkubaci NK buněk s cílovými buňkami. Po inkubaci jsou buňky značeny 7-aminoactinomycin D (7- AAD), který je fluorescenční značkou pro DNA. 7- AAD/DNA má při excitaci 488 emisní maximum 647 nm. 7-AAD je aktivně vylučováno z buněk. Kontrolní vzorek NK buňky 1:1 NK buňky 20:1

15 Multiplexové metody Využívají k reakci uměle připravené částice, které nesou protilátky proti hledaným cytokinům. Zle stanovit až 96 cytokinů v 1 vzorku (20ul). Stanovení je velice levné (více parametrů v jedné reakci) Při výběru parametru pro stanovení je nutné zvažovat dynamiku hladin cytokinů při léčbě. Koncentrace cytokinů je přímo úměrná MIF PE. Y IL-6 Y IL-17 IL-6 IL-6 IL-17 IL-17

16 Stanovení IL-6 multiplexovou metodou Vyhledání kuliček s hledaným cytokinem Kalibrační křivka pro IL-6

17 Závěr Díky obrovskému rozvoji průtokové cytometrie máme možnost měřit mnoho parametrů. To klade velké nároky na správnou interpretaci získaných dat. Dodržovat navržený postup analýzy Zavedený systém QC. Kritický pohled na výsledky

18