ACTA ENVIRONMENTALICA UNIVERSITATIS COMENIANAE (BRATISLAVA) Vol. 19, Supplement (2011): 169 173 ISSN 1335-0285 PRINCIP 3R POUŽITELNOST V EKOTOXIKOLOGICKÉ PRAXI Klára Kobetičová, Alena Nachtigallová, Markéta Chudobová Skupina Ekotoxicita, Testovací pracoviště SLP, Centrum ekologie, toxikologie a analytiky (CETA), Výzkumný ústav organických syntéz a.s., č. 296, 533 54 Rybitví, Česká republika, e-mail: klara.kobeticova@vuos.com, alena.nachtigallova@vuos.com Abstract: Approach of "3R" an use in ecotoxicological experiments. In the interest of EU legislative (REACH) is animal welfare and avoiding the unnecessary use of animals whenever possible. This applies to the acute toxicity testing of fish according to OECD TG 203 in the field of aquatic ecotoxicology. The new threshold approach described using a single-concentration test (threshold concentration) requiring less fish compared to the full acute fish toxicity test. The lower EC 50 value of existing and reliable algae or acute daphnids ecotoxicity data is used as threshold concentration (TC). It is considered if fish are more or less sensitive than algae/invertebrates for which an EC/LC 50 is available. The absence of mortality indicates that the fish is not the most sensitive group of test organism and that the LC 50 is greater than the TC. Full test with fish is not necessary prepared in this case. If mortality occurs in the test with TC, the full test with fish is consequently performed according the guideline OECD TG 203. The aim of this study was an assessment of effectivity of threshold approach on the base of results from acute tests with algae, daphnids and fish passed during the being of our ecotoxicological laboratory. Klíčová slova: akutní testy toxicity na rybách, REACH ÚVOD Jedním z cílů REACH je redukce počtu obratlovců použitých k testování toxicity chemických látek a chemických přípravků. Zákon na ochranu zvířat sleduje etický problém využívání laboratorních zvířat k pokusům. Z těchto důvodů je zdůrazněn význam alternativních postupů při testování toxicity. Alternativními metodami testování jsou myšleny takové postupy, které splňují podmínky 3R nahrazuje, redukuje nebo vylepšuje užití zvířat (Replace, Reduce, Refine) (Tichý et al. 2005). Použití jedné takové alternativní metody je diskutováno v aktualizaci metody OECD TG 203 (OECD SG 126, 2010). Tato metoda je založena na použití tzv. hraniční koncentrace (Threshold Concentration). Původně byl tento princip popsán pro testování léčiv (Hutchinson et al. 2003), později byl ale převzat i pro chemické látky. Zohledňuje fakt, že ryby jsou v testech akutní 169
toxicity v řadě případů méně citlivé než řasy a dafnie. V případě, že se při použití prahové koncentrace (Threshold Concentration) prokáže nižší citlivosti ryb k testované chemikálii ve srovnání s řasami nebo dafniemi, může být celkový počet ryb použitých k testování zredukován až o 53,6 73,2 % (Jeram et al. 2005; Hutchinson et al. 2003). Cílem této studie bylo zjistit, zda je na základě vyhodnocení výsledků z testů toxicity na rybách, dafniích a řasách, získaných v průběhu existence naší ekotoxikologické laboratoře, tento přístup použitelný jako alternativní postup při provádění testů akutní toxicity na rybách. METODIKA Na základě ekotoxikologických dat naměřených na pracovišti CETA v období 2004 2010 byla studována možnost využití přístupu Threshold Concentration popsaného v příslušném nařízení (OECD SG 126, 2010). Pro účel této studie byly ze všech provedených zakázek vybrány pouze ty, ve kterých byl daný produkt otestován na všech třech druzích organismů (dafnie, řasy, ryby). U vybraných ekotoxikologických dat byly nejdříve porovnány EC 50 hodnoty z testů inhibice růstu řas (Metoda C.3, 2008; OECD TG 201, 2006) a testu akutní toxicity pro dafnie (Metoda C.2, 2008; OECD TG 211, 2008). Z hodnot EC 50 na dafniích a řasách byla vybrána nižší hodnota EC 50 jako tzv. prahová koncentrace Threshold Concentration (TC). Tato koncentrace byla poté porovnána s LC 50 hodnotami z testu s rybami na té samé látce. Pokud podle výsledků testu s rybami došlo při použití prahové koncentrace k úmrtí jedné nebo více ryb, byl navržen k provedení úplný test akutní toxicity na rybách (OECD TG 203, 1992). Pokud bylo zjištěno, že prahová koncentrace získaná z testu na dafniích a řasách přesahovala 100 mg.l -1, test na rybách byl uvažován s koncentrací 100 mg/l. Pokud by na základě dat z testů s rybami při použití prahové koncentrace nedošlo k úmrtí ani jedné ze sedmi použitých ryb, bylo testování ukončeno se závěrem, že hodnota LC 50 je pro ryby vyšší než hodnota prahové koncentrace. Vzhledem k tomu, že šlo o retrospektivní hodnocení dat, při porovnávání TC hodnot byly brány v úvahu nejen LC 50 hodnoty z akutního testu na rybách, ale i průběh celé křivky závislosti sledovaného parametru na koncentraci látky a k odvození celkových závěrů byly použity také hodnoty NOEC (nejvyšší testovaná koncentrace, která nezpůsobila statisticky významný efekt v porovnání s kontrolou) a LOEC (nejnižší testovaná koncentrace, která v porovnání s kontrolou způsobila statisticky významný efekt). VÝSLEDKY Výsledky této studie vycházejí z 23 studií, hodnotících toxicitu jednotlivých chemických látek a komplexních matric na všech třech výše 170
zmíněných organismech (dafnie, řasy, ryby). V grafu je vždy pro konkrétní testovanou položku znázorněna tzv. Threshold Concentration (TC) = prahová koncentrace, t. j. koncentrace odpovídající nižší EC 50 hodnotě z testu s dafniemi nebo řasami, která by byla použita do testu s rybami. Dále je uvedena LC 50 hodnota z akutního testu s rybami (graf 1). 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 kód studie TC (mg/l) LC50 < 100 mg/l LC50 > 100 mg/l Graf 1: Hodnoty Threshold Concentration (TC) z akutních testů s dafniemi nebo řasami a LC 50 hodnoty z testů s rybami. vyjadřuje hodnotu TC, * hodnotu LC 50 z testu s rybami, která byla nižší než 100 mg/l a hodnotu LC 50 z testu s rybami, která byla vyšší než nejvyšší testovaná koncentrace (> 100 mg/l). Výsledky ukazují, že tato metoda je použitelná pro 19 studií (83 %) z celkových 23 (100 %). U vzorků č. 3, 4, 6 by nešlo tento princip uplatnit, protože testovaný materiál byl pro dafnie a řasy sice netoxický i při nejvyšší testované koncentraci (100 mg/l), v případě akutního testu na rybách byla ale zjištěna úmrtnost ryb při nižší koncentraci, než je prahová koncentrace. U vzorku č. 8 byla zase zjištěna toxicita pro všechny tři organismy, prahová koncentrace ovšem odpovídala LOEC hodnotě v testu s rybami, při které už došlo k úmrtí některé z ryb. Z těchto důvodů by proto musel být u zmíněných čtyř vzorků (vzorek č. 3, 4, 6 a 8) proveden úplný test na rybách pro stanovení LC 50 hodnoty. DISKUZE Pokud budeme uvažovat, že pro otestování jedné látky se provede předběžná a hlavní zkouška, použijeme pro otestování jedné látky min. 102 ryb (předběžná zkouška: 5 koncentrací + kontrola, kde pro každou koncentraci i 171
kontrolu použijeme 7 ryb; hlavní zkouška: 5 koncentrací + kontrola, pro každou koncentraci i kontrolu použijeme 10 ryb) (OECD, TG 203, 1992). Při uplatnění principu prahové koncentrace bychom tedy potřebovali pouze 14 ryb (14 %) z celkového počtu 102 ryb (100 %) u každé z 19 výše jmenovaných studií. V případě všech 23 studií (celkový počet ryb použitých do předběžného a úplného testu = 2346 ks) bychom při uplatnění nového přístupu u 19 z nich potřebovali pouze 266 ryb (19 x 14) a u zbylých 4 studií 296 (4 x (14 + 60)). Pokud by tak byl princip prahové koncentrace v minulých letech na našem pracovišti aplikován, mohlo se ušetřit zhruba více než 70 % ryb, což odpovídá předpokladům o redukci počtu ryb používaných do testů o 53,6 73,2 % (Jeram et al. 2005; Hutchinson et al. 2003). ZÁVĚR Výsledky našeho průzkumu potvrzují, že při používání přístupu prahové koncentrace (OECD SG 126, 2010) by bylo možné v praxi zredukovat množství ryb používaných pro testování chemických látek a přípravků. PODĚKOVÁNÍ Poděkování patří všem pracovníkům, kteří se podíleli na realizaci laboratorních prací a zpracování získaných dat. Tato studie byla provedena v rámci projektu Výzkum v oblasti certifikovaných ekotoxikologických metod pro nařízení EU-REACH, evidenční číslo FR- T11/143, program TIP. LITERATURA Hutchinson T. H., Barret S., Buzby M., Constable D., Hartmann A., Hayes E., Huggett D., Laenge R., Lillicrap A. D., Straub J. O., Thompson R. S. 2003. A strategy to reduce the numbers of fish used in acute ecotoxicity testing of pharmaceuticals. Environ. Toxicol. Chem. 22, pp. 3031-3036. Jeram S., Sintes J. M. R., Halder M., Fentanes J. B., Sokull-Klüttgen B., Hutchinson T. H. 2005. A strategy to reduce the use of fish in acute ecotoxicity testing of new chemical substances notified in the European Union. Regulat. Toxicol. Pharmacol. 422, pp. 218-224. Metoda C. L. 2008. Akutní toxicita pro ryby. Nařízení komise (ES) č. 440/2008, O. J. L 142, pp. 446-455. Metoda C.2. 2008. Zkouška akutní imobilizace dafnií (Daphnia sp.). Nařízení komise (ES) č. 440/2008, O. J. L 142, pp. 456-463. Metoda C.3. 2008. Zkouška inhibice růstu řas. Nařízení komise (ES) č. 440/2008, O. J. L 142, pp. 464-472. OECD Test Guideline No. 201. 2006. Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Adopted March 23, 25 p. 172
OECD Test Guideline No. 203. 1992. Fish, Acute Toxicity Test. Adopted: July 17, 9 p. OECD Test Guideline No. 211. 2008. Daphnia magna Reproduction Test. Adopted: October 3, 13 p. OECD Short Guideline No. 126. 2010. Short Guidance on the threshold approach for acute fish toxicity. Adopted: May 31, 5 p. Tichý M., Roth Z., Bláha K., Andrew P. 2005. Alternativní metody testování toxicity chemických látek in silico. Worth: Chem. listy 99, pp. 675-681. 173