MASARYKOVA UNIVERZITA

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii Soňa MARVANOVÁ Genotoxicita polyaromatických sloučenin v jaterních progenitorových buňkách Disertační práce Školitel: RNDr. Miroslav Machala, CSc. Brno, 2009

Bibliografické informace Jméno a příjmení autora: Soňa Marvanová Název disertační práce: Genotoxicita polyaromatických sloučenin v jaterních progenitorových buňkách Název disertační práce anglicky: Genotoxicity of polyaromatic compounds in liver progenitor cells Studijní program: Studijní obor (směr), kombinace oborů: Školitel: Chemie Chemie životního prostředí RNDr. Miroslav Machala, CSc. Rok obhajoby: 2009 Klíčová slova v češtině: Polyaromatické sloučeniny; genotoxicita; apoptóza; protein p53; proliferace; Ah receptor; jaterní progenitorové buňky. Klíčová slova v angličtině: Polyaromatic compounds; genotoxicity; apoptosis; protein p53; proliferation; Ah receptor; liver progenitor cells.

Soňa Marvanová, Masarykova univerzita, 2009

Poděkování Můj největší dík patří mému školiteli RNDr. Miroslavu Machalovi, CSc. za jeho vedení, cenné rady a velkou podporu. Za spolupráci děkuji také Honzovi Vondráčkovi, Zdeňkovi Andrysíkovi, Katce Pěnčíkové a všem kolegyním a kolegům z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, kteří zde vytvářeli příjemné pracovní prostředí. Můj dík za spolupráci také náleží Zuzce Valovičové a RNDr. Aleně Gábelové, CSc. z Ústavu experimentální onkologie SAV a Ing. Janu Topinkovi, CSc. z Ústavu experimentální medicíny AV ČR. Za pomoc s péčí o naši dcerušku velmi děkuji svému muži Hynkovi, který mi tím umožnil tuto práci dokončit.

Abstrakt Játra představují centrální orgán metabolismu xenobiotik. Obsahují několik typů buněk, včetně buněk progenitorových, které mohou v případě rozsáhlého poškození jater proliferovat a nahradit poškozené buňky. Vedle této role při regeneraci jater se mohou progenitorové buňky také stát cílem chemických karcinogenů a hrát roli v hepatokarcinogenezi. Přesto je většina studií zabývajících se účinky polyaromatických uhlovodíků (PAU), významných environmentálních kontaminantů, dosud zaměřena na diferencované buňky nebo jejich deriváty. V prezentované práci byly jako buněčný model pro studium genotoxických efektů PAU použity buňky WB-F344, potkaní jaterní epiteliální buněčná linie, sdílející řadu vlastností s progenitorovými buňkami. Z vybraných karcinogenních PAU byly dibenzo[a,l]pyren (DBalP), benzo[a]pyren, benzo[g]chrysen a dibenzo[a,e]pyren schopny vytvářet v buňkách WB-F344 stabilní DNA adukty s následnou aktivací proteinu p53 a apoptózou. Naproti tomu další karcinogenní PAU chrysen, benz[a]anthracen, benzo[b]fluoranthen a dibenzo[a,h]anthracen tyto genotoxické účinky nevyvolávaly a na základě předchozích studií lze předpokládat, že v jejich působení na jaterní progenitorové buňky hrají významnější roli tumor-promoční efekty. Na příkladu DBalP bylo za použití inhibitorů cytochromu P450 (CYP) 1B1 potvrzeno, že CYP1B1 hraje jednu z klíčových rolí v genotoxických a cytotoxických procesech indukovaných PAU. Některé monomethylované deriváty benzo[a]anthracenu (MeBaA) ve starších studiích projevovaly tumor-iniciační, karcinogenní a mutagenní účinky v hlodavčích kožních a bakteriálních modelech. V modelu jaterních progenitorových buněk WB-F344 pouze 10-MeBaA vyvolával mírně genotoxické účinky, a to tvorbu stabilních aduktů DNA, fosforylaci proteinu p53, apoptózu, zvýšené procento buněk v S-fázi buněčného cyklu a zvýšenou produkci reaktivních kyslíkových radikálů. Ostatní MeBaA v buňkách WB-F344 tyto genotoxické účinky nevyvolávaly, ale byly schopny aktivovat receptor AhR silněji než jejich parentální sloučenina BaA. Tímto mechanismem, aktivitou zprostředkovanou receptorem AhR, mohou významně přispívat k toxicitě environmentálních směsí. Výsledky také poukazují na rozdílnou tkáňovou specifitu účinků PAU. Environmentální polutant 7H-dibenzo[c,g]karbazol (DBC) a jeho syntetický derivát 5,9-dimethyldibenzo[c,g]karbazol (dimedbc), vykazující striktní hepatokarcinogenitu, v buňkách WB-F344 vyvolávaly efekty související s jejich silnou genotoxicitou (fosforylace p53, akumulace buněk v S-fázi a apoptóza). Další syntetický derivát, sarkomagenní N-methyldibenzo[c,g]karbazol (N-MeDBC) tyto účinky nevyvolával. DiMeDBC ale překvapivě nevytvářel adukty s DNA a na druhé straně N-MeDBC vyvolával vznik zlomů na DNA i mikrojader v buňkách WB-F344. Podrobnější studium genotoxických efektů ukázalo, že zatímco příčinou genotoxicity DBC jsou stabilní DNA adukty, v případě dimedbc by mohlo být za genotoxicitu zodpovědné oxidativní poškození nebo modifikace bází. N-MeDBC vyvolával sice nízkou hladinu aduktů na DNA, ale pravděpodobně dostačující pro

vznik zlomů na DNA a mikrojader. Tato poškození byla nicméně účinně opravena a neprojevila se na buněčné úrovni. Buňky WB-F344 byly dále použity jako model pro studium genotoxických a tumorpromočních efektů vzorku ovzduší - městského prachu, standardního referenčního materiálu SRM 1649a a jeho chromatografických frakcí. Extrakt SRM 1649a a polární frakce vyvolávaly genotoxické účinky (apoptóza, fosforylace p53 a snížení počtu buněk) pouze v nejvyšších koncentracích. Mezi DNA adukty, vytvořenými po expozici extraktem SRM, byly identifikovány pouze adukty BaP-dihydrodiolepoxidu a ve velmi malé míře adukty DBalP-dihydrodiolepoxidu. Efekty asociované s nádorovou promocí (aktivace receptoru AhR, indukce mrna CYP1A1 a CYP1B1 a proliferace) se projevovaly už od nízkých koncentrací celkového extraktu SRM, polární frakce i neutrální frakce obsahující PAU. Tyto výsledky potvrzují, že genotoxicita PAU ve směsích není aditivní, ale její výsledný efekt je slabší, pravděpodobně díky inhibici enzymů metabolické aktivace CYP1 některými PAU přítomnými ve směsi, a dále naznačují významnost tumor-promočních efektů, projevujících se na rozdíl od genotoxicity v nižších koncentracích.

Abstract (in English) The liver represents a central organ of xenobiotic metabolism. It consists of several types of cells, including progenitor cells, which are able to proliferate in case of extensive liver damage and replace the damaged cells. Besides their role in liver regeneration, these progenitor cells might be a target of chemical carcinogens and thus play a role in hepatocarcinogenesis. Nevertheless, most of the studies dealing with the effects of polyaromatic hydrocarbons (PAHs), important environmental contaminants, are focused on the differentiated cells or their derivatives. In this thesis, rat liver epithelial cell line WB- F344, sharing many characteristics with progenitor cells, was used as a cellular model for the research of genotoxic effects of PAHs. From the group of selected carcinogenic PAHs, dibenzo[a,l]pyrene (DBalP), benzo[a]pyrene, benzo[g]chrysene and dibenzo[a,e]pyrene were able to induce the formation of stable DNA adducts with subsequent protein p53 activation and apoptosis in the cell line WB-F344. In contrast, the other selected carcinogenic PAHs chrysene, benz[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene and dibenzo[a,h]anthracene did not induce these genotoxic effects and on the basis of previous studies it could be assumed that their tumor-promoting effects might play a more important role in their activity in liver progenitor cells. Next, using DBalP and the inhibitors of cytochrome P450 (CYP) 1B1 activity, we confirmed that CYP1B1 played a significant role in genotoxic and cytotoxic processes induced by PAHs. In former studies, several monomethylated derivatives of benz[a]anthracene (MeBaAs) have exhibited tumor-initiating, carcinogenic and mutagenic effects in rodent skin and bacterial models. In the WB-F344 cell line, only 10-MeBaA induced slight genotoxic effects, such as formation of stable DNA adducts, phosphorylation of protein p53, apoptosis, accumulation of cells in S-phase of the cell cycle and increased formation of reactive oxygen species. Other MeBaAs did not induce these genotoxic effects in the WB-F344 cells, but were able to activate the Ah receptor stronger than their parental compound BaA. Therefore they may contribute significantly to the toxicity of environmental mixtures through AhR-mediated activity. The results of the study also point to different tissue specificity of methylated PAHs. Environmental contaminant 7H-dibenzo[c,g]carbazole (DBC) and its synthetic derivative 5,9-dimethyldibenzo[c,g]carbazole (dimedbc), strict hepatocarcinogen, induced effects connected with their strong genotoxicity in cells WB-F344 (phosphorylation of p53, cell accumulation in S-phase and apoptosis). Another synthetic derivative of DBC, sarcomagen N-methyldibenzo[c,g]carbazole (N-MeDBC) did not induce these effects. Surprisingly, dimedbc did not induced formation of DNA adducts, while N-MeDBC caused formation of DNA strand breaks and micronuclei in WB-F344 cells. More detailed study of genotoxic effects showed that while the cause of DBC genotoxicity is the formation of DNA adducts, in case of dimedbc, the oxidative damage or base modifications might be responsible for its genotoxicity. N-MeDBC induced low level of DNA adducts, but these were

probably sufficient to form DNA strand breaks and micronuclei. Nevertheless, this damage was efficiently repaired and did not exert on the cell level. Next, the WB-F344 cells were used as a model for study of genotoxic and tumorpromoting effects of air particulate sample (urban dust), Standard Reference Material SRM 1649a and its chromatographic fractions. The extract of SRM 1649a and polar fraction induced genotoxic effects (phosphorylation of p53, apoptosis and decreased number of cells) only at the highest doses used. Of DNA adducts formed by SRM extract, only BaPdihydrodiolepoxide adducts were identified, as well as a very small amount of DBalPdihydrodiolepoxide adducts. Crude extract of SRM, neutral fraction containing PAHs and polar fraction exerted effects associated with tumor promotion (AhR activation, induction of mrna CYP1A1 and CYP1B1 and proliferation), already in low doses. These results confirmed that genotoxicity of PAHs in mixtures is not additive, but instead, their final effect is lower than expected, most probably due to inhibition of xenobiotic metabolizing enzymes CYP1 by some PAHs present in the mixture. The results also indicate the importance of tumor-promoting effects, observed already in lower doses, contrary to genotoxicity.

Obsah 1. Úvod...11 1.1. Polyaromatické uhlovodíky, jejich zdroje a expozice...11 1.2. Metabolismus a účinky PAU...12 1.2.1. Metabolická aktivace a genotoxické účinky PAU...12 1.2.1.1. Aktivace receptoru AhR...12 1.2.1.2. Tvorba dihydrodiolepoxidů...13 1.2.1.3. Tvorba o-chinonů a ROS...13 1.2.1.4. Tvorba kationtových radikálů...14 1.2.1.5. Typy genotoxických poškození a odpovědi na poškození DNA...15 1.2.2. Negenotoxické účinky PAU...16 1.3. Metody detekce genotoxických a negenotoxických účinků PAU...18 1.3.1. Testy in vivo...18 1.3.2. Testy in vitro...19 1.3.2.1. Testy genotoxických efektů...19 1.3.2.2. Testy negenotoxických efektů...20 1.4. Charakteristika vybraných skupin PAU...22 1.4.1. Abundantní nížemolekulární PAU...22 1.4.2. Skupina PAU s molekulovou hmotností 228...23 1.4.3. Skupina PAU s molekulovou hmotností 252...23 1.4.4. Skupina PAU s molekulovou hmotností 278...24 1.4.5. Skupina PAU s molekulovou hmotností 302...25 1.4.6. Methylované deriváty chrysenu a benz[a]anthracenu...26 1.5. Vybrané N-heterocyklické aromatické uhlovodíky...27 2. Cíle práce...28 3. Materiál a metody...29 3.1. Buněčná linie...29 3.2. Metody...30 3.2.1. Analýza DNA aduktů...30 3.2.2. Detekce mrna metabolizačních enzymů pomocí real time-pcr...30 3.2.3. Detekce proteinu p53 metodou Western blotting...31 3.2.4. Detekce apoptózy...31 3.2.5. Hodnocení buněčné proliferace a buněčného cyklu...32 3.2.6. Detekce zlomů na DNA pomocí gelové elektroforézy jednotlivých buněk...32 4. Výsledky...34 4.1. Tvorba DNA aduktů a indukce apoptózy v potkaních jaterních buňkách WB-F344 exponovaných karcinogenním PAU...35 4.1.1. Tvorba stabilních DNA aduktů...35 4.1.2. Akumulace a fosforylace proteinu p53...36 4.1.3. Indukce apoptózy...37 4.1.4. Aktivace metabolizačních enzymů...39 4.1.5. Role CYP1B1 v metabolické aktivaci genotoxinu DBalP...39 4.2. Toxické efekty methylovaných benz[a]anthracenů v jaterních buňkách...41 4.2.1. Aktivace metabolizačních enzymů...41 4.2.2. Narušení buněčného cyklu a indukce buněčné proliferace...42 4.2.3. Fosforylace proteinu p53 a apoptóza...43 4.2.4. Tvorba DNA aduktů a oxidativního stresu...45 4.3. Genotoxické a tumor-promoční efekty 7H-dibenzo[c,g]karbazolu a jeho syntetických derivátů v jaterních epiteliálních buňkách WB-F344...46

4.3.1. Aktivace metabolizačních enzymů...47 4.3.2. Narušení buněčného cyklu a indukce proliferace...47 4.3.3. Indukce apoptózy a fosforylace proteinu p53...49 4.3.4. Poškození DNA - tvorba stabilních DNA aduktů, zlomů a mikrojader...49 4.3.5. Kinetika oprav zlomů na DNA...51 4.3.6. Oxidativní poškození DNA a oxidativní stres...51 4.4. Účinky komplexní směsi PAU vázaných na částice ovzduší SRM 1649a v jaterních progenitorových buňkách...53 4.4.1. Aktivace metabolizačních enzymů...54 4.4.2. Tvorba DNA aduktů...54 4.4.3. Fosforylace proteinu p53 a apoptóza...55 4.4.4. Vliv SRM na buněčnou proliferaci a cyklus...57 5. Diskuze a závěry...59 6. Použitá literatura...63 7. Souhrnný přehled publikací a odborných příspěvků...73 Přílohy

Úvod 1. Úvod 1.1. Polyaromatické uhlovodíky, jejich zdroje a expozice Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) jsou velkou a rozmanitou skupinou organických sloučenin, obsahujících dvě a více kondenzovaných benzenových jader. Mohou existovat také ve formě alkyl-, nitro-, amino-, sulfo-, halogen- a dalších derivátů. Strukturou, účinky a výskytem jsou jim velmi blízké heterocyklické aromatické uhlovodíky, které obsahují jeden nebo více atomů dusíku, síry nebo kyslíku v aromatických kruzích. PAU představují hojně rozšířené kontaminanty životního prostředí s negativními, především karcinogenními, účinky na živé organismy. PAU vznikají nedokonalým spalováním organických materiálů během antropogenních i přírodních procesů. Největší podíl na jejich produkci má lokální vytápění, silniční doprava, průmyslová výroba (např. výroba hliníku, koksu, asfaltu, plastů), výroba energie spalováním fosilních paliv a spalování odpadu (Boström, 2002; IARC, 1983; WHO, 1998). Nejvýznamnější cestou expozice člověka PAU je potrava (v případě nekuřáků). Hlavním zdrojem kontaminace zeleniny a obilovin je atmosférická depozice malých částic obsahujících PAU, zatímco maso je kontaminováno během úpravy, především při uzení a pečení na otevřeném ohni (rev. viz Phillips, 1999). K další expozici člověka PAU dochází dýcháním ovzduší kontaminovaného cigaretovým kouřem, výfukovými plyny, emisemi z domácích topenišť, průmyslovými emisemi, příp. expozicí na některých pracovištích. Expozice je také možná prostřednictvím dermálního kontaktu s ropnými produkty (např. dehtem) nebo vodou jimi kontaminovanou (Boström, 2002). PAU se vyskytují v prostředí ve směsích. Řada směsí a materiálů obsahujících PAU a expozic v zaměstnání byla Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC) klasifikována jako prokazatelně nebo potenciálně karcinogenní. Do skupiny 1, jako prokazatelně karcinogenní pro člověka, byly zařazeny např. uhelný dehet, asfalt, saze, cigaretový kouř, výroba hliníku, zplyňování uhlí a výroba koksu. Do skupiny 2A, jako pravděpodobně karcinogenní pro člověka, byly zařazeny např. výfukové plyny nebo rafinace ropy (IARC, 1984a,b; IARC, 1985; IARC, 1987; IARC, 1989a,b). 11

Úvod 1.2. Metabolismus a účinky PAU PAU vyvolávají řadu genotoxických a negenotoxických účinků, které se na úrovni organismu mohou projevit vznikem různých chorob, včetně vzniku nádoru. Proces karcinogeneze je třístupňový a zahrnuje fázi iniciace, promoce a progrese. Genotoxické účinky se uplatňují během iniciace, kdy dochází k nevratným změnám na DNA (Trosko, 1997). Ve druhé fázi, nádorové promoci, se projevují především negenotoxické efekty, vyvolané dlouhodobým působením nádorového promotoru. Negenotoxické efekty vedou ke vzniku nezávislosti iniciovaných buněk na homeostatické kontrole tkáně, jejímž výsledkem je potom nekontrolovaná proliferace iniciovaných buněk (Trosko, 1998), a dalším procesům jako inhibice apoptózy, rezistence vůči protirůstovým signálům, angiogeneze atd. (Hanahan and Weinberg, 2000). 1.2.1. Metabolická aktivace a genotoxické účinky PAU Pro rozvoj svých mutagenních a karcinogenních vlastností vyžadují PAU metabolickou aktivaci, tzn. fungují jako promutageny, resp. prokarcinogeny (Miller, 1966; Miller, 1978). Metabolická aktivace vede k produkci reaktivních metabolitů PAU a následně ke vzniku DNA aduktů, které jsou jednou z hlavních příčin genotoxických efektů PAU. Existuje několik cest metabolické aktivace PAU, přičemž všechny mohou přispívat ke genotoxickým účinkům PAU. Během metabolické aktivace PAU může docházet také k oxidativnímu stresu a následně k oxidativnímu poškození DNA. Význam příspěvku každého mechanismu závisí na chemických a biologických vlastnostech jednotlivých sloučenin, druhu organismu, úrovni exprese aktivačních enzymů apod. (Xue, 2005). 1.2.1.1. Aktivace receptoru AhR Významnou úlohu v metabolické aktivaci PAU hraje cytosolový receptor AhR (Aryl Hydrocarbon Receptor). Po vazbě PAU na AhR dojde k uvolnění receptoru z komplexu s dalšími proteiny a k dimerizaci AhR s jeho translokátorem ARNT. Vzniklý dimer interaguje v jádře s promotery obsahujícími specifickou sekvenci - xenobiotický responzivní element (XRE). Tato interakce vyústí v indukci genové exprese řady proteinů první a druhé fáze biotransformace xenobiotik, při níž jsou PAU transformovány na reaktivní metabolity, které mohou být buď konjugovány a vyloučeny z buňky, nebo se mohou vázat na DNA a proteiny (Whitlock, 1999). Aktivace AhR vede ale také ke změně exprese řady genů regulujících 12

Úvod buněčný cyklus a další buněčné procesy; tyto negenotoxické efekty jsou spojeny s nádorovou promocí, vývojovými a obecně endokrinními poruchami (Puga, 2002). 1.2.1.2. Tvorba dihydrodiolepoxidů Jednou z cest metabolické aktivace je biotransformace PAU cytochromy P450 (CYP), zejména CYP1A1, 1A2 a 1B1, a epoxidhydrolázou za vzniku dihydrodiolepoxidů, které se mohou kovalentně vázat na purinové báze a vytvářet stabilní DNA adukty (obr. 2) (Baird, 2005). V druhé fázi biotransformace se uplatňují enzymy glutation-s-transferázy, UDPglukuronyltransferázy a sulfotransferázy, které vytvářejí konjugáty s metabolity PAU z první fáze nebo přímo s některými substituovanými deriváty PAU (Cooper, 1983; Sims, 1981; Yuzuru, 1978). Schopnost dihydrodiolepoxidů vázat se na DNA souvisí s přítomností tzv. bay a fjord oblasti ve struktuře molekuly (obr. 1). Reaktivní metabolity PAU s epoxidovou skupinou navázanou v pozici sousedící s touto oblastí mohou mít silnější genotoxické účinky, především pokud PAU obsahuje strukturu označovanou jako fjord (Baird, 2005). Tyto oblasti, zejména pokud jsou v sousedství s epoxidovou skupinou, představují natolik významné sférické zábrany pro enzymy druhé fáze biotransformace, že vzniklé metabolity s touto strukturou jsou nedostatečně konjugovány a reagují s DNA (Baird, 2005). bay oblast fjord oblast Obr. 1: Bay a fjord oblast v molekule benzo[a]pyrenu a dibenzo[a,l]pyrenu. 1.2.1.3. Tvorba o-chinonů a ROS V alternativní dráze metabolické aktivace slouží dihydrodiol, vzniklý hydrolýzou epoxidu, jako substrát pro dihydrodioldehydrogenázy, které patří mezi aldo-ketoreduktázy (AKR). Dihydrodiol je oxidován AKR na ketol, který spontánně přechází na katechol (obr. 2). Katechol je nestabilní a podstupuje další neenzymovou oxidaci. První jednoelektronovou oxidací vzniká o-semichinonový aniontový radikál a peroxid vodíku. Druhou jednoelektronovou oxidací vzniká o-chinon a superoxidový anion (Penning, 1996). Vzniklé o- chinony jsou vysoce reaktivní a mohou vytvářet stabilní i nestabilní DNA adukty (McCoull, 1999; Shou, 1993). Mohou také dvouelektronovou redukcí znovuvytvořit katechol za účasti 13

Úvod NADPH-chinonoxidoreduktázy (NQO1) nebo jednoelektronovou redukcí dalšími cytosolovými reduktázami znovuvytvořit o-semichinonový aniontový radikál (Flowers-Geary, 1992; Flowers-Geary, 1996). Takto může docházet k několikanásobnému opakování redoxního cyklu a opakované tvorbě reaktivních forem kyslíku (ROS), které mohou vyvolat oxidativní poškození DNA bází vedoucí k mutacím (obr. 2). PAU CYP1/Epoxidhydroláza OH Dihydrodioldehydrogenáza AKR OH OH konjugace OH dihydrodiol CYP1 katechol - 1e O2. - H2O2 oxidativní poškození DNA O OH OH dihydrodiolepoxid NAD(P) + NADPH-chinonoxidoreduktáza NAD(P)H Ō O. o-semichinonový radikál O2-1e O2. - oxidativní poškození DNA DNA adukty konjugace O O tvorba aduktu o-chinon PAU Obr. 2: Role cytochromů a aldo-ketoreduktáz v metabolické aktivaci trans-dihydrodiolů PAU (upraveno podle Burczynski, 2000). 1.2.1.4. Tvorba kationtových radikálů Ke vzniku DNA aduktů může vést i tvorba kationtových radikálů PAU katalyzovaná P450 peroxidázou (Cavalieri, 1995) nebo v případě methylsubstituovaných PAU tvorba benzylkarboniových kationtů, vzniklých hydroxylací methylové skupiny s následnou tvorbou reaktivních benzylesterů nesoucích dobře odstupující skupinu, např. sulfátovou (Surh, 1994). 14

Úvod 1.2.1.5. Typy genotoxických poškození a odpovědi na poškození DNA Změny v genotypu organismu mohou být způsobeny různými typy genotoxických poškození. Genotoxické efekty na řetězci DNA se označují jako genové mutace a mohou vzniknout inzercí, tj. zařazením jednoho nebo více nukleotidů, delecí, tj. ztrátou jednoho nebo více nukleotidů, nebo substitucí, tj. náhradou báze. Chromozomální aberace představují změny struktury nebo počtu chromozomů. Strukturní změny chromozomů vznikají jako následek chromozomální nestability (zlomů). Jako euploidie se označuje znásobení celé chromozomové sady, jako aneuploidie znásobení jednoho z chromozomů (Rosypal, 2002). Zachování integrity a přesnosti genomu je nezbytné pro správné fungování a přežití všech organismů. V eukaryotických buňkách se vyvinul komplexní systém odpovědí na poškození DNA, který má zabránit projevu jeho škodlivých následků. Tento systém zahrnuje modulaci tzv. kontrolních bodů buněčného cyklu, aktivaci mechanismů opravujících poškozenou DNA a iniciaci apoptózy v případě vážného poškození. Aktivace kontrolních bodů po rozpoznání poškození DNA nebo přerušení replikace zastaví postup buněčným cyklem a tím poskytne více času k opravě DNA (Zhou, 2000). Klíčovými regulátory mechanismů fungování kontrolních bodů v G1, S a G2 fázi buněčného cyklu jsou v savčích buňkách proteinkinázy ATM a ATR, podílející se na detekci poškození DNA a na přenosu signálu na transduktorové a efektorové proteiny (Bakkenist, 2004) (obr. 3). Kinázy ATM a ATR kontrolují mimo jiné jeden z nejvíce studovaných procesů odpovědi na poškození DNA, kterým je akumulace a aktivace tumor-supresorového proteinu p53. Protein p53 funguje jako transkripční faktor a má důležitou úlohu v regulaci buněčného cyklu a prevenci karcinogeneze. Bylo zjištěno, že v řadě lidských nádorů se vyskytuje v mutované, nefunkční formě (Levine, 1997). Za normálních podmínek je v nestresovaných buňkách přítomen inaktivní a v relativně malém množství. K jeho aktivaci a akumulaci dochází působením buněčného stresu, jako je právě poškození DNA. Protein p53 může regulovat zastavení buněčného cyklu v G1 fázi prostřednictvím svého transkripčního produktu, proteinu p21 (El Deiry, 1994), v S fázi (Binková, 2000; Khan, 2002), zastavení v G2 fázi prostřednictvím p21 nebo GADD45 (Smith, 1994; Luch, 1999) nebo indukovat v poškozených buňkách apoptózu. Pro apoptózu je nezbytná aktivace proapoptotických genů a represe antiapoptotických genů. Apoptózu zprostředkovanou p53 může podporovat několik cílových genů proteinu p53, aktivujících paralelní apoptotické cesty. Jedná se o geny aktivující tzv. receptory smrti (např. CD95/Fas, TNF) a geny indukující změny v mitochondriích vedoucí k apoptóze (např. Bcl-2, Bax, Noxa, PUMA) (rev. viz Bourdon 2003). Pro všechny alternativní apoptotické signály je obdobná následná kaskádová aktivace kaspáz, vedoucí až k samotné apoptóze. 15

Úvod p21 Obr. 3: Schematické znázornění složek přenosu signálu po poškození DNA v lidských buňkách. Poškození DNA je detekováno senzory (proteinové komplexy obsahující např. proteinkinázy ATM a ATR), které za pomoci mediátorů přenášejí signál na checkpoint-kinázy Chk1 a Chk2. Ty aktivují nebo inaktivují další proteiny (efektory), např. p53 nebo Cdc25, které se účastní inhibice přechodu z G1 do S-fáze, postupu S-fází nebo přechodu z G2 do M-fáze. (Převzato a upraveno podle Sancar, 2004). 1.2.2. Negenotoxické účinky PAU Vedle genotoxicity mohou PAU vyvolávat také řadu negenotoxických účinků, zejména účinky spojené s aktivací receptoru AhR, inhibicí mezibuněčné komunikace a další efekty zmíněné níže; jejich výskyt po působení PAU navzájem nekoreluje. Modulace genové exprese a mezibuněčné komunikace se může projevit na buněčné úrovni ve změnách v buněčném cyklu, diferenciaci, proliferaci, apoptóze nebo adaptivní odpovědi. Tyto změny na tkáňové úrovni mohou vyústit v narušení rovnováhy, expanzi transformovaných buněk, vznik dysplasií a neoplasií, vedoucích ke karcinogenezi. Negenotoxické mechanismy se uplatňují především v procesech nádorové promoce a endokrinní disrupce. Aktivace receptoru AhR po expozici PAU vede k indukci biotransformačních enzymů, jejímž následkem je zvýšená metabolická aktivace prokarcinogenů (Guengerich, 1998). 16

Úvod Aktivace AhR však také patří mezi negenotoxické mechanismy; dalším možným mechanismem PAU přispívajícím k nádorové promoci je AhR-dependentní modulace proliferace, v případě jaterních progenitorových buněk uvolnění buněk z kontaktní inhibice růstu (Chramostová, 2004; Andrysík, 2007). Dalšími typy škodlivých účinků PAU jsou aktivace nebo inhibice aktivity jaderných receptorů pro steroidní hormony vedoucí k endokrinní disrupci (Arcaro, 1999; Vinggaard, 2000; Vondráček, 2002). Rovnovážný stav organismu a chování buněk v tkáních jsou regulovány prostřednictvím komunikace na úrovni mimo-, mezi- a vnitrobuněčné a PAU mohou tuto komunikaci narušovat. Endogenní extracelulární signální molekuly (hormony, růstové faktory, cytokiny a neurotransmitery), stejně jako různé exogenní chemické látky (složky potravy, léčiva a kontaminanty prostředí), mohou spouštět různé vnitrobuněčné signální dráhy, které ovlivňují expresi genů, a mohou ovlivňovat také mezibuněčnou komunikaci (Trosko, 1998). Důležitou roli v nádorové promoci představuje inhibice mezibuněčné komunikace zprostředkované spojením gap junction (Gap Junctional Intercellular Communication, GJIC), která uvolňuje buňky z regulace růstu (Trosko and Ruch, 1998; Upham, 1998; Yamasaki, 1995). Schopnost PAU inhibovat mezibuněčnou komunikaci (Bláha, 2002) nekoreluje s jejich genotoxickou potencí, nýbrž s karcinogenitou (Rosenkranz, 2000). Mezi další významné efekty PAU patří modulace dalších vnitrobuněčných signálních drah a aktivit transkripčních faktorů, které mohou být spojeny s indukcí buněčné proliferace nebo modulací buněčné diferenciace a apoptózy (Li, 2004). Jedná se např. o narušení hladiny vápenatých iontů (Tannheimer, 1997), modulaci aktivity proteinkináz aktivovaných mitogenem (MAPK) (Patten Hitt, 2002; Rummel, 1999; Tan, 2002; Andrysík, 2006), modulaci metabolismu kyseliny arachidonové (Sumida, 1993). Modulací cytokinů, regulujících hematopoézu, mohou PAU způsobovat poškození imunitního systému (Page, 2004). Imunotoxicita PAU je způsobena také indukcí apoptózy buněk imunitního systému metabolity PAU (Page, 2002). 17

Úvod 1.3. Metody detekce genotoxických a negenotoxických účinků PAU Od 19. století s rozvojem industrializace docházelo k narůstajícímu počtu pozorování lékařů, že pracovní expozice některým chemikáliím nebo směsím mají za následek karcinogenní efekty. Na začátku 20. století proto vzrostla potřeba vyvinout metody experimentálního vyvolání nemocí v testovacích systémech pro potřeby systematického výzkumu. Prvními, komu se podařilo experimentálně vyvolat maligní epiteliální nádory po aplikaci černouhelného dehtu na uši králíků, byli japonští patologové Yamagiwa a Ichikawa v roce 1915. Tento experiment je považován za přechod do moderní éry experimentálního výzkumu rakoviny. V roce 1930 Kenneway a Hieger poprvé prokázali, že jednotlivý PAU, dibenzo[a,h]anthracen, vyvolává nádory v myší kůži. Roku 1933 byl izolován benzo[a]pyren a byla dokázána jeho karcinogenita v myší kůži. Roku 1935 Boyland a Levi navrhli hypotézu, že toxické PAU mohou být v organismu přeměněny na aktivnější patogenní látky nebo mohou být metabolizovány (rev. viz Luch, 2005). S rozvojem testovacích metod se objevily snahy o harmonizaci testovacích strategií a standardů. Jednou z prvních snah bylo hodnocení mezilaboratorní shody výsledků různých testovacích systémů a vývoj testovacích doporučení Světové zdravotnické organizace (WHO) v rámci programu IPCS (International Programme on Chemical Safety) (Ashby, 1988). Hlavní roli ve vývoji doporučení pro mezinárodně harmonizované testovací protokoly hraje v současné době Organizace pro ekonomickou spolupráci a rozvoj (OECD). Směrnice Evropské unie pro testování chemikálií se shodují se směrnicemi OECD, pouze z testů genotoxicity zahrnují navíc test na morfologické transformace buněk. 1.3.1. Testy in vivo Základní informaci o karcinogenních schopnostech PAU poskytují in vivo testy na zvířatech, zejména hlodavcích. Jedná se o schopnost iniciovat vznik nádoru, působit nádorovou promoci nebo kompletní karcinogenezi. V testu na tumorovou iniciaci je zvířeti jednorázově podána testovaná látka a opakovaně je podáván modelový tumorový promoter, např. forbolester. Pokud dojde ke vzniku nádoru, má testovaná látka tumor-iniciační schopnosti (Iyer, 1980; Wislocki, 1982). Ve dvoustupňovém testu karcinogenity je testovaná látka podávána opakovaně a pokud dojde ke vzniku nádoru, jedná se o kompletní karcinogen (Stevenson and von Haam, 1965; Lacassagne, 1968; NIH, 2006). Vedle dospělých hlodavců se také k testování používá model novorozených myší (Grover, 1975; Rice, 1987). 18

Úvod Nevýhodou dat získaných z těchto testů je, že nepodávají informaci o mechanismech karcinogenity a nádorové promoce a že se tato data obtížně extrapolují mezi živočišnými druhy, včetně člověka. 1.3.2. Testy in vitro 1.3.2.1. Testy genotoxických efektů Vzhledem k náročnosti testování na zvířatech byla jako alternativa vyvinuta řada testů genotoxicity a metod stanovujících parametry tumorové promoce. První test mutagenity založený na sledování reverzních mutací v bakterii Salmonella typhimurium (Amesův test) (Ames, 1973; Ames, 1975) detekuje genové mutace a je zahrnut ve směrnicích OECD a EU pro testování chemikálií. Je používán ve variantě bez a s metabolickou aktivací mikrosomální a cytosolovou jaterní frakcí z hlodavců, obsahující biotransformační enzymy, nebo přímo intaktními jaterními buňkami. Dalšími metodami využívajícími bakteriální modely jsou umuc test (Hansen, 1998) a SOS Chromotest (Quillardet, 1993), které však nejsou zahrnuty ve směrnicích OECD a EU. Navzdory používání metabolické aktivace v bakteriálních testech genotoxicity zůstává tento systém poměrně vzdálený savčímu, resp. lidskému organismu. Nevýhodami tohoto testovacího systému je potřeba experimentálních zvířat pro získání frakce jaterních enzymů, rozdíly v profilech metabolitů v závislosti na použitém typu aktivačních systémů, rozdíly mezi metabolity produkovanými testovaným systémem a organismy in vivo a skutečnost, že externě vytvořené metabolity v testovacím systému nemusí proniknout až k DNA použité cílové buňky (Rueff, 1996). Vhodnější jsou proto testy na savčích primárních buňkách nebo modelových buněčných liniích. Pro testování účinků sloučenin vyžadujících metabolickou aktivaci jsou nejvhodnějšími modely metabolicky kompetentní buňky, zejména jaterní, např. často používaná hepatoma linie HepG2, ale také plicní, např. lidské buňky A549 nebo fibroblasty z čínského křečka V79, které se používají transfekované jednotlivými biotransformačními enzymy CYP. Další hojně používanou buněčnou linií jsou buňky odvozené z prsního karcinomu MCF-7. Následující testy využívající savčí buňky jsou zahrnuty ve směrnicích OECD a EU pro testování chemikálií. Ze savčích systémů se v testech na genové mutace používají buněčné linie lymfocytů myší, křečků nebo lidské lymfoblastické linie, v nichž se detekují mutace v určitých specifických genech (TK, HPRT a XPRT) (Liber, 1982; Moore, 1989; Aaron, 1989). Z hlediska PAU jsou významné práce Duranta et al. s výsledky mutagenity řady PAU stanovované v lokuse TK na lidských B-lymfoblastoidních buňkách transfekovaných lidskou cdna kódující CYP1A1 (Durant, 1996; Durant, 1999). Zlomy DNA jsou běžně detekovány testem na chromozomové aberace (Preston, 1987; 19

Úvod Tice, 1994), v němž je možné používat různé buněčné linie, primární buněčné kultury nebo buňky získané po expozici zvířete in vivo, zejména buňky kostní dřeně. Test na chromozomové aberace se také používá k analýze periferních lymfocytů lidí jako expoziční test in vivo, sloužící ke sledování reálného genetického rizika prostředí (Georgiadis, 2005; Topinka, 2007). Poškození chromozomů nebo mitotického aparátu může vyvolat indukci mikrojader, obsahujících fragmenty chromozomů nebo celé chromozomy. V testu na mikrojádra se nejčastěji používají erytrocyty in vivo, možné je ale i použití jiných typů buněk in vivo nebo in vitro (Heddle, 1973; Schmid, 1975; Heddle, 1983). Testy na neplánovanou syntézu DNA, související s poruchami oprav poškozené DNA, a na výměny sesterských chromatid, zahrnující zlomy a znovuspojení chromatid, využívají inkorporaci radioaktivně značeného thymidinu a bromdeoxyuridinu (Warshawsky, 1995). Vedle metod zahrnutých do směrnic OECD pro testování chemikáliií existuje a je vyvíjena řada dalších. Zlomy DNA detekuje gelová elektroforéza jednotlivých buněk (SCGE, tzv. comet assay), která může využít prakticky jakékoli buňky in vivo nebo in vitro (Singh, 1988; Tice, 2000). Předchůdcem metody SCGE byla metoda alkalického vymývání DNA (alkaline elution) (Ahnström, 1974) a metoda alkalického rozvinutí DNA (alkaline DNA unwinding) (Kohn, 1973). Další metoda využívá skutečnost, že přítomnost zlomů DNA zvyšuje citlivost k denaturaci jaderné DNA in situ (Gorczyca, 1993). Barvivo akridinová oranž se váže na denaturované jednořetězcové úseky DNA a nedenaturované dvouřetězcové úseky DNA a emituje záření o rozdílné vlnové délce, které je detekováno průtokovou cytometrií. Tato metoda je využívána zejména k detekci poškození spermií jako tzv. metoda SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) (Evenson, 1980). Často je také používána imunochemická detekce proteinů indukovaných následkem poškození DNA, např. p53, p21 a dalších nebo detekce jejich mrna pomocí PCR (Chramostová, 2004; Helt, 2005). Je možné také měřit přímo adukty reaktivních metabolitů s DNA za použití radioaktivního značení a rozdělení vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií nebo tenkovrstvou chromatografií (Gupta, 1985; Mahadevan, 2001). Jako marker genotoxicity je také možné využít zvýšenou apoptózu. Ranné fáze apoptózy jsou detekovatelné průtokovou cytometrií po vazbě annexinu-v (Koopman, 1994) a pozdní fáze mohou být určeny mikroskopicky po barvení DAPI (Chramostová, 2004). 1.3.2.2. Testy negenotoxických efektů K určení aktivace receptoru AhR se často používá stanovení aktivity CYP1 enzymů pomocí modelových substrátů, především O-deethylace 7-ethoxyresorufinu (EROD) (Prough, 1978) nebo hydroxylace aromatických uhlovodíků (AHH) (Piskorska-Pliszczynska, 1986). Hojně užívané jsou také metody detekující indukci genové exprese specifických reporterových genů pod kontrolou dioxin-responzivního elementu. Jako reporterový gen se 20

Úvod využívá zejména luciferáza (metoda DR-CALUX) (Murk, 1996), β-galaktosidáza nebo zelený fluorescenční protein (Nagy, 2002). Metodou PCR může být měřena indukce mrna cytochromů P450, transkripčních produktů aktivovaného AhR (Umannová, 2008). Z in vitro metod se k určení aktivace receptoru ER obdobně jako u měření aktivace AhR využívají metody založené na aktivaci stejných reporterových genů pod kontrolou estrogen-responzivního elementu (např. luciferáza v testu ER-CALUX) (Legler, 1999). Obdobné systémy jsou v současné době vyvinuty také pro stanovení (anti)androgenní aktivity, modulaci aktivity glukokortikoidního receptoru apod. (Sonneveld, 2005). Alternativním testem je také E-screen, test indukce proliferace závislé na ER v buněčných linií karcinomu prsu (Gupta, 1998; Combes, 2000; Plíšková, 2005). V posledních deseti letech byla vyvinuta nová metoda tzv. DNA microarray, umožňující sledovat expresi tisíců genů na jednom čipu. Změny v genové expresi mohou sloužit jako citlivý parametr toxicity a indikovat mechanismy působení (Nuwaysir, 1999). Změny v buněčném cyklu bývají detekovány průtokovou cytometrií, proliferace může být stanovována různými metodami jako počet buněk nebo měřením inkorporace bromdeoxyuridinu průtokovou cytometrií (Chramostová, 2004). Fáze buněčného cyklu i počet pozdně apoptotických buněk obsahujících zlomy na DNA mohou být určeny na průtokovém cytometru také pracnější metodou TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Assay) (Tuschl, 2005). Inhibice mezibuněčné komunikace (GJIC) může být určena mikroskopicky metodou scrape-loading, která spočívá v měření vzdálenosti proniknutí fluorescenční barvy buňkami od místa řezu (El-Fouly, 1987). Také je možná detekce změn hladin a post-translačních modifikací (fosforylací) konexinů, proteinů tvořících kanálky gap junction, imunochemickými metodami (Bager, 1994; Tateno, 1994). 21

Úvod 1.4. Charakteristika vybraných skupin PAU Obecně lze říci, že PAU působí celou řadou mechanismů toxicity a tyto efekty jsou silně závislé na molekulové hmotnosti (MW), struktuře, poloze substituce atd. Z velké řady PAU a jejich derivátů jsou v této kapitole charakterizovány ty skupiny, kterými se zabývá experimentální část této práce nebo skupiny obsahující tzv. prioritní PAU vybrané Americkou agenturou pro ochranu životního prostředí (US EPA) pro rutinní chemické monitorování prostředí. 1.4.1. Abundantní nížemolekulární PAU Anthracen, fenanthren, fluoranthen, pyren a fluoren (obr. 4) se většinou vyskytují v životním prostředí ve vyšších koncentracích než ostatní PAU. Patří mezi šestnáct tzv. prioritních PAU (US EPA). Podle IARC nejsou klasifikovány jako lidské karcinogeny (IARC, 1983; IARC, 1987). anthracen fenanthren pyren fluoren fluoranthen Obr. 4: Abundantní PAU Anthracen a fluoren nemají genotoxické ani karcinogenní účinky (WHO, 1998) a neaktivují AhR (Machala, 2001). Důkazy o schopnosti fenanthrenu a pyrenu vyvolávat genotoxické a karcinogenní účinky nejsou jednoznačné, nicméně fluoranthen vykazoval v některých testech slabou genotoxicitu (WHO, 1998). Pyren a fluoranthen také patří mezi slabé induktory aktivity AhR (Machala, 2001). Pouze u fluoranthenu (v nejvyšší testované koncentraci 10 µm) byla zjištěna schopnost vyvolávat proliferaci v modelu jaterních progenitorových buněk (Chramostová, 2004) a aktivaci estrogenního receptoru (Vondráček, 2002). Kromě anthracenu jsou tyto PAU silnými inhibitory mezibuněčné komunikace, zejména fluoranthen, který je mezi PAU dosud nejsilnějším identifikovaným inhibitorem GJIC (Bláha, 2002). U fluoranthenu byla navíc zjištěna schopnost vyvolávat imunotoxické účinky (Hinoshita, 1992). 22

Úvod 1.4.2. Skupina PAU s molekulovou hmotností 228 Nejvýznamnějšími zástupci jsou benzo[a]anthracen (BaA), chrysen (Chry), benzo[c]fenanthren (BcPhe) a trifenylen (obr. 5). Z nich patří BaA a Chry mezi prioritní PAU podle US EPA. BaA, Chry a BcPhe jsou zařazeny do kategorie 2B jako možné lidské karcinogeny, trifenylen není klasifikován jako lidský karcinogen (IARC, 1983; IARC, 1987; IARC, 2008). Mají genotoxické a (kromě trifenylenu) karcinogenní účinky v myších a krysích modelech (WHO, 1998). Vyvolávají aktivaci AhR a slabou inhibici GJIC, pouze BcPhe je silnějším inhibitorem GJIC (Machala, 2001; Bláha, 2002). BaA vyvolává estrogenní efekty (Plíšková, 2005). benz[a]anthracen chrysen benzo[c]fenanthren trifenylen Obr. 5: PAU s molekulovou hmotností 228. 1.4.3. Skupina PAU s molekulovou hmotností 252 Do této skupiny patří např. benzo[a]pyren (BaP), benzo[e]pyren (BeP), benzo[k]fluoranthen (BkF), benzo[b]fluoranthen (BbF), benzo[j]fluoranthen (BjF) (obr. 6) a některé další. BaP je klasifikován jako karcinogenní pro člověka (kategorie 1), BkF, BbF a BjF jako potenciální karcinogeny (kategorie 2B) a BeP není klasifikován jako karcinogen (IARC 1983; IARC, 1987; IARC, 2008). Tyto PAU mají genotoxické a karcinogenní účinky (WHO, 1998) a aktivují AhR. Zejména benzofluorantheny jsou silnými induktory aktivity AhR (Machala, 2001), vyvolávají také proliferaci a zvyšují procento buněk v S-fázi v modelu jaterních progenitorových buněk (Chramostová, 2004). Neinhibují GJIC vůbec nebo jen slabě (BaP, BbF) (Bláha, 2002). Z této skupiny patří mezi prioritní PAU BaP, BkF a BbF. BaP je silný genotoxin in vivo a v řadě in vitro modelů a je široce používán jako referenční genotoxický a karcinogenní PAU (WHO, 1998). BaP v genotoxických koncentracích aktivuje protein p53, vyvolává fragmentaci buněčného jádra a další apoptotické procesy, zároveň aktivuje AhR a indukuje kompenzující proliferaci buněk (Chramostová, 2004). 23

Úvod benzo[a]pyren benzo[e]pyren benzo[b]fluoranthen benzo[j]fluoranthen benzo[k]fluoranthen Obr. 6: PAU s molekulovou hmotností 252. 1.4.4. Skupina PAU s molekulovou hmotností 278 Z této skupiny PAU jsou významné především dibenzo[a,h]anthracen (DBahA), dibenzo[a,c]anthracen (DBacA), dibenzo[a,j]anthracen (DBajA), benzo[g]chrysen (BgChry), benzo[c]chrysen (BcChry) a benzo[b]chrysen (BbChry) (obr. 7). DBahA je klasifikován jako pravděpodobný lidský karcinogen (kategorie 2A), DBacA a DBajA nejsou (kategorie 3) (IARC, 1983; IARC, 1987; IARC, 2008). Z této skupiny je na seznam prioritních PAU zařazen pouze DBahA. Dibenzoanthraceny jsou silnými induktory aktivity AhR (Machala, 2001), DBahA má genotoxické a karcinogenní účinky (WHO, 1998); z dibenzoanthracenů pouze DBacA vyvolává inhibici GJIC (Bláha, 2002). BgChry a BbChry nejsou klasifikovány jako karcinogeny (kategorie 3) (IARC, 2008). Molekuly BcChry a BgChry obsahují ve své struktuře zároveň tzv. bay a fjord oblast, přičemž v obou částech molekuly mohou vznikat dihydrodiolepoxidy. Zejména BgChry má velmi silné genotoxické účinky. BcChry i BgChry vyvolávaly tvorbu DNA aduktů v kůži myší (Giles, 1996; Giles, 1997). BcChry dihydrodiolepoxid lokalizovaný v sousedství fjord regionu indukoval, na rozdíl od dihydrodiolepoxidu umístěném v bay oblasti, vznik nádoru v prsních žlázách krys (Amin, 2003). BbChry a zejména BcChry indukovaly EROD aktivitu jaterních CYP1A1/2 v krysách in vivo, BgChry nebyl v experimentu zahrnut (Cheung, 1993). 24

Úvod dibenzo[a,c]anthracen dibenzo[a,j]anthracen dibenzo[a,h]anthracen benzo[b]chrysen benzo[c]chrysen benzo[g]chrysen Obr. 7: PAU s molekulovou hmotností 278. 1.4.5. Skupina PAU s molekulovou hmotností 302 Nejvýznamnějšími zástupci této skupiny jsou dibenzo[a,l]pyren (DBalP) a dibenzo[a,e]pyren (DBaeP) (obr. 8). DBalP je klasifikován jako pravděpodobný lidský karcinogen (kategorie 2A), ale není zařazen na seznam prioritních PAU. DBaeP není klasifikován jako karcinogen (IARC, 1983; IARC, 1987; IARC, 2008). Mají genotoxické a karcinogenní účinky (WHO, 1998), jsou slabšími aktivátory AhR (Machala, 2001) a jen velmi slabými inhibitory GJIC (Bláha, 2002). DBalP je používán jako modelový PAU a vykazuje nejsilnější genotoxický a karcinogenní účinek z doposud testovaných PAU (Cavalieri, 1991). dibenzo[a,l]pyren dibenzo[a,e]pyren Obr. 8: PAU s molekulovou hmotností 302. 25

Úvod 1.4.6. Methylované deriváty chrysenu a benz[a]anthracenu V životním prostředí se vyskytuje také velké množství methylovaných derivátů PAU (naftalenů, anthracenů, fenanthrenů, pyrenů, chrysenů, benzanthracenů a benzo[a]pyrenů). Mezi monomethylovanými deriváty chrysenu má unikátní karcinogenní vlastnosti 5-methylchrysen (5-MeChry) (obr. 9), pravděpodobně díky přítomnosti tzv. methyl bay oblasti (Hecht, 1987). 5-MeChry je zařazen do kategorie 2B (IARC, 1973; IARC, 1987; IARC, 2008). 5-MeChry je také silným aktivátorem AhR (Machala, 2001), silným inhibitorem GJIC (Bláha, 2002) a vyvolává proliferaci a nárůst procenta jaterních progenitorových buněk v S-fázi (Chramostová, 2004). 2-, 3-, 4- a 6-MeChry mají výrazně slabší karcinogenní účinky, zatímco 1-MeChry je neaktivní (Hecht, 1974), podle IARC nejsou klasifikovány jako lidské karcinogeny (IARC, 1973; IARC, 1987; IARC, 2008). Všechny deriváty silně indukovaly aktivitu jaterních CYP1A1 v krysách in vivo, měřenou jako O-deethylace ethoxyresorufinu (Cheung, 1993). 7,12-dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) (obr. 9) je jedním z nejsilnějších karcinogenních PAU. Může indukovat vznik kožních (Boyland, 1965), plicních (Walters, 1966), jaterních a prsních nádorů (Huggins, 1961). Tvoří vysoké hladiny aduktů s DNA v řadě experimentálních modelů. Aktivuje AhR (Machala, 2001) a inhibuje GJIC (Bláha, 2002). Z monomethylovaných derivátů benz[a]anthracenu (MeBaA) mají na kožních hlodavčích modelech karcinogenní účinky 6-, 7-, 8- a 12-MeBaA, zatímco ostatní deriváty mají velmi slabé nebo žádné schopnosti vyvolat nádor v těchto modelech (Dunning, 1960; Stevenson, 1965). Nejsilnější tumor-iniciační účinky vykazoval 7-MeBaA, který byl ve srovnání s DMBA středně silný. Dalšími aktivními deriváty byly 8- a 12-MeBaA, následované 6- a 9-MeBaA (Wislocki, 1982). S karcinogenitou MeBaA v kožních modelech přibližně korelovala jejich mutagenita v Amesově testu za použití intaktních potkaních hepatocytů jako metabolizujícího systému (Utesch, 1987). 9 8 10 7 11 6 12 5 1 4 CH3 2 3 10 9 11 12 8 7 CH3 1 2 CH3 5 6 3 4 5-methylchrysen 7,12-dimethylbenz[a]anthracen Obr. 9: Příklady methylovaných derivátů PAU s vysokou karcinogenní potencí. 26

Úvod 1.5. Vybrané N-heterocyklické aromatické uhlovodíky Ze skupiny N-heterocyklických aromatických uhlovodíků byl v této práci vybrán ke studiu 7H-dibenzo[c,g]karbazol (DBC) a jeho syntetické deriváty 5,9-dimethyldibenzo[c,g]karbazol (dimedbc) a N-methyldibenzo[c,g]karbazol (N-MeDBC) (obr. 10). DBC je environmentální polutant, přítomný v řadě směsí vzniklých nedokonalým spalováním organického materiálu, jako např. v cigaretovém kouři, asfaltu, sazích a automobilových exhalátech (rev. viz Warshawsky, 1996). Je to silný karcinogen, vyvolávající tvorbu nádorů na různých místech organismu a v různých druzích zvířat (Szafarz, 1988; Warshawsky, 1996). Je klasifikován jako možný lidský karcinogen (kategorie 2B) (IARC, 1983). Pro studium vztahu mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou byly syntetizovány deriváty DBC substitucí methylovou skupinou na různých pozicích jeho molekuly. Z těchto derivátů vykazují N-MeDBC a dimedbc specifické účinky. N-MeDBC tvoří DNA adukty, nádory a mutace především na kůži (Périn, 1984; Schurdak, 1987), zatímco dimedbc je striktní hepatokarcinogen, který tvoří nádory, adukty a mutace v játrech, ale nemá žádnou aktivitu na kůži (Valéro, 1984; Renault, 1998). Experimenty na geneticky upravených buňkách čínského křečka V79, stabilně produkujících buď CYP1A1 nebo CYP1A2, ukázaly, že po metabolické aktivaci CYP1A1, resp. CYP1A2 vyvolává DBC a N- MeDBC tvorbu DNA aduktů, zatímco dimedbc jen velmi málo, resp. vůbec (Gábelová, 2004). 11 12 13 10 1 2 3 4 11 12 13 10 1 2 3 4 11 12 13 10 1 2 3 4 9 8 7 N H 6 5 H 3 C 9 8 7 N H 6 5 CH 3 9 8 7 N CH 3 6 5 7H-dibenzo[c,g]karbazol 5,9-dimethyldibenzo[c,g]karbazol N-methyldibenzo[c,g]karbazol Obr. 10: N-heterocyklické aromatické uhlovodíky. 27

Cíle práce 2. Cíle práce Játra představují centrální orgán metabolismu xenobiotik. Obsahují několik typů buněk, včetně buněk progenitorových, které mohou v případě poškození jater proliferovat a nahradit poškozené buňky. Vedle této role při regeneraci jater se mohou progenitorové buňky také stát cílem chemických karcinogenů a hrát roli v hepatokarcinogenezi. Přesto je většina studií zabývajících se účinky polyaromatických uhlovodíků (PAU), významných environmentálních kontaminantů, dosud zaměřena na diferencované buňky (hepatocyty) nebo buněčné hepatoma linie odvozené z hepatocytů. Cílem této práce byl výzkum genotoxických účinků PAU a referenčního abiotického vzorku prostředí v potkaních buňkách WB-F344, jaterní progenitorové epiteliální buněčné linii. Práce byla zaměřena na: studium genotoxických efektů karcinogenních PAU; studium genotoxických a tumor-promočních efektů methylovaných benz[a]anthracenů; studium genotoxických a tumor-promočních efektů 7H-dibenzo[c,g]karbazolu a jeho derivátů a mechanismu jejich působení; studium genotoxických a tumor-promočních efektů vzorku pevných částic z ovzduší SRM1649a. 28

Materiál a metody 3. Materiál a metody 3.1. Buněčná linie Experimenty byly provedeny v linii jaterních epiteliálních buněk WB-F344, původně izolovaných z jater dospělého samce potkana Fischer 344 (Tsao, 1984). Tuto linii nám poskytnul prof. James E. Trosko, Michigan State University, East Lansing, USA. Buňky WB- F344 představují model jaterní progenitorové linie (Tsao, 1984). Jaterní progenitorové buňky, označované u zvířat také jako oválné buňky (Libbrecht, 2002), se mohou jak u lidí, tak u zvířat diferencovat na hepatocyty a buňky žlučových kanálků (Haque, 1996; Yasui, 1997; Roskams, 1998; Yang, 2004). Progenitorové buňky bývají v játrech aktivovány v případě, že hepatocyty a/nebo cholangiocyty jsou poškozeny nebo je inhibována schopnost jejich replikace (Roskams, 2003). Tato kompenzační expanze jaterních progenitorových buněk hraje roli v zachování tkáňové integrity jater a omezuje poškození jater (Yang, 2004). Zároveň tyto buňky představují možný cíl hepatokarcinogenů, jelikož hepatocelulární karcinomy mohou vznikat z jaterních buněk v různých stadiích diferenciace, včetně oválných buněk (Roskams, 2006; Wu, 2006). Linie WB-F344 obsahuje receptor AhR, dále významné hladiny biotransformačních enzymů, zejména CYP1A1, CYP1B1, AKR1C9 a nemutovaný protein p53. V těchto buňkách jsou také funkční mezibuněčná spojení typu gap junctions. Z hlediska in vitro studií je důležité, že se jedná o nenádorovou a netransformovanou buněčnou linii, což zvyšuje výpovědní hodnotu získaných výsledků. 29