Fluorescence humusových látek Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Fluorescence humusových látek Bakalářská práce Vedoucí práce: Doc. RNDr. Lubica Pospíšilová, CSc. Vypracovala: Eva Novotná Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Fluorescence humusových látek vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

PODĚKOVÁNÍ Přála bych si na tomto místě poděkovat všem, kteří mi pomáhali při tvorbě této bakalářské práce. Především bych chtěla poděkovat vedoucí práce paní Doc. RNDr. Lubici Pospíšilové, CSc., za ochotu, trpělivost a nesmírné množství rad, které mi poskytla. Dále bych chtěla poděkovat paní Mgr. Jaroslavě Chalupové a paní Mgr. Miroslavě Koutné za pomoc při tvorbě bakalářské práce. Rodině za podporu a trpělivost.

ANOTACE V bakalářské práci hodnotíme kvalitu a stupeň humifikace humusových látek pomocí synchronní fluorescenční spektroskopie. U deseti subtypů černozemí byl stanoven stupeň humifikace a kvalita HL klasickou frakcionací a následně byl stupeň humifikace vypočítán z fluorescenčních indexů (F). Bylo zjištěno, že synchronní fluorescenční spektra indexy mohou podrobně charakterizovat kvalitu HL a výsledky dobře korelují s klasickou frakcionací. Byla zjištěna lineární korelace mezi HK a Sh* (R = 0,97) a Sh a F (R = 0,85). Klíčová slova: černozem, huminové kyseliny, SFS spektra, stupeň humifikace. ANNOTATION The aim of bachelor thesis was to assess humic substances quality and humification degree. We determined fractional composition and humification degree in ten subtypes of chernozems by classical short fractionation method. Further synchronous fluorescence spectra and indexes were determined and humification degree was calculated. Results showed that synchronous fluorescence is useful tools for humic substances quality determination. Linear correlation between HA and HD* (R = 0,97) and HD and F (R = 0,85)was found. Key words: chernozem, humic acid, SFS spectra, humification degree.

1 ÚVOD... 8 2 CÍL PRÁCE... 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 11 3.1 Černosoly jejich taxonomie a chemické vlastnosti... 11 3.2 Půdní organická hmota, její vznik a funkce... 13 3.3 Třídění a frakcionace humusových látek... 16 3.4 Izolace huminových kyselin... 22 3.5 Nedegradační metody studia... 23 3.6 Fluorescenční spektrofotometrie... 27 3.6.1 Synchronní fluorescenční spektra... 30 3.6.2 Časově rozlišená fluorimetrie... 30 3.6.3 Rentgenová fluorescenční analýza... 30 3.6.4 Energiově-disperzní spektrofluorimetry... 31 4 MATERIÁL A METODY... 34 4.1 Objekt studia... 34 4.2 Metody... 35 4.2.1 Celkový obsah organického uhlíku... 35 4.2.2 Frakční složení humusových látek... 35 4.2.3 Izolace půdních HK... 36 4.2.4 Fluorescenční spektra HK... 37 5 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ... 39 5.1 Základní fyzikální a chemické charakteristiky černozemí... 39 5.2 Fluorescence HL... 43 5.3 Vyhodnocení fluorescenčního indexu (F) a barevného koeficientu (Q 4/6 )... 43 5.3 Atomové poměry podle Van Krevelenova diagramu... 45 6 ZÁVĚRY... 46 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 47 INTERNETOVÉ ZDROJE... 52 SEZNAM ZKRATEK... 55 SEZNAM OBRÁZKŮ... 56 SEZNAM TABULEK... 58 SEZNAM GRAFŮ... 59

1 ÚVOD Půda Existence života na Zemi, je závislá na vodě, vzduchu, teplotě atd. Mezi důležité složky pro život patří i půda. Každý den po zemi chodíme a bereme ji jako samozřejmost Na půdu je třeba vždy pohlížet jako na dynamický přírodní útvar, který se tvoří a udržuje pod vlivem okolního prostředí. Nejvýstižnější definici půdy podal jeden ze zakladatelů světového půdoznalství V. V. Dokučajev, který půdu považuje za samostatný přírodně-historický útvar, který vzniká a vyvíjí se zákonitým procesem, jenž probíhá působením několika půdotvorných činitelů (In: Tomášek, 2007). Obr. 1 Krajina (www.google.cz) Význam půdy a její ochrany je důležité vyzdvihnout a zdůraznit. V dnešní době je půda nadmíru vyčerpaná vlivem špatného obhospodařování např. špatná volba a dávkování hnojiv, nevhodné obdělávání orné půdy, nevhodné střídání polních plodin atd. Veškeré nevhodné postupy vyvolávají degradaci půdy, dochází k půdní erozi a v nejhorších případech dochází k nevratnému poškození půdy. Ekologické havárie zasahující půdu bodově nebo plošně jsou téměř na denním pořádku. Na půdu se lze dívat z různých hledisek. Z hlediska geologického se dá na půdu pohlížet jako na zvětralou svrchní část zemské kůry, která obsahuje organické zbytky rostlin a živočichů. Z hlediska chemizmu je půda zdrojem živin. 8

Je povinností člověka chránit půdu, jelikož je lehce zničitelná. Ochrana půdy se musí stát jedním z hlavních témat pro udržení kvality půd, nebo pro jejich zlepšení nejen u nás, ale na celé Zemi. Obr. 2 Poškozená půda (www.google.cz) Dnes si uvědomujeme, že půda v žádném případě neexistuje neomezeně, že současně není odolná vůči ničení, které způsobuje člověk. Souvisí to se zvýšeným nárokem na půdu potřebnou k bydlení vzrůstajícího počtu obyvatelstva na světě (Prax a Pokorný, 1996). V únoru 2011 byla zveřejněná zpráva o stále se snižující kvalitě půdy v ČR. Uvádí se, že v nejohroženějších místech se každý rok splavuje 7,5 tun na hektar, přitom je ohroženo téměř 50 procent zemědělské půdy v ČR (www.novinky.cz). Půda vzniká zvětráváním hornin a ze zbytků organické hmoty půdotvorným procesem (Jůva a Krejčíř, 1974). Půda spolu s organismy tvoří ekologické systém, který je základem pro život na zemi. Slouží rostlinám jako stanoviště, které dál slouží jiným živočichům jako potrava. Půda je základním zdrojem obživy pro lidstvo. Půda je hlavním místem, kde se shromažďuje voda, minerální látky, biogenní prvky a další. 9

2 CÍL PRÁCE Bakalářská práce na téma Fluorescence humusových látek je rozdělena do dvou částí. První část je zaměřena na zpracování literární rešerše o spektrálních metodách využívaných k charakteristice humusových látek. Důraz je kladen na fluorescenční spektroskopii humusových látek, na metody měření různých typů fluorescenčních spekter a vyhodnocení fluorescenčních dat. Druhá část bakalářské práce je věnovaná praktickému měření fluorescence humusových látek u půdního typu černozem. Ve vybraných subtypech černozemí (např. modální, arenická a luvická) byla stanovena relativní hodnota fluorescence, vypočítány hodnoty fluorescenčních indexů a stanoven stupeň humifikace humusových látek. Byly zjištěny rozdíly v intenzitě fluorescence a tím i rozdílný stupeň humifikace u vybraných subtypů černozemí. Výsledky byly porovnány s klasickou frakcionací podle Kononové a Bělčikové (1963), z jejíchž hodnot byl taktéž stanoven stupeň humifikace. Cílem práce bylo zjistit, zdali je možné pomocí fluorescenční metody stanovit přesně stupeň humifikace, který indikuje kvalitu/zdraví půdy a patří mezi základní ukazatele kvality humusových látek. Bakalářská práce byla vypracována s podporou projektů: NAZV QH 82100 Optimalizace vodního režimu v krajině a zvýšení retenční schopnosti krajiny uplatněním kompostu z biologicky rozložitelných odpadů na orné půdě i trvalých travních porostech. NAZV QH 72039 Stanovení stupně degradačních změn v půdě vlivem antropogenní činnosti v souvislosti s pěstováním plodin. 10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Černosoly jejich taxonomie a chemické vlastnosti Česká republika zabírá rozlohu zhruba 7,8 mil. ha, z toho zemědělská půda zabírá 4273000 ha, z toho černozemě tvoří 11 %. Patří k našim nejúrodnějším půdám, proto jsou využívány jako půdy orné. Limitujícím faktorem jejich úrodnosti je dostatečné množství atmosférických srážek. Černozemě se tvoří v nejsušších a nejteplejších oblastech viz obr. 3. Vznik sahá až do raných období postglaciálu pod původní lesostepí a stepí. Matečným substrát tvoří převážně spraše, ojediněle zvětraliny slínovců (slíny) nebo vápnité písky. Při intenzivním zvětrávání hornin, v jednotlivých glaciálech se tvořil jemný horninový prach. Tokem povrchových vod, byly unášeny zvětraliny, které tvořily naplaveniny. Vlivem vysychání byl jemný prach unášen větrem do míst, kde vítr ztratil svoji sílu (Tomášek, 2007 a Jandák a kol., 2010). V dnešní době se uchovávají ve své původní podobě převážně jen díky zemědělské kultivaci. Roční úhrn srážek v černozemních oblastech činí 450 650 mm, průměrná roční teplota je nad 8 C. Nadmořská výška výskytu černozemí zpravidla nepřesahuje 300 m. Utváření terénu je převážně rovinaté. Pro půdní profil je charakteristický nápadně mocný (> 30 cm), tmavě zbarvený humusový horizont. Vyznačuje se odolnou vodostálou strukturou a hojným edafonem. Pro spraše je příznačná přítomnost vápnitých žilek, povlaků a konkrecí (cicvárů) a chodeb stepních savců (krotovin), vyplněných humózní zeminou. Černozemě jsou nejčastěji středně těžké, bez skeletu, s vyšším až vysokým obsahem humusu, neutrální reakcí a velmi dobrými sorpčními vlastnostmi (Tomášek, 2007) viz obr. 3. Podle Taxonomického klasifikačního systému půdy (Němeček a kol., 2001) je řadíme do referenční třídy Černosoly. Představují velmi úrodné půdy se souborem optimálních fyzikálních, chemických, mineralogických a biologických vlastností půd pro zemědělské využití (Jandák, Pokorný a Prax, 2010). Do této referenční třídy patří dva půdní typy: CE ČERNOZEM CC ČERNICE 11

Černozemě se skládají z hlubokohumózní půdy s tmavým černickým horizontem Ac. Vytvořily se ze spraší, písčitých spraších a slínů intenzivní akumulací a kondenzací půdní organické hmoty, v podmínkách nepromyvného vodního režimu. Původní vegetací byly stepi a lesostepi (Jandák, Pokorný, Prax, 2010). Stratigrafie: Ap Ac Ac/Ck K Ck Černozemě podle Taxonomického klasifikačního systému půdy Němeček a kol. (2001) lze dělit na tyto hlavní subtypy a variety: CEm černozem modální hlavně ze spraší, s kalcickým horizontem CEl černozem luvická s horizontem Bth, odvápnění níže Ac CEce černozem černická s redoximorfními znaky (2 stupeň) do 60 cm CEr černozem arenická vytvořená z lehčích substrátů (zrnitost 2) CEp černozem pelická v horizontu Ac zrnitost 4 Variety: karbonátová s obsahem uhličitanu vápenatého v celém profilu; degradovaná s náznakem iluviálního horizontu na přechodu do matečného substrátu; Černozemě se dále vyznačují vláhovým režimem v intervalu bod vadnutí polní kapacita, v suchých letech s poklesem pod bod vadnutí. Obsahují v ornici 1,9 3,0 % humusu, C HK :C FK > 1,5. Půdní reakce je neutrální až slabě alkalická. Porovnání chemických vlastností černozemí s jinými půdními subtypy uvádíme v Tab. 1. Obr. 3 Černozem (www.vseozahrade.blog.cz) 12

Tab. 1 Porovnání chemických vlastností u různých subtypů černozemí (Němeček a kol. 1990, Vlček, 2006) T (mmol/100g) V (%) Subtypy ph/kcl Humus (%) CE modální 6,6 7,2 18 25 95 2,2 3 2,4 CE luvická 5 6 17 21 90 1,9 2,5 2,7 CE černická 7 8 25 30 95 4 8 2,7 CE karbonátová 7 8 25 30 95 2 5 1,6 CE vertická 7 8 18 21 90 3 4 2,0 HK/FK 3.2 Půdní organická hmota, její vznik a funkce Organická hmota půdy představuje část půdy, která se odlišuje od hornin a zabezpečuje úrodnost především díky humusu a uhlíku, tyto látky určují potenciální a efektivní úrodnost půd. V organické hmotě půdy dochází k bio-geochemickým reakcím a migraci látek, které určují charakter vývoje půd. Ve vztahu organické hmoty a úrodnosti půd, hraje důležitou roli množství, kvalita a rychlost humusu, tak jako jeho složení a vlastnosti při vzniku humusových látek (Sotáková,1982). Organická hmota prochází neustálými změnami jak po stránce chemického složení, tak i po stránce vlastností a funkcí v půdě (Prax a Pokorný, 1996, Pospíšilová a Tesařová, 2009). Skládá se z různých látek, které jsou převážně rostlinného původu. Mohou být v různém stupni rozkladu nebo i nerozložené. Dále obsahují nově vzniklé látky v procesu humifikace a tyto se nazývají humusové látky. Organický podíl v půdách mírného klimatu představuje 0,4 10 %. Zbytek tvoří anorganický podíl. Obecně se organický podíl půdy dělí na část živou a neživou. Neživá část, tj. půdní organická hmota, představuje dynamický systém složený z čerstvě nerozložených zbytků, částečně rozložených zbytků, produktů mikrobiálního rozkladu a humusu, jak bylo uvedeno výše. Organická hmota představuje tedy soubor organických látek nahromaděných v půdě a na půdě, pocházejících z odumřelých zbytků rostlin, živočichů a mikroorganismů v různém stupni přeměn a v různém stupni smíšení s minerálním podílem. Rozlišuje čtyři frakce půdní organické hmoty: rozpuštená organická hmota (DOM < 45 µm), rozdrobená organická hmota (particulate organic matter 53 2000 µm), humus a inertní organická hmota (Sotáková, 1982, 1986 a Smith et al. 2005, Oades, 1989, 1993, Kogel-Knabel et 13

al., 2002). Různorodost názorů na humus, jeho vznik, složení a vlastnosti určuje rozdíly v samotném pojmu a definicích. Půdní humus plní nezastupitelnou roli na planetě Zemi. Mezi hlavní přednosti půdního humusu patří zadržování vody v půdě, absorpce sluneční energie díky své tmavé barvě, při procesu mineralizace půdní organické hmoty, napomáhá rozkladu některých anorganických sloučenin a tak se zvyšuje příjem živin rostlinami. Další důležitou funkcí je ochrana půdy proti vodní a větrné erozi (Sotáková,1982). Tvorba humusu probíhá třemi základními procesy humifikace, rašelinění a mineralizace. Humifikace je značně ovlivňována abiotickými faktory. Ideální teplota pro optimální humifikaci se pohybuje kolem 30 C. Dalším faktorem ovlivňující složení a tvorbu humusu jsou humifikované látky a jejich povaha (Pospíšil, 1980 a Mikula, 1998). Humózní horizonty vznikají hromaděním koloidně disperzních humusových látek, dokonale smíšených s minerálním substrátem. Tento proces probíhá optimálně pod stepní vegetací na hlinitých půdotvorných substrátech plně nasycených bázemi v podmínkách nepromyvného až periodicky promyvného vodního režimu. Prostředí bohaté CaCO 3 bez dostatku jílu podmiňuje zpomalení transformačních procesů čerstvých organických látek, vysrážení produktů humifikace bez výraznější polymerizace. Aktivní Fe působí na stabilizaci huminových kyselin i mikrobiálních polysacharidů. Silně polymerizované huminové kyseliny se hromadí za podmínek střídání optimální vlhkosti a prosýchání půdy za přítomnosti smektitů (jílových minerálů skupiny montmorillonitu), jak uvádějí Prax a Pokorný (1996). Za výrazně omezeného množství vzduchu, případně za výhradně anaerobních podmínek, při nedostatečné oxidaci, probíhá proces rašelinění. Jedná se o proces převážně enzymatický a biochemický, kde se uplatňují anaerobní bakterie. Výsledkem jsou huminové a ulminové látky s vysokým obsahem uhlíku. Dochází k nedokonalému rozkladu organických zbytků. Za extrémních podmínek dochází až ke karbonizaci, při níž vzniká tzv. humusové uhlí. Mineralizace představuje úplný rozklad organických látek v půdě. Tento proces vede k přeměně organické hmoty až na jednoduché složky jako například oxid uhličitý, vodu, amoniak, oxidy různých prvků atd. Procesy probíhají za příznivých teplotních a vlhkostních podmínek, zejména v půdách lehčího charakteru, silně provzdušněných (Jandák a kol., 2010). 14

V současnosti převládá názor, že humusové látky mohou vznikat dvěmi cestami (Hayes, 2001, Swift, 1996 a Gobat et al., 2004). První cesta zahrnuje biochemické modifikace transformace a rozklady existujících složek organických látek, především ligninu, vosků a fenolových kyselin. Druhou možností je, že humusové látky vznikají syntézou a polykondenzací molekul odštěpených z rostlinných prekurzorů (mj. kyseliny ferulové, syringové, kávové, protokatechové, z pyrogalolu a konyferylu, alkoholu, katecholu aj.), jak je uvedeno v úvodu kapitoly. Hlavní rozdíl mezi těmito procesy spočívá v tom, že první je založena na postupné oxidaci a degradaci existujících rostlinných polymerů, zatímco druhá zahrnuje tvorbu (syntézu) nových makromolekul, které jsou samy po čase oxidativně degradovány. Je pravděpodobné, že v půdě probíhají oba dva procesy souběžně. Schéma humifikace podle Gobat et al. (2004) uvádíme na obr. 4. Obr. 4 Typy mineralizace a humifikace půdní organické hmoty modifikováno podle Gobat et al. (2004) 15

3.3 Třídění a frakcionace humusových látek Oden (1919) jako první využil známé rozpustnosti humusových látek v alkáliích a rozdělil humusové látky na skupiny různě kondenzované a v půdě různě sorbované. První skupinou byla tzv. volná frakce extrahovaná slabým louhem za studena. Druhá frakce je extrahovaná po dekalcinaci půdy a třetí, pevně vázaná frakce se uvolní po kyselé hydrolýze za horka. Tento postup byl upraven Konovou a Bělčikovou (1963). Humusové látky se rozdělí na specifické humusové látky, nespecifické humusové látky a na meziprodukty rozkladu, které mohou být volné nebo vázané chemicky nebo sorpčně. Frakcionaci podle Orlova (1985) viz obr. 5 je možné získat tyto frakce: látky rozpustné v alkoholu (lipidy), nespecifické sloučeniny a část HL uvolňujících se z půdy při dekalcinaci, volné HK a FK rozpustné v 0,1M NaOH, bez předchozí dekalcinace, HK a FK vázané na vápník a pohyblivé sesquioxidy, HK a FK pevně vázané na minerální část půdy, huminy (tj. nerozpustný nehydrolyzovatelný zbytek POH). Obr. 5 Frakcionace humusových látek podle Orlova (1985) 16

Baldock a Skjemstad (2000) rozdělují hlavní složky organické hmoty v půdě na organické zbytky, půdní biomasu, humus, půdní organickou hmotu, huminové látky a nehuminové látky, humin, huminové kyseliny, fulvokyseliny a hymatomekanové kyselin. V Tab. 2 uvádíme hlavní složky půdní organické hmoty a jejich definici podle Baldock & Skjemstad (2000). Tab. 2 Hlavní složky půdní organické hmoty podle Baldock a Skjemstad (2000) Složka organické Definice hmoty Organické Nerozložené části rostlinných a živočišných tkání a produkty jejich zbytky částečného rozkladu Půdní biomasa Humus Půdní organická hmota Huminové látky Nehuminové látky Humin Huminové kyseliny Fulvokyseliny Hymatomelanové kyseliny Organická hmota tvořená živými mikrobiálními tkáněmi Všechny organické látky v půdě, kromě nerozložených rostlinných a živočišných tkání, produktů jejich částečného rozkladu a půdní biomasy Soubor všech neživých látek nacházejících se na povrchu půdy nebo v ní Řada vysokomolekulárních hnědě nebo černě zbarvených látek, které vznikly sekundárními syntetickými reakcemi Látky patřící do známých biochemických tříd, jako aminokyseliny, uhlovodíky, tuky, vosky, pryskyřice a organické kyseliny Frakce humusu (půdní organické hmoty) nerozpustná v alkalickém roztoku Tmavě zbarvený organický materiál nerozpustný ve zředěných kyselinách Světleji zbarvený organický materiál, který zůstává v roztoku po vysrážení huminových kyselin po okyselení Část huminových kyselin rozpustná v alkoholu 17

Huminové kyseliny (HK) jsou tmavé barvy a většinou se hromadí na místě vzniku. Jsou charakteristické dobrou rozpustností v louhu a roztocích hydrolyticky zásaditých solí. Ve vodě jsou jen částečně nebo velmi slabě rozpustné. Huminové kyseliny se vyznačují vysokou sorpční schopností (Pospíšilová a Tesařová, 2009). Černozemě, černice a fluvizemě lze charakterizovat jako půdy nejvíce obohacené půdy uhlíkem huminových kyselin viz obr. 6. Huminové kyseliny jsou považovány za nejhodnotnější produkt humifikačních procesů v půdě, výrazně ovlivňují půdní vlastnosti podmiňující vysokou úrodnost. Ovlivňují zejména kationovou výměnnou kapacitu, strukturu a vysokou pufrovací schopnost půd. V nasyceném stavu jsou stálé, vysoce odolné vůči mineralizaci (Zaujec a kol. 2009). Obr. 6 Huminové kyseliny (www.google.cz) Předpokládá se, že základní strukturní složkou huminových kyselin je aromatické jádro fenolického nebo chinoidního typu, na které navazují alifatické a cyklické dusíkaté sloučeniny. Struktura huminových kyselin dosud není objasněna a existují tyto základní hypotézy: polymerní a polydisperzní makromolekuly Schnitzer a Khan (1978), Kononova (1966), Stevenson (1972); micelární koncept Wershaw (1986, 1999), von Wandruska (1997 a 1998), Suton & Sposito (2005); heterogenní supra-molekuly s relativně malou hmotností, stabilizované slabými disperzními a Van der Waalsovy sílami a vodíkovými můstky. (Piccolo, 2002 a 2005); 18

zesítěné molekuly, které mají charakter nano-částic (Tan, 1985 a 2003). Klasickou představu strukturního složení HK podle Stevensona (1982) a supramolekulu HK podle Piccolo (2002) uvádíme na obr. 7 a 8. Obr. 7 Struktura molekuly huminové kyseliny podle Stevensona (1972) Obr. 8 Supra-molekula huminové kyseliny podle Piccolo (2002) 19

Elementární složení huminových kyselin závisí na půdním typu, chemickém složení rostlinných zbytků a na podmínkách humifikace. Chemické složení huminových kyselin se převážně skládá z uhlíku asi 52 62 %, kyslíku 31 39 %, vodíku 2,8-5,8 % a dusíku 1,7-4,9 %. Huminové kyseliny obsahují více uhlíku a méně kyslíku v molekule v porovnání s fulvokyselinami viz Tab. 3. HK dále obsahují 1-10 % popelovin. Kyselinový charakter je daný přítomností kyselých funkčních skupin, ze kterých jsou nejdůležitější karboxylové (COOH) a fenol hydroxylové (OH). Při procesu zrání se řadí mezi hlavní znaky postupně se zvyšující obsah karboxylových COOH funkčních skupin a současně se snižující obsah fenolových OH funkčních skupin (Jandák, a kol., 2010). Tab. 3 Průměrné hodnoty elementárního složení a obsah funkčních skupin podle Schnitzera (1982), kde: HK huminová kyselina, FK fulvokyselina Prvek (%) HK FK C 56,2 45,7 H 4,7 5,4 N 3,2 2,1 O 35,5 41,8 S 0,8 1,8 Funkční skupiny HK FK (meq/100g) Celková kyselost 6,7 10 Karboxylová sk. 3,6 8,2 Fenolová sk. 3,9 3,1 Alkoholová sk. 2,6 6,1 Chininová sk. 2,9 2,7 Ketonová sk. 2,9 2,7 OCH sk. 0,6 0,8 Q 4/6 4,8 9,6 Fulvokyseliny jsou žluté až hnědé barvy, velmi pohyblivé a lehce se přemísťující v půdním profilu. Jsou charakteristické dobrou rozpustností ve vodě, minerálních kyselinách, louzích i v roztocích hydrolyticky zásaditých solí. Od huminové kyselin se 20

liší jednodušší stavbou makromolekuly i celkovým složením. Fulvokyseliny obsahují oproti huminovým kyselinám méně uhlíku, více kyslíku a vodíku, jak bylo uvedeno dříve viz Tab. 3. Fulvokyseliny jsou v půdním profilu velmi pohyblivé. V půdotvorném procesu se výrazně uplatňují při migraci rozkladných produktů v půdním profilu, zvláště při podzolizaci a illimerizaci (www.cojeco.cz) viz obr. 9. Fulvokyseliny by neměly tudíž ve frakčním složení humusových látek převládat. Stanovení jejich množství a poměru obsahu HK/FK se využívá jako důležitý ukazatel kvality humusu. U kvalitních humusových látek má poměr obsahu huminových kyselin a fulvokyselin (HK/FK) hodnoty větší než 1,5. Se vzrůstajícím obsahem huminových kyselin vzrůstá i kvalita humusu. Vysoce kvalitní humusové látky v půdě zabezpečují kvalitní živinný režim, strukturu, půda je odolnější vůči zhutnění i okyselení (Pokorný a Denešová, 2005, Pospíšilová a Tesařová, 2009). Obr. 9 Fulvokyseliny (cz.exportpages.com) Fulvokyseliny dle chemického složení obsahují 40 52 % uhlíku, 40 48 % kyslíku, 4 6 % vodíku a 2 6 % dusíku. Obsah popelovin je 2 8 %. Vodné roztoky fulvokyselin jsou silně kyselé (ph 2,6 2,8), ve vodě jsou dobře rozpustné. Molekulová hmotnost kolísá od 200 do 50 000. Fulvokyseliny jsou v důsledku silně kyselé reakci a dobré rozpustnosti ve vodě velmi agresivní na minerální část půdy, kterou zároveň ochuzují o živiny a koloidní látky. Kyselinový charakter fulvokyselin je dán především karboxylovými skupinami (Pospíšilová, Tesařová, 2009). Na obr. 10 uvádíme zesítěnou molekulu fulvokyseliny podle Tan (2003). 21

Obr. 10 Zesítěná molekula Fulvokyseliny podle Tan (2003) 3.4 Izolace huminových kyselin Pro izolaci čistých preparátů huminových kyselin byla vyzkoušena rozsáhlá škála extrakčních činidel od silných alkálií až po mírná organická rozpouštědla. Každé extrakční činidlo má své výhody a nevýhody, ale ideální extrakční činidlo nebylo dosud nalezeno (Schnitzer, 1982). Izolace huminových kyselin tak v podstatě představuje jejich vysrážení z tmavého alkalického extraktu zředěnou minerální kyselinou. Vysrážené HK čistíme opakovaným rozpouštěním v roztoku NaOH (Pospíšilová a Tesařová, 2009). Tímto se odstraní fyzikálně, ale ne kovalentně vázané sloučeniny (soli, kovy, lipidy, polysacharidy, mastné kyseliny atd.). Anorganické soli se odstraňují buď zředěným roztokem HCl HF, anebo elektrodialýzou proti destilované vodě, čímž se odstraní i některé koextrahované organické molekuly. Velmi složité je odstranění organických nečistot, které odstraňujeme organickými rozpouštědly jako je éter, nebo směsí alkohol-benzen. V poslední době se začínají využívat různé druhy pryskyřic (XAD-2, XAD-8), které mají slibnou perspektivu (Piccolo, 1988). Preparáty huminových kyselin se suší při velmi mírných teplotách (HK do 50 C). Vysušené a na prášek rozdrcené HK se nakonec podrobí dalším chemickým rozborům. Vyčištěné preparáty se následně uchovají vymrazováním (lyofilizací). Ideální extrakční metoda pro izolaci humusových látek z půdy by měla splňovat následující kriteria: 22

měla by vést k izolaci neznámého preparátu ze substrátu, extrahované huminové kyseliny by měly být zbaveny anorganických nečistot (jíl, polyvalentní kationty), měla by být použitelná pro všechny druhy a typy půd. 3.5 Nedegradační metody studia UV-VIS spektroskopie její podstatou je absorpce ultrafialového a viditelného záření (200 až 800 nm) zředěnými roztoky molekul. Při absorpci dochází k excitaci valenčních elektronů, které jsou součástí molekulových orbitalů. Měření zářivého toku neboli, fotometrie, je podstatou přístrojů pro optické metody. Používání názvu fotometrie, případně spektrofotometrie pro tuto konkrétní metodu je méně výstižné, ale časté, jak uvádí Klouda (2003). Spektrální čáry (barevné křivky) v UV-VIS oblasti spektra představují závislost absorbance huminových kyselin (resp. log absorbance) na vlnové délce (lambda, nm) a jejich tvar závisí na chemickém složení a kondenzaci molekuly HK (tj. na intenzitě zbarvení měřeného roztoku) viz obr. 11. Čím více klesá absorbance roztoku huminových kyselin, tím je menší polykondenzace HK, tím strmější tvar má barevná křivka, a tím vyšší jsou hodnoty barevného indexu (Q 4/6 ). Princip stanovení barevných křivek a indexů vychází z Lambert Beerova zákona o empirickém vztahu mezi intenzitou absorpce monochromatického záření po přechodu kyvetou o stanovené tloušťce, ve které se nachází měřený roztok dané, nebo zjišťované koncentrace: A = log Io /I = log 1/T = E. C. L Barevný index (Q 4/6 ) se vypočítá jako poměr absorbance humusových látek A465 nm a 665 nm (Orlov, 1985, Zaujec a kol., 2009). Z dat naměřených v UV-VIS oblasti spektra můžeme určit zralost humusových látek podle Kumady (1987). Kumada zavedl koeficient log K, který vypočítáme z rozdílu logaritmických hodnot absorbance při 400 nm (E 1% 4) a při 600 nm (E 1% 6). Podle hodnot koeficientu log K můžeme rozdělit HK na typy: A, B a Rp podle zralosti. Nejkvalitnější je skupina A a nejméně kvalitní je skupiny Rp. 23

Obr. 11 UV-VIS spektra humusových látek (Pospíšilová a Fasurová, 2009) Infračervená spektrometrie představuje měření absorpce elektromagnetického záření HL v oblasti 12 500 100cm -1, což vyvolává změny rotačně-vibračních energetických stavů molekul (Jandera, 2011). Infračervená (IČ) spektra se podstatně liší od UV-VIS spekter. Principem IČ spektroskopie je absorpce infračerveného záření molekulami látek, které má větší vlnovou délku a nižší energii než záření ultrafialové a viditelné (Pospíšilová a Tesařová, 2009). Infračervené spektrum je pásové a pásy ve spektru odpovídají různým typům vibračních přechodů. Nejdůležitější oblast pro infračervenou spektrometrii je 4000 670 cm 1. Pro HK v této oblasti je charakteristické značné množství absorpčních pásů, které přísluší různým funkčním skupinám: =CH-, - CH 2, -CH 3, -CH, -COOH, -C=C-, -NH 2, -C=N- apod. (Kalous, 1987). Ke stanovení infračervených spekter je nutné izolovat čisté preparáty huminových kyselin, fuklvokyselin, resp. jejich solí humátů a fulvátů). Příklad pásového infračerveného spektra organických látek uvádíme na obr. 12. Obr. 12 Pásové infračervené spektrum organických látek (www.en.wikipedia.org) 24

Nukleární magnetická rezonance (NMR) slouží k identifikaci a strukturní analýze organických látek, studiu vodíkových vazeb, studiu chemických dějů a rovnováh v organické chemii. Výška signálů roste s koncentrací, proto nachází NMR využití i v kvantitativní analýze ke stanovení obsahu a čistoty látky ve vzorku. S využitím NMR je možné kvantitativně analyzovat směs, která obsahuje známé sloučeniny (Klouda, 2003). Atomová jádra některých prvků mají magnetický moment a ve vnějším magnetickém poli se orientují do poloh, kterým odpovídají určité energetické hladiny. Absorpcí elektromagnetického záření v oblasti krátkých rádiových vln dochází k přechodu jádra na vyšší energetické hladiny (Klouda, 2003). Ze spektrálních metod je prozatím metoda NMR nejpřesnější pro identifikaci huminových kyselin viz obr. 13. Jednou z hlavních charakteristik, které se dají vyčíst z 13C-NMR spektra, je procento aromaticity, které vyjadřuje poměr procentického zastoupení uhlíku v alifatických a aromatických strukturách (Russell et al., 1983; Hayes, 1985, 2001; Barančíková, 1997; Pospíšilová, Tesařová, 2009). Obr. 13 13 C NMR spektra půdních HK, kde: HA1= HK z černozemě karbonátové, HA5= HK z černice glejové, HA6= HK z kambizemě oglejené (Barančiková et al., 1997) 25

Atomová absorpční spektrometrie (AAS) - je jednou z nejrozšířenějších analytických metod. Jejím principem je absorpce záření volnými atomy v plynném stavu. Volné atomy absorbují fotony určité energie, záření o určité vlnové délce viz obr. 14. Energetická hodnota fotonů je charakteristická pro určitý druh atomů a počet absorbovaných fotonů je mírou množství stanovovaných atomů. Metoda umožňuje stanovení více než 60 prvků, kovových prvků a metaloidů jak uvádí Komárek (2000). Obr. 14 Atomový absorpční spektrometr (www.google.cz) Plamenová emisní fotometrie je metoda určená ke kvantitativnímu stanovení látek na základě fotometrického měření intenzity zbarvení plamene. Příklad plamenového fotometru viz obr. 15. Při této metodě se do bezbarvého plamene vhání roztok ve formě jemné mlhy, přičemž vznikající záření je rozkládáno disperzním systémem a fotometrují se spektrální čáry, charakteristické pro určité prvky (Kalous, 1975). Obr. 15 Plamenový fotometr (www.google.cz) 26

3.6 Fluorescenční spektrofotometrie Patří k nedegradačním technikám studia kvality humusových látek. Je schopna detekovat nízké koncentrace fluoroforních látek. Molekulová fluorescenční spektrometrie spadá do okruhu luminiscenční spektrometrie, spolu s molekulovou fosforescenční spektrometrií a chemiluminiscenční spektrometrií. Luminiscence je emise světla látkou, jež může nastat při návratu elektronu z excitovaného stavu na stav základní (Mlčoch, 2008). Typy luminiscencí: Bioluminescence Chemiluminescence Krystalluminescence Elektroluminescence Mechanoluminescence Fotoluminescence Radioluminescence Sonoluminescence Termoluminescence Při ozařování některých látek ultrafialovým zářením vzniká viditelné trvání dosvitu a to na fluorescenci (10-9 10-6 s) a na fosforescenci (10-6 10 2 s), jak uvádí Jandera (2011). Toto záření s delší vlnovou délkou označujeme jako luminiscenci. Luminiscenční spektroskopie se využívá pro fotoluminiscenci, je to sekundární záření, které molekuly látky vyzařují po absorpci primárního elektromagnetického záření z ultrafialové nebo viditelné oblasti. Molekuly na vysoké vibrační hladině ztrácí při kolizích s okolními molekulami rychle energii a přechází na nejnižší vibrační hladinu. Jestliže nastane přechod na základní elektronovou hladinu ze singletového excitovaného stavu při současném vyzáření nadbytečné energie formou emise fotonu, pak hovoříme o fluorescenci (Mlčoch, 2008). 27

Hlavní znaky fluorescence jsou: Intezita počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času. Spektrální složení spektrální hustota fotonového toku na jednotkový interval vlnových délek nebo frekvencí. Polarizace směr kmitání elektrického vektoru elektromagnetické vlny Doba dohasínání je dána nitřní dobou života excitovaného stavu, z něhož dochází k emisi. Úzce také souvisí s pochody vedoucími k nezářivé deaktivaci tohoto stavu. Koherenční vlastnosti vztahy mezi fázemi světelných vln. Jak již bylo řečeno výše, některé látky jsou schopny po absorpci ultrafialového či viditelného záření přechodu z nulové vibrační hladiny excitovaného (primárního, budícího) singletového stavu do různých vibračních hladin základního stavu (Jandera, 2011). Významná je fluorescence kovových komplexů organických látek, tzv. chelátů. Vznik chelátů vede ke zpevnění molekuly a ke zmenšení molekulových vibrací. Huminové kyseliny mají intenzivní fluorescenci ve velmi širokém rozsahu vlnových délek. Princip měření spočívá v excitaci molekul intenzivním excitačním zářením a v měření poměrně slabého fluorescenčního záření dopadajícího kolmo na směr vstupujícího excitačního záření. Přístroje na měření fluorescence se nazývají fluorimetry, resp. Spektrofluorimetry (Mlčoch, 2008, Pospíšilová, Tesařová, 2009). Intenzita fluorescence obecně klesá se stoupající teplotou. Přitom sama fluorescence (emise) příliš na teplotě nezávisí. Fluorescenci většinou zhášejí látky (i rozpouštědla), které obsahují karbonylové skupiny. Nejčastěji se jako zhášedlo projevuje kyslík přítomný v roztocích při měření (Jandera, 2011). Podle Sierra et al.(2005) rozlišujeme fluorescenční spektra: Synchronní Emisní scan spektra Excitační scan spektra Exitračně emsiní matrix (EEM) = 3D exitačně emisní scan spektra 28

Fluorescenci humusových látek různého původu studovali Senesi et al. (1991) a klasifikovali 5 základních tříd podle hodnoty relativního indexu fluorescence (RFI) jak je uvedeno níže: 1. Paleosols Maximální emise při > 520 nm Maximální excitace při > 456 nm RFI <1 2. Humaty, Histosols, lignitické HK, Mollisols HK Maximální emise při 500 520 nm Maximální excitace při 450 456 nm RFI =2 8 3. Terrae Rossa Maximální emise při 460 500 nm Maximální excitace 440 450 nm RFI = 6 29 4. FK, HK z kompostu, humáty z kompostu Maximum emision peaks at 440 470 nm Maximální excitace při 385 395 nm RFI > 10 5. HL v odpadních kalech a ve vodě Maximální emise při < 440 nm Maximální e xcitace při 390 and at 340 nm RFI = 4 13 29

3.6.1 Synchronní fluorescenční spektra Huminové kyseliny mají intenzivní fluorescenci v širokém rozsahu vlnových délek a fluorescenční píky souhlasí s jejich stupněm disociace. Synchronní metoda je založena na současném běhu obou monochromátorů, přičemž je nastaven konstantní rozdíl vlnových délek mezi excitačním a emisním monochromátorem. V případě synchronního spektra můžeme pozorovat všechny excitace a odpovídající emise u směsí látek, podle volby nastavení. Spektra obsahují více ostřejších píků získáme tak kompletnější spektrum vzorku. U synchronního spektra je výhodou, že nedochází k překrývání jednotlivých emisí složek oproti běžnému emisnímu měření fluorescence a dochází k většímu rozlišení spektrálních píků (Konečná, 2009). Tato metoda byla použita v bakalářské práci a bude podrobně popsána v kapitole Metody měření. 3.6.2 Časově rozlišená fluorimetrie Zavedení laseru jako excitačního zdroje umožnilo měřit dobu trvání fluorescence. Excituje se velmi krátkým pulsem, načež se sleduje pokles emisního toku ne l/e počáteční hodnoty. Při fázové metodě je vzorek excitován sinusově modulovaným zářením. Časové rozlišení přináší další informace, které např. umožňují rozlišit dvě látky s blízkými emisními píky. Laserová fluorimetrie je součástí pikosekundové spektroskopie, která dává možnost sledovat primární molekulové procesy např. při fotosyntéze nebo při procesech v polovodičích (Kalous, 1975). 3.6.3 Rentgenová fluorescenční analýza Rentgenová fluorescenční analýza (X-Ray Fluorescence Spectrometry) je v praxi nejrozšířenější metodou atomové spektroskopie subvalenčních elektronů (Černohorský a Jandera, 1997). Metoda zaměřená na sledování sekundárního rentgenového záření se nazývá rentgenová fluorescenční spektrometrie. Zdrojem rentgenového záření je rentgenová lampa rentgenka. Primární rentgenové záření dopadá na vzorek a budí sekundární fluorescenční rentgenové záření. Aplikují se hlavně tuhé vzorky, k jejichž 30

přípravě se využívá různých technik jako například broušení, leštění a jiné (Klouda, 2003). Sekundární záření vstupuje do monochromátoru. Jako disperzní prvek je používán krystal vhodné látky. V monochromatizaci rentgenového záření využíváme jevu difrakce, kterým rozumíme interferenci na krystalu rozptýleného záření. Rentgenové záření se odráží na krystalových rovinách v různých úrovních, některý paprsek hned na povrchu, jiný na vnitřní rovině. Odražené paprsky se setkávají a interferují spolu (Klouda, 2003). V případě vlastních rentgenfluorescenčních spektrometrů rozlišujeme dva zásadně odlišné přístupy k analýze. Přístroje vlnovédisperzní a přístroje energiově disperzní, kde funkci monochromátoru přebírá vlastní detektor (Černohorský a Jandera, 1997). 3.6.4 Energiově-disperzní spektrofluorimetry V případě energiově-disperzního spektrofluorimetru (EDXRF) přebírá funkci monochromátoru přímo detektor. Do detektoru dopadají fotony vybuzeného charakteristického záření současně a k jejich rozlišení se využívá proporcionálních vlastností detektorů. Důležitá je dobrá rozlišovací schopnost detektoru, a proto se nejčastěji používá Si (Li) detektor, který má zároveň velmi rychlý sběr náboje (25 100 ns). Detektor produkuje napěťové impulsy, jejichž velikost je úměrná energii dopadajících fotonů. Ty jsou zesíleny v předzesilovači a dále jsou zpracovány multikanálovým analyzátorem (MCA), který třídí původní polychromatické impulsové spektrum do jednotlivých kanálů podle jejich velikosti. V průběhu zpracování nábojového impulsu elektronikou spektrometru vzniká určitá časová ztráta, takže při vysoké hustotě dopadajících fotonů je měření přerušováno, vzniká tak mrtvý čas, který je spektrometrem automaticky korigován. V jednotlivých kanálech je zaznamenávána četnost impulsů. Vynesením četnosti impulsů v závislosti na jednotlivých kanálech pak dostáváme energetické spektrum. Poloha kanálu definuje energii fotonu (vlnovou délku) a četnost impulsů intenzitu záření o příslušné energii. Máme tak k dispozici vždy kompletní rentgenfluorescenční spektrum, což je základní výhoda energiově-disperzních přístrojů. (Černohorský, Jandera, 1997). 31

Obr. 16 Schéma energiově-disperzního spektrofluorimetru (Zdroj: Černohorský a Jandera, 1997) Vliv matrice vzorku u rentenfluorescenční analýzy je možné podle Černohorského a Jandery (1997) rozdělit na dvě kategorie: vlivy fyzikálního stavu látky (skupenství, granulometrie apod.), vlivy chemického složení matrice RFA není závislá na složení matrice vzorku, což výražně limituje možnosti použití této techniky. Naměřené energiově-disperzní spektrum obsahuje charakteristické záření prvků přítomných ve vzorku. Kvalitativní složení vzorku se určí na základě identifikace charakteristických linií, což je u moderních spektrometrů řešeno již softwarem spektrometru. Podle Černohorského a Jandery (1997) lze analyzovat vzorky ve všech skupenstvích: pevné vzorky práškový materiál kapalné vzorky vzdušní aerosoly Analýza pevných vzorků: při menších nárocích na přesnost analýzy je možné analyzovat neupravené vzorky. Pro přesnou analýzu musí být povrch pevných vzorků dokonale vybroušen. Analýza práškových materiálů: přímá analýza sypaných práškových materiálů nedává přesné výsledky, zejména při analýze lehčích prvků, proto se pro přesnou analýzu 32

práškové materiály melou na jednotné zrno menší než 40 m a lisují se do tablet. Druhou možností je použití tavení do boraxových perel. Výhodou tavení je dokonalá homogenita vzorku s kvalitním povrchem a možnost použití metody vnitřního standardu nebo standardního přídavku. Nevýhodou je naředění vzorku tavidlem, čímž dochází ke zhoršení detekčních limitů. Analýza kapalných vzorků: analýza je bezproblémová a je efektivní zejména pro analýzu těžko rozložitelných organických kapalin (analýza olejů). Není příliš vhodná pro analýzu lehkých prvků, protože dochází ke značným ztrátám záření v okénku kyvety. Analýza vzdušných aerosolů: analýza vzdušných aerosolů se provádí odběrem vzdušného aerosolu na vhodný typ filtru, který je následně měřen přímo ve spektrometru. Analýza je velmi rychlá a odpadají problémy s rozkladem vzorků. Energiově-disperzní systémy s buzením rentgenkou jsou universální přístroje, kdy již v průběhu analýzy můžeme sledovat kompletní složení vzorku. Analýzy stopových obsahů vyžadují delší kumulaci spektra (až tisíce sekund), metoda tak není vhodná pro velmi rychlé analýzy. Metoda také není vhodná pro analýzu velmi lehkých prvků, pro lehké prvky má horší detekční limity. Rozsah použití se zvyšuje s použitím nových systémů s detekčními limity srovnatelnými s vlnově disperzními přístroji. Hlavní aplikace jsou v oblasti analýzy životního prostředí, ve vývoji a výzkumu (Černohorský a Jandera, 1997). Obr. 17 RFA spektrum kontaminované půdy při buzení radionuklidem (kde: Cd 109, ----- kontaminovaná půda,.. čistá půda, Zdroj: Černohorský a Jandera, 1997) 33

4 MATERIÁL A METODY 4.1 Objekt studia Objektem studia byly následující subtypy černozemí: Černozem modální (Bořetice) Černozem arenická (Březí) Černozem lužní (Dubany) Černozem luvická (Kašenec) Černozem modální (Hrušovany) Černozem modální (Ostrožská Lhota) Černozem luvická (Praha-Ruzyně) Černozem modální (Syrovice) Černozem luvická (Unčovice) Černozem modální (Želeč) Standard půdní HL Elliott (1S 102 H) Podrobný popis lokalit a profilů je uveden v příloze. 34

4.2 Metody 4.2.1 Celkový obsah organického uhlíku Celkový obsah organického uhlíku (C org ) byl stanoven oxidimetrickou titrací podle Walkley Blacka v modifikaci Novák Pelíška. Princip stanovení spočívá v tom, že organický uhlík humusových látek se zoxiduje chromsírovou směsí při zvýšené teplotě (120 o C) a oxidačně redukční titrací Mohrovou solí se stanoví nezreagovaný zbytek chromsírové směsi. Podrobný postup uvádějí, Zbíral (1997), Pospíšilová a Tesařová (2009). Podrobný postup stanovení uvádí Pospíšilová a Tesařová (2009). 4.2.2 Frakční složení humusových látek Frakční složení humusových látek metoda stanovuje množství C HL, C HK, C FK, poměru HK/FK a stupně humifikace. Byla použita metoda krátké frakcionace podle Kononové a Bělčikové (1963). Podrobný postup uvádí Podlešáková a kol. (1992) a Pospíšilová a Tesařová (2009). Princip frakcionace probíhá dekalcinaci půdy a poté v rozrušování stabilních sloučenin humátů vápenatých, hořečnatých (resp. železitých) pufrovaným roztokem pyrofosforečnanu sodného. Dochází poté k tvorbě nerozpustných sloučenin pyrofosfátů Ca, Mg, Al, Fe a k uvolnění rozpustných humátů sodných, které jsou extrahovány ze vzorku. Určí se tak veškeré humusové látky (tj. suma HL volných a HL vázaných v půdě ve formě humátů dvojmocných bází a nesilikátových forem železa a hliníku). Vhodným postupem (srážením a odstřeďováním) byly humusové látky rozděleny na huminové kyseliny a fulvokyseliny. Podrobný postup stanovení uvádí Pospíšilová a Tesařová (2009). Hlavním výsledkem frakcionace humusových látek bylo zjištění poměru HK/FK a stupně humifikace. Stupeň humifikace (Sh) se uvádí v procentech a vypočítali jsme ho podle Orlova (In: Sotáková, 1982) z následujícího vztahu: Sh (%) = 100 * C HK / C org 35

4.2.3 Izolace půdních HK Jak bylo uvedeno dříve, metoda krátké frakcionace není vhodná pro studium změn ve složení a struktuře huminových kyselin, fulvokyselin a humátů. Zde je potřeba provést izolaci čistých preparátů huminových kyselin, fulvokyselin a humátů. Preparativní izolace je doplněna stanovením elementárního složení, chemických a optických vlastností humínových kyselin a humátů. Využili jsme standardní mezinárodní metodu IHSS (Hayes, 1985, Piccolo, 1988), která je podrobně popsána v kapitole Metody identifikace HL. Touto metodou se izolují tři základní frakce, tj. huminové kyseliny, fulvokyseliny a huminy. Při izolaci HK jsme postupovali následovně: 100 g na vzduchu vyschlé zeminy prosejeme přes síto 1mm, propláchneme 10 % HCl a mícháme 1 2 hod (dekalcinace). Až je reakce na CO 2 negativní (neuvolňuje se CO 2 ) propláchneme vzorku 0,05 M HCl. Až je reakce na přítomnost Ca 2+ negativní (indikátor šťavelan amonný) propláchneme vzorku destilovanou vodou. Destilovanou vodou proplachujeme do té doby až je reakce na Cl - negativní (indikátor AgNO 3 ). Poté vzorku zalijeme 0,1 M NaOH a necháme extrahovat 7 8 hod. Vzorku 2x odstředíme 15 minut při otáčkách 5000 rpm. Tmavý roztok humusových látek srážíme koncentrovanou HCl na ph = 1. Koagulát HK se opakovaně dekantuje a intensivně pročistí směsí 0,5 % HCl+HF. Vzorky se dočistí dialýzou a lyofilizují se (Pospíšilová a Tesařová, 2009, Pospíšilová et al., 2010). Elementární analýza HK byla provedena na Ústavu struktury a mechaniky hornin AVČR (Praha) a byly použity standardní metody a Carlo Erba elementární CHNS/O analyzátor Thermo Finnigan. Byly použity standardní postupy Carlo Erba s platnou kalibrací. 36

4.2.4 Fluorescenční spektra HK Fluorescenční spektra při ozařování zářením určité vlnové délky vydávají některé látky záření větších vlnových délek, tzv. záření fluorescenční (Kalous, 1975). Fluorescenční spektra rozlišujeme na emisní, excitační a synchronní. V našem případě měření byla provedena na spektrofluorimetru Aminco Browman, Serie 2, Thermospectronics, Xe-lampa, štěrbiny obou monochromátorů byly nastaveny na 4 nm, při laboratorní teplotě. Při měření vzorků byla použita skleněná kyveta Suprasil s průměrem 1 cm. Všechna spektra byla korigována, aby se zabránilo nežádoucí svítivosti excitačního zdroje při záření odlišných vlnových délek. Měření probíhala za stejného napětí 940 V. Naměřené hodnoty se srovnávaly s nejkoncentrovanějším vzorkem. Byla stanovena 2D scan mode a 3D scan mode spektra. Při měření synchronní fluorescenci byly hodnoty v rozmezí od 320 do 620 nm s rychlost měření 60 nm/1 min. Konstantní rozdíl mezi monochromátory byl 20 nm. Fluorescenční záření bylo měřeno ve směru kolmém tzn. pod úhlem 90 mezi emisním a excitačním spektrem. Metoda poskytuje vysoké rozlišení spektrálních píků. Relativní indexy fluorescence naměřených spekter byly vypočítány jako poměry, kde hlavní píky mají hodnoty 488/502 nm a 360/488 nm. Výsledky byly porovnány se standardem půdní HK od firmy Fluka Elliott Soil Humic Acids Standard (1S 102 H). Měření fluorescenčních spekter HK byla provedena na VUT v Brně (Mgr. N. Fasurová, Ph.D.). Fluorescenční indexy byly korelovány s hodnotami parametrů stanovených jinými spektrálními metodami (UV- VIS, IČ a 13 C NMR spektroskopie). Korelace byly provedeny pomocí jedno-faktorové korelační analýzy a výpočty stupně humifikace pro HL černozemí byly provedeny podle následující rovnice: Sh* (%) = (0,83 - F)/0,02 37

Jak bylo již uvedeno, princip měření ve fluorimetrii záleží v excitaci molekul intenzivním excitačním zářením a v měření poměrně slabého fluorescenčního záření kolmo na směr vystupujícího excitačního záření. Přístroje pro měření fluorescence se nazývají fluorimetry (v literatuře se setkáváme i s označením fluorometry). Jednodušší typ, který pro analytické účely plně vyhovuje, je jedno-paprskový fluorimetr s filtry. Excitační neboli primární filtr izoluje ze záření xenonové nebo rtuťové výbojky excitační linii, která odpovídá vlnovou délkou maximu na excitačním spektru. Sekundární (emisní) filtr propouští pouze sledované fluorescenční záření. Protože fluorescenční záření je málo intenzivní, používá se jako detektor fotoelektrický násobič. Při náročnějších úkolech se uplatňují spektrofluorimetry. Místo filtrů mají excitační a emisní monochromátor. Při měření excitačního spektra se emisní monochromátor nastaví na vlnovou délku maxima fluorescenční emise a spojitě se mění excitační záření. Když se naopak nastaví excitační monochromátor na stálou vlnovou délku odpovídající vlnové délce excitačního (absorpčního) maxima a analyzuje se fluorescenční záření podle vlnových délek, získá se emisní spektrum. Při vlastním měření se vybere vlnová délka maxima na emisním spektru (Kalous, 1975). Obr. 18 Schéma spektrofluorimetru Aminco-Bowman (Kalous, 1975) 1 xenonová výbojka, 2 zrcadla, 3 mřížky, 4 kyveta s rozkem, 5 fotoelektrický násobič 38

5 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ 5.1 Základní fyzikální a chemické charakteristiky černozemí Vybrané subtypy černozemí byly analyzovány na stanovení základních fyzikálních a chemických parametrů. Ke zjištění zrnitostního složení byla použita pipetovací metoda a výsledky uvádíme v Tab. 5. Podrobně ho hodnotíme níže. Z chemických vlastností byla stanovena půdní reakce (ph/h 2 O, ph/kcl) potenciometricky, kationtová výměnná kapacita podle Mehlicha, množství karbonátů Jankovým vápnoměrem a zasolení půdy potenciometrickou metodou. Výsledky jsou uvedeny v Tab. 5 a hodnotíme je níže. Půdní typ černozem modální (lokalita Bořetice) zrnitostní složení ukázalo 38 % jílnatých částic, což značí půdní druh střední - hlinitý. U půdního typu jsme naměřili slabě alkalickou aktivní půdní reakci ( ph/h 2 O = 7,8). Výměnná půdní reakce je alkalická s hodnotou 7,4. Kationtová výměnná kapacita byla 28,95 mmol/100g, tedy vysoká. Půda byla nezasolená 0,08 ms/cm, dopady salinity jsou zanedbatelné. Obsah karbonátů v půdním vzorku byl 0,40 %, což značí slabě vápenitá půda. Obsah organického uhlíku byl 1,84 %, tj. odpovídá 3,2 % humusu, jedná se o vysoký obsah humusu. Veškeré HL tvořily 0,72 % z toho HK 0,41 % a FK 0,31 %. Poměr HK/FK vychází 1,3 což odpovídá fulvátně-humátnímu typu humusu. Stupeň humifikace tvoří 22,3 %, půdní typ se střední humifikaci viz Tab. 5 a 6. Půdní typ černozem arenická (lokalita Březí) obsah jílnatých částic v půdním preparátu ukázala 14,92 %, vypovídá o lehkém půdní druh hlinitopísčitém. U půdního typu jsme naměřili slabě alkalickou aktivní půdní reakci ( ph/h 2 O = 8). Výměnná půdní reakce je neutrální s hodnotou 7,2. KVK byla 5,4 mmol/100g, odpovídá velmi nízké hodnotě. Půda byla nezasolená 0,07 ms/cm, dopady salinity jsou zanedbatelné. Obsah karbonátů v půdním vzorku byl 0,40 %, tj. zemina slabě vápenitá. Corg byl 1,51 %, odpovídá 3,4 % s vysoký obsahem humusu. Celkové množství HL tvořilo 0,40 % z toho HK 0,20 % a FK 0,20 %. Poměr HK/FK se rovná 1, je na rozhraní mezi typem humusu fulvátně-humátní a humátně-fulvátní. Stupeň humifikace 14,5 %, je považovaná za půdní typ s nízkou humifikaci viz Tab. 5 a 6. 39