Příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie. Miroslav Průcha

Transkript

1 Příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie Miroslav Průcha

2 Příklady optických technik Atomová absorpční spektrofotometrie Absorpční spektrofotometrie Absorpční spektrofotometrie kinetická Denzitometrie Fluorimetrie Luminometrie Nefelometrie Nefelometrie laserová Polarimetrie Refraktometrie Spektrofotometrie reflexní Spektrofotometrie infračervená Spektroskopie Turbidimetrie UV spektrometrie

3 Optické metody Rozptyl světla je soubor jevů, které způsobují, že disperzní soustava se při průchodu světla jeví zakalená. Při průchodu světla soustavou s disperzními částicemi se světelné paprsky mohou: od částic odrážet, mohou částicemi procházet, přičemž index lomu částic je téměř vždy odlišný od indexu lomu disperzního prostředí, takže paprsek mění směr, vyvolat oscilaci částice (pokud je částice dostatečně malá tj. je li průměr částice r< 0,1 l), takže částice sama se stane zdrojem záření o stejné vlnové délce.

4 Nefelometrie a turbidimetrie Reakce založené na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem. Koncentrace příslušného antigenu je úměrná rychlosti tvorby nebo hustotě zákalu.

5 Turbidimetrie a nefelometrie principy metod V důsledku reakce mezi antigenem a protilátkou dochází k precipitaci a vznikají tři zóny zóna nadbytku protilátky, zóna ekvivalence a zóna nadbytku protilátky Precipitační křivka - oblast využitelná pro měření, bezpečnostní oblast, oblast za kritickým bodem Kritický bod nejvyšší koncentrace antigenu, který může analyzovaný vzorek obsahovat a nedojde přitom k naměření falešně nízkých koncentrací Reakce probíhají v tekutém prostředí, v měřící kyvetě (pufr, enhancující látka, antigen a protilátka. Nefelometrie zdroje světla výbojka nebo laser (670 nm) Turbidimetrie zdroj světla dioda

6 Turbidimetrie a nefelometrie

7 Nefelometrie

8 Turbidimetrie a nefelometrie Systém end point po smíchání antigenu a protilátky proběhne měření po dosažení rovnovážného stavu, možnost falešně negativní (nízká) koncentrace antigenu Proto nastavení systému tak, aby měření probíhala v oblasti lineární části křivky Systém kinetický - reakce je rychlejší, měří se přírůstek vzniku precipitátu v pravidelných časových intervalech, po dosažení rovnovážného stavu (desítky vteřin) se měření ukončuje. Výhoda možnost vyhodnocování atypických koncentrací měřené látky

9 Turbidimetrie Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném poměru s odpovídající protilátkou, vytvoří se precipitát. Kvantitativně byla tato reakce popsána již v r Heidelbergem a Kendallem po průchodu světelného paprsku suspensí imunitních komplexů dochází k poklesu jeho intensity v důsledku rozptylu, absorpce a odrazu. Pokles intensity paprsku je úměrný množství imunitních komplexů vroztoku. Při konstantní vysoké koncentraci specifických protilátek, je množství vytvořených imunitních komplexů (turbidita analyzovaného vzorku tělní tekutiny) přímo úměrné koncentraci analytu.

10 Turbidimetrie Optická metoda spočívající na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích (zákalu) Stupeň zákalu turbidita Precipitační reakce mezi antigenem(ag) a protilátkou (Ab) Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci Sleduje se pokles intenzity záření procházejícího absorbující a rozptylující vrstvou. Nutno získat reakční směs dostatečně stálou (ochranný polymér polyetylenglykol) Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce, proto je vhodné měřit při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem (340 nm v blízké UV oblasti

11 Turbidimetrie Průchod záření nehomogenním prostředím způsobí absorpci záření, která se měří absorpčními fotometry a spektrofotometry. Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce, proto se specifické proteiny stanovují při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem tj. při 340 nm. Největší citlivost turbidimetrických metod se dosahuje modrým světlem ( nm)

12 Turbidimetrie Turbiditu lze měřit na jakémkoli fotometru nebo spektrofotometru, pokud je suspenze bezbarvá Ruší hemolýza Vztah mezi absorbancí a koncentrací částic je pro malé částice lineární, tato lineární závislost se může měnit na nelineárné se změnou vlnové délky I t = I 0. Exp (- ( Lז (I intenzita prošlého záření, I 0 intenzita světelného zdroje, ז turbiditní koeficient, L světelná dráha kyvetou Reprodukovatelnost 5%

13 Nefelometrie k měření se využívá světelného toku rozptýleného disperzní soustavou Optická metoda měření intenzity difuzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích Rozptýlené (Tyndallovo) světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření Světelný zdroj helium neonového nebo argonového laseru

14 Nefelometrie Je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu Úhel rozptylu je dán velikostí částic a vlnovou délkou dopadajícího světla Měření kinetické, měření rychlosti změny rozptylu světla, která je přímo úměrná rychlosti vzniku IK Ag-Ab Srovnatelná citlivost s turbidimetrií

15 Praktické aplikace IgA,G,M, podtřídy, volné řetězce kappa, lambda, reaktanty akutní fáze (CRP, haptoglobin, orosomukoid, ceruloplasmin, alfa 1 antitrypsin, alfa 2 makroglobulin) Léky Finanční nákladnost Příklady analyzátorů Beckman, Olympus