Analýza kvalitativních ukazatelů hřebčího spermatu Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Analýza kvalitativních ukazatelů hřebčího spermatu Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vypracoval: Simona Jakubčíková Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Kvalitativní analýza hřebčího spermatu vypracovala samostatně a používala jsem pouze prameny, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu použité literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF Mendelovi Univerzity v Brně. Dne: Podpis:

PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla poděkovat svému vedoucímu práce prof. Ing. Ladislavu Máchalovi, DrSc. za odborné vedení, cenné rady a pomoc při vypracování bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Šárce Hanulákové za částečné vedení a připomínky při zpracování bakalářské práce. Děkuji také panu Ing. Ondřeji Mamicovi za umožnění návštěvy hřebčince v Tlumačově, za ochotu odborně odpovídat na mé dotazy a budoucí spolupráci na diplomové práci.

ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá popisem pohlavních orgánů hřebce, vlastnostmi a složením ejakulátu, způsoby jeho odběru a vyšetřovacích metod používaných k analýze kvalitativních ukazatelů semene. Dále se práce zabývá problematikou morfologické stavby spermie a dopady případných abnormalit v morfologii spermií na plodnost hřebců. V kapitole metodika a materiál je charakterizována skupina hřebců, jejichž sperma bude hodnoceno v navazující diplomové práci. Jedná se o kolekci plemenných hřebců Zemského hřebčince v Tlumačově. V metodice je popsán postup při veškeré manipulaci s ejakulátem, počínaje odběrem semene, až po konečné vyšetření a expedici dávek majitelům chovných klisen. V navazující diplomové práci budou zpracovány výsledky a závěry systematického vyšetřování jednotlivých vzorků ejakulátu pomocí vyšetřovacích metod se zaměřením na patologické stavy v morfologii spermií. Klíčová slova: pohlavní orgány hřebce, ejakulát, analýza semene, morfologie spermií ABSTRACT This bachelor thesis deals with description of male reproductive organs, characteristics and composition of ejaculate, methods of collecting semen and examination methods used to analyze qualitative indicators of ejaculate. By the way the thesis deals with morphological sperm structure and abnormalities in sperm morphology and effects of possible abnormalities on fertility of stallions. In chapter methodology and materials is characterized a group of stallions whoose sperm will be evaluated in folow thesis. It is a collection of stallions on stud farm in Tlumačov. Methodology is describes all procedures with semen. Starting with semen collection to final examinations and shipping doses to owners of breedeing mares. In the diploma thesis will be describe the results and conclusions of a systematic investigation various samples using methods of examination with a focus on the pathological conditions in the morphology of stallion sperm. Key words: sex organs of stallion, ejaculate, sperm analysis, sperm morphology

OBSAH 1 ÚVOD... 6 2 CÍL PRÁCE... 7 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 8 3.1 Pohlavní orgány samců... 8 3.1.1 Varle... 8 3.1.2 Šourek... 8 3.1.3 Vývodné pohlavní cesty... 9 Nadvarlata... 9 Chámovody... 9 3.1.4 Přídatné pohlavní žlázy... 10 Semenné váčky... 10 Předstojná žláza... 10 Bulbouretrální žlázy... 10 3.1.5 Pyj...11 3.1.6 Předkožka...11 3.2 Ejakulát... 12 3.2.1 Kvalitativní vlastnosti ejakulátu... 12 3.2.1.1 Objem ejakulátu... 12 3.2.1.2 Barva a pach ejakulátu... 13 3.2.1.3 ph ejakulátu... 13 3.2.1.4 Koncentrace spermií v ejakulátu... 13 3.2.1.5 Pohyb spermií... 14 3.2.1.6 Obsah mikroorganysmů v ejakulátu... 14 3.2.2 Semenná plazma... 14 3.2.3 Spermie a její morfologická stavba... 15 3.2.3.1 Stavba spermie... 15 3.2.3.2 Vývojový cyklus spermie... 18 3.2.3.3 Zrání spermií... 20 3.3 Manipulace s ejakulátem... 21 3.3.1 Odběr ejakulátu... 21 3.3.2 Analýza hřebčího spermatu... 22 3.3.2.1 Makroskopické vyšetření hřebčího ejakulátu... 23 3.3.2.2 Mikroskopické vyšetření hřebčího ejakulátu... 24 3.4 Morfologické vady spermií... 31 3.4.1 Morfologické vady hlavičky spermie... 32 3.4.2 Morfologické vady bičíku... 36 3.4.3 Vliv morfologických poruch na plodnost... 39 4 MATERIÁL A METODIKA... 41 4.1 Materiál... 41 4.2 Metodika... 41 4.2.1 Barvení dle B. T. Farellyho... 42 4.2.2 Barvení Wels X... 42 5 ZÁVĚR... 44 6 LITERATURA... 45

1 ÚVOD V nedávné době si chovatelé vybírali plemenné hřebce především na základě jejich sportovní výkonnosti. Kvalita plemenného hřebce, ale nespočívá pouze v jeho sportovní výkonnosti a exteriéru. Podstatnou část jeho plemenné hodnoty tvoří kvalitní reprodukční schopnosti, které stanovují hranice pro využitelnost plemenářsky i sportovně špičkového plemeníka. Kvalita reprodukčních schopností spočívá v dostatečné produkci kvalitního genetického materiálu v podobě semene. O genofond špičkových hřebců je velký zájem, proto je snahou aby tito plemeníci byli v reprodukci co nejvíce využíváni. Maximalizace využití plemeníků s sebou přináší nutnost pravidelných kontrol kvalitativních ukazatelů odebíraného spermatu. Ne každý odebraný ejakulát je vhodný k připuštění klisny. Tento fakt ještě podtrhává značné využívání biotechnologické metody jakou je umělá inseminace. Se zavedením umělé inseminace nedošlo pouze k plnohodnotnému využití kvalitních plemenných hřebců, ale byly zavededny pravidelné kontroly kvality jednotlivých dávek ejakulátů, a to prostřednictvím pravidelných analýz vlastností semene. Jsou to vyšetření sloužící k vyjádření vlivu různých činitelů na pohlavní aktivitu plemeníka a jakost jeho spermatu. Toto vyšetření se nazývá spermatoanalýza a v dnešní době je neoddělitelně spojeno s procesem reprodukce v chovech všech hospodářských zvířat. Nejen, že poskytuje informace o základních fyzikálních vlastnostech semene jako jsou objem, hustota, konzistence, barva a pach, ale pomocí speciálních mikroskopických metod vyšetření spermií odhaluje ty poruchy, které mohou být a často jsou příčinou vyřazení plemeníků z plemetiby. Z těchto důvodů je na vyšetření semene nutné pohlížet jako na velmi významnou činnost v procesu péče o chovy, jejich zdraví a dobrou vyrovnanou plodnost. Analýza kvalitativních ukazatelů hřebčího semene je tedy nezbytná z toho důvodu, že poskytuje neocenitelné informace důležité pro stanovení plemenné hodnoty nejen nově zařazovaných hřebců do plemenitby, ale také pro kontrolu těch hřebců, kteří již v plemenitbě působí. 6

2 CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce bylo podat ucelený pohled na hodnocení kvality hřebčího semene prostřednictvím vyšetřovacích metod používaných pro analýzu jakosti ejakulátu. V neposlední řadě popsat morfologické odchylky od stavby spermií a jejich dopad na plodnost hřebce. Cílem navazující diplomové práce bude získání a zpracování vzorků semene vybrané skupiny hřebců, jejich postupné vyhodnocování a stanovení hlavních kvalitativních ukazatelů se zaměřením na abnormality v morfologické stavbě spermií. Dále pak zjištění frekvence těchto abnormalit a stanovení jejich vlivu na kvalitu ejakulátů. Všechny zjištěné výsledky budou vyhodnoceny pomocí statistických metod. 7

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Pohlavní orgány samců KOMÁREK et al.(1964) popisuje samčí pohlavní orgány jako orgány určené k produkci samčích pohlavních buněk a k jejich vpravení do pohlavních cest samice. K samčím pohlavním orgánům patří varlata, nadvarlata, chámovody, přídatné pohlavní žlázy a pářící orgán pyj. KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) uvádí, že pohlavní orgány samců vznikají v době prenatálního vývoje. 3.1.1 Varle Varle (testis) je párová samčí pohlavní žláza, která slouží k tvorbě spermií a samčího pohlavního hormonu testosteronu (KOMÁREK et al., 1964). VĚŽNÍK et al. (2004) uvádí, že má tvar rotačního elipsoidu s různou délkou své podélné osy. Rozdíly ve tvaru varlat mohou být také v rámci jednoho druhu a plemene. Relativně velká varlata jsou vyvinuta u prasete a malých přežvýkavců. U hřebce a býka jsou poměrně malá s váhou pohybující se okolo 500 gramů. Hřebec má tvar varlat spíše kulovitý a jsou uložena horizontálně k tělu, oproti protáhlým a svisle uloženým varlatům býka (MARVAN et al., 2007). Povrch varlat je kryt tenkou serózní blánou, pod níž se nachází tuhá blána zvaná tunica albuginea. Tato blána tvoří obalové pouzdro varlete, protože samotná varletní tkáň je velmi křehká. Z blány vybíhají do varlete vazivové trámce dělící tkáň varlete na varletní lalůčky (KOMÁREK et al., 1964). Podle MARVANA et al. (2007) je tkáň lalůčků tvořena jemně zrnitou hmotou a skládá se z 2-4 stočených semenotvorných kanálků, které jsou vystlány zárodečným epitelem. Semenotvorné kanálky se postupně spojují v krátký vývod přímý kanálek, který je počátkem vývodných cest varlete. V době prenatálního vývoje jsou varlata uložena v blízkosti ledvin. K jejich sestupu do šourku dochází u hřebců brzy po narození ( MOREL, 2003). 3.1.2 Šourek Šourek je kožní vak uložený u hřebce a býka ve stydké oblasti mezi stehny (HOLUB et al., 1969). 8

KOMÁREK et al. (1964) doplňuje, že šourek je kožní vychlípenina břišní stěny sloužící k uložení varlat a nadvarlat. U býka je na rozdíl od hřebce dlouhý, visící hlouběji mezi stehny a při bázi zaškrcený. Má schopnost reagovat na teplotu okolního prostředí. Díky své schopnosti reagovat na změny teplot je šourek orgánem důležitým pro správný průběh vývoje spermií, jelikož udržuje teplotu varlat o 1, 5 2 stupně nižší, než je teplota tělesná (MATSUMOTO et al., 1989; AMANN et al., 1993). Povrch šourku je tvořen jemnou tenkou kůží, zpravidla jemně ochlupenou. Obsahuje množství mazových a potních žlázek, které se uplatňují při termoregulačních vlastnostech šourku (DYCE et al., 1987; VARNER et al., 1991). 3.1.3 Vývodné pohlavní cesty Nadvarlata Nadvarle (epididymis) je párový orgán uložený podél varlete jako jeden z úseků vývodných cest pro sperma ( KLIMENT et al., 1989). Je to důležitý orgán z hlediska shormažďování a zrání spermií. Vnitřní struktura nadvarlete je tvořena sití odvodných kanálků, které ústí v chámovod. Celé nadvarle se pak dělí na tři základní části hlavu, tělo a ocas (THOMPSON et al., 1979). Jak uvádí KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) průchod spermií celým nadvarletem trvá zhruba 8 11 dní. Chámovody Chámovod je párovým orgánem tvořící samostatný vývod složený ze sliznice, svaloviny a serózy. Vystupuje z ocasu nadvarlete odkud prochází dutinou šourkovou, tříselným kanálem, břišní dutinou a dostává se do dutiny pánevní, kde se přikládá k dorsální straně močového měchýře (VĚŽNÍK et al., 2004). MARVAN et al. (2007) udává, že v pánevním úseku se u koně a přežvýkavců rozšiřuje v ampulu chámovodu, jejíž délka i šířka je druhově značně odlišná. Jak doplňuje KOMÁREK et al. (1964) peristaltickými pohyby stěny chámovodu je při ejakulaci sperma transportováno do močové roury. 9

3.1.4 Přídatné pohlavní žlázy Přídatné pohlavní žlázy se do značné míry podílí na tvorbě celého ejakulátu, a to ve formě semenné plazmy. Jsou uloženy kolem kořene penisu a u konečné části chámovodu (MOREL et al., 2003). HOLUB et al. (1969) uvádí, že sekrety těchto přídatných pohlavních žláz slouží pro zředění ejakulátu a pro vytvoření vhodných podmínek pro přežití spermií. K přídavným pohlavním žlázám patří: semenné váčky, předstojná žláza a bulbouretrální žlázy. Semenné váčky Semenné váčky nebo také vezikulární žlázy jsou párové. Leží na močovém měchýři a dosahují délky až 20 centimentrů. Vzhled váčků lze díky laločnaté struktuře srovnat s velkými vlašskými ořechy. Jejich sekret tvoří velkou část semenné plazmy. Je bohatý na draslík, kyselinu citronovou a glukózu (THOMPSON et al., 1980; WEBER et al., 1990). KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) doplňují, že u hřebce jsou semenné váčky spíše hladkého charakteru a jsou duté. Předstojná žláza Předstojná žláza (prostata) je nepárový orgán ležící na začátku močové trubice, kaudálně od vyústění chámovodu a semenných váčků. Zatímco u býka je tvořena roztroušenou částí a tělem, u hřebce ji tvoří především tělo rozdělené na dva laloky spojené můstkem (MARVAN et al., 2007). Sekret prostaty popisují LITTLE a WOODS et al. (1987) jako sekret pro hřebčí sperma typicky alkalické reakce s vysokým obsahem bílkovin, kyseliny citronové a zinku. Bulbouretrální žlázy Bulbouretrální žlázy, nebo také Cowperovi žlázy jsou párové a leží na močové trubici těsně před jejím východem z pánve (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Tvar těchto žláz popisuje MARVAN et al. (2007) jako kulovitý s hladkým povrchem. Hřebec a býk mají téměř shodnou velikost pohybující se kolem 2 3 cm. 10

Největší bulbouretrální žlázy jsou vyvinuté u kance. Sekret bulbouretrálních žláz je u hřebce vodnatý a v relativně malém objemu. Je vylučován již na počátku ejakulace a jeho funkcí je připravit pro spermie vhodné prostředí v močové trubici. Díky své konzistenci slouží také jako lubrikant a napomáhá spermiím při transportu (MANN, 1975; WEBER a WOODS, 1993). 3.1.5 Pyj Je orgán jehož anatomie umožňuje přenos semene do pohlavních cest samice. Morfologie pyje je pro každý druh zvířete specifická. Erekce pyje, neboli ztuhnutí, je u hřebce založeno především na překrvení topořivých těles, která jsou základem celého pyje. U býka je erekce založena na mechanismu vyrovnání esovitého ohnutí v době, kdy dojde k pohlavnímu vzrušení (VĚŽNÍK et al., 2004). Tento názor potvrzuje MOREL et al. (2003) a zárověn dodává, že schopnost topořivého tělesa reagovat na překrvení, neboli na zvýšený krevní tlak se nazývá hemodynamická. MARVAN et al. (2007) uvádí, že tvar pyje je válcovitý a skládá se z kořene, těla a žaludu pyje. Hřebec i kanec mají pyj dlouhý kolem 50 60 cm s průměrem 5 6 cm u hřebce a 1 1,5 cm u kance. Koncová část pyje žalud je u hřebce silně vyvinut a má tvar klobouku. Jeho základ tvoří houbovité těleso, příbuzné topořivému. 3.1.6 Předkožka Předkožku popisuje KLIMENT et al. (1989) jako ochranný obal volného konce těla pohlavního údu, který je lehce stažitelný. Je to kožní duplikatura s vnějším a vnitřním listem a předkožkovým otvorem na jeho konci. Tento názor zastává i MARVAN et al. (2007) a doplňuje, že vnější list předkožky je tvořen ochlupenou kůží břicha a vnitřní list má charakter sliznice a přechází na pyj jako pyjový list. Vnitřní list obsahuje žlázky, které tvoří předkožkový maz zvaný smegma. 11

Obr. 1: Pohlavní orgány hřebce (VĚŽNÍK et al., 2004, upraveno) 3.2 Ejakulát Semeno je nejčastěji šedobílá viskózní tekutina skládající se z tekuté (semenná plazma) a buněčné složky (spermie). Spermie vznikají ve varlatech a semenná plazma je produkována přídatnými pohlavními žlázami (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Jak uvádí KOMÁREK et al. (1964) největší podíl ejakulátu tvoří voda, z anorganických látek je to draslík, sodík, chlór, vápník, síra aj., z organických látek především cukry, bílkoviny a tuky. Chemické složení semene, jeho kvalita a stav spermií jsou závislé na výživě, stáří, plemeni, ustájení, pohybu, pohlavním využívání a pod. Tento názor zastává i MARVAN et al. (2003) a doplňuje, že tato pestrá skladba ejakulátu má za úkol vytvořit pro spermie ideální prostředí k přežití, umožnit jejich pohyb a chránit je před nepříznivými vlivy. 3.2.1 Kvalitativní vlastnosti ejakulátu 3.2.1.1 Objem ejakulátu Ejakulát hřebce je tvořen částí tekutou a částí hlenovitou. Největší podíl na množství vyprodukovaného semene tvoří semenná plazma. Všeobecně se její obsah pohybuje okolo 97 98% ( KLIMENT et al., 1989). 12

Objem ejakulátu se u hřebce pohybuje průměrně v rozemzí 30 60 ml. Obsah spermií se pohybuje kolem 2 3 %. Celkový objem semene kolísá v závisloti na mnoha faktorech jako jsou výživa, věk, hmotnost hřebce, intenzita pohlavního využívání, stupeň pohlavního vydráždění, způsob odběru semene, genetické predispozice a zdravotní stav plemeníka (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). 3.2.1.2 Barva a pach ejakulátu Barva hřebčího semene je mléčně bílá s vodnatou až mléčnou konzistencí a slabým specifickým hřebčím aromatem (KLIMENT et al., 1989). KOZUMPLÍK a GAMČÍK et al. (1987) uvádí, že případné změny v barvě a zápachu semene se vyskytují především při zánětlivých onemocněních varlat, nadvarlat, nebo přídatných pohlavních žláz. Semeno má pak nahnědlou až tmavočervenou barvu. Při kontaminaci močí nebo hnisem se může zbarvení změnit až na žlutozelené. Tyto patologické stavy s sebou nesou i výrazné změny v pachu a jsou ukazatelem změny kvality ejakulátu. 3.2.1.3 ph ejakulátu PH se u čerstvého hřebčího semene pohybuje v rozmezí 7, 2 7, 7 s mírnými rozdíly mezi jednotlivými ejakulacemi (KENNEY et al., 1983). KLIMENT et al. (1989) doplňuje, že ph hraje důležitou roli pro oplozeníschopnost spermií a jejich přežitelnosti. Normální ph spermatu má pufrovací účinek. Zvýšení ph často vyvolává kontaminace močí a znečistění mýdly, či vazelínou. U dávek, které jsou po odběru delší dobu inkubovány, dochází k poklesu ph z důvodu hormadění produktů metabolismu spermií (GRIGGERS et al., 2001). 3.2.1.4 Koncentrace spermií v ejakulátu Koncentrace spermií je vyjadřována počtem spermií na 1 mm³ semene. V celém ejakulátu se u zdravého hřebce vyskytuje 6 48 miliard spermií. Celkový počet ovlivňuje frekvence odběrů semene (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Dále VĚŽNÍK et al. (2004) uvádí, že by se koncentrace spermií měla u hřebců pohybovat okolo 0,10 0,25 milionu spermií na mm³ nativního ejakulátu. 13

3.2.1.5 Pohyb spermií Pohyb spermií v ejakulátu, neboli jejich motilita, je podle LOUDY et al. (2001) na hranici 65 80 % s průměrnou hodnotou 70 %. Pohyblivost spermií má výrazný vztah k ph ejakulátu a k teplotě samotného semene. BAUMANN (1950) in KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) uvádí, že motilita hřebčích spermií ustává při teplotě 15 ºC v prostředí při ph 7,6. V případě, že je nižší ph, jsou spermie výrazně méně aktivní již při teplotě 38 ºC. Z funkčního hlediska je pohyb spermií nutný pro oplození samičího vajíčka. Z tohoto důvodu potřebuje spermie získat dostatek energie v podobě ATP. Tohoto spermie docílí přeměnou chemické energie na energii mechanickou (VĚŽNÍK et al., 2004). KLIMENT et al. (1989) upřesňuje, že zásoba energie ve spermii vystačí pouze na 30 sekund pohybu. Tvorba ATP musí být nepřetržitá, a proto je nutná zásoba energie i v samotném ejakulátu. Zdroj energie je v hřebčím spermatu v podobě glukózy. Hřebčí ejakulát obsahuje značné množství ergothioeninu a kyseliny citronové. Což jsou látky, které mají ochrannou funkci a podílí se na udržení rovnováhy osmotického tlaku. Má také o něco nižší obsah fosfolipidů a to má za následek vyšší cilivost hřebčích spermií na tepelný šok (KOMÁREK et al., 1965). 3.2.1.6 Obsah mikroorganysmů v ejakulátu Pro každý druh je přirozené, že ejakulát obsahuje určitý počet mikroorganismů. Z hlediska vhodnosti semene k inseminaci sperma hřebce nesmí obsahovat více, než 5000 nepatogenních mikroorganismů. Tyto mikroorganismy se do ejakulátu dostávají často z předkožky, ale také porstřednictvím znečištěné umělé vagíny (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). 3.2.2 Semenná plazma V ejakulátu hřebce tvoří semenná plazma převážnou část z celého objemu. Její funkcí je zachování životaschopnosti spermií, jejich výživa a upravuje prostředí v pohlavním ústrojí samice (MOREL, 1999). Dle KOZUMPLÍKA, GAMČÍKA et al. (1987) je semenná plazma složená z množství anorganických i organických látek. Semenná plazma je tvořená sekrety 14

přídatných pohlavních žláz. Její složení se odvíjí od aktivity těchto žláž. Obsahuje velké množství bílkovin, lipidů a minerálních látek. Pro hřebce je typický vyšší obsah kyseliny citronové. V hřebčí semenné plasmě je nízká hladina fruktózy, ale obsahuje dostatek glukózy a vyšší množství ergothioeninu. KLIMENT et al. (1989) uvádí, že funkcí bílkovin v semenné plazmě je udržení osmotického tlaku, ochrana spermií před nepříznivou činností elektrolytů semenné plazmy a úprava ph. V případě disfunkce přídavných pohlavních žláz, mohou vznikat nesrovnalosti ve složení semenné plazmy, a to může mít za následek negativní dopady na kvalitu ejakulátu. 3.2.3 Spermie a její morfologická stavba Spermie svou morfologickou stavbou představují buňky připravené k samostatnému životu a určené k cílené funkci. Přenos genetické informace zajišťuje jádro spermie obsahující poloviční počet chromozomů, než je tomu u ostatních buněk (VĚŽNÍK et al., 2004). Spermie jsou nejdůležitější složkou ejakulátu se schopností pohyblivosti, přežití a oplození. Normální, zralá spermie se skládá ze dvou základních částí z hlavičky a bičíku. Hlavička spermie vzniká z jádra spermatidy v době spermiohistogeneze. Skládá se z akrozomu, postakrozomální čepičky a jádra. Bičík spermie je složen ze 4 hlavních oddílů: z krčku, spojovacího oddílu, hlavního oddílu a koncového oddílu. Povrch celé spermie kryje cytoplazmatická membrána. Rozměry spermií jsou druhově, ale i individuálně rozdílné. U hřebce je délka hlavičky spermie 5 8 µm, šířka hlavičky se pohybuje kolem 2,4 4,6 µm a celková délka spermie je 55 60 µm (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1987). 3.2.3.1 Stavba spermie Hlavička spermie Hlavička spermie má v procesu oplodnění velký význam, protože je nositelem dědičného materiálu uloženého v nukleoplazmě. Je to ze stran sploštělý útvar, který je na apikálním konci širší a v místě připojení na bičík se zužuje. Hlavička spermie hřebce má téměř oválný tvar, zatímco u býka, nebo berana je užší a kratší (KLIMENT et al., 1989). 15

Podle DOTTA (1975) je struktura hlavičky tvořena několika základními částmi akrozomem, postakrozomální čepičkou a jádrem. Podobný názor ve své publikaci zastávají také (AMANN a GRAHAM, 1993; MOREL, 1999), kteří na hlavičce navíc popisují výskyt dvojité membrány. Membrána má vnitřní nukleovou a vnější buněčnou vrstvu a v prosotoru se mezi těmito vrstvami nachází již zmiňovaný akrozom. MARVAN et al. (2007) popisuje akrozom jako membránový útvar pokrývající přední část hlavičky spermie. Má podobu čepičky, uvnitř které jsou enzymy (hyaluronidáza, akrozín, proakrozín aj.) důležité pro průnik spermie přes vaječné obaly samičího vajíčka. Díky této skutečnosti má akrozom klíčovou roli v oplozeníschopnosti spermie. Podle KOZUMPLÍKA, GAMČÍKA et al. (1987) akrozom spermie nevyniká příliš pevnou konzistencí jako ostatní části hlavičky. Je velmi vnímavý na osmotické změny vnějšího prostředí a nešetrnou manipulaci s ejakulátem. Na křehkost akrozomu poukazuje i ŠMERHA et al. (1980) a doplňuje, že akrozom je tvořen z polysacharidů vázaných na bílkoviny. Další částí hlavičky je postakrozomální čepička.tento útvar obaluje tu část jádra, kterou nepokrývá akrozom. U spermie, která není nijak porušena je čepička spojena s buněčnou membránou. Její struktura je mnohem pevnější než je tomu u akrozomu (HANCOCK in KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Jádro je nejdůležitější složka hlavičky z hlediska jejího účelu. Obsahuje genetický materiál v podobě deoxyribonukleové kyseliny DNA. Obdobné informace ve své publikaci uvádí i MARVAN et al. (2007) a zároveň popisuje strukturu jaderné hmoty, která se nazývá nukleoplazma, jako jemně vláknitou až homogenní. Bičík spermie Bičík spermie je nástroj sloužící k pohybu spermie. Dělí se na několik úseků, které se odlišují lokalizací, strukturou a funkcí. Jsou to krček spermie, spojovací, hlavní a koncový oddíl. Krček se podle nové nomenklatury nazývá také centriolový oddíl a spojovací oddíl se nazývá mitochondriální (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1987). Podle DOTTA et al. (1975) slouží krček ke spojení hlavičky spermie a bičíku spermie. Je ukotven v takzvané implantační jamce při bázi hlavičky.vnitřní strukturu 16

krčku tvoří dva centrioly a několik měnších mitochondrií. Obdobný popis krčku uvádí i KLIMENT et al. (1989) a dodává k tomu, že z centriolů, které se dělí na proximální a distální, vzniká základ pro hlavici bičíku a axonemu, což je osové vlákno celého bičíku. Po krčku následuje úsek bičíku nazývaný spojovací oddíl nebo také mitochondriální část. Tato část obsahuje velké množství mitochondrií. Jsou to buněčné organely sloužící k tvorbě chemické energie, která je v podobě adenosintrifosfatázy a je nezbytná pro pohyb spermie (AMANN a GRAHAM, 1993; MORELL, 1999) MARVAN et al. (2007) dodává, že mitochondrie tvoří kolem osového vlákna spojovacího oddílu mitochondriální pochvu v podobě souvislé spirály. Tato spirála z mitochondrií je pravotočivá a její délka je druhově velice rozdílná. Počet mitochondrií se pohybuje v rozmezí 65-75. Každá mitochondrie tvoří asi ¾ kruhu spirály (KLIMENT et al., 1989). PESCHA et al. (2006) uvádí, že nejdelší část spermie tvoří hlavní oddíl bičíku. U hřebčí spermie dosahuje délky 30 40 µm. Vnitřní struktura hlavního oddílu je tvořena souborem osových vláken složených ze dvou ústředních mikrotubulů. Kolem mikrotubulů je uloženo 9 párů vláken, která jsou označována jako dublety (VĚŽNÍK et al., 2004). PESCHA et al.( 2006) společně s DOTTEM (1975) popisují unikátní fibrózní pochvu obalující celý hlavní oddíl bičíku. Pochva je tvořená převážně z bílkovinných materiálů a slouží pro podporu a přenos vlnivých pohybů osového vlákna. Hlavní oddíl bičíku pak přechází v koncový oddíl. Na koncovém oddílu již není patrná fibrózní pochva a je tvořen pouze osovým vláknem a cytoplazmatickou membránou (JELÍNEK, KOUDELKA et al. 2003). 17

Obr. 2: Skladba spermie ( MOREL, 2003, upraveno) 3.2.3.2 Vývojový cyklus spermie Spermatogeneze Vývoj spermií probíhá v semenotvorných kanálcích varlete. Výchozím bodem pro spermatogenezi je množení prvopohlavních buněk v embryonálním základu gonád v době prenatálního vývoje. Z gonocytů pak vznikají spermatogonie. U hřebce dochází k nastartování spermatogeneze ve věku 12. měsíců. Spermatogeneze probíhá ve třech fázích fáze množení, růstu a zrání. Dělí se na dva děje, a to na spermatocytogenezi a spermiohistogenezi (MARVAN et al., 2007). Fáze rozmnožování Podle MARVANA et al. (2003) je tato první fáze spermatocytogeneze typická několikanásobným dělením spermatogonií při bazální membráně epitelu semenotvorného kanálku. Postupně, tak dochází k diferenciaci spermatogonií na několik forem. Prvním typem jsou spermatogonie typu A, které mají velké jádro a podléhají dalšímu dělení. Vznikají z ní dceřinné spermatogonie typu A a spermatogonie intermediální. Intermediální spermatogonie mají již odlišný tvar jádra a jejich dělením vznikají spermatogonie typu B, které jsou základem pro vznik dalších vývojových stadií spermií a vstupují tak do další fáze spermatocytogeneze (VĚŽNÍK et al., 2004). Fáze růstu Fáze růstu je charakteristická růstem spermatogonií typu B a změnami v jejich 18

jádře. Výsledným produktem jsou pak spermatocyty I. řádu nebo také takzvané primární spermatocyty (MARVAN et al,. 2007). VĚŽNÍK et al. (2004) doplňuje, že primární spermatocyty se postupně dostávají k lumen semenotvorného kanálku a jsou to první buňky vstupující do meiotického dělení, které je typické pro další stádium vývoje spermií, a to do fáze zrání. Fáze zrání Jak uvádí KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) je tato fáze nazývána také meiotická. To proto, že je pro ni typické meiotické dělení primárních spermatocytů. Jsou to v podstatě dvě po sobě jdoucí buněčná dělení. Při tomto meiotickém dělení již dochází k redukci chromozmů pohlavních buněk na haploidní počet, což znamená, že výsledná spermie ponese pouze jeden chromozom z původního páru. KOZUMPLÍK a GAMČÍK et al. (1992) dále uvádí, že v prvním meiotickém dělení dojde ke vzniku sekundárních spermatocytů. Výsledkem druhého dělení jsou 4 rovnocenné spermatidy. Spermatidy jsou buňky okrouhlého tvaru nacházející se těsně při lumenu semenotvorného kanálku uložené v podpůrných buňkách epitelu. Obdobně popisuje spermatocytogenezi také KLIMENT et al. (1989) a přidává, že byť jsou spermatidy již finální generací pohlavních buněk, musí ještě projít stadiem spermiohistogeneze, neboli metamorfózy. Spermiohistogenze je proces při, kterém se kulatá spermatida přemění ve zralou spermii schopnou pohybu, průniku do vajíčka a přenosu genetického materiálu. Je důležitá z hlediska formování akrozomu, bičíku i vnitřních struktur spermie (MARVAN et al., 2007). Na konci vývoje se spermie uvolňují ze zárodečného epitelu a přechází do nadvarlat, kde dojde k jejich zrání. Celý proces vývoje spermií trvá u hřebce obvykle 57 dní. Probíhá v jednotlivých vlnách, což znamená, že zásobování zralými spermiemi je plynulé. Doba kterou spermie tráví v nadvarleti, než je schopná jej opustit je okolo 8 11 dní. Po té jsou již spermie plně oplozeníschopné (DINGER a NOILES,1986; JONHSON et al., 1997; MOREL, 1999). KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) uvádí, že délka spermatogenního cyklu u hřebce je obvykle 50 dní. Nevylučuje možnost delšího, či kratšího trvání a poukazuje 19

na individualitu a vliv plemenné příslušnosti. 3.2.3.3 Zrání spermií Spermie, které opouští varlata nejsou ještě plně zralé a tudíž nemůže dojít k oplození vajíčka samice (YOUNG, 1931). Dle ORGEBIN CRISTA (1969) je z hlediska nabytí oplozeníschopnosti pro spermie velice důležité, aby prošly jednotlivými úseky nadvarlete a dozrály. Tento proces se nazývá maturace a z hlediska fertility všech samců je nepostradatelný. Nadvarle zastává v době maturace mnoho funkcí. Poskytuje spermiím výživu, možnost dozrát, nabýt oplozeníschopnost a poskytuje prostředí pro přežití. Nepostradatelnou funkcí nadvarlat je udržení spermií v neaktivní podobě, až do doby ejakulace, aby nedošlo k předčasnému vyčerpání zásob energie nutné k transportu spermie k vajíčku v samičím pohlavním ústrojí. V nadvarleti dochází k resorpci přestárlých spermií a tím k redukci těch, které by mohly mít určité vývojové vady (MARENGO et al., 2008). Každý úsek nadvarlete má z hlediska dozrání spermií svůj úkol. Nejdůležitější je hlava a tělo nadvarlete. U některých druhů i horní část ocasu. V těchto místech dochází k řadě specifických změn (COOPER, 1986). Jsou to změny týkající se hlavně lipidů a proteinů v cytoplasmatické membráně a ve vnější membráně akrozomu, u některých druhů i v morfologickém uspořádání akrozomu. Spermie v této době získávají jednu velmi podstatnou vlastnost, a to schopnost pohyblivosti (SCHOYSMANNA a BEDFORDA, 1986; SILBERA et al., 1989; SCHOYSMANNA, 1993). Po ukončení všech zracích procesů v nadvarleti jsou spermie přesunuty do ocasu nadvarlete a zde jsou uloženy, až do doby ejakulace ( TURNER, 1995; JONES, 1999). 3.3 Manipulace s ejakulátem 3.3.1 Odběr ejakulátu Odběr ejakulátu určeného k inseminaci klisen lze provádět pouze u hřebců zařazených do plemenitby. U chladnokrevníků je to ve věku od 3 let, u teplokrevníků 20

ve věku od 4 let. Tito hřebci musí být zapsáni v plemenné knize (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Podle názoru KATILY (2011) musí mít každý hřebec zařazený do plemenitby odpovídající pohlavní pud a schopnost připustit klisnu, čí odsemenit do umělé pochvy. ŠMERHA et al. (1980) ve své publikaci uvádí, že se pro odběr semene od hřebce používá především umělá vagína otevřeného typu, která může být ve více formách. Typy umělých vagín : Missourský typ tento typ pochvy má zúžený vchod pomocí pryžového prstence. Tento prstenec dráždí bázi pyje hřebce a vyvovlává reflex ejakulace (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Krakovský typ - jedná se o typ vagíny, která je zkrácená tak, aby žalud pyje přečníval a ejakulát je zachycován pod kontrolou do volného sběrače (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. 1987). K popisu krakovského typu vagíny ŠMERHA et al. (1980) dodává, že je nejvhodnější pro frakciovaný odběr semene. Příprava umělé vagíny Příprava umělé vagíny k odběru spočívá v napuštění gumové výstelky vodou o takové teplotě, aby byla teplota vagíny v době odběru 40 42 ºC. Tlak v umělé vagíně by měl odpovídat tlaku v pohlavním ústrojí klisny. Lze jej upravit dle velikosti pyje hřebce přifouknutím vzduchu do gumové vložky. Aby byla zachována určitá kluzkost, je nutné pochvu vymazat bílou sterilní vazelínou (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Vlastní odběr semene Pro odběr semene od hřebců se používá buď klisna v říji nebo fantom jednoduché konstrukce a tvaru. Prostor kde se hřebec odebírá musí být dostatečně velký s podlahou, která neklouže. K atrapě se hřebec přivádí na delší oprati, technik odběru se postaví z prava a po vzeskoku hřebce na fantom nasadí na pyj umělou pochvu do doby ejakulace (ŠMERHA et al., 1980). KOSINIAK (1975) uvádí, že ejakulace je výsledkem stahů svaloviny ve stěně 21

nadvarlete, chámovodu a přídatných pohlavních žláz. Nejčastěji se ejakulace u hřebce skládá z 6 9 výronů semene. Obdobný názor zastává také KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1987), který navíc ejakulaci u hřebce rozděluje do 3-4 frakcí. První, předspermiová frakce je tvořena výměšky bulbouretrálních žláz. Druhá frakce je spermatická, pochází z nadvarlat a tvoří asi jen 2 3 % z celkového objemu semene. Třetí frakce je želatinózního charakteru a poslední čtvrtá je vodnatá směs výměšků všech přídatných pohlavních žláz. K ejakulaci dochází v době, kdy je pyj hřebce maximálně vychlípen. V tomto stadiu kopulace, při použití otevřené vagíny, je možno pozorovat 10 15 cm žaludu před vývodem umělé pochvy. Žalud postupně nabyde tvar houby a po té se objevuje první frakce semene (TISCHER in Šmerha et al., 1980). Obdobně průběh odběru semene popisuje i KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) a doplňuje, že ejakulace trvá zhruba 16 vteřin a lze ji poznat podle vlnivých pohybů ohonu hřebce. 3.3.2 Analýza hřebčího spermatu Pravidelné vyšetřování semene napomáhá včas rozeznat méně kvalitní a nekvalitní ejakuláty, které nemají spravné vlastnosti a vykazují neschopnost oplození. Právě z tohoto pohledu je vyšetření semene velice důležitým opatřením pro získávání kvalitních inseminačních dávek, v případě přirozené plemenitby kvalitních plodných plemeníků (KATTILA, 2011). Pojem kvalitní ejakulát vyjadřuje biologickou plnohodnotnost hřebčího spermatu, jeho schopnost oplodnit vajíčko a umožnit tak vznik nového života. Tuto biologickou plnohodnotnost lze určit pomocí laboratorních vyšetřovacích metod. Díky těmto metodám lze zjistit zda jsou vlastnosti vyšetřovaného ejakulátu odpovídající plemenným požadavkům (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1987). Každý čerstvě odebraný ejakulát musí být analýze podroben ihned po odběru, nejpozději však do deseti minut. V případě použití mražených inseminačních dávek by měla být časová prodleva ještě kratší (ŠMERHA et al., 1980). Účelem kontroly semene je zjistit, zda bude vhodné pro využití v přirozené i umělé plemenitbě, určit plodnost plemeníka a určit, zda bude vhodným kandidátem 22

pro využití v umělé inseminaci (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1987). KLIMENT et al. (1989) uvádí, že analýza spermatu se skládá z několika základních skupin. vyšetření makroskopické Obvykle se toto vyšetření skládá ze stanovení objemu, barvy, konzistence, pachu a stanovení ph. vyšetření mikroskopické Zahrnuje širokou škálu laboratorních metod, jako je například vyšetření motility, stanovení koncentrace, určení živých a mrtvých spermií, hodnocení morfologické stavby spermií a posouzení mikrobiálního znečištění. vyšetření speciální Jsou to metody používané především v případě, kdy došlo k odhalení poruch a snížené plodnosti. KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1987) dodávají, že veškeré výsledky analýzy semene jsou podkladem pro vytvoření spermiogramu záznamu o kvalitě získaného ejakulátu. 3.3.2.1 Makroskopické vyšetření hřebčího ejakulátu Stanovení objemu Objem semene se stanovuje ihned po jeho odebrání. S věkem hřebce se objem značně mění. Pro vyšetření je podstatná především spermatická frakce, která by měla mít minimální objem 20 ml. Na objem má vliv velká škála činitelů, a to zejména plemeno, genetické predispozice, intenzita pohlavního využívání, technika odběru semene, kvalita krmení, roční období a celkový zdravotní stav hřebce (VĚŽNÍK et al., 2004). Objem zjišťujeme pomocí kaliborvaných nádob v mililitrech nebo vážením na analytických vahách v gramech (KLIMENT et al., 1989). VĚŽNÍK et al. (2004) dále popisuje, že nádoby pro stanovení objemu musí být douplášťové a veškeré pomůcky, které přijdou do kontaktu se spermatem musí mít 23

konkrétně u hřebce teplotu 37-38 ºC. Hodnocení barvy, konzistence a pachu KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) ve své publikaci uvádí, že barva ejakulátu je závislá na hustotě a konzistenci. Obvyklá je mléčně bílá až našedlá, může mít i namodralý odstín díky vysoké koncentraci spermií. Konzistence hřebčího spermatu má být vodnatá až mléčná. Podle KLIMENTA et al. (1989) se barva i konzistence správně posuzují ve sběrači proti procházejícímu světlu nebo na tmavé podložce v dopadajícím světle. Pach čerstvě odebraného semene má mírný hřebčí nádech a posuzuje se pomocí čichu. Nesmí dojít k vydechnutí vzduchu do sběrače se semenem, aby nedošlo ke kontaminaci semene mikroorganismy. Jakákoliv odchylka od přirozených vlastností může být signálem onemocnění pohlavního ústrojí. Nejčastěji se jedná o záněty varlat, přídatných pohlavních žláz, ale může jít i o změny v související s výživou plemeníka (KLIMENT et al., 1989). 3.3.2.2 Mikroskopické vyšetření hřebčího ejakulátu Stanovení koncentrace ejakulátu Stanovení koncetrace ejakulátu je jednou z nejdůležitějších informací o kvalitě ejakulátu a o spravné aktivitě zárodečného epitelu (VĚŽNÍK et al., 2004). 2008). Pro určení hustoty spermatu existuje několik metod (JOHANSSON et al., Posouzení odhadem KLIMENT et al. (1989) metodu uvádí jako finančně nenáročnou, ale nejméně spolehlivo. Je vhodná zejména v laboratořích běžného provozu. Na předehřáté podložní sklíčko se kápne 1 2 kapky nativního semene, přikryje se krycím sklíčkem a vloží pod světelný mikroskop. Hodnotí se subjektivně prohlížením zorného pole. Jak dodává KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) je tato metoda založena na hustotě uložení spermií vedle sebe. Posuzuje se vzdálenost mezi jednotlivými spermiemi, která se určuje podle délky a šířky hlavičky, případně délky celé spermie. ŠMERHA et al. (1980) píše, že v případě určování hustoty odhadem se semeno 24

dělí do několika základních skupin. Velmi husté v případě, že obsah spermií je vyšší než 1, 5 mil/mm³. Husté takové semeno obsahuje 1 1, 5 milionu spermií v mm³. Středně husté obsahuje 0, 7 1 milion spermií v mm³. Řídké v tomto případě je v ejakulátu pouze 0, 2 0, 7 milionu spermií v mm³. Další metodu popisuje JOHANSSON et al. (2008) jako metodu hemocytometrickou. Jedná se o přesné určení koncentrace spermií, neboli hustoty semene pomocí Bürkerovi komůrky. Hemocytometrická metoda Popisem metody se ve své publikaci zabývá VĚŽNÍK et al. (2004). Uvádí, že k přípravě vzorku semene se používá mísící pipeta neboli melanžér na červené krvinky. Do melanžéru se nasaje sperma zředěné nejčastěji citrátem sodným a přidá se Haymův roztok. Celá směs se postupně promíchává. Rozředěné sperma se navrství pod krycí sklíčko Bürkerovi komůrky. Jakmile je komůrka zcela zaplněna vkládá se pod světelný mikroskop a při zvětšení 200 400 x se počítají jednotlivé spermie podle přesně stanoveného postupu. KOZUMPLÍK a GAMČÍK et al. (1992) uvádí, že určování koncentrace spermií pomocí Bürkerovi komůrky je velice přesná metoda, ale dosti časově náročná. V dnešní době je často používanou metodou spektrofotometrie (JOHANSSON et al., 2008). Spektrofotometrická metoda Podle GAMČÍKA, KOZUMPLÍKA et al. (1987) je principem této metody prostupnost zákalu semene paprskem světla. Ejakulát, jehož koncentrace má být měřena pomocí fotometru musí být ředěn fyziologickým roztokem, nebo citrátem sodným. Stupeň zákalu ejakulátu způsobí úbytek světla. Tento úbytek zaznamenává fotobuňka a galvanometr, jejichž pomocí je možné určit hustotu spermatu. JOHANSSON et al. (2008) doplňuje, že spektrofotometrie je velice rychlou a přesnou metodou. U hřebčího spermatu je požadovaná koncentrace minimálně 100 000 spermií v 25

jednom mm³ (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Hodnocení motility spermií Motilita, neboli pohyblivost spermií, je velmi důležitým znakem kvality a vitality spermií (KATTILA, 2011). Podle JASKA et al. (1988) a KENNEYHO et al. (1983) může být motilita jedním z podstatných vlivů působících na plodnost hřebců. Pro správný odhad motility je důležité, aby jakýkoliv materiál, se kterým dojde semeno do kontaktu, byl čistý, suchý a předehřátý na 35 38 ºC. Vyšetření je nutné zahájit do pěti minut po odběru (ROUSSET et al., 1986). Nejzákladnější a také nejčastější způsob určení motility popisuje ve své publikaci VĚŽNÍK et al. (2004). Uvádí subjektivní hodnocení pomocí mikroskopického nápočtu v zorném poli mikroskopu. Výpočet se vyjadřuje v procentech nebo pomocí bodového systému, kdy každý jeden bod znamená 20 % spermií schopných pohybu. Hodnocený ejakulát se před vyšetřením většinou ředí fyziologickým roztokem. Stupeň ředění je závislý na hustotě semene. Naředěný ejakulát musí obsahovat 100 000 spermií na mm³. ROUSSET et al. (1986) tvrdí, že důvodem pro ředění semene je schopnost čerstvého ejakulátu tvořit shluky spermií. Tento jev se nazývá aglutinace a je pro určení motility nežádoucí. Tento názor zastává i KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992). Doplňují, že za normální fyziologický pohyb spermií se považuje přímočarý pohyb vpřed za hlavičkou. Uvádí také několik případů nefyziologických druhů pohybu : nekrospermie uplná nepohyblivost pohyb okolo hlavičky pohyb do kruhu trhavý pohyb oscilační pohyb spermie se sice pohybuje ale stojí na místě a pouze se kýve 26

Při vlastním posuzování aktivity spermií se hodnotí především progresivní pohyb spermií pomocí světelného fázového mikroskopu. LOUDA et al. (2001) uvádí, že se hodnotí charakter pohybu, směr pohybu a rozsah kmitů bičíku. Hodnocení se provádí na předehřátem podložním sklíčku na teplotu 39 C ± 1 C. Posouzení probíhá pomocí mikroskopu při 200 300 násobném zvětšení. VĚŽNÍK et al. (2004) doplňuje, že pozorování se provádí ve třech zorných polích. Progresivní pohyb spermií je znakem dobré plnohodnosti ejakulátu a mělo by jej vykazovat alespoň 70 % spermií. Dolní hranice pro hřebčí sperma je 60 % motilních spermií. Průměrně se aktivita v hřebčím ejakulátu pohybuje okolo 75 % (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Stanovení podílu živých a mrtvých spermií Ke stanovení živých a mrtvých spermií se používá nejčastěji metoda barvení eozinem. Obarvený preparat je následně pozorován ve světelném mikroskopu. Podstata této metody spočívá v celistvosti cytoplazmatické membrány na povrchu spermie. U živých spermií je membrána nepoškozená a spermie se neobarví, zatímco u spermií s porušenou cytoplazmatickou membránou dojde k průniku barviv do vnitřních strukutur spermie (KLIMENT et al., 1989). Souhlasné stanovisko zastávají také KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992). Dodávají, že k barvení se nepoužívá pouze eozin, ale také černé barvivo nigrosin, které slouží jako kontrastní pozadí. Nazývá ji metodou barvení podle Blooma. KLIMENT et al. (1989) uvádí, že se posuzuje 100 200 spermií v několika zorných polích. A dodává, že by sperma určené k tvorbě konzervovaných inseminačních dávek mělo obsahovat minimálně 70 % živých spermií. Mrtvé spermie se vlivem eosinu zbarví narůžověle, živé nebudou zbarveny vůbec. Mezi mrtvé spermie se počítají i spermie s nádechem do růžova, jelikož u nich dchází k odumírání a nemohou být počítány mezi živé (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Barvicích metod pro určení mrtvých a živých spermií je více druhů. Výše popsaná metoda je však nejčastěji užívaná a dostupná pro většinu běžných laboratoří 27

(VĚŽNÍK et al., 2004). Vyšetření morfologie spermií Vyšetření morfologické stavby spermií je velmi důležitou součástí kvalitní plemenitby koní. Účelem tohoto vyšetření je identifikovat ty hřebce, kteří nemohou být na základě negativních výsledků zařazeni do plemenitby nebo v ní být nadále využíváni. Díky této metodě lze odhalit důvody, kvůli kterým dochází ke snížení plodnosti hřebců (KENNEY et al., 1983). JOUANNET et al. (1988) uvádí, že morfologické vyšetření je jedním z hlavních prediktorů fertility hřebce a metody vyšetřování jsou velmi přesné, precizní, jednoduché s nenáročností na vybavení. Jsou dostupné pro většinu laboratoří. Jak doplňuje KLIMENT et al. (1989) skládá se toto vyšetření ze základní morfologické analýzy, kdy zjišťujeme procento tvarově změněných spermií. Základním předpokladem pro správné hodnocení morfologických vad je správná příprava nátěru. Nátěr musí být jemný, v souvislé vrstvě a pokud možno nepřerušovaný či jinak poškozený. Používaná sklíčka musí být dokonale čistá a nepoškozená. Nesprávným postupem při přípravě nátěru vznikají často arteficiální vady. Nejčastěji se jedná o různě potrhané a zohýbané hlavičky a bičíky (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1987). Po zhotovení preparátu dojde k jeho obarvení pomocí některé z používaných barvících metod. Výběr barvení je závislý na tom, co chceme u spermie pozorovat. Podle těchto kriterií existují metody barvení přehledné a speciální (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). ŠMERHA et al. (1980) dodává, že preparáty pro morfologické vyšetření je nutné připravit nejpozději do 30 minut po odběru ejakulátu, aby nedošlo k sekundárním změnám. Hotové preparáty se hodnotí pod mikroskopem při 1000 1500 násobném zvětšení za použití imerzního oleje. Pozoruje se 200-400 spermií a normální ejakulát nesmí obsahovat více než 20 % patologicky změněných spermií. VĚŽNÍK et al. (2004) ve své publikaci uvádí, že při posuzování nátěrů se hodnotí především poměr změněných spermií a spermií normálních, jejich kvalitativní změny a přítomnost spermií nezralých. 28

Přehledné barvící metody Nejčastěji používané metody barvení jsou metoda dle Blooma a dle Bydgoště. B. T. Farellyho, dle Barvení podle B. T. Farellyho Při posuzování morfologie pomocí této metody se nátěr fixuje 35 % formalínem a fyziologickým roztokem po dobu 15 sekund. K obarvení se používá 5 % vodný roztok anilinové modři a 0, 5 % vodný roztok krystalické violeti (VĚŽNÍK et al., 2004). Výsledné zbarvení spermií bude modrofialové s dobře rozeznatelným akrozomem. Pro zřetelnější zobrazení lze použít modrozelený filtr (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Barvení podle Blooma Při barvení pomocí této metody se používá roztok 96 % alkoholu, 1 % roztok uhličitanu sodného a 10 % methylvioleť. Nátěr se několikrát ponoří do alkoholu a opláchne vodou. Barvení methylvioletí trvá 4 5 minut (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1987). Výsledkem metody barvení podle Blooma je jasně failové zbarvení spermií, které nám dobře umožňuje pozorovat morfologické anomálie spermií (KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al., 1992). Barvení dle Bydgoště Pro tuto barvící techniku se používá ejakulátu ředěného citrátem sodným. K barvení se používá barvivo Bydgošť, 1% roztok eosinu a 96 % ethanol. Použití této metody je vhodné zejména v případech kdy chceme zhodnotit primární změny na hlavičce a bičíku. Hlavička má po obarvení barvu podobnou květům černého bezu a bičík je celý tmavě fialový (JAŠKOVSKI et al., 1968). Speciální barvící metody Jak uvádí KLIMENT et al. (1989) řadíme sem širokou škálu barvících metod. Jejich funkcí je informovat o procentu tvarově normálních spermií, které by na tomto základě měly být oplozeníschopné. Normální spermiogram je ukazatelem správně 29

probíhající spermiogeneze. Speciální morfologické vyšetření slouží ke kontrole: Poruch spermiogeneze Zánětů pohlavních cest a orgánů Poruch tvorby a uvolňování gonadotropních a specifických hormonů Odolnosti a poškození spermií během skladování pomocí kryokonzervace Odolnosti spermií v pohlavních cestách samice Nejčastěji používanou technologií pro vyšetření obarvených preparátů je světelný mikroskop (KLIMENT et al., 1989). Metody barvení akrozomu Jak uvádí KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) k obarvení akrozomu se používá nejčastěji metoda podle Hancocka. Je to metoda, využívaná pro zvýraznění vad vzniklých na akrozomu, ale lze s její pomocí posuzovat i ostatní vady. Je to jedna z nejlepších a nejstandartnějších metod používaných pro vyšetření morfologie spermií. Barvení dle Hancocka Pro barvení dle Hancocka je typické použití Hancockova roztoku pro fixaci nátěru. Doba fixace je 30 minut. Následuje barvení v kyvetách v Giemsově roztoku. Výsledné zbarvení akrozomu je výrazně modrofialové. Barvení Wels X Tuto metodu barvení vypracoval ROB (1966) a uvádí, že jde o polychromatickou rychlou metodu sloužící zejména k běžnému morfologickému vyšetření dědičných změn na akrozomu. Nátěr fixovaný na vzduchu se barví konžskou červení, roztokem fuchsinu, roztokem bromthylové modři, vodným roztokem Janusové modři nebo brilantní zeleně (KLIMENT et al., 1989). KLIMENT et al. (1989) dále uvádí, že při tomto barvení lze pod mikroskopem posuzovat zřetelně diferencovaný akorozom od ostatních částí spermie. Díky tomu je možné pozorovat celé struktuy spermie včetně velmi jemných změn v akrozomálním 30

systému a vnitřní struktuře hlavičky. Barvení dle Karrase Tuto metodu vytvořil KARRAS (1958). Existuje ve dvou modifikacích. VĚŽNÍK et al. (2004) popisuje, že při tomto barvení se používá 96 % alkohol, metalchromová žluť, odvar z dubové kůry, 3 % methylalkoholický roztok Viktoriánské modři. KLIMENT et al. (1989) doplňuje, že výsledné vzezření akrozomu bude blankytně modré, zbytek hlavičky je narůžovělý a bičík žlutý. Obecně lze říci, že nejvíce využívanými metodami pro morfologické vyšetření spermií jsou metody barvení dle Farellyho, dle Hancocka a metoda Wels X (ŠMERHA et al., 1980). 3.4 Morfologické vady spermií Ne všechny spermie, které jsou ve varlatech vyprodukovány jsou zcela normálně vyvinuté. Běžně se vyskytují určité morfologické odchylky, které však za optimálních podmínek nijak výrazně neovlivňují plodnost hřebce. Vzhledem k tomu, že většina odebraného ejakulátu je použita k tvorbě inseminačních dávek, je téměř nutné vyšetřovat morfologii spermií každého plemeníka zařazeného v chovu ( HOFMANN et al., 1985; GRAVANCE et al.,1998; JOHNOSON, 1997). KOZUMPLÍK, GAMČÍK et al. (1992) doplňují, že morfologické abnormality mohou být způsobeny různými činitely. Mezi nejčastější negativní faktory patří působení toxinů, infekcí a výživy. Nejzávažnější jsou vady vyvolané genetickými poruchami. Všeobecně lze morfologické změny rozdělit na dvě skupiny na získané a vývojové. Získané jsou takové, které mohly vzniknout až po úplném dokončení vývoje spermie (VĚŽNÍK et al., 2004). Toto tvrzení doplňuje BARTH et al. (1989) a upřesňuje dělení morfologických vad podle jejich původu na primární a sekundární. Primární vady vznikají ve varlatech v průběhu spermatogeneze a sekundární většinou v průběhu transportu semene vývodnými cestami. 31