VYUŽITÍ ALTERNATIVNÍCH TESTŮ EKOTOXICITY PRO POSOUZENÍ KONTAMINOVANÝCH ENVIRONMENTÁLNÍCH MATRIC

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION VYUŽITÍ ALTERNATIVNÍCH TESTŮ EKOTOXICITY PRO POSOUZENÍ KONTAMINOVANÝCH ENVIRONMENTÁLNÍCH MATRIC APPLICATION OF ALTERNATIVE ECOTOXICITY TESTS FOR EVAULATION OF CONTAMINATED ENVIRONMENTAL MATRICES BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR ŠÁRKA HŘIBOVÁ MVDr. HELENA ZLÁMALOVÁ GARGOŠOVÁ, Ph.D. BRNO 2011

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12 Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: FCH-BAK0573/2010 Akademický rok: 2010/2011 Ústav: Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí Student(ka): Šárka Hřibová Studijní program: Chemie a chemické technologie (B2801) Studijní obor: Chemie a technologie ochrany životního prostředí (2805R002) Vedoucí práce MVDr. Helena Zlámalová Gargošová, Ph.D. Konzultanti: Název bakalářské práce: Využití alternativních testů ekotoxicity pro posouzení kontaminovaných environmentálních matric Zadání bakalářské práce: Formou literární řešerše budou zpřehledněny alternativní testy ekotoxicity a porovnány se standardními testy ekotoxicity. Dále budou provedeny návrhy baterií testů pro odhad ekotoxicity environmentálních matric. Termín odevzdání bakalářské práce: 6.5.2011 Bakalářská práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Šárka Hřibová MVDr. Helena Zlámalová Gargošová, Ph.D. doc. Ing. Josef Čáslavský, CSc. Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu V Brně, dne 31.1.2011 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá posuzováním negativních vlivů kontaminovaných matric na biotu přírodních ekosystémů prostřednictvím ekotoxikologických testů. V práci je uveden přehled alternativních testů ekotoxicity, které jsou následně porovnány se standardními testy. Dále je diskutována potřeba rozšíření základní sady standardních testů vyţadovaných současnou legislativou ČR o testy na trofické úrovni dekompozitorů pro testování pevných i kapalných matric a o kontaktní testy pro testování pevných matric. V souvislosti s tím jsou provedeny návrhy baterií testů pro hodnocení ekotoxicity environmentálních matric. ABSTRACT This bachelor thesis deals with assessment of harmful effects of contaminated matrices on biota of nature ecosystems via alternative ecotoxicology tests. The alternative and standard ecotoxicology test are summarised and compared in the thesis. Furthermore, the need of broadening of basic test battery required by actual Czech legislation is discussed. The basic test battery should be widened by the tests on decomposer trophic level for solid and liquid matrices and by contact tests for solid matrices. In connection with that the test batteries for evaluation of environmental matrices ecotoxicity are proposed. KLÍČOVÁ SLOVA Ekotoxikologie, environmentální matrice, alternativní ekotoxikologické testy, standardní ekotoxikologické testy. KEYWORDS Ecotoxicology, environmental matrices, alternative tests of ecotoxicology, standard tests of ecotoxicology. 3

HŘIBOVÁ, Š., Využití alternativních testů ekotoxicity pro posouzení kontaminovaných environmentálních matric. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 55 s. Vedoucí bakalářské práce MVDr. Helena Zlámalová Gargošová, Ph.D. PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a ţe všechny pouţité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a můţe být vyuţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT... podpis studenta PODĚKOVÁNÍ Tímto chci poděkovat především MVDr. Heleně Zlámalové Gargošové, Ph.D. za trpělivost, ochotu a cenné rady a všem mým blízkým za pevné nervy a optimismus. 4

OBSAH 1. ÚVOD 7 2. KONTAMINACE ŢIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGIE 8 2.1. Vymezení vědního oboru toxikologie a ekotoxikologie 8 2.2. Typy znečišťujících látek v prostředí 8 2.3. Vliv a migrace znečišťujících látek v prostředí 9 2.4. Typy environmentálních matric a zdroje kontaminace 10 2.4.1. Voda 11 2.4.2. Vzduch 12 2.4.3. Půda 13 3. EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 15 3.1. Základní rozdělení testů ekotoxicity 15 3.1.1. Testy akutní a semichronické ekotoxicity 15 3.1.2. Testy chronické ekotoxicity 16 3.1.3. Akvatické biotesty 16 3.1.4. Terestrické biotesty 16 3.2. Princip ekotoxikologického testu 17 3.3. Výsledky ekotoxikologických testů 20 4. ALTERNATIVNÍ EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY VERSUS STANDARDNÍ BIOTESTY 21 4.1. Alternativní ekotoxikologické biotesty 21 4.1.1. Přehled alternativních ekotoxikologických testů 21 4.1.1.1.Algaltoxkit F 22 4.1.1.2. Daphtoxkit F 23 4.1.1.3. Thamnotoxkit F 24 4.1.1.4. Protoxkit F 24 4.1.1.5. Rotoxkit M 25 4.1.1.6. Phytotoxkit 26 4.1.1.7. Ostracodtoxkit 27 4.1.1.8. Toxi-screening Kit 28 4.2. Standardní ekotoxikologické testy 29 4.2.1. Přehled standardních ekotoxikologických testů OECD 29 4.2.1.1. OECD 201 Test inhibice růstu řas 30 4.2.1.2. OECD 202 Test akutní imobilizace Daphnia sp. 30 4.2.1.3. OECD 203 Test akutní toxicity ryb 31 4.2.1.4. OECD 204 Test chronické toxicity ryb: 14 - denní studie 31 4.2.1.5. OECD 205 Test potravní toxicity ptáků 31 4.2.1.6. OECD 206 Test reprodukce ptáků 31 4.2.1.7. OECD 207 Test akutní toxicity ţíţal 32 4.2.1.8. OECD 208 Test s vyššími rostlinami: Test klíčivosti a růstu sazenic 32 4.2.1.9. OECD 209 Test inhibice respiračních procesů v aktivovaných kalech (oxidace uhlíku a amoniaku) 32 4.2.1.10. OECD 210 Test toxicity ryb v raném stádiu 33 4.2.1.11. OECD 211 Test reprodukce Daphnia magna 33 4.2.1.12. OECD 212 Krátkodobý test toxicity ryb v embryonálním stádiu 33 5

4.2.1.13. OECD 213 Akutní test orální toxicity včely medonosné 33 4.2.1.14. OECD 214 Akutní test kontaktní toxicity včely medonosné 34 4.2.1.15. OECD 215 Test růstu juvenilních ryb 34 4.2.1.16. OECD 216 Půdní mikroorganismy: Test transformace dusíku 34 4.2.1.17. OECD 217 Půdní mikroorganismy: Test transformace uhlíku 34 4.2.1.18. OECD 218 Test toxicity Chironomidae sp. ve vodním sedimentu (s pouţitím obohaceného sedimentu) 35 4.2.1.19. OECD 219 Test toxicity Chironomidae sp. ve vodním sedimentu (s pouţitím obohacené vody) 35 4.2.1.20. OECD 220 Test reprodukce roupic 35 4.2.1.21. OECD 221 Test inhibice růstu Lemna sp. 35 4.2.1.22. OECD 222 Test reprodukce ţíţal (E. Fetida/E. andrei) 35 4.2.1.23. OECD 224 Stanovení inhibice aktivity anaerobních bakterií: Sníţení produkce plynu anaerobním trávením kalů (odpadních vod) 36 4.2.1.24. OECD 225 Test toxicity Lumbriculus sp. ve vodním sedimentu (s pouţitím obohaceného sedimentu) 36 4.2.1.25. OECD 226 Test reprodukce roztočů (Hypoaspis aculeifer) 36 4.2.1.26. OECD 227 Test s vyššími rostlinami: Test vitality rostlin 36 4.2.1.27. OECD 228 Stanovení vývojové toxicity zkoušené chemické látky na dvoukřídlých hnojních mouchách (Scathophaga stercoraria L.) a na mouše dobytčí (Musca autumnalis) 37 4.2.1.28. OECD 229 Krátkodobá zkouška reprodukce ryb 37 4.2.1.29. OECD 230 21 - denní zkouška na rybách: Krátkodobý screening estrogenní a androgenní aktivity a inhibice aromatázy 37 4.2.1.30. OECD 231 Zkouška metamorfózy obojţivelníků 37 4.2.1.31. OECD 232 Test reprodukce chvostoskoků v půdě 38 4.2.1.32. OECD 223 Akutní test orální toxicity ptáků 38 4.2.1.33. OECD 233 Test toxicity v průběhu ţivotního cyklu Chironomidae sp. ve vodním sedimentu (s pouţitím obohaceného sedimentu nebo obohacené vody) 38 4.2.2. Přehled standardních ekotoxikologických testů pro ČR 39 4.2.2.1. Test inhibice růstu sladkovodních řas 39 4.2.2.2. Test inhibice růstu kořene Sinapis alba 40 4.2.2.3. Akutní imobilizační test na perloočkách Daphnia magna 41 4.2.2.4. Test akutní ekotoxicity na rybách 41 4.2.2.5.Test inhibice růstu okřehku menšího Lemna minor 42 4.2.3. Další testy běţně vyuţívané v ČR 43 4.2.3.1. Test akutní ekotoxicity na ţíţalách 43 4.2.3.2. Test akutní ekotoxicity na chvostoskocích 44 4.2.3.3. Bakteriální bioluminiscenční test ekotoxicity 45 5. DISKUZE 46 6. ZÁVĚR 48 7. SEZNAM POUŢITÝCH ZDROJŮ 49 8. SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK 55 6

1 ÚVOD Člověk se nikdy zcela nevymaní z lůna přírody, přesto jiţ dlouhá léta vytváří velmi sloţitou umělou strukturu prostředí, označovanou jako antropocenóza. V dnešním světě 21. století, ve kterém se stále rychleji rozvíjejí civilizace, věda a technika, narůstá produkce odpadů a úniky emisí. Jsou syntetizovány a objevovány stále nové sloučeniny a látky, které ve většině případů zatěţují ţivotní prostředí. I přes to, ţe jsou vyvíjeny efektivnější a výkonnější metody sniţování a eliminace emisí, vypouští člověk do ţivotního prostředí stále poměrně vysoká mnoţství škodlivých látek. Obdobná situace je v oblasti odpadů, které nebude za několik desetiletí kam ukládat. Pomalu dochází k naplnění kapacit úloţných prostor pro dále nevyuţitelný odpad. Takto zaplněné skládky odpadů je nutno následně rekultivovat a touto cestou co moţná nejlépe eliminovat jejich negativní vliv na ţivotní prostředí. Snahy vyspělých společností chránit ţivotní prostředí vyústily ve vznik organizace nejen se snahou o srovnatelné emisní a imisní limity pro jednotlivé státy. Takovou organizací bylo Evropské hospodářské společenství, které bylo zaloţeno na základě Maastrichtské smlouvy (Smlouva o Evropské unii). Tato mezinárodní organizace sdruţuje státy Evropy a klade na ně nároky ve všech směrech. V zájmu ochrany ţivotního prostředí udává směr v oblasti legislativy, obsahující normy a limity pro emise a imise znečišťujících látek jednotlivých států. Bohuţel na světě se vyskytuje stále mnoho rozvojových zemí, které z důvodu nízké ekonomiky nemohou vyuţívat ekologicky šetrné technologie průmyslových výrob a metody zneškodňování látek vypouštěných do ţivotního prostředí. Látky, které v těchto zemích uniknou do ovzduší či vody jsou transportovány na velké vzdálenosti. Všechny ţivé organismy, včetně člověka, potřebují ke své existenci a prosperitě kvalitní ţivotní podmínky zahrnující nezbytný přísun ţivin, vody a vzduchu. Tyto jsou stále více kvalitativně ohroţovány. Z těchto důvodů představuje ochrana přírody a přírodních zdrojů nejen u nás, ale i na celém světě jeden z nejzávaţnějších úkolů. Z podnětu mezinárodních organizací byla vypracována světová strategie pro ochranu přírody. Jedná se o soubor doporučených nutných zákroků k ochraně ovzduší, vody, půdy, vymírajících druhů rostlin a ţivočichů. Tato strategie nebude nikdy konečná. Bude se stále vyvíjet s rozvojem technologií. Člověk je součástí přírody, která je pro jeho ţivot nezbytně nutná. Je proto důleţité omezit ničení a drancování přírodních zdrojů a zachovat je pro další generace. Je třeba zabývat se nejen řešením následků těchto problémů, ale především jejich příčin [1]. Pro tyto účely vypracovala světová organizace WHO (World Health Organisation; Světová zdravotnická organizace) komplexní soubor směrnic, ve kterém byly doporučeny směrné hodnoty pro specifické kontaminanty směrnice pro kvalitu ţivotního prostředí, hygienické a ekotoxikologické limity. Stanovováním těchto ekotoxikologických limitů se zabývá ekotoxikologie vyuţívající k tomuto účelu standardní a alternativní ekotoxikologické testy (mikrobiotesty), které vypovídají o přítomnosti xenobiotika v environmentální matrici a o jeho vlivu na organismy. Z výsledků těchto testů lze dále usuzovat na výši rizika pro ekosystém vyplývajícího z kontaminované matrice a určit druh opatření [1]. 7

2 KONTAMINACE ŢIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGE 2.1 Vymezení vědního oboru toxikologie a ekotoxikologie Toxikologie jako taková je nauka o jedech. Ovšem pojem jed je velmi široký. V zásadě se jedná o kteroukoliv sloučeninu vyvolávající poruchu biologických rovnováh charakteristických pro zdraví. O tomto procesu rozhoduje především dávka. I vysoce nebezpečné jedy v malých mnoţstvích nemusí vyvolat ţádné patologické změny. Za vhodných podmínek mohou být prospěšné jako léčiva. Pro ţivot běţné sloučeniny mohou naopak mít ve velkých dávkách za následek smrt. Jiţ Paracelsus definoval léčivé látky jako jedy, přičemţ rozdíl mezi jedem a lékem je v mnoţství podané látky [1, 2]. Předmětem ekotoxikologie je zkoumání negativních vlivů cizorodých látek na ekosystém jako celek. Lze tedy konstatovat, ţe ekotoxikologie je vědní obor na rozhraní ekologie a toxikologie. Definice ekotoxikologie byla jiţ mnohokrát pozměněna. Dnes ji definujeme jako vědu o kontaminantech v prostředí a jejich účinky na sloţky biosféry, včetně člověka [18]. Při posuzování ekotoxicity je důleţité znát jak fyziologické charakteristiky zkoumaného organismu, tak podmínky jeho ţivotního prostředí. Dalším nezbytným parametrem je čas. Vzhledem k času lze ekotoxikologii hodnotit retrospektivně, kdy jsou hodnoceny události z minulosti a jejich nynější a budoucí dopad na ekosystém, a progresivně, kdy jsou do budoucnosti hodnoceny havárie a jejich moţný negativní dopad na ţivotní prostředí. Hodnocení ekotoxicity je zaměřeno na testování akutních a chronických účinků látek, popřípadě kontaminovaných matric, na organismy a jejich společenstva, popřípadě na celé ekosystémy. Z rozdělení ekosystémů vychází i členění ekotoxikologie. A to na terestrickou a akvatickou. Ekotoxikologie terestrická zkoumá negativní vliv látek na samotnou funkci půdy a na půdní organismy (bakterie, ţíţaly) v ekosystémech (lesy, louky). Ekotoxikologie akvatická zkoumá negativní vliv látek na vodní ekosystémy (řeky, rybníky, jezera) a na vodní organismy (bakterie, řasy, vyšší rostliny, ryby) [18]. 2.2 Typy znečišťujících látek v prostředí Do prostředí se dostávají jak látky přirozené (přírodního původu), tak látky antropogenní. Zdroji přírodních látek jsou rozkladné procesy a vylučovací mechanismy organismů, které jsou nedílnou součástí přírodních procesů. Produkty těchto procesů jsou především látky organické. Dalším zdrojem mohou být sopečné erupce, ke kterým nedochází tak často, ale mnoţství uvolněných látek je vysoké. Při tomto procesu jsou naopak uvolňovány látky především anorganického charakteru, a to od plynů po pevné částice ve formě prachu. Zdrojem antropogenních látek je člověk a jeho činnost. Jedná se o širokou škálu chemických látek anorganického a organického charakteru ve formě různých detergentů, přírodních i umělých hnojiv, pesticidů a v neposlední řadě plynných i pevných emisí a odpadů z různých průmyslových odvětví. V posledních třech desetiletích je věnována nemalá pozornost těţko odbouratelným, tzv. perzistentním organickým polutantům (POPs). Jedná se o chemické látky s negativními účinky na organismy a vysokou odolností vůči fyzikálně-chemickým i biologickým rozkladným procesům [1, 2, 6, 14]. 8

2.3 Vliv a migrace znečišťujících látek v prostředí Znečišťující látky se dostávají do prostředí z individuálních zdrojů a na základě svých fyzikálně-chemických vlastností jsou transformovány a vstupují do biogeochemických cyklů v jednotlivých sloţkách ţivotního prostředí (ovzduší, vodní prostředí, půda, horniny a sedimenty). Ovzduší a voda jsou povaţovány za velmi dynamická média, která transportují řadu látek na velké vzdálenosti. Oproti tomu půda, sedimenty a organismy jsou povaţovány za zprostředkovatelská média pomalá nebo dokonce za dlouhodobé rezervoáry řady škodlivin. Znečišťující látky, které se dostaly do organismů, jsou za příznivých podmínek přeměňovány na metabolity procesem detoxikace, anebo se z nich tvoří škodlivé, reaktivní produkty. Cizorodé látky, tzv. xenobiotika, mají na organismy letální nebo subletální účinky. Některá xenobiotika mohou podléhat procesům biotransformace, bioakumulace či přenosu potravním řetězcem na další organismy (tzv. bioobohacováním) [2]. Bioakumulace je proces, při kterém dochází k akumulaci škodlivých látek přímo v tělech organismů prostřednictvím okolního média nebo přijímané potravy. Koncentrace akumulované látky v biotě je několikanásobně vyšší neţ koncentrace v prostředí, ve kterém dané organismy ţijí. Proces biokoncentrace spočívá v nárůstu koncentrace škodlivých látek vlivem okolního prostředí v důsledku současného vylučování a příjmu. Bioobohacováním dochází ke zvyšování koncentrace škodliviny ve vyšších trofických úrovních [14]. Protoţe ekotoxikologie se zabývá působením škodlivých látek na ekosystém jako celek, nelze studovat organismus a jeho reakce na škodliviny, aniţ bychom vzali v úvahu jeho okolní prostředí [2, 14]. Vliv znečišťujících látek na jednotlivé sloţky a funkce ekosystému znázorňuje obr. 1. 9

Obr. 1. Vliv a osud znečišťujících látek v životním prostředí [2]. 2.4 Typy environmentálních matric a zdroje kontaminace Prostřednictvím ekotoxikologických testů lze posoudit moţné vlivy chemických látek, popřípadě celé řady dalších materiálů na biotu všech environmentálních sloţek. Dále mohou být posuzovány přímo vlivy kontaminovaných sloţek, jako je voda, sediment a půda, na ţivé organismy. Jednotlivé sloţky jsou znehodnocovány různými způsoby. Jedny slouţí jako transportní médium (voda, vzduch) a druhé jako médium zadrţovací (půda, sedimenty a biota). Všechny tyto sloţky jsou nezbytné pro ţivot na planetě Zemi, a proto je nutné omezit jejich znečišťování na minimum [1, 2, 6]. 10

2.4.1 Voda Voda je základní sloţka důleţitá pro ţivot. Podle Darwinovy teorie v ní ţivot samotný vznikl a dodnes se bez ní ţádný organismus neobejde. Pokrývá více neţ tři čtvrtiny planety a tvoří tzv. hydrosféru, která zahrnuje moře, jezera, řeky, ledovce a vodu podzemní. Pouze 1 % z tohoto mnoţství tvoří voda sladká, která je pro ţivot nejpodstatnější. Protoţe voda je pro ţivot nepostradatelná, byl její význam pro člověka a ţivotní prostředí definován ve dvanácti bodech Evropské charty o vodě, která byla vyhlášena Evropskou radou ve Štrasburku 6. května 1948 [1]. Voda pro nás má existenční význam. I přes to je neustále znečišťována. Dochází k tomu především splachy a vyluhováním přirozených nebo neodborně aplikovaných látek z půdy, havarijními úniky chemických látek a v neposlední řadě přímým vypouštěním odpadních vod do vodních recipientů, které ačkoliv musí dodrţovat stanovené emisní limity, jsou kontinuálním zdrojem znečišťujících látek. Dále dochází ke druhotnému znečišťování vody prostřednictvím atmosférické depozice [6]. Zdroje znečištění Na znečišťování ţivotního prostředí, nejenom vody, se značnou měrou podílí zemědělství. Jedná se především o biologické znečištění ve formě močůvky, siláţních šťáv, fekálií a další hnijící organickou hmotou. Problematika spočívá především v hospodaření na velkých plochách, kde často dochází ke splachům pouţitých hnojiv a pesticidů (především chlorované, organofosforové a organokovové) [1, 6]. Preventivní opatření spočívá v uváţeném dávkování hnojiv a v zamezení průniku zbytků pesticidů, močůvky a siláţních šťáv do zdrojů vody se zvýšeným ohledem na zdroje vody pitné [6]. Současně se zemědělskou činností je největším znečišťovatelem průmysl. Pro znečištění vod mají hlavně význam ta odvětví průmyslu, která potřebují pro svoji činnost velká mnoţství technologické vody. Jedná se o průmysl zpracovávající kaolin a uhlí a dále odvětví, která potřebují velké objemy vody pro čištění či chlazení. Nařízení vlády č. 416/2010 Sb., o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění odpadních vod a náleţitostech povolení k vypouštění odpadních vod do vod podzemních, ukládá povinnost zajišťovat zneškodňování odpadních vod v souladu s podmínkami stanovenými v povolení k jejich vypouštění. Při povolování vypouštění odpadních vod stanoví vodoprávní úřad nejvýše přípustné hodnoty jejich mnoţství a znečištění, včetně specifikace nejlepších dostupných technologií v oblasti zneškodňování odpadních vod a podmínek jeho pouţití, které stanoví vláda nařízením. To vede k částečné eliminaci znečišťování odpadních vod [1, 3, 6, 62]. Těţba a zpracování ropy mají vysoký podíl na znečištění vody i půdy ropou a uhlovodíky, které se uvolňují při jejím zpracování, a značným mnoţstvím kalů. S tím souvisí výroba koksu, která je zdrojem rizikových kovů, fenolů, sirovodíku a mnoha dalších škodlivých znečišťujících látek. Na obsahu těţkých kovů ve vodách se nejvíce podílí výroba a zpracování kovů. Strojírenská výroba kontaminuje vodu oleji, chladícími emulzemi i sloţkami galvanických lázní. Hydrogensiřičitany a organickými látkami znečišťuje vodu papírenský průmysl. Chemický průmysl je zdrojem mnoha látek. Typ kontaminantů se liší dle druhu výrobního procesu. Jedná se o různé detergenty, rozpouštědla, anorganické a organické látky ve formě kyselin, louhů, chlorovaných látek a mnoha dalších. Významným zdrojem 11

organického znečištění je potravinářský průmysl, který je především zdrojem těţko odbouratelných organických látek (tuky, kvasinky) [1, 6]. V těchto odvětvích jsou řešením pro eliminaci znečištění vody moderní technologie s uzavřeným oběhem vody a interní čistírny odpadních vod [6]. Celosvětově významné znečišťovatele představují lidská sídla. Jedná se o malé zdroje znečištění, ale vyskytují se v takovém mnoţství, ţe ovlivňují vodní recipient stejnou měrou jako velké zdroje. Z těchto zdrojů se do vody dostávají splaškové vody z domácností, které jsou organicky i mikrobiálně znečištěné a navíc obsahují další znečišťující látky, jako jsou například prací prostředky, které jsou zdrojem fosforu a povrchově aktivních látek. Znečištění vody z lidských sídel je řešeno budováním čistíren odpadních vod (ČOV). Jejich provoz je nákladný a přes zdokonalující se technologie čištění se stále vyskytují látky, které nedokáţe odstranit ani v současné době pouţívané třístupňové čištění. Tento problém lze eliminovat co největším omezováním vypouštění nebezpečných látek. V pracích a čisticích prostředcích jsou ekologicky škodlivé látky nahrazovány ekologicky šetrnými. Především jsou nahrazovány fosfáty a povrchově aktivní látky, které se podílejí na eutrofizaci vod a brání výměně plynů ve vodách [1, 6]. Způsob sledování znečištění odpadních vod a měření vypouštěného objemu odpadních vod udává 6 Vyhlášky č. 293/2002 Sb., o poplatcích za vypouštění odpadních vod do vod povrchových [17]. 2.4.2 Vzduch Kvalitní ovzduší, stejně jako voda, je pro ţivot na modré planetě nezbytné. Tvoří atmosféru, která chrání planetu před nebezpečným UV zářením z vesmíru a její příznivé sloţení poskytuje organismům ţivotně důleţitý kyslík. Znečišťování ovzduší jde ruku v ruce s technickým rozvojem společnosti. Vypouštěním mnoha kontaminantů do ovzduší klesá jeho kvalita a dochází k poškozování rostlin a zhoršování zdravotního stavu ţivočichů i člověka. Rozhodně se ale nejedná o fenomén poslední doby. Jiţ v r. 1272 se anglický král Edward I pokoušel zbavit Londýn smogu zákazem pouţívání uhlí [1, 6]. Zdroje znečištění Dle Zákona č. 86/2002 Sb., o ochraně ovzduší a o změně některých dalších zákonů (Zákon o ochraně ovzduší) se znečišťující látkou rozumí jakákoliv látka vnesená do vnějšího ovzduší nebo v něm druhotně vznikající, která má přímo, a nebo můţe mít po fyzikální nebo chemické přeměně nebo po spolupůsobení s jinou látkou škodlivý vliv na ţivot a zdraví lidí a zvířat, na ţivotní prostředí, na klimatický systém Země nebo na hmotný majetek [7]. Ke znečišťování ovzduší dochází přímým vypouštěním látek nebo chemickými ději probíhajícími v atmosféře. Dle tohoto kritéria lze kontaminanty ovzduší rozdělit na primární a sekundární. Primární zdroje se týkají přímého vypouštění látek, tedy exhaláty. Ty mohou mít původ jak antropogenní, tak přírodní. Exhaláty vypouštěné do ovzduší z konkrétního zdroje v určitém čase jsou emise. Emise jsou látky tuhého, kapalného či plynného skupenství, které jsou obsaţeny v plynech vstupujících do atmosféry ze zdroje znečištění. Jednotlivé sloţky emisí spolu vzájemně interagují a vlivem fotochemických dějů dochází ke vzniku pestré škály látek zvaných imise. Imise jsou látky, které se vyskytují v ovzduší 12

a vlivem atmosférických sráţek jsou splachovány na povrch země, tudíţ charakterizují zatíţení plynnými a tuhými látkami ve vznosu [1, 6]. Mezi plynné emise patří SO 2, NO X, které se podílejí na acidifikaci a dále CO 2, podílející se na globálním oteplování. Dalšími plynnými emisemi jsou výfukové plyny, které podněcují vznik troposférického ozonu a freony poškozující ozonovou vrstvu [6]. Ačkoliv výroba a pouţívání freonů byla regulována jiţ od roku 1985 Vídeňskou úmluvou na ochranu ozonové vrstvy a následně byla změnou Montrealskému protokolu O látkách, které poškozují ozonovou vrstvu z roku 1997 zcela zakázána, budou tyto látky ještě dlouhou dobu ozonovou vrstvu poškozovat vzhledem k jejich stabilitě a mnoţství v atmosféře [10]. Pevné emise jsou částice uvolněné do ovzduší spalovacími procesy, při úpravě surovin a výrobách. Tyto částice působí znečištění mechanické (popílek způsobující ucpávání průduchů rostlin) a chemické, jehoţ účinek je ovlivněn obsahem rizikových kovů (např. kadmium, rtuť, olovo). Pevné částice se v atmosféře podílejí i na vzniku smogu. Na produkci plynných i pevných emisí se zejména podílejí tepelné elektrárny, doprava a lidská sídla [6]. Pro preventivní sniţování je koncentrace polutantů v ovzduší udávána nejvyššími přípustnými koncentracemi (průměrnými denními a maximálními koncentracemi). Dále jsou stanoveny emisní a imisní limity Vyhláškou č. 337/2010 Sb., o emisních limitech a dalších podmínkách provozu ostatních stacionárních zdrojů znečišťování ovzduší emitujících a uţívajících těkavé organické látky a o způsobu nakládání s výrobky obsahující těkavé organické látky, a Vyhláškou č. 553/2002 Sb., kterou se stanoví hodnoty zvláštních imisních limitů znečišťujících látek, ústřední regulační řád a způsob jeho provozování včetně seznamu stacionárních zdrojů podléhajících regulaci, jsou stanoveny zásady pro vypracování a provozování krajských a místních regulačních řádů a způsob a rozsah zpřístupňování informací o úrovni znečištění ovzduší veřejnosti [1, 11, 12]. 2.4.3 Půda Další sloţkou ţivotního prostředí, která má důleţitý význam pro ţivot je půda. Jedná se v podstatě o systém ţivých a neţivých součástí. Neţivé součásti tvoří převáţnou hmotu půdy; jsou to především látky anorganického původu (zvětralé horniny, sedimenty, ale i půdní vzduch a voda) a organického původu (produkty rozkladných procesů ve formě humusu). Ţivé součásti jsou organismy a mikroorganismy ţijící v půdě, které jsou souhrnně nazývány půdní edafon. Půda, ve které se nevyskytují organické látky a půdní edafon, nemá ţádnou hodnotu [1, 6]. Ochrana půdy, především zemědělského půdního fondu, je definována Zákonem č. 334/1992 Sb. České národní rady, o ochraně zemědělského půdního fondu [16]. Zdroje znečištění Stejně jako je tomu u vody a ovzduší, je hlavním zdrojem znečištění antropogenní činnost. Z různých průmyslových odvětví je vypouštěna řada exhalátů a odpadů, které ohroţují kvalitu půdy především sekundárními vlivy. K nejzávaţnějším znečišťovatelům půdy nesporně patří zemědělství. Problémy představuje především hospodaření na velkých plochách, kdy můţe docházet k masové degradaci půdy a ovlivnění jejích fyzikálně-chemických a biologických vlastností neodborně pouţívanými hnojivy, pesticidy a neadekvátními agrotechnickými zásahy. Významný problém představuje 13

i pěstování monokultur, kdy dochází k velkému úbytku specifických ţivin pro danou monokulturu. Moţnou cestou ke zlepšení situace je ekologizace zemědělství. To spočívá v omezení hnojiv a pesticidů, nebo v jejich nahrazení ekologicky šetrnými prostředky. Dalšího zlepšení je moţné dosáhnout udrţováním vyrovnaného stavu půdy, a to sezónní obměnou pěstovaných kultur, sniţováním kyselosti půdy a zabraňováním úniku humusu. Dalšími zdroji znečištění půd jsou různá průmyslová odvětví, energetika, doprava a lidská sídla. Ze všech těchto zdrojů jsou do ovzduší vypouštěny emise, které se prostřednictvím suché a mokré atmosférické depozice dostávají do půd. V půdách jsou ve většině případů různě transformovány, popřípadě různými mechanismy sorbovány, a přispívají tak ke zhoršování její kvality [1, 6]. 14

3 EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY Reakce, kdy je jednoduchý organismus se známými ţivotními projevy, stavbou těla a fyziologií v uměle vytvořeném prostředí vystaven známé koncentraci známé látky, jsou sledovány prostřednictvím tzv. ekotoxikologických testů. Stejně tak jsou prostřednictvím těchto testů sledovány reakce organismů na působení prostředí, u kterého nejsou známy konkrétní vlastnosti. Z následné reakce organismu jsou vyvozovány rizika pro volně ţijící populace [2]. Vědecký základ testování ekotoxicity zahrnuje znalost škodlivého působení určité látky a hodnocení mnoţství látky, kterému můţe být organismus vystaven, aniţ by byly ohroţeny jeho ţivotní projevy a fyziologické funkce. Účelem ekotoxikologických testů je hodnocení bezpečnosti, popřípadě rizika látky pro ekosystém a stanovení přípustných limitů pro různé typy expozice [1, 5, 14]. 3.1 Rozdělení ekotoxikologických biotestů Ekotoxikologické testy lze třídit mnoha způsoby dle různých ukazatelů. Jedním z nich je expoziční doba, podle které se biotesty dělí na akutní (krátkodobé), semichronické a chronické (dlouhodobé). Dalším hlediskem je trofická úroveň organismů, podle které se biotesty rozlišují na testy na producentech, konzumentech a dekompozitorech (destruentech). Nejčastěji je pouţíváno rozdělení testů podle prostředí, ve kterém jsou prováděny. Z toho pohledu rozeznáváme testy terestrické a akvatické. První z nich probíhají v kontaktním uspořádání, tzn., ţe látky (popř. odpady) jsou testovány v pevném stavu na uměle vytvořených nebo přírodních půdách. V případě testů akvatických jsou testované látky převáděny do roztoků, popřípadě jsou testovány vodné výluhy pevných nerozpustných vzorků (odpadů). Biotesty lze rozdělit i podle zkoumané matrice. Matrice mohou být abiotické (voda, půda, vzduch) a biotické (rostliny, ţivočichové). Důleţitým hlediskem je pokročilost metod stanovení, podle které se testy dělí na testy první, druhé a třetí generace. Jedná se o hlavní rozdělení, pod které spadají výše uvedené testy. Testy první generace představují testy standardní, které udává legislativa. Testy druhé generace jsou alternativní biotesty, tzv. mikrobiotesty. A testy třetí generace zahrnují biosenzory, biomarkery a biofondy. Tyto metody jiţ mají význam pro monitoring ţivotního prostředí [13]. 3.1.1 Testy akutní a semichronické ekotoxicity Testy akutní ekotoxicity slouţí k hodnocení okamţitého účinku xenobiotik na organismy. Obvykle je hodnocena mortalita po 24 aţ 96 hodinovém intervalu. V dnešní době jsou tyto testy pouţívány jak v akvatické, tak v terestrické ekotoxikologii. Pro hodnocení akutní ekotoxicity je udáno mnoho standardních biotestů, které byly zveřejněny organizacemi ISO (International Organisation of Standardisation; Mezinárodní organizace pro standardizaci), US EPA (United States Environmental Protection Agency; Agentura Spojených států amerických pro ochranu ţivotního prostředí), ASTM (American Society for Testing and Materials; Americká společnost pro zkoušení a materiály), OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development; Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj) a mnoha dalšími. 15

Tyto testy se nejčastěji pouţívají pro testování ekotoxicity na zelených řasách (Raphidocelis subcapitata), mořských řasách (Skeletonema costatum), perloočkách (Daphnia magna), rostlinách okřehku (Lemna minor) a na některých druzích sladkovodních ryb (sumec velký, pstruh duhový) [13]. Semichronická toxicita, toxicita po opakované dávce, zahrnuje nepříznivé účinky, které se u pokusných zvířat projevují po opakované denní expozici chemické látce, nebo expozici po významnou část ţivota organismu (obvykle nepřesahující 10 %). Perioda expozice se pohybuje v rozsahu od několika dní po šest měsíců [2, 5]. 3.1.2 Testy chronické ekotoxicity Testy chronické ekotoxicity se pouţívají k posouzení negativních vlivů xenobiotik při jejich dlouhodobém působení na organismy. Doba expozice představuje desetinu i větší část ţivotního cyklu organismu. Tyto testy hodnotí negativní ovlivnění růstu, rozmnoţovacího mechanismu a vylučovacího metabolismu organismu, včetně mortality. Testovací organismy jsou většinou dafnie (Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia), střevle (Pimephales promelas), larvy pakomárů (Chironomus tentans), plţi (Hyalella azteca) [2, 5, 13]. 3.1.3 Akvatické biotesty Tyto testy se pouţívají pro hodnocení negativních vlivů xenobiotik na organismy ve vodním prostředí. Pro hodnocení jsou pouţívány organismy všech trofických úrovní (producenti - konzumenti - destruenti). Jako testovací organismy se pouţívají řasy (Pseudokirchneriella subcapitata), rostliny okřehku (Lemna minor) na úrovni producentů, perloočky (Daphnia magna), nitěnky (Tubifex tubifex) na úrovni konzumentů a bakterie (Vibrio fischeri) na úrovni dekompozitorů. Dále jsou pouţívány vhodné druhy sladkovodních ryb a obojţivelníků [13, 14]. 3.1.4 Terestrické biotesty Jedná se o testy, které hodnotí škodlivé vlivy kontaminovaných matric nebo jednotlivých xenobiotik na terestrické organismy a ekosystémy. Lze hodnotit účinky na producenty, konzumenty, dekompozitory a dále ovlivnění půdního biotopu. Tyto testy oproti testům akvatickým probíhají kontaktním způsobem přímo v pevné testované matrici. Pro tyto testy jsou vyuţívány vhodné druhy rostlin, např. hořčice bílá (Sinapis alba), cukrová řepa (Beta vulgaris), ječmen (Hordeum vulgare), cibule (Allium cepa). Jsou vyuţíváni i bezobratlí jako je včela (Apis mellifera), moucha (Musca autumnalis), hlístice (Panagrellus redivivus), ţíţala (Enchytraeidae) [13, 14]. 16

3.2 Princip ekotoxikologického testu Cílem ekotoxikologie je v prvé řadě hodnotit potenciální nebezpečí pro ekosystém jako celek. To znamená, ţe výběr testovacích organismů k testům ekotoxicity musí být takový, aby zahrnoval jednotlivé trofické úrovně daného ekosystému (producent - konzument - destruent). Prakticky se tedy jedná o bakterie, řasy, bezobratlé a ryby. Bakterie jakoţto destruenti jsou nedílnou sloţkou ţivotního prostředí, protoţe se podílejí na koloběhu ţivin. V ČR ovšem zatím není hodnocení účinků chemických látek na bakterie vodního prostředí vyţadováno legislativou [5]. Postup testování případné ekotoxicity chemických látek na vodním organismu Daphnia magna znázorňuje schéma na obr. 3. Obr. 3. Postup hodnocení ekotoxicity chemických látek na Daphnia magna [14]. Limitní test Prvním krokem testování ekotoxicity je limitní test, jehoţ účelem je zjistit, zda je látka toxická či nikoliv. Testovací organismy jsou tedy vystaveny účinku zkoušené látky o neznámém vlivu a je hodnocena reakce testovacích organismů na koncentraci 100 mg.l -1. Jsou prováděny dva paralelní testy se dvěma kontrolami. Nedochází-li k ţádnému úhynu organismů, je limitní test hodnocen jako negativní a provádí se ověřovací test [5, 14]. 17

Ověřovací test Tímto testem je ověřován negativní výsledek limitního testu v šesti paralelních nasazeních. Jestliţe v testovaných roztocích zkoušené látky nedochází k úhynu převyšujícím o 10 % úhyn v kontrole, je ověřovací test hodnocen jako negativní a další zkoušky se jiţ neprovádějí. Avšak převyšuje-li úhyn v testovaném roztoku o více neţ 10 % úhyn v kontrole, je ověřovací test hodnocen jako pozitivní a další postup se odvíjí od míry pozitivní reakce organismů. V případě, kdy mortalita nepřekračuje 50 %, nejsou prováděny další testy a získané informace se zaznamenávají do protokolu. Pokud mortalita překračuje hodnotu 50 %, provádí se předběţný test [5, 14]. Předběžný test Předběţný test určuje rozmezí, ve kterém lze očekávat hodnotu EC 50 zkoušené látky. O výsledku ekotoxikologických testů rozhoduje konkrétní typ testu, který sleduje mortalitu a inhibici organismů. K tomuto testu se pouţívá deset koncentrací testované látky, které jsou voleny v širokém rozmezí. V tomto případě obvykle postačuje otestovat pouze jednu koncentrační řadu při nasazení menšího počtu organismů. Nejčastěji jsou do kaţdé koncentrace nasazovány čtyři organismy. Účelem tohoto testu je zjistit hodnotu OC 0 (orientační koncentrace 0 ), coţ je hodnota nejvyšší koncentrace látky, při které ještě nedochází k úhynu či imobilizaci organismů a hodnotu OC 100 (orientační koncentrace 100 ), coţ je hodnota nejniţší koncentrace, která má letální účinek [5, 14]. Závislost předpokládané negativní odezvy organismu (mortalita, inhibice) na vzrůstajícím logaritmu koncentrace je znázorněna na obr. 4. Obr. 4. Závislost předpokládané negativní odezvy organismu [14]. 18

Základní test Pro vlastní určení hodnoty EC 50 (LC 50 ) je pouţíván základní test. Při testování je obvykle pouţito sedm vodných výluhů o různých koncentracích pohybujících se v rozmezí, které bylo udáno předběţným testem. Ředění zkoušených roztoků se provádí tak, aby ve třech či více ředěních došlo kolem předpokládané hodnoty EC 50 (LC 50 ) k 5 95% negativnímu dopadu na organismy (mortalita, inhibice). Na začátku i na konci testu je odečítána teplota, ph kaţdého roztoku a koncentrace rozpuštěného kyslíku. Ze zjištěných dat je vyhodnocena hodnota EC 50 (LC 50 ) [14]. K ověření výše vedených testů a v řadě případů k výpočtu ekotoxikologických hodnot, slouţí kontrolní testy, které probíhají za stejných podmínek se stejným počtem a druhem testovacích organismů stejně jako pokus. Kontrolní organismy jsou nasazovány do ředící vody bez přítomnosti testované látky pro ověření jejich kondice a zdravotního stavu i pro ověření podmínek testu. Jako ředící voda je pouţívána voda o známých fyzikálně-chemických vlastnostech. V prvé řadě voda nesmí obsahovat zbytkový chlor ani rezidua toxických látek a musí vyhovovat fyziologickým potřebám organismů. Pro zajištění srovnatelných výsledků je doporučena příprava tzv. umělé ředící vody, čímţ je zaručeno její stejné sloţení ve všech laboratořích [5]. Pro moţnost srovnání výsledků různých laboratoří je třeba, aby laboratoře postupovaly dle shodných metodik standardizovaných na mezinárodní úrovni organizací ISO a OECD. Při provádění testů na vyšších organismech je nutné řídit se zásadami Zákona č. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání a Vyhlášky Mze ČR č. 311/1997 Sb., o chovu a vyuţití pokusných zvířat [5]. 19

3.3 Výsledky ekotoxikologického testu Výsledkem ekotoxikologického testu je hodnota EC 50, resp. LC 50 nebo IC 50. Hodnota EC 50 udává efektivní koncentraci látky, při které je pozorována 50% odezva organismů. Hodnota LC 50 udává letální (smrtelnou) koncentraci látky, při které je pozorována smrt u 50 % jedinců. Hodnota IC 50 udává inhibiční koncentraci, při které je způsobena inhibice růstu kořene nebo růstové rychlosti u 50 % testovacích rostlin. Vedle hodnot koncentrací jsou uváděny i hodnoty ED 50, resp. LD 50, ID 50. Hodnota ED 50 udává efektivní dávku látky, při které je pozorována 50% odezva organismů. Hodnota LD 50 udává letální dávku látky, při které je pozorována smrt u 50 % jedinců. Hodnota ID 50 udává inhibiční dávku, při které je způsobena inhibice u 50 % jedinců. Tyto hodnoty lze uvádět pro různá procentuální zastoupení odezvy organismů. Ty slouţí pro doplňkovou charakterizaci negativního vlivu látky na organismus. Dále jsou uváděny indexy NOEL, NOAEL, NOEC, LOEL, LOAEL a LOEC. Index NOEL (No Observed Effect Level; Nejvyšší dávka bez pozorovaného účinku) udává nejvyšší hodnotu dávky, při které není pozorovatelný ţádný znatelný účinek. Index NOAEL (No Observed Adverse Effect Level; Nejvyšší dávka bez pozorovaného nepříznivého účinku) udává nejvyšší hodnotu dávky, při které není pozorován statisticky významný negativní účinek v porovnání s kontrolou. Index NOEC (No Observed Effect Concentration; Koncentrace bez pozorovaného účinku) udává nejvyšší koncentraci, při které není pozorovatelný významný účinek. Index LOEL (Lowest Observed Effect Level; Nejniţší koncentrace s pozorovaným účinkem) udává nejniţší dávku, při které je pozorovatelný významný účinek. Index LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level; Nejniţší dávka s pozorovaným nepříznivým účinkem) udává nejniţší hodnotu dávky, při které je pozorován statisticky významný nepříznivý účinek. Index LOEC (Lowest Observed Effect Concetration; Nejniţší koncentrace s pozorovaným účinkem) udává nejniţší hodnotu koncentrace, při které je pozorován statisticky významný účinek [14, 15]. 20

4 ALTERNATIVNÍ EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY VERSUS STANDARDNÍ BIOTESTY 4.1 Alternativní ekotoxikologické testy Jak samotné označení testů napovídá, jedná se o testy, které byly vyvinuty jako alternativy ke stávajícím standardním tesům. Alternativní ekotoxikologické testy jsou označovány pojmem mikrobiotesty. Celosvětově uznávanou řadu mikrobiotestů tvoří tzv. Toxkity. Toxkity vznikly v důsledku neustálého vývoje kontrolované produkce testovacích organismů a jejich uchovávání v latentní fázi. Tyto testy tedy obcházejí potřebu kontinuální kultivace organismů a náklady spojené s obhospodařováním jiţ ţivých organismů. Vedle toho, ţe časově ani finančně nezávisí na celoroční kultivaci ţivých kmenů organismů, převaţují nad standardními testy i svojí praktičností a uţivatelskou přívětivostí. Tím pádem jsou Toxkity ekonomičtější a časově málo náročné. Tyto výhody činí Toxkity populárními pro rutinní aplikace v akvatické i terestrické ekotoxikologii [13, 22, 28]. Všechny Toxkity jsou vhodné pro hodnocení rizika způsobené kontaminací chemickou látkou. Částečně jsou vhodné i pro posouzení ekotoxicity kontaminovaných vodních a terestrických biotopů, odpadních vod i pevných odpadů. Protoţe jsou všechny ekotoxikologické testy druhově specifické a neexistuje druh, který by byl výrazně citlivý na všechny chemikálie, musí být pro hodnocení rizika aplikována baterie testů. Ta by měla sestávat z více Toxkitů druhově reprezentativních pro jednotlivé trofické úrovně potravního řetězce (producent - konzument - destruent) [21]. 4.1.1 Přehled alternativních ekotoxikologických testů V následujících tabulkách jsou uvedeny baterie testů pro sladkovodní, mořské a terestrické ekosystémy a pevné matrice. Tab. č. 1: Baterie testů pro sladkovodní ekosystémy [21]. Úroveň Skupina trofie organismů Toxkit Endpoint Testované druhy P mikrořasy Algaltoxkit F inhibice růstu K D Pseudokirchneriella subcapitata Daphtoxkit F imobilizace magna /mortalita Daphnia magna korýši Daphtoxkit F pulex mortalita Daphnia pulex Thamnotoxkit F mortalita Thamnocephalus platyurus prvoci Protoxkit F inhibice růstu Tetrahymena thermophila bakterie Toxi-screening Kit inhibice luminiscence Vibrio fischeri P producenti, K konzumenti, D dekompozitoři 21

Tab. č. 2: Baterie tesů pro mořské ekosystémy [21]. Úroveň Skupina Toxkit Endpoint Testované druhy trofie organismů Phaeodactylum P mikrořasy Algaltoxkit inhibice růstu tricornutum K vířníci Rotoxkit M mortalita Brachionus plicatilis D bakterie Toxi-screening Kit inhibice luminiscence Vibrio fischeri Tab. č. 3: Baterie testů pro terestrické ekosystémy a pevné matrice [21]. Úroveň Skupina Toxkit Endpoint Testované druhy trofie organismů vyšší předčasný růst Sinapis alba P Phytotoxkit rostliny rostliny Lepidium sativum mortalita Heterocypris K korýši Ostracodtoxkit /inhibice růstu incongruens D bakterie Pro tuto trofickou úroveň není definován ţádný Toxkit Toxkity jsou dodávány ve formě setů akutních a semichronických testů. Tyto sety obsahují především jednotlivé druhy organismů, které patří do několika fylogenetických skupin (mikrořasy, vířníci, korýši a prvoci) v latentní (imobilizované) fázi, chemikálie pro dané stanovení, laboratorní pomůcky z biologicky inertního materiálu a přesný postup provedení zkoušky a její vyhodnocení. Tyto testy byly postupně vyvinuty a jsou komerčně dostupné v různých firmách (např. MicroBioTests Inc.) [21, 28]. 4.1.1.1 Algaltoxkit F Jedná se o test semichronické inhibice růstu mikrořasy Pseudokirchneriella subcapitata, dříve zvané Selenastrum capricornutum (obr. 4). Test je dodáván ve formě sady, která obsahuje samotné řasové kultury ve formě korálků. Řasové kultury jsou v latentní (inhibované) formě. Jeden korálek obsahuje více neţ jeden milion řasových buněk. Test lze provádět do 30 minut od uvolnění řasových buněk z korálků. Stanovení optické hustoty trvá méně neţ 15 minut. Samotná zkouška trvá 72 hodin a výstupem je hodnota 72hEC 50. Pro stanovení jsou pouţívány speciální dlouhé kyvety, ve kterých probíhá samotný test, zhotovené z biologicky inertního materiálu, coţ zajišťuje jednotné podmínky inkubace. Pracovní doba je sníţena přímým měřením růstu řas ve spektrofotometru. Algaltoxkit F koresponduje s ISO a OECD normami pro 72 hodinový test inhibice růstu sladkovodních řas. Jediný rozdíl je v tom, ţe Algaltoxkit F vyuţívá imobilizované mikrořasy z řasových korálků [13, 20, 21, 22, 23, 30]. Algaltoxkit F lze pouţít téměř pro všechny druhy vodných roztoků, včetně výluhů sedimentů. Problematické můţe být zakalení nebo zbarvení vzorku, které negativně ovlivňuje zkoušku [13]. 22

Obr. 4: Řasa Pseudokirchneriella subcapitata a řasové korálky [24, 25]. 4.1.1.2 Daphtoxkit F Daphtoxkit F se pouţívá pro hodnocení akutní imobilizace či mortality korýše Daphnia magna a Daphnia pulex (obr. 5). Test je rovněţ dodáván ve formě sady, která obsahuje klidová stádia testovacích organismů ve formě latentních cyst, tzv. ephippií. Ephippia jsou uchovávána při anoxických podmínkách. Daphnia pulex byla do testu zařazena především z toho důvodu, ţe má oproti Daphina magna lepší schopnost tvořit ephippie. Principem zkoušky je 24 aţ 48 hodinová expozice neonátních organismů vylíhnutých z ephippií zkoušené látce. Právě pouţíváním neonátních organismů z ephippií se Daphtoxkit F liší od standardní zkoušky. Neonátní organismy jsou získávány 72 aţ 96 hodinovou inkubací cyst Daphnia magna. Pro zkoušku je vyţadováno minimálně 120 jedinců, kteří nesmí být starší 24 hodin. Laboratorní pomůcky pro test jsou zhotoveny z biologicky inertního materiálu. Výsledky testu jsou hodnoty EC 50 nebo LC 50. Daphtoxkit F koresponduje s ISO a OECD normami pro test akutní imobilizace na perloočkách Daphnia magna [13, 21, 22, 29, 30]. Daphtoxkit F je vhodný pro všechny druhy vodných roztoků, včetně výluhů sedimentů a pevných matric. Lze ho pouţít jako prověřovací zkoušku nebo jako zkoušku pro přesné hodnocení účinku látek na testovací organismus. Daphtoxkit F společně s Algaltoxkitem F jsou velmi vhodné pro ekonomicky efektivní monitorování průmyslových odpadních vod [13]. Obr. 5: Perloočky Daphnia magna, Daphnia pulex a ephippie [21, 26, 27]. 23

4.1.1.3 Thamnotoxkit F Thamnotoxkit F je 24 hodinová zkouška zaloţená na hodnocení mortality korýšů Thamnocephalus platyurus (obr. 6). Thamnocephalus platyurus je organismus, který obývá extrémní biotopy, jimiţ jsou bahnité vody, které se vyznačují alkalitou. Test je dodáván ve formě sady, která obsahuje vše potřebné pro provedení zkoušky, včetně testovacích organismů ve formě latentních cyst (vajíček), které je moţné snadno inkubovat v kultivačním roztoku dle standardního postupu. Principem zkoušky je 24 hodinový kontakt organismů se zkoušenou látkou na destičkách v jednotlivých jamkách, které jsou zhotovené z biologicky inertního materiálu. To zajišťuje jednotné expoziční podmínky. Zkouška by neměla přesáhnout doporučenou dobu 24 hodin kvůli dokrmování organismů, popřípadě kvůli úmrtí hladověním. Tato zkouška je v některých případech citlivější neţ standardní zkouška akutní mortality na sladkovodních korýších Daphnia magna. Specificky citlivá je na biotoxiny produkované zeleno-modrými řasami (např. cytotoxiny vylučované sinicemi). Výsledkem zkoušky je hodnota 24hLC 50. Akutní mikrobiotest s korýšem Thamnocephalus platyurus je uznáván jako regulérní test v několika zemích. Tento test je vhodný pro čisté sloučeniny, splaškové vody, výluhy sedimentů, povrchové a podzemní vody, odpadní vody a výše uvedené biotoxiny. Zákal ani zabarvení vody zkoušku neovlivňuje [13, 21, 32]. Obr. 6: Korýši Thamonocephalus platyurus [30, 31]. 4.1.1.4 Protoxkit F Protoxkit F je 24 hodinová zkouška růstové inhibice nálevníků (Ciliata) Tetrahymena thermophila nebo Tetrahymena pyriformis (obr. 7). Test patří mezi subchronické multigenerační testy. V průběhu testu se obmění aţ šest generací. Nálevníci jsou důleţitou součástí bentické mikrofauny a hrají klíčovou roli v recyklaci organických materiálů. Vedle bakterií tvoří důleţitou skupinu bioty, která se vyskytuje v aktivovaném kalu pouţívaném na ČOV. Testovací organismy jsou součástí sady, dodávané ve vialkách v imobilizovaném stavu v prostředí specifického média, které zajišťuje vhodné podmínky pro jejich uchovávání. Zkouška je zaloţena na měření přeměny potravy na biomasu nálevníků v závislosti na turbiditě (zákalu). V případě, ţe se organismy rozmnoţují normálně a nejsou ohroţovány kontaminantem, je po 24 hodinách spotřebován potravinový substrát a není registrován ţádný zákal. V případě, ţe je přítomný kontaminant, organismy nespotřebují veškerou potravu a je patrný zákal matrice. Stupeň inhibice je tedy indikován nepřímo turbiditou v závislosti 24

na spotřebě potravinové suspenze organismy. Protoxkit F pouţívá pro měření turbidity jednorázové spektrofotometrické kyvety, ve kterých je prováděna i samotná expozice. Citlivost organismů je srovnatelná s ostatními nálevníky obsaţenými v aktivovaných kalech, a proto jsou právě tyto organismy dobrým indikátorem ekotoxikologického nebezpečí přitékajících vod na ČOV. Zkouška je vhodná pro čisté sloučeniny, splašky, výluhy sedimentů, povrchové i podzemní vody a odpadní vody. Výsledky zkoušky mohou být negativně ovlivněny zákalem matrice. Výsledkem zkoušky je hodnota 24hEC 50. Dále mohou být stanoveny hodnoty NOEC a LOEC. Metodický pokyn pro Protoxkit F na organismech rodu Tetrahymena koresponduje s příslušnou OECD normou [13, 33]. Obr. 7: Nálevníci rodu Tetrahymena [34, 35, 36]. 4.1.1.5 Rotoxkit M Rotoxkit M je 24 aţ 48 hodinová zkouška mortality mořských vířníků Brachionus plicatilis (obr. 8). Vířníci druhu Brachionus plicatilis jsou euryhalinní organismy, které umoţňují provádět zkoušky vodných matric od stupně salinity 5 ppt (brakické vody) do 35 ppt (mořské vody). Tato zkouška lze provést i pro sladkovodní ekosystémy se sladkovodními vířníky Brachionus calyciflorus, na místo mortality je však hodnocena inhibice reprodukce. Pro provedení zkoušky jsou pouţívány neonáty těchto vířníků, které jsou v určitém ročním období nejrozšířenějším organismem zooplanktonu, a proto jsou vhodnými testovacími organismy. Vířníci jsou ekologicky významnou součástí akvatických komunit a vyznačují se rychlou reprodukcí, krátkou generační dobou a dobrou citlivostí. Velmi dobře tvoří latentní cysty, které jsou pouţívány v sadách komerčních testů. Organismy vhodné pro test se z latentních cyst líhnou po dobu 24 hodin. Citlivost testu je závislá na chemických vlastnostech zkoušené látky a lze částečně zvýšit prodlouţením expoziční doby z 24 hodin na 48 hodin. Pouţívané testovací organismy jsou poměrně malé (250 400 μm) a manipulace s nimi je časově náročná. Výsledkem testu je hodnota 24(48)hLC 50. Tento mikrobiotest je vhodný pro testování čistých sloučenin, kontaminovaných mořských vod, splašků, odpadních vod a výluhů sedimentů. Test není vhodný pro posuzování havárií vzhledem k 24 hodinovému líhnutí organismů z latentních cyst. Rotoxkit odpovídá Francouzskému standardu pro stanovení chronické ekotoxicity Brachionus calyciflorus (AFNOR NF T90-377 2000), který je konečným stupněm hodnocení environmentálních matric akceptovaným ISO normou (ISO/CD 20666 2005) [13, 22, 28, 37]. 25