Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa a skládání proteinů - translace Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodické přístupy molekulární biologie
Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Deoxyribonukleová kyselina (DNA) Ribonukleová kyselina (RNA) Každá monomerní jednotka obsahuje: 1) Fosfátovou skupinu 2) Pětiuhlíkatý monosacharid Ribosa 2-deoxyribosa 3) Base Purinové a pyrimidinové stejné
Nukleové báze
Vlastnosti nukleových bází souvisí s jejich funkcí Planární Keto-enol tautomerie Slabě bazické Spektrální - UV
Strukturní jednotky NK Uhlíkové atomy v cukerné části číslovány s čárkou O O P O HO O H 2 C 5 O C 4 H H C 1 H C 3 C 2 H O OH H NUKLEOSID Monosacharid + base base Monomerní jednotka RNA Monomerní jednotka DNA Glykosidická vazba Mezi C 1 monosacharidu a N base NUKLEOTID C5 - fosforylovaný derivát nukleosidu, monomerní jednotka NK
Glykosidická vazba v nukleosidech a nukleotidech je u pyrimidinových bází tvořena mezi N 1 a C 1 (deoxy)ribosy Glykosidická vazba v nukleosidech a nukleotidech je u purinových bází tvořena mezi N 9 a C 1 (deoxy)ribosy 1 9
Názvosloví Báze se označují jednopísmennými symboly: A T C G U Nukleosidy: Purinové: přípona osin (adenosin, guanosin) Pyrimidinové: přípona idin (thymidin, cytidin, uridin) Deoxy- Nukleotidy: Nukleosid (x ) mono-, di-, tri- fosfát Adenosin 5 trifosfát = ATP, obecně NTP nebo dntp
Funkce nukleotidů stavební složky nukleových kyselin přenašeče energie (ATP, GTP, ligasy, hydrolasy) fosforylační činidla (ATP - kinasy) aktivátory meziproduktů biosyntéz: N H 3 C CH 3 N + CH 3 CH 2 H 2 C O O P O O O P O O H 2 C H H O N H H N O HO OH UDPglukosa CDPcholin
Funkce nukleotidů. součásti kofaktorů (NAD(P), FAD, AdoMet, CoA) regulační molekuly a neuromodulátory (camp, cgmp) Využití v terapii antivirotika (AIDS, herpes, hepatitida) NH 2 N N N N H 2 C O camp O H H H H O P O OH O Cyklický AdenosinMonoFosfát
Struktura DNA Primární - pořadí nukleotidů 5 3 Sekundární Terciární
Primární struktura Zapisujeme: TACG... (dtdadcdg...)
Sekundární struktura DNA dvojitá šroubovice 1953 - James Watson, Francis Crick Rosalind Franklin - rentgenostrukturní analysa meziatomární vzdálenosti, helikální struktura
Chargaffova pravidla: Zastoupení basí v DNA (molární %) Organismus A T G C Člověk 30.9 29.4 19.9 19.8 Kuře 28.8 29.2 20.5 21.5 Kobylka luční 29.3 29.3 20.5 20.7 Pšenice 27.3 27.1 22.7 22.8 Kvasinky 31.3 32.9 18.7 17.1 E. coli 24.7 23.6 26.0 25.7 [A] = [T] a [G] = [C] [A] /[T] = [G] / [C] = 1 Princip párování basí
James D.Watson & Francis Crick Nobelova cena 1962
Sekundární struktura 1. Dvě vlákna, z nichž každé tvoří pravotočivý helix, vzájemně svinuté, parametry 2. Monosacharid + fosfát = páteř vně šroubovice polární povrch 3. Báze lokalizovány uvnitř šroubovice, roviny kruhů kolmo na osu, stohování basí, patrové hydrofobní interakce 4. Komplementární párování basí odpovídá Chargaffovým pravidlům, vodíkové můstky 5. Dvoušroubovice má dva žlábky: velký(mělký a široký) a malý (úzký a hluboký) 6. Polynukleotidové řetězce mají antiparalelní uspořádání: 5 3 3 5 velikost se udává počtem párů bazí bp
Prokaryotní Terciární struktura DNA 1 molekula kruhové DNA - 1 chromosom (E.coli 2,6x10 6 kda, 1400 m!!) + Plasmid(ová DNA) - autonomně se replikující (zdvojující) mimochromosomální cirkulární DNA, odlišná od bakteriálního genomu (chromosomální DNA), která není nezbytná pro kontinuální existenci organismu za neselektivních podmínek.
Eukaryotní DNA je lineární Chromosomy + mimojaderná: mitochondriální, plastidová (pozor!! kruhová) Kódující úseky exony, nekódující úseky - introny Kondenzace, poměr sbalení až 8 000 Základní jednotka - nukleosom
Vlastnosti DNA DNA poměrně málo stabilní - lze poškodit i mechanicky Přechod dvouvláknové struktury na jednovláknovou - porušení hydrofobních interakcí a vodíkových můstků: Pokles optické otáčivosti Pokles viskozity změna spektrálních vlastností Změna ph - protonace N1 v adeninu a N3 v cytosinu Pokles iontové síly - odhalení záporných nábojů fosfátové kostry
Teplotní denaturace DNA Hyperchromní efekt: T m = teplota tání DNA Tm se s zastoupením GC párů Denaturace může být vratná - annealing
RNA Ribosa x deoxyribosa U x T Jednovláknová! Messenger RNA mrna (5%) Ribosomální RNA rrna (80%) Transferová RNA trna (10 15%)
Ribosomální RNA, sekundární struktury: smyčky, výdutě, helikální úseky
Transferová RNA 3 konec
Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa a skládání proteinů Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodický přístup molekulární biologie
Přenos genetické informace Centrální dogma molekulární biologie: x viry Základní pojmy: Templát - vázán nekovalentně - matrice, vzor Replikace, transkripce, translace řízené polymerace: Iniciace, elongace, terminace, postsyntetické úpravy (processing) Primer - vázán kovalentně - iniciátor růstu řetězců
Replikace DNA Konzervativní x Semikonzervativní? Meselson - Stahlův experiment
Meselsonův a Stahlův experiment nově vznikající DNA je kombinací starého a nového řetězce: E.coli v mediu s 15 N hybridizace
Replikace Specifické párování bází umožňuje kopírování ssdna slouží jako templát Vysoká rychlost genom E.coli 4,8 x 10 6 bp zkopírován za 40 min!!! tj. inkorporace 2000 bází/s lidský genom 6 x 10 12 bp - replikace zahájena na více místech najednou
Rozvolnění dvojšroubovicové struktury v počátku replikace Vznik replikační bubliny replikační vidlička Espero Publishing, s.r.o.
Polarita DNA-řetězců v replikační vidličce Espero Publishing, s.r.o.
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg 2+ Specifita: Vazba 3 5 Růst vlákna ve směru 5 3 Na začátku nutná přítomnost volné 3 OH - primer Sumárně: dntp + (DNA) n (DNA) n+1 + PPi
Mechanismus replikace
Asymetričnost replikační vidličky
Dokončení synthesy zpožďujícího se vlákna DNA polymerasa III DNA polymerasa I DNA ligasa
DNA ligasa propojení Okazakiho fragmnetů ATP AMP + PPi
Replikace DNA... Terminace Prokaryota kruhová DNA Eukaryota telomery, telomerasy
Vysoká přesnost kopírování je nezbytná!!! Pravděpodobnost inkorporace chybné base je 1 : 10 4 Ve skutečnosti pouze 1 : 10 10 Opravný mechanismus?? Nukleasová aktivita DNA polymerasy
Stručná historie sekvenování DNA První DNA sekvence ~1965 - alanin trna (77 basí) z kvasinky Vývoj metod pro sekvenování DNA 1977 - Maxam-Gilbert a Sanger
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg 2+ Primer s 3 OH Specifita: Vazba 3 5 Růst vlákna ve směru 5 3 Sumárně: dntp + (DNA) n (DNA) n+1 + PPi
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg 2+ Specifita: Vazba 3 5 Růst vlákna ve směru 5 3 Na začátku nutná přítomnost volné 3 OH - primer Sumárně: dntp + (DNA) n (DNA) n+1 + PPi
Sangerova metoda Založena na použití dideoxynukleotidů
Pro sekvenování je třeba: Dostatečný počet kopií DNA Vhodný primer DNA polymerasa normalní nukleotidy v dostatečném množství Malé množství dideoxynukleotidů nějak označených (radioaktivně, fluorescenční značkou)
Templát 3 CCAAGGGT 5 5 primer G GG GGT GGTT GGTTC GGTTCC GGTTCCC GGTTCCCA 4 reakční směsi: - Elektroforetické dělení fragmentů podle Mh +
Sangerova metoda
Automatické sekvenování s využitím fluorescenčně značených dideoxynukleotidů Copyright Bios Publishers Ltd
Realita..
Amplifikace DNA Metoda PCR - polymerase chain reaction Polymerasová řetězová reakce
Amplifikace DNA - PCR (polymerase chain reaction) Reakční směs: - Taq polymerasa - Primery: levý pravý - Nukleotidy dntp
Využití PCR: Materiál pro sekvenování Sekvenace genomů (HUGO) Diagnostika infekčních onemocnění Identifikace poruch na úrovni DNA Identifikace osob Studium evoluce (zpracování fosilií) Základ genových technologií - GMO
Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodické přístupy molekulární biologie
Exprese genu DNA RNA RNA protein Transkripce Translace
Transkripce DNA RNA RNA polymerasa katalyzuje většinu kroků v procesu: - rozpoznává iniciační místa promotory - vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny) - katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb - rozpoznává terminační místo - nemá nukleasovou aktivitu neopravuje chyby! Mechanismus syntézy je stejný pro všechny typy RNA
Transkripce Iniciace - promotor rozpoznán sigma (σ) podjednotkou RNA polymerasy prokaryota: σ podjednotka: 1. snižuje afinitu RNA polymerasy k nepřepisovaným oblastem 2. Rozpoznává oblast promotoru
DNA je transkribována enzymem RNA-polymerázou ( DNA dependentní) 5 3 - vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny) - katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb - rozpoznává terminační místo RNA n + NTP RNA n + 1 + PPi 3 5
Transkripce dvou genů na snímku z elektronového mikroskopu Transkripce mnoha RNA najednou Není třeba opravovat RNA polymerasa nemá nukleasovou aktivitu Espero Publishing, s.r.o.
Posttranskripční úpravy RNA Prokaryota - bez úprav Eukaryota - replikace a transkripce jsou časoprostorově oddělené procesy 5' čepička (cap) 3 ' konec - poly A ocas (tail) + Sestřih (splicing)
Sestřih RNA Genom: 5 Intergenic Gen Intergenic 3 Transkripce pre-mrna 5 Exon Intron Exon Intron Exon GT AG GT AG 3 Sestřih mrna Transkriptom: 5 Exon Exon Exon 3
Translace - proteosynthesa Probíhá na ribosomech Mechanismus u všech organismů prakticky stejný Směr N-konec C-konec Překlad z jazyka basí do jazyka aminokyselin: Genetický kód úkol: Ze 4 písmen je třeba vytvořit 20 slov : 4 2 = 16 4 3 = 64 Dešifrován pomocí syntetických polynukleotidů: poly U polyphe
Tripletový Nepřekrývá se Degenerovaný, pouze trp a met jeden kodon, ostatní více (synonyma) Většina synonym se liší basí na třetí pozici Degenerace minimalizuje vliv mutací záměna basí neznamená vždy záměnu AK (Ile, Leu) Počet kodonů koreluje s četností výskytu AK v proteinech Pouze tři nemají smysl - stop! Iniciace start kodon Met Téměř univerzální, výjimky u protozoí a mitochondrií (vlastní sada trna) Vlastnosti genetického kódu
Proteosynthesa probíhá na ribosomech: rrna - 80% buněčných RNA Ribozymy 25% sušiny E.coli S = Svedbergův koeficient míra rychlosti sedimentace při centrifugaci
Base aminokyselina
Vazba AK na trna - aminoacyl trna synthetasa (ligasa) sumárně: AK + trna + ATP aminoacyl trna + AMP + PPi Opravný mechanismus hydrolasová aktivita některých aminoacyl trna synthetas (thr x val)
Iniciace
Elongace růst peptidového řetězce Energetická bilance aktivace AK ekv. 2 ATP elongace 2 GTP Terminace stop kodon, Rf faktor
Proteosynthesa -shrnutí
Exprese genu u prokaryot a eukaryot - shrnutí
Postranslační modifikace proteinů fosforylace glykosylace myristoylace N-glykosidická vazba - Asn O-glykosidická vazba - Ser a Thr
Posttranslační úpravy proteinů - štěpení Doprava na místo určení (targeting) signální sekvence pre- Vznik biologicky aktivní formy z pro formy Příklad - insulin
Regulace genové exprese Konstitutivní geny - kontinuální transkripce síla promotoru Indukovatelné a reprimovatelné geny Transkripce a postranskripční procesy Degradace RNA Translace Degradace proteinů Regulace převážně na úrovni iniciace translace Příklad: lac operon
Regulace genové exprese Operonová teorie: + regulátor
lac operon E.coli Kultivace v mediu s glc Při nedostatku glc náhrada laktosou
Genové technologie (inženýrství) Manipulace s genomem a s tím související technologie PRO nejoptimističtější scénář: Zvýšení nutriční hodnoty potravin Boj s chorobami Výživa třetího světa Snížení spotřeby pesticidů PROTI nejpesimističtější scénář: Zvýšení úmrtnosti díky alergickým reakcím Nevratné zamoření životního prostředí
Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: Sekvenování celých genomů - tvorba DNA knihoven Transkriptomika - Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) Klonování organismů - produkce geneticky identických populací organismů, ale také tvorba kopií DNA Genetická modifikace organismů - vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Technologie rekombinantní DNA Amplifikace DNA pomocí plasmidů Základ genových manipulací: Plasmid vektor Restrikční endonukleasy
Restrikční endonukleasy
Příprava plasmidu (vektor) rekombinantní DNA
Selekce plasmidů nesoucích vloženou DNA 1. Vhodný plasmid (resistence k amp a tet 2. Štěpení restrikčními endonukleasami 3. ligace insertu 4. Transfekce buněk 5. Selekce buněk nesoucích plasmid s insertem
DNA knihovny, YAC, BAC fragmenty DNA Chromosom mrna cdna Reversní Transkriptasa 1) Reversní transkriptasa: RNA Dependentní DNA Polymerasa 2) Každý gen je nejméně jednou zastoupen v DNA knihovně
Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) Klonování organismů Genetická modifikace organismů - vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Instead of putting the foreign DNA into a bacterium, put it into a farm animal that can be milked so that the factor will be in he milk. Genetically modified organisms
Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) Klonování organismů Genetická modifikace organismů - vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Konvenční křížení versus genové technologie škůdce Vložit do jiné rostliny Pomalý přirozený výběr resistentních rostlin škůdce škůdce Může trvat mnoho generací rychle nepřirozeně vedlejší účinky? Isolace genu resistence
Genetické úpravy rostlin Buněčná kultura Buňka nesoucí příslušný gen DNA A single gene Rostlinná buňka Rekonstrukce rostliny transformace Transgenní rostlina Dělení buněk
Studium funkce genů SIGnAL- SALK Institute Genomic Analysis Laboratory T-DNA SALK lines resource for systematic genome-wide functional screens, a "phenomeready" genome, Up today 24773 lines, representing 15719 individual genes are available Agrobacterium tumefaciens
Transkriptom Příprava cdna
DNA mikročipy - analýza exprese genů Microarrays detect gene interactions: 4 colors: Green: high control Red: High sample Yellow: Equal Black: None Problem is to quantify image signals
Proteomika
A toto je realita
Proteom:
Studium procesů probíhajících v živých organismech DNA Genom Transkripce Translace Transkriptom DNA array Vnější prostředí Proteiny Biochemické procesy Proteom 2D MS Vnější projevy Metabolom, Fyziom HPLC
Reversní genetika studium funkce genů Příprava cdna