Nukleové kyseliny. Jsou universální složky živých organismů. Jsou odpovědné za uchování a přenos genetické informace.

Transkript

1 Nukleové kyseliny Jsou universální složky živých organismů. Jsou odpovědné za uchování a přenos genetické informace. Richard Vytášek 2012

2 Nukleové kyseliny objeveny v 19.století v mlíčí (rybí sperma) a v dalších biologických materiálech funkce objasněna v uplynulém půlstoletí (název odvozen od buněčného jádra [nucleus]) dva základní typy DNA, RNA v posledních dvaceti pěti letech prudký rozvoj molekulární biologie a genetika

3 Složení nukleových kyselin kyselina fosforečná (H 3 PO 4 ) pentosa (pětiuhlíkatý cukr) D-ribosa (RNA) 2-deoxy-D-ribosa (DNA)

4 heterocyklické base (nukleobase) - pyrimidinové base pyrimidin uracil thymin cytosin - purinové base (RNA) (DNA) NH 2 O N N N N HN N N NH N NH H N NH 2 N purin adenin guanin

5 Nukleosid je sloučenina pentosy (ribosy nebo deoxyribosy) a heterocyklické base. Ta je vázána na cukr přes dusík heterocyklu -N-glykosidickou vazbou. Adenosin, guanosin, cytidin, thymidin a uridin adenosin cytidin thymidin

6 AMP Nukleotid nukleosid esterifikovaný fosforečnou kyselinou buď na 5 -hydroxylové skupině (pouze tyto jsou prekursory nukleových kyselin) nebo řidčeji 3 -hydroxylové skupině. Nukleotidy jsou monomerní jednotky polymerní nukleové kyseliny (polynukleotidu). ribonukleotidy AMP, GMP, UMP a CMP (monomery RNA) deoxyribonukleotidy damp, dgmp, dtmp a dcmp (monomery DNA)

7 Nukleová kyselina je polynukleotidový řetězec, který je tvořen mononukleosidy vázanými navzájem fosfodiesterovými vazbami. 5 -OH skupina cukru v nukleotidu je vázána k 3 -OH skupině dalšího nukleotidu fosfodiesterovou vazbou polynukleotidový řetězec obsahuje 5 - a 3 - konec (buď ve formě volné OH skupiny nebo esterifikovaný), dle konvence se sekvence nukleotidů v nukleové kyselině zapisuje od 5 do 3 konce

8 RNA

9 DNA

10 DNA existuje v nativní formě převážně jako dvojvláknová šroubovice (dvoušroubovice, double helix, duplex)

11 Obsah nukleobází v DNA různého původu

12 Párování bází

13 Dvoušroubovice DNA

14 Dvoušroubovicová struktura DNA dvoušroubovice je stabilisována vodíkovými můstky nukleotidových párů (A-T, C-G), ale podílí se na ní i další síly (van der Waalsovy, interakce dipol-dipol, odpuzování negativně nabitých fosforylových skupin atd.) denaturace DNA je rozrušení dvouřetězcové struktury (např. teplotou) na jednotlivé komplementární řetězce renaturace DNA je opětné vytvoření dvoušroubovicové struktury z jednotlivých komplementárních řetězců

15

16 A, B a Z konformace DNA B forma - pravotočivá, standardní přirozená konformace A forma - pravotočivá, konformace arteficielní krystalické struktury s redukovaným obsahem vody Z forma - levotočivá, konformace vyskytující se občas uprostřed molekuly s B konformací A B Z A B Z

17 RNA

18 Mesengerová (informační) RNA mrna přenos informace z genu (DNA) do místa proteosynthesy veliká variabilita jak ve velikosti molekuly, tak stabilitě Přepis mrna do sekvence aminokyselin proteinu začíná od 5 -konce většina mrna obsahuje na 3 -konci polya ( adenylátových zbytků)

19 5 -konec čapkován (capped) 5 -konec

20 Transferová RNA trna malé molekuly (73-95 nukleotidů) 7-15% posttranskripčně modifikovaných bází. 3' konec vždy končí sekvencí CCA překlad informace ze sekvence mrna do sekvence aminokyselin každá aminokyselina má alespoň jednu vlastní specifickou trna sekundární struktura připomíná jetelový trojlístek

21

22 Biosynthesa aminoacyl-trna trna je spojena s příslušnou aminokyselinou kovalentní esterovou vazbou na 3' konci katalysa enzymy aminoacyl-trna synthetasami 20 různých aminoacyl-trna synthetas, každá pro jednu aminokyselinu

23 Ribosomální RNA rrna většina buněčné RNA je rrna jsou integrálními složkami ribosomů (5S, 5,8S, 28S a 18S) vykazuje katalytickou (enzymatickou) aktivitu při vytváření peptidické vazby

24

25 Malé interferující RNA Small interfering RNAs (sirnas) okolo 22 nukleotidů zprostředkovávají nově objevený jev zvaný RNA interference (RNAi) významná role v regulaci genové exprese - váží se na specifické sekvence mrna a takto označená specifická mrna je rozložena enzymy zvanými endonukleazy

26 MikroRNA MicroRNAs (mirnas) nukleotidů odhaduje se, že je kolem 250 různých mikrorna, ale je jich možná i 500 ovlivňují zásadním způsobem funkce zhruba lidských genů regulace genové exprese - vazba na mrna způsobí vyřazení příslušné mrna z translace na příslušný protein

27 Genové utlumení (gene silencing) mikrorna a malými interferujícími RNA Nature Rev Genet 3(2002)

28 Malé RNA jadérek Small nucleolar RNAs (snornas) důležité pro biosyntézu rrna modifikuje ribosomální RNA (rrna) uspořádáním štěpení dlouhé prerrna na funkční podjednotky (18S, 5,8S a 28S molekuly)

29 Malé jaderné RNA Small nuclear RNAs (snrnas) součástí buněčné struktury (spliceosome) pro produkci mrna odstraní nekodující oblasti (introny) genů a složí dohromady kodující regiony (exony) do mrna sekvence kodující proteiny některé snrna přitom v těchto reakcích vykazují znaky funkčního enzymu

30 Ribozym RNA molekula, která katalyzuje chemickou reakci název znikl spojením ribonukleová kyselina enzym ribozymy často katalyzují buď hydrolyzu jedné z vlastních fosfodiesterových vazeb nebo hydrolyzu vazeb v jiné RNA,

31 Rozdíly mezi DNA a RNA DNA RNA 1) cukr deoxyribosa ribosa 2) pyrimidinová b. thymin uracil 3) struktura dvoušroubovice jeden řetězec 4) alkalické prostř. stabilní labilní

32 Stanovení nukleových kyselin stanovení basí (UV) stanovení pentosy stanovení nativních řetězců (interkalující barvičky) Hoechst , ethidium bromid obsah fosforu

33 Interkalace ethidium bromidu

34 přírodní nebo umělý proces měnící genetickou informaci organismu (DNA ev. RNA v retrovirech) proces je buď fysikální nebo chemické nebo biologické povahy UV světlo a ionisující záření jsou typické fysikální mutagenní agens Mutagenese

35 Mutagenese Vznik pyrimidinových dimerů UV světlem vznik dimerů vlivem UV je fotochemická reakce působí ihibici a špatné přepisování informace v DNA DNA reparační (opravné) mechanismy dokáží jednak rozštěpit thyminový dimer na původní thyminy, jednak vystřihnou vadnou část řerězce a podle druhého řetězce (templátu) ji znovu správně nasynthetisují

36 Chemické mutageny 1 Alkylační činidla N-Nitroso-N-ethylmočovina N-Nitroso-N-methylmočovina G...C 7-Met-G...T

37 Chemické mutageny 1 Prokřižující alkylační agens hořčičný plyn (yperit) a dusíkatý yperit jsou nespecifická DNA prokřižující alkylační činidla bis(2-chloroethyl)methylamin

38 Chemické mutageny 2 Deaminace Deaminace HNO 2 Adenin Hypoxanthin Komplementární dvojice : A...T Hx...C C...G U...A

39 Chemické mutageny 3 Analogy nukleobází Bromouracil (5-BrU) 5-BrU existuje v třech tautomerních formách, které se odlišně párují. Keto forma je komplementární k adeninu a jako taková bude inkorporována do DNA jako část páru tvořící vodíkové můstky s adeninem druhého řetězce během DNA replikace. Enol forma a ionizovaná forma jsou ale komplementární ke guaninu.

40 Chemické mutageny 4 Interkalační agens např. Ethidium bromid nebo akridinová oranž po navázání mezi vlákna DNA způsobují inserci či deleci celého páru bází