Barvení mikroorganismů; imerzní mikroskopie (teoretický úvod) Barvení mikroorganismů Pro barvení mikroorganismů se použivají zředěné vodné roztoky organických barviv : 1. Bazická barviva (soli, v nichž je barevnou složkou kationt) - např. krystalová violeť, genciánová violeť, methylénová modř, safranin, zásaditý fuchsin, vesuvin, malachitová zeleň. Používají se pro barvení bakterií nebo jader eukaryotických buněk. 2. Kyselá barviva (soli, v nichž je barevnou složkou aniont) - např. kyselina pikrová, eosin. Používají se pouze pro vybarvení cytoplazmy eukaryotních organismů. Intenzitu vybarvení bazickými barvivy zvyšuje zásaditá reakce prostředí, u kyselých barviv pak kyselá reakce prostředí. Některé chemické sloučeniny (např. fenol, anilin, kyselina chromová, tanin, Lugolův roztok) způsobují sytější a lepší vybarvení objektů - při používání těchto sloučenin hovoříme o moření. Barvící metody podle účelu : Jednoduché barvení - používáme jej, pokud potřebujeme rozlišit tvar buněk (např. cvičení - Bakterie mléčného kvašení) Diferenciační barvení - slouží k rozlišení jednotlivých morfologických útvarů buňky prokaryotické i eukaryotické (př. jádro, spóry, vakuoly apod.) nebo chemických složek buňky (škrob, glykogen, tukové kapénky apod.) Diagnostické barvení - slouží jako jedna z metod při klasifikaci mikroorganismů. Nejpoužívanější je Gramovo barvení bakterií. Negativní barvení - používáme v případě, kdy potřebujeme zjistit nejen tvar ale i velikost buněk. Při běžných metodách barvení jednotlivé kroky postupu mohou velikost buněk výrazně měnit (např. fixace, působení chemikálií barviv). Při negativním barvení je barveno pouze pozadí, nikoli buňky. Buňky pak pozorujeme jako světlé útvary, které jsou patrné na barevně odlišeném pozadí. Pozn. Pro přípravu preparátů se používají čistá, odmaštěná podložní sklíčka (tuk odstraníme xylenem nebo benzenem nebo chromsírovou směsí; po řádném opláchnutí je vkládáme do odmašťovacích roztoků na několik hodin, potom ponoříme do ethanolu a následně opláchneme destilovanou vodou, usušíme a vyleštíme hadříkem) před použitím se sklíčko vždy ožehne z obou stran v plameni kahanu. Pro přípravu většiny barvených preparátů (zvláště barvení bakterií) je třeba objekty fixovat. Účelem fixace je usmrcení buněk (mrtvé buňky snáze přijímají barvivo) a lepší přilnutí buněk k podkladu, aby nebyly při barvení či oplachování odplaveny. Bakterie fixujeme nejčastěji plamenem, kvasinky a plísně většinou chemikáliemi (aceton, ethanol) neboť plamen výrazně mění jejich tvar. Fixace kvasinek a plísní se používá jen při některých speciálních barvících technikách. Není-li v návodu uvedeno, neprovádí se. Fixace plamenem - na plamenem protažené sklíčko přeneseme bakteriologickým očkem kulturu a provedeme nátěr (rezetřeme na plochu cca 2 cm 2. Necháme na vzduchu oschnout. Pak sklíčko (nátěrem vzhůru) několikrát protáhneme plamenem kahanu a po vychladnutí barvíme.
Imerzní mikroskopie Imerzní mikroskopie je často používanou metodou v mikrobiologii, kde pozorované objekty mají velmi malé rozměry. Užívá se pro zvýšení rozlišovací schopnosti. Mezi čočku objektivu a pozorovaný objekt se dává imerzní olej (oleum cedri = cedrový olej) - kapalina, jejíž index lomu je stejný jako index lomu skla, nedochází proto ke zkreslení tvarů a zvyšuje se ostrost pozorovaných objektů - získáme věrný obraz. U velmi podrobných pozorování se používá dvojitá imerze (imerzní olej se dává i mezi čočku kondenzoru a sklíčko). Imerzní mikroskopii lze provozovat pouze u mikroskopu, který je vybaven imerzním objektivem (označen jedním, častěji dvěmi černými proužky). Postup : 1. Na obarvený suchý preparát bez krycího sklíčka kápneme kapku cedrového oleje 2. Preparát umístíme na stolek mikroskopu, zvolíme imerzní objektiv 3. Opatrně přibližejeme objektiv, až čočku namočíme do kapky oleje (sledujeme ze strany, pozor na proražení sklíčka) 4. Za pohlížení do okuláru velmi pomalu mikrošroubem oddalujeme objektiv. Sloupec kapaliny oleje mezi sklíčkem a čočkou se nesmí přerušit. Pokud jsme objektiv příliš oddálili, postup opakujeme (nikdy nepřibližujeme objektiv při pohlížení do okuláru, vždy kontrolujeme pohledem z boku). 5. Po skončení pozorování omyjeme objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčko. Pokud prohlížíme s imerzí trvalé preparáty, dáváme imerzní olej na krycí sklo trvalého preparátu. Při omývání oleje z preparátu postupujeme opatrně, abychom trvalý preparát neznehodnotili. Nejčastější chyby : Nedostatečné osvětlení zorného pole (pracujeme s velkým zvětšením, kondenzor musí být v maximální horní poloze) Příliš hrubé zaostřování - zaostřování makrošroubem, či příliš rychle mikrošroubem, zaostření objektu naše oko nepostřehne. Postup je třeba trpělivě opakovat. Pozor!!! Nezapomínejte zvolit správnýobjektiv - černými proužky označený imerzní objektiv Literatura : Šilhánková, L. a kol : Návody pro laboratoře z mikrobiologie; SNTL Praha 1985
Návod bakterie 2 Jednoduché barvení bakterií a diagnostické barvení podle Grama Užívaná barviva: Karbolfuchsin dle Ziehl - Neelsena: 1 g bazického fuchsinu se rozetře v porcelánové třecí misce s 10 ml 96% ethanolu a ke směsi se přidá 100 ml vodného roztoku fenolu. Nechá se stát do druhého dne, pak se přefiltruje. Uchovává se v tmavých lahvích se zabroušenou zátkou. K barvení se používá zředěný vodný roztok - 10 ml koncentrovaného karbolfuchsinu se zředí 90 ml destilované vody Methylénová modř dle Lofflera: roztok A - 0,2 g methylénové modři, 60 ml ethanolu; roztok B - 2 ml 0,1 M NaOH, 200 ml destilované vody Roztoky A a B se smíchají a uchovávají v tmavé lahvi GRAMOVO BARVENÍ Krystalová violeť roztok A: 5 g krystalové violeti se rozpustí přes noc v termostatu při 37 C v 200 ml 96% ethanolu; zfiltruje se přes filtrační papír do tmavé reagenční láhve se zabroušenou zátkou. roztok B : 2 g šťavelanu amonného se rozpustí v 200 ml destilované vody a zfiltruje se přes filtrační papír do tmavé reagenční láhve se zabroušenou zátkou. OBA TYTO ZÁKLADNÍ ROZTOKY JSOU STÁLÉ A DO ZÁSOBY SE UCHOVÁVAJÍ ODDĚLENĚ. Příprava barviva : 1 díl roztoku A a 4 díly roztoku B se smísí. SMĚS NENÍ STÁLÁ, UCHOVÁVÁ SE V TMAVÉ LAHVIČCE NEJDÉLE 7-14 DNÍ. BARVIVO JE TŘEBA TĚSNĚ PŘED BARVENÍM FILTROVAT PŘES FILTRAČNÍ PAPÍR. Lugolův roztok (IIK): 1 g jódu a 2 g jodidu draselného se dobře rozetře v třecí misce s 10 ml destilované vody. Doplní se 290 ml destilované vody. Uchovává se v tmavých reagenčních lahvích se zabroušenou zátkou. Aceton - ethanolová odbarvovací směs : 4 díly 96% ethanolu + 1 díl acetonu Karbolfuchsin dle Ziehl - Neelsena : viz výše 1. Bakterie mléčného kvašení Jednoduché barvení Teorie : Mléčné kvašení je děj způsobený bakteriemi mléčného kvašení. Díky jejich činnosti neupravované mléko během 24 hodin (při teplotě 15-35 C) samovolně kysne. Vzniklá kyška má dietetické účinky. Při zkvašování cukrů produkují bakterie značné množství kyseliny mléčné, která snižuje ph prostředí a tím znemožňuje rozvoj jiných nežádoucích druhů bakterií např. bakterií hnilobných. V potravinářském průmyslu a zemědělství jsou bakterie využívány při přípravě kysaného zelí, kvašených okurek, řady mléčných výrobků (jogurty, podmáslí, zákysy, acidofilní mléko, kefir apod.), silážování píce atd. Potrava i píce získává při tomto procesu na stravitelnosti i chuti. Nejčastějšími zástupci bakterií mléčného kvašení v mléčných výrobcích jsou streptokoky (Streptococcus lactis; S. termophillus), diplokoky (Diplococcus cremoris), tyčinkovité laktobacily (Lactobacillus bulgaricus; L. jogurti; L. acidopihlus) Úkol: Zhotovte preparát bakterií z donesených mléčných výrobků Materiál a pomůcky : Bílý jogurt, mléčný zákys, podmáslí, karbolfuchsin nebo methylénová modř podle Löfflera, kahan, bakteriologické očko, potřeby pro mikroskopování.; imerzní olej, mikroskop s imerzním objektivem (preparáty prohlížejte v obyčejném mikroskopu zv. 600x bez imerze, i v laboratorním mikroskopu s imerzí)provedení : Ve všech případech zhotovíme preparát nátěrem. Do kapky destilované vody na sterilním ožehnutém sklíčku přenesem bakteriologickým očkem jogurt (podmáslí, zákys) v množství cca velikosti špendlíkové hlavičky a očkem provedeme nátěr. Preparát po oschnutí fixujeme plamenem a barvíme karbolfuchsinem 3-5 min (methyl. modří 5-10 min). Barvivo
opláchneme destilovanou vodou, necháme oschnout či opatrně osušíme filtračním papírem. Mikroskopujeme bez vody a krycího sklíčka, v případě imerzní mikroskopie s imerzním olejem. Zjištění: V zákysu nalezneme řetízky streptokoků, v preparátu z jogurtu tyčinky laktobacilů a řetízky streptokoků, v preparátu podmáslí diplokoky a streptokoky. Poznámky : V široké škále mléčných výrobků současného trhu je možné objevit jednotlivé zástupce mléčných bakterií v různých kombinacích. Používají se též jiné druhy, než výše zmíněné. 2. Téma : Bakterie zubního hlenu Jednoduché barvení, negativní barvení Teorie : Ústa, stejně jako další dutiny v těle člověka jsou díky svému teplému a vlhkému prostředí vhodným místem pro výskyt bakterií. Stejně jako např. trávicí trubice, dýchací či pohlavní ústrojí obsahují svoji přirozenou mikroflóru a stejně jako další části těla jsou vstupní branou pro průnik patogenních (choroboplodných) mikroorganismů do těla. Hlavním zdrojem živin pro bakterie jsou sliny obsahují rozpuštěné pevné látky - anorganické (např. sodík, draslík, vápník aj. stopové prvky; chloridy, bikarbonáty, fosfáty aj. sloučeniny) a organické (bílkoviny - např, enzymy; cukry, aminokyseliny, vitamíny, amonikak apod.). Ve slinách byly objeveny i látky s antibakteriálním účinkem (např. lysozym). Reakce slin se pohybuje v rozmezí ph 5,7-7,0. Složení slin u různých lidí se do jisté míry liší (je ovlivněno např. fyziologickými předpoklady, emocionálním stavem apod.). Mikroflóra je závislá na přítomnosti a stavu zubů (flóra bezzubých úst a úst se zuby se výrazně liší, s růstem zubů se mění od aerobní k převážně anaerobní). Na povrchu zubů se tvoří tenký, pevně přisedlý film, který nelze úplně odstranit ani při čištění zubů kartáčkem (tloušťka filmu je cca 60 mikrometrů na nepřístupných místech; 1-3 mikrometry na čištěných místech). Tento film obsahuje hlavně vláknité gramnegativní bakterie, které zkvašují cukry na kyselinu mléčnou, dále pak menší počet dalších bakterií, jako streptokoky, koryneformní tyčky, gramnegativní koky a jiné. Dutina ústní obsahuje pak další bakterie - např. grampozitivní koky, mikrokoky, stafylokoky, streptokoky, gramnegativní koky a tyčky (z hlediska systému se jedná o zástupce rodů Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Lactobacillus, Leptotrichia, Corynebacterium, Bacteroides, Fusobacterium,
Spirillum apod.) Všechny tyto organismy jsou za normálních podmínek neškodné, dojde-li však k poškození sliznice, pronikají do tkání a mohou vyvolat onemocnění. Ústní mikroflóra se významně podílí na vzniku zubního kazu. Nejvýznamější je podíl bakterií, které zkvašují cukry na kys. mléčnou (Lactobacillus, Streptococcus, Leptotrichia aj.). Kyselina mléčná způsobuje odvápnění zubní skloviny a umožňuje vznik zubního kazu. Úkoly : A. Obarvěte bakterie zubního hlenu metodou jednoduchého barvení B. Obarvěte bakterie zubního hlenu metodou negativního barvení Materiál a pomůcky : Zubní hlen (bílý povlak zubů), párátka, zředěný roztok tuše, kahan, potřeby pro mikroskopování, voda, karbolfuchsin, imerzní olej, mikroskop s imerzním objektivem (preparáty prohlížejte v obyčejném mikroskopu zv. 600x bez imerze, i v laboratorním mikroskopu s imerzí) Provedení : ad A. Tupou stranou párátka opatrně seškrábneme bílý zubní povlak ze zubů (pozor na poranění dásní) a provedeme nátěr na ožehnuté podložní sklíčko (nátěr provádíme párátkem, jímž jsme povlak seškrábli). Necháme na vzduchu vyschnout, fixujeme plamenem (několikrát protáhneme plamenem kahanu, nátěrem vzhůru) a barvíme metodou jednoduchého barvení - cca 3 minuty zředěným karbolfuchsinem. Po té opatrně opláchneme destilovanou vodou, necháme oschnout či opatrně osušíme filtračním papírem a mikroskopujeme pod imerzí. Zjištění : Pozorujeme růžově zbarvené bakteriální buňky rozmanitých tvarů (vlákna, spirály, tyčky, koky, stafylokoky, streprokoky aj. Převažují vláknité bakterie. ad B. Na čisté ožehnuté podložní sklíčko dáme kapku zředěné tuše a do ní párátkem přeneseme zubní hlen získaný jako v úkolu č. 1. Párátkem provedeme nátěr hlenu společně s kapkou tuše, necháme na vzduchu oschnout, nefixujeme. Na suchý preparát kápneme kapku cedrového oleje a pozorujeme pod imerzí. Zjištění: Na tmavém tušovém pozadí vidíme světlé buňky bakterií. Tvary buněk zakreslíme. V závěru protokolu vyjmenujeme nejčastější zástupce (podle úvodu protokolu či podle dostupné literatury) Poznámky : S metodou negativního barvení se seznamujeme pouze informativně, velikost buněk neměříme. V praxi se metoda negativního barvení používá v případě, kdy potřebujeme zjistit nejen tvar ale i velikost buněk. Při běžných metodách barvení jednotlivé kroky postupu mohou velikost buněk výrazně měnit (např. fixace, působení chemikálií z barviv aj.)
3. Diagnostické barvení bakterií podle Grama Teorie : Diagnostické barvení je barvení, které pomáhá diagnostikovat - určovat bakterie a zařazovat je do systému. Gramova reakce je založena na reakci některých látek v buněčné stěně bakterií s určitými barvivy. Buněčné stěny některých bakterií obsahují kyselinu teichovou, která po obarvení krystalovou violetí a moření Lugolovým roztokem vytvoří pevný barevný komplex (kyselina, barvivo, jód z IIK) který se nevymývá rozpouštědlem (alkoholem nebo acetonem či jejich směsí). V preparátu mají tyto bakterie barvu krystalové violeti - fialovou až modofialovou. Jsou grampozitivní - G +. Druhá skupina bakterií neobsahuje kyselinu teichovou v buněčné stěně, takže zmíněný komplex se netvoří a modrá violeť se rozpouštědlem vymývá. Po dobarvení světlejším barvivem např. karbolfuchsin nebo safranin se tyto bakterie obarví na růžovo (příp. růžovočerveno). Jsou gramnegativní - G -. Za určitých podmínek (stáří bakteriálních kultur, nevhodné kultivační podmínky apod.) se něktré bakterie mohou jevit jako gramlabilní anebo se z grampozitivních mění na gramnegativní. Gramovo barvení je tedy metodou potvrzující, nikoli vyvracející. Jiný výsledek gramova barvení sám o sobě nevyvrátí zažazení druhu do systému, pokud není podpořen dalšími zkouškami, např. biochemickými testy apod. Úkol : Obarvěte gramovou metodou zadaný vzorek, pozorujte tvary bakterií, rozhodněte, zda jsou bakterie ve vzorku grampozitivní či gramnegativní. Materiál a pomůcky : Bakteriální kultura (mléčný výrobek, kolonie na agaru, zooglea senného nálevu apod.), bakteriologické očko, kahan, mikroskop s imerzním objektivem a potřeby pro mikroskopování, imerzní olej (oleum cedri), destilovaná voda, barviva a roztoky: Provedení : Připravíme preparát - nátěr vzorku ožehnutým bakteriologickým očkem, necháme na vzduchu oschnout, fixujeme plamenem kahanu. Na takto připravený preparát kápneme kapku krystalové violeti a necháme působit 20 sekund. Bez opláchnutí přikápneme kapku Lugolova roztoku, který slejeme i s původním barvivem (violetí), znovu nalejeme dostatečné množství Lugolova roztoku a necháme působit 20-30 sekund. Preparát odbarvujeme aceton-ethanolovou směsí (pipetou, odbarvovací směs lijeme opatrně na zešikmené sklíčko nad nátěr, přes preparát necháváme volně stékat) a dobře opláchneme destilovanou vodou (stříčkou nebo pipetou, stejně opatrně jako při odbarvování). Preparát dobarvíme zředěným karbolfuchsinem 30-60 sekund. Nakonec preparát znovu opláchneme a necháme oschnout či opatrně osušíme filtračním papírem. Mikroskopujeme v olejové imerzi. Mnemotechnická pomůcka pro snadnější zapamatování si postupu gramova barvení : VLAK = Violeť - Lugol - Aceton(alkohol) - Karbolfuchsin příp. VLAS = Violeť - Lugol - Aceton(alkohol) - Safranin Zjištění: V preparátu pozorujeme tvary a zbarvení bakteriálních buněk. Výsledky konfrontujeme s literaturou. Např. V jogurtu jsme pozorovali grampozitivní řetízky koků - streptokoky. Po konfrontaci výsledků s literaturou jsme druh určili jako Streptococcus lactis. Poznámky : Nejčastější chyby, které mohou způsobit chybný výsledek : sušení preparátu za přílišného tepla - uvaření buněk příliš dlouhé odbarvování acetonem (odbarvení i barevného komplexu b. stěny G + bakterií) lití vody nebo odbarvovací směsi přímo na preparát - znehodnocení preparátu, odplavení objektů.