MIKROBIOLOGIE. Grampozitivní kokovitá bakterie STAPHYLOCOCCUS AUREUS bakteriální kmen dle ATCC 1260 (CCM 888).

Transkript

1 MIKROBIOLOGIE Veškeré testy jsou prováděny s těmito bakteriálními kmeny: Gramnegativní tyčinkovitá bakterie ESCHERICHIA COLI bakteriální kmen dle ATCC 9637 (CCM 2024). Grampozitivní kokovitá bakterie STAPHYLOCOCCUS AUREUS bakteriální kmen dle ATCC 1260 (CCM 888). Oba bakteriální kmeny jsou referenční kultury mikroorganismů (dle ALE-G18, ČSNI), zakoupené z České sbírky mikroorganismů Masarykovy univerzity v Brně. Inkubace byla provedena na sterilním krevním agaru (Columbia agar) zakoupeno od firmy BIO-RAD. ÚKOL Č.1: Test je prováděn dle ČSN EN ISO Plošné textilie zjišťování antibakteriální aktivity zkouška šíření agarovou destičkou. MATERIÁL: 4 Petriho misky (obsahující krevní agar), bakteriální kultury naředěné na koncentraci 10 8 /ml bakteriální suspenze (dostanete již připravené), vysterilizovaný agar, testovaný materiál (textilie). POSTUP: při práci používejte vždy sterilní rukavice a roušku, dodržujte základní pravidla bezpečnosti práce v mikrobiologické laboratoři viz školení bezpečnosti práce 1. Byl připraven výživný agar pro testované bakterie (viz norma). 2. Agar byl autoklávován při 121 C po dobu 15 minut (ph = 7,2, při 20 C). 3. Agar byl ochlazen na teplotu 45 C. 4. Do ochlazeného agaru o objemu 150 ml naočkujte 1ml bakteriální inokula (10 8 /ml). 5. Takto připravený agar důkladně promíchejte a v objemu cca 5 ml nalijte do Petriho misek na krevní agar (spodní vrstva). 6. Takto připravené agarové misky k testům použijte za 1 hodinu po nalití a utuhnutí agaru. 7. Do každé z misek položte vzorek tkaniny (2x2 cm). 8. Misky inkubujte v termostatu o teplotě 37 C po dobu 20 hodin. 1

2 9. Po vyjmutí z termostatu změřte a vyhodnoťte halo zóny (dle tabulky viz norma), výsledky fotograficky zdokumentujte. Výsledky testů jsou dle výše uvedené normy hodnoceny následovně: Inhibiční zóna (mm): A. >1 mm až inhibiční zóna do 1 mm DOBRÝ ANTIBAKTERIÁLNÍ EFEKT B. 0 mm LIMIT ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINNOSTI (bez inhibiční zóny, pouze omezené kolonie, růst téměř zcela potlačen), neboť stejně dobře 0 růst uvádí hranice účinnosti C. 0 mm NEDOSTATEČNÝ EFEKT Příklad výsledku s velmi dobrým inhibičním efektem 2

3 ÚKOL Č.2: K testování je používána metoda AATCC Method 147 An American Standard 1993 POSTUP TESTOVÁNÍ: 1. Na Petriho misku s krevním agarem (Columbia agar) naneste pět pruhů bakteriálního inokula ( E. coli a Staphylococcus aureus) o koncentraci 10 5 v 1 ml bakteriálního inokula. 2. Testované vzorky (tkaniny) o rozměru 50x25 mm umístěte napříč těchto pruhů tak, aby byl zajištěn kontakt s povrchem agaru 3. Vzorky umístěte do termostatu a inkubujte 24 hodin při teplotě 37 C. 4. Pro výpočet průměrné šířky zóny tlumení růstu bakterií podél testovaného vzorku z jedné strany použijte následující vzorec: W = (T D) /2 5. Výsledky vyfotografujte a vyhodnoťte dle normy. Legenda: W šířka čisté zóny tlumení růstu bakterií v mm T celkový rozměr testovaného vzorku a čisté zóny tlumení růstu bakterií v mm D rozměr testovaného vzorku v mm Příklad výsledku s velkou halozónou velice dobrý antibakteriální efekt. 3

4 ÚKOL Č.3: K testování je používána metoda AATCC Method 100 An American Standard 1993 POSTUP TESTOVÁNÍ: 1. Vzorky (tkaniny) o rozměrech 18x18 mm sterilizujte ve sterilizátoru 20 minut při teplotě 90 C. 2. Vysterilizované vzorky umístěte do sterilních kontejnerů a zaočkujte bakteriálním inokulem v koncentraci 10 5 /ml v objemu 0,1 ml bakteriálního inokula. Kontejnery umístěte do termostatu a kultivujte při teplotě 36,5 C po dobu 24 hodin. 3. Po 24 hodinách kultivace do kontejnerů přidejte 10 ml fyziologického roztoku, čímž se upraví ředění bakterií na 10 3 /ml. 4. Kontejnery protřepejte (vortexujte) po dobu 5 minut. 5. Z každého kontejneru dále odeberte 1 ml bakteriologického média, které vyočkujte na Petriho misku s krevním agarem. 6. Misky umístěte do termostatu a inkubujte po dobu 24 hodin při teplotě 36,5 C. 7. Výsledky vyfotografujte a zhodnoťte dle normy určete % inhibice dle počtu nově obnovených bakteriálních kolonií. Příklad nově obnovené bakteriální kolonie po 24 hodinové inkubaci. 4

5 HISTOLOGIE Příprava bločků pro histologické řezy: Postup přípravy bločků (odebrání tkáně, fixování a zalití tkáně do parafínu) bude tématem teoretické přednášky. Příprava řezů Postup přípravy řezů na rotačním mikrotomu včetně bezpečnosti práce bude vysvětlen a demonstrován vyučujícím. ÚKOL: Upevněte přidělený parafinový bloček s živočišnou tkání do mikrotomu a proveďte několik řezů (maximální tloušťka řezů by neměla přesáhnout 10 mikrometrů) Vyberte nejtenčí řez a preparační jehlou ho přeneste do kapky vody na podložním skle (podložní sklo musí být předem vyčištěné a potřené adhezivním materiálem: nejlépe se hodí směs vaječného bílku s destilovanou vodou v poměru 1:1 poté zamíchat a přefiltrovat). Podložní sklo přeneste na chladící desku, která je vytemperovaná na teplotu 45 C. Pomocí preparační jehly řez opatrně natáhněte a parafín vlivem teploty nechte rozvinout a řez napnout. Sklo sejměte a zbylou vodu opatrně slijte. Preparát nechte usušit při laboratorní teplotě. Odparafínování řezů Je připravena tzv. odparafínovací řada. Jedná se o řadu kyvet. V každá kyvetě preparát ponechejte 5 minut. Principem tohoto kroku je odstranění parafínu a příprava řezů k barvení. Protože jsou barvící média rozpuštěná ve vodě, je nutné převádět připravené řezy systémem látky nepolární k polární. 5

6 ODPARAFÍNOVACÍ ŘADA: Xylen I. xylen II. xylen III. ethanol 96% - ethanol 96% - ethanol 70% - destilovaná voda Barvení řezů Barvíme nejprve v 1.hematoxylinu 3 10 minut, opláchnout diferencovat v 2.okyseleném ethanolu (na 50 ml ethanolu 2-3 kapky konc.hcl) diferenciace se projeví únikem namodralé barvy, oddiferencovaný preparát ponoříme do roztoku (3. voda z vodovodu 50 ml kapky 4% roztoku NaOH) Cytoplasma buněk je prakticky bezbarvá, jsou pouze intenzivně zbarvené chromatinové struktury. Preparát nakonec vložíme na 3 5 minut do roztoku 4. eosinu (0,5% vodný roztok), opláchneme vodou a odvodňujeme. Odvodnění řezů Odvodňovací řada slouží k převedení řezu od polárního rozpouštědla k nepolárnímu, aby mohlo dojít k vytvoření prostředí pro uzavírací médium a k tvorbě trvalého preparátu. ODVODŇOVACÍ ŘADA: Etanol 80% (1-3 minuty) etanol 96% (1 3 minuty) etanol 100% (5 minut) xylen I. (5 minut) xylen II. (5 minut) Uzavření řezů do média Na vyčištěné krycí sklo kápneme kapku uzavíratelného média (například kanadského balzámu, který má vynikající lom světla), přikryjeme jím obarvený řez a necháme zaschnout. Délka zasychání je závislá na druhu uzavíratelného média. U kanadského balzámu se jedná o 5-10 dnů, u syntetických médií je doba zasychání kratší. 6

7 ÚKOLY: Na dalším cvičení zhotovený preparát prohlédněte pod mikroskopem a porovnejte se standardním (ukázkovým) preparátem, který Vám rozdá vyučující. V preparátu se zaměřte na studium buněčných struktur a způsob obarvení preparátu. 7