Úkol: Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol pomocí CE-LIF Proveďte separaci a následné stanovení účinných látek (paracetamol, propyfenazon, kofein) v přípravku Valetol pomocí kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescencí. Teoretická část: Kapilární zónová elektroforéza (CZE) patří spolu s dalšími elektromigračními metodami mezi moderní a vysokoúčinné separační techniky. CZE je založena na elektroforetické migraci iontů v elektrickém poli, je tedy použitelná pro analyty schopné nést náboj v důsledku jejich disociace či protonizace. Dalším jevem ovlivňujícím separaci je elektroosmotický tok kapaliny křemennou kapilárou. Separace je uskutečňována v kapiláře, která je nejčastěji vyrobena z taveného křemene. Kapilára má vnitřní průměr od 10 do 100 μm a její délka se pohybuje v rozmezí od 40 do 100 cm. Křemenná kapilára je potažena vrstvou polyimidu (vnější průměr kapiláry je 375 μm), který zvyšuje její pružnost a snižuje křehkost. Konce kapiláry jsou umístěny v nádobkách s vhodným separačním pufrem a tyto nádobky jsou opatřeny platinovými elektrodami. Separace analytů probíhá vložením vysokého napětí, které je používáno v rozmezí od 0 do 30 kv. Rozseparované analyty jsou poté sledovány pomocí detektoru, který je umístěn na opačném konci kapiláry, než je dávkován vzorek. Dávkování vzorku se provádí buď elektrokineticky, nebo tlakem (hydrodynamické dávkování). Obr. 1. Schématické znázornění kapilární elektroforézy
Elektroosmotický tok Po vložení vysokého napětí napříč kapilárou naplněnou pufrem obvykle dochází ke vzniku elektroosmotického toku (EOF), který unáší analyty směrem ke katodě nebo anodě. Při použití křemenné kapiláry vzniká EOF v tom případě, kdy je hodnota ph separačního pufru větší než 2 (jedná se pouze o přibližnou hodnotu). Nad touto hodnotou ph totiž dochází k disociaci silanolových skupin (Si-OH) a ke vzniku záporného náboje na povrchu kapiláry, což má za následek přitahování kationtů separačního pufru a vznik elektrické dvojvrstvy na povrchu kapiláry. Pokud dojde k vložení vysokého napětí, migrují kationty směrem k záporné elektrodě tedy ke katodě. Jelikož jsou kationty solvatovány, strhávají s sebou veškerou kapalinu. Rychlost EOF je zpravidla větší než elektroforetické rychlosti jednotlivých iontů, je tudíž schopen strhávat všechny kationty, neutrální částice i anionty ke katodě, u které je umístěn detektor. Migrační parametry Rychlost pohybu iontů v je přímoúměrná intenzitě vkládaného elektrického pole E: (1) kde µ je elektroforetická pohyblivost (elektroforetická mobilita), U je vložené napětí a L je celková délka kapiláry. Pokud budeme separovaný ion považovat za kulově symetrický, můžeme předpokládat, že během separace budou na ion působit dvě síly opačného směru, a to síla elektrická a síla odporová. V ustáleném stavu dojde k vyrovnání těchto sil, což vyjadřuje rovnice (2) definující vztah pro elektroforetickou pohyblivost: (2) kde q je náboj iontu, η je dynamická viskozita prostředí, r je efektivní poloměr kulovité částice (včetně solvatačního obalu). Z této rovnice (2) mimo jiné vyplývá, že vícenásobně nabité ionty budou mít vyšší pohyblivost a naopak ionty s větším efektivním poloměrem budou mít elektroforetickou pohyblivost menší.
Pokud zahrneme vliv dalších transportních dějů (především vliv elektroosmotického toku), které se podílejí na migraci analytu, získáme mobilitu zdánlivou, kterou vyjadřuje rovnice (3): (3) kde l je efektivní délka kapiláry, L je celková délka kapiláry, t m je migrační čas analytu a U je použité separační napětí. Detekce v CE V kapilární elektroforéze jsou možné dva způsoby detekce, kterými jsou off-line a on-line detekce. Častěji využívanou detekcí je on-line detekce probíhající přímo. Nejčastěji využívanými typy detektorů jsou spektrofotometrické detektory, jejichž citlivost je však omezena krátkou optickou délkou danou průměrem separační kapiláry. Pro citlivou detekci je možné použít např. fluorescenční detekci, a to laserem indukovanou fluorescenci (LIF). Tato metoda je vhodná pouze pro látky schopné absorbovat záření v UV oblasti a následně vysílat záření o vyšší vlnové délce. Nevýhodou laserem indukované fluorescence, je fakt, že pokud látka neobsahuje fluorofor, je nutné provést derivatizaci analytů reakcí s látkou obsahující fluorofor nebo provést nepřímou detekci. Tab. I Nejčastěji používané lasery a jejich excitační vlnové délky Laser Vlnová délka (nm) HeNe 543, 632 Ar + 488, 514 Diodový 645-840 V našem případě budeme používat detektor vybavený Ar + laserem s excitační vlnovou délkou 488 nm. Proto je nutné v případě derivatizace použít derivatizační činidlo schopné absorbovat UV záření v této oblasti a následně ho emitovat při vyšší vlnové délce (λ em. = 520 nm). Nejčastěji využívanými derivatizačními činidly pro tuto vlnovou délku jsou deriváty fluoresceinu, např.: fluorescein-isothiokyanát (derivatizace primárních a sekundárních aminů), fluorescein-5-karbonyl azid (derivatizace alkoholů a cukrů), fluorescein-5- thiosemikarbazid (derivatizace aldehydů a ketonů).
Valetol účinné látky Valetol je složený přípravek, který obsahuje kombinaci tří účinných látek. Těmito látkami jsou propyfenazon (1,5-dimethyl-2-phenyl-4-propan-2-ylpyrazol-3-on), paracetamol (N-acetylp-aminofenol) a kofein (1,3,7-trimethylxanthin). Propyfenazon a paracetamol působí proti bolesti a snižují tělesnou teplotu, kofein jejich účinky zesiluje, zmírňuje únavu a zvyšuje duševní aktivitu. V jedné tabletě Valetolu je obsaženo 300 mg propyfenazonu, 150 mg paracetamolu a 50 mg kofeinu. Struktury účinných látek jsou zobrazeny na Obr. 2. Vzhledem k tomu, že stanovované analyty nejsou schopny fluorescence při vlnové délce 488 nm, je potřeba provést před vlastní separací derivatizaci, a to pomocí fluorescein-5- thiosemikarbazidu. M kofein = 194 g/mol, M paracetamol = 151 g/mol, M propyfenazon = 230 g/mol Obr. 2 Struktury stanovovaných účinných látek Praktická část: Chemikálie: Kyselina boritá, hydroxid sodný, derivatizační činidlo: fluorescein-5-thiosemikarbazid (FTSC), standardy kofeinu, paracetamolu a propyfenazonu, reálný vzorek: tablety VALETOL, deionizovaná voda Pomůcky: Kádinky, odměrné baňky (50 ml, 250 ml), nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, teflonové míchadlo, křemenná kapilára (s vnitřním průměrem 50 µm a celkové délky 65 cm), řezátko, viálky, ependorfky
Přístroje: Agilent HP 3D CE s LIF detektorem, elektromagnetická míchačka, vypalovač detekčních okýnek, ultrazvuk, ph metr, váhy, varná deska Separační parametry: Separační napětí: + 20 kv Dávkování: hydrodynamicky 50 mbar/5s Promývání mezi analýzami: 3 minuty separačním pufrem Teplota: 25 C Postup: Příprava roztoků: Příprava separačního elektrolytu (250 ml): 50 mm borát sodný o ph 9,0 (ředit deioniz. vodou) o připravte 50 mm roztok kyseliny borité a pomocí NaOH dotitrujte na potřebnou hodnotu ph; před analýzou přefiltrujte elektrolyt přes nylonový filtr s velikostí pórů 0,45 µm Příprava derivatizačního pufru (50 ml): 50 mm borát sodný o ph 9,0 s přídavkem 0,5 mm FTSC o při přípravě využijte již připravený separační elektrolyt Připravte sadu kalibračních roztoků (ředit separačním pufrem): o propyfenazon: 0,10; 0,20; 0,40; 0,60 mg/ml o paracetamol: 0,0375; 0,075; 0,15; 0,30 mg/ml o kofein: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06 mg/ml o všechny tři standardy připravte do jednoho roztoku! Příprava vzorku: Tabletu Valetolu rozpusťte ve 100 ml separačního pufru Roztok umístěte na 5 minut do ultrazvuku a poté přefiltrujte přes nylonový filtr s velikostí pórů 0,45 µm Přefiltrovaný vzorek 10 x zřeďte separačním pufrem
Derivatizace: K 0,5 ml vzorku v ependorfce přidejte 0,5 ml derivatizačního pufru, ependorfku obalte alobalem, vložte do vodní lázně umístěné na varné desce a 3 hodiny udržujte na teplotě cca 60 C Stejný postup proveďte u všech kalibračních roztoků! Postup: Podle instrukcí vedoucího cvičení uřízněte potřebnou délku separační kapiláry (65 cm). Ve vzdálenosti 50 cm odstraňte (pomocí vypalovače) polyimidovou vrstvu kapiláry (cca 0,5 cm), čímž vytvoříte detekční okýnko potřebné pro online detekci Okýnko omyjte methanolem a důkladně vysušte Podle instrukcí vedoucího cvičení umístěte na kapiláru interface a vložte kapiláru do CE kazety a následně do přístroje Za pomoci vedoucího cvičení zapněte přístroj, promyjte kapiláru (10 minut 1 M NaOH, 10 minut H 2 O, 10 minut separační pufr) a nastavíte všechny parametry metody (separační napětí, způsob dávkování, promývání, teplotu, atd.) Do dvou plastových viálek odpipetujte 600 µl separačního elektrolytu (50 mm borát sodný ph 9,0): 1. viálka bude sloužit jako promývací, 2. jako separační. Dále připravte viálky obsahující připravený naderivatizovaný vzorek spolu s naderivatizovanými kalibrační vzorky. Postupně proměřte všechny kalibrační roztoky a poté vzorek (každé měření provádějte 3x!) Sestavte kalibrační křivku a vypočtěte množství propyfenazonu, paracetamolu a kofeinu v tabletě Valetolu (nezapomeňte na ředění vzorku při jeho úpravě). Otázky: 1. Z jakého důvodu je nutné provést derivatizaci vzorku před stanovením účinných látek v přípravku Valetol pomocí CE-LIF? 2. Jaký laser byl použit pro stanovení účinných látek? (typ a vlnová délka) 3. Jak vypočítáte elektroforetickou mobilitu analytů, ve které je zahrnut vliv elektroosmotického toku?
4. Popište vznik elektroosmotického toku v křemenné kapiláře. Literatura: 1. Principles of Fluorescence Spectroscopy: J.R. Lakowicz. 2. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy, 91 (1997) 320 329, V. Kašíčka. 3. Analytické separační metody, Karolinum Praha 2004, Štulik K. a kol.